Summary
Patient-härledda organoider (PDO) är ett kraftfullt verktyg i translationell cancerforskning, vilket återspeglar både den genetiska och fenotypiska heterogeniteten hos sjukdomen och svaret på personliga anti-cancerterapier. Här beskrivs ett konsoliderat protokoll för att generera humana primära blåscancer-SUB som förberedelse för utvärdering av fenotypiska analyser och läkemedelssvar.
Abstract
Nuvarande in vitro-terapeutiska testplattformar saknar relevans för tumörpatologiologi, som vanligtvis använder cancercellinjer etablerade som tvådimensionella (2D) kulturer på vävnadsodlingsplast. Det finns ett kritiskt behov av mer representativa modeller av tumörkomplexitet som exakt kan förutsäga terapeutiskt svar och känslighet. Utvecklingen av tredimensionell (3D) ex vivo-odling av patient-härledda organoider (PDO), härledda från färska tumörvävnader, syftar till att ta itu med dessa brister. Organoidkulturer kan användas som tumörsurrogat parallellt med rutinmässig klinisk hantering för att informera terapeutiska beslut genom att identifiera potentiella effektiva ingrepp och indikera terapier som kan vara meningslösa. Här syftar denna procedur till att beskriva strategier och ett detaljerat steg-för-steg-protokoll för att upprätta PDO: er för blåscancer från färsk, livskraftig klinisk vävnad. Våra väletablerade, optimerade protokoll är praktiska för att sätta upp 3D-kulturer för experiment med begränsat och varierat utgångsmaterial direkt från patienter eller patienthärledd xenograft (PDX) tumörmaterial. Denna procedur kan också användas av de flesta laboratorier utrustade med standard vävnadsodlingsutrustning. Organoiderna som genereras med hjälp av detta protokoll kan användas som ex vivo-surrogat för att förstå både de molekylära mekanismerna som ligger till grund för urologisk cancerpatologi och för att utvärdera behandlingar för att informera klinisk hantering.
Introduction
Blåscancer är den vanligaste urinvägscancern och den tionde vanligaste mänskliga maligniteten i världen1. Det omfattar ett genetiskt varierat och fenotypiskt komplext spektrum av sjukdom2. Uroteliala icke-muskelinvasiva former av blåscancer (NMIBC) är de vanligaste blåscancerdiagnoserna (70% -80%), och dessa cancerformer uppvisar betydande biologisk heterogenitet och varierande kliniska resultat 2,3,4. Patienter med NMIBC upplever vanligtvis en hög risk för sjukdomsåterfall (50-70%) och en tredjedel av cancerformerna kommer att utvecklas och utvecklas till betydligt mer aggressiv muskelinvasiv blåscancer (MIBC)2. Även om 5-årsöverlevnaden för NMIBC är hög (>90%), måste dessa patienter genomgå långsiktig klinisk hantering5. Å andra sidan anses lokalt avancerad (oåterkallelig) eller metastatisk MIBC i allmänhet vara obotlig6. Följaktligen har blåscancer en av de högsta livstidsbehandlingskostnaderna inom cancervården och är en betydande börda för både individen och sjukvården 3,7. De underliggande genetiska avvikelserna i avancerad sjukdom gör terapeutisk hantering av blåscancer till en klinisk utmaning, och terapeutiska alternativ för invasiva uroteliala tumörer har först nyligen förbättrats sedan godkännandet av immunterapier för både avancerad och högrisk NMIBC 8,9. För närvarande har kliniskt beslutsfattande styrts av konventionella kliniska och histopatologiska egenskaper, trots att enskilda blåscancertumörer visar stora skillnader i sjukdomsaggressivitet och svar på terapi10. Det finns ett akut behov av att påskynda forskningen om kliniskt användbara modeller för att förbättra förutsägelsen av individuell patientprognos och identifiering av effektiva behandlingar.
Tredimensionella (3D) organoider visar stor potential som tumörmodeller på grund av deras förmåga att självorganisera och rekapitulera den ursprungliga tumörens inneboende in vivo-arkitektur och farmakogenomiska profil och deras förmåga att spegla den ursprungliga cellulära funktionaliteten hos den ursprungliga vävnaden från vilken de härleddes 11,12,13 . Även om etablerade blåscancercellinjer är lättillgängliga, relativt kostnadseffektiva, skalbara och enkla att manipulera, misslyckas in vitro-cellinjerna i stor utsträckning med att efterlikna spektrumet av olika genetiska och epigenetiska förändringar som observerats i klinisk blåscancer12,14 och alla etablerades och upprätthölls under 2D, vidhäftande odlingsförhållanden. Dessutom har cellinjer härledda från primära och metastatiska blåstumörer signifikant genetisk avvikelse från det ursprungliga tumörmaterialet. 8,15.
Ett alternativt tillvägagångssätt är att använda genetiskt konstruerade och cancerframkallande inducerade musmodeller. Men medan dessa modeller rekapitulerar några av de naturliga onkogena kaskaderna som är involverade i human neoplasi (granskad i refs 16,17,18), saknar de tumörheterogenitet, är dyra, representerar dåligt invasiv och metastatisk blåscancer och är inte livskraftiga för snabb läkemedelstestning eftersom tumörer kan ta många månader att utveckla 14,19 . Patient-härledda modeller av cancer (inklusive organoider, villkorligt omprogrammerad primärcellodling och xenotransplantat) ger ovärderliga möjligheter att förstå effekterna av läkemedelsbehandling före klinisk behandling20. Trots detta använder få grupper rutinmässigt dessa patient-proximala modeller på grund av begränsad tillgång till färsk primär patientvävnad och den omfattande optimering som krävs för att reproducerbart generera patient-härledda organoid (SUB) odlingsförhållanden. I en in vivo-miljö kan onkogena celler interagera och kommunicera med olika kompositioner av de omgivande beståndsdelarna, inklusive stromaceller, vävnadsinfiltrerande immunceller och matris12. På samma sätt, för PDF-filer som odlas i ett 3D-format, kan cell-/matriskomplexitet anpassas för att inkludera andra relevanta komponenter. PDO kan snabbt genereras och kan ofta passeras i stor utsträckning eller kryokonserveras för senare användning, trots att de har en begränsad livslängd 21,22,23. Farmakodynamik (dvs. svar på ett läkemedel) kan utvärderas med hjälp av flera avläsningar, inklusive organoidviabilitet och morfologi, och karakterisering av immunohistokemiska mål eller transkriptionsförändringar.
Här beskrivs procedurerna för etablering av blåscancerorganoider från patientmaterial som samlats in från transuretral resektion av blåstumör (TURBT) eller kirurgiskt avlägsnande av blåsan (radikal cystektomi). Metoden för att generera PDF-filer illustreras med hjälp av lättillgängliga våta laboratoriematerial och verktyg. Endpoints inkluderar förändringar i cellmorfologiska egenskaper och livskraft. Dessa mättes med hjälp av fluorescensmikroskopi, in vitro-viabilitetsanalyser (metabolisk och cellmembranintegritet) och histopatologisk analys. Figur 1 visar arbetsflödet för att fastställa humana blåscancer-PDOs från kliniskt material som erhållits under elektiv kirurgi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Patienter har samtyckt till denna studie efter deras inläggning under urologiteamet vid Princess Alexandra Hospital, Brisbane, Australien. Studien utfördes i enlighet med principerna i Helsingforsdeklarationen och inom ramen för etiska och institutionella riktlinjer (etiknummer HREC/05/QPAH/95, QUT 1000001165).
OBS: Som behörighetskriterier var patienterna ≥ 18 år med cancer och kunde förstå och ge samtycke. De som inte kunde ge informerat samtycke uteslöts. De som hade ett annat primärt språk än engelska uteslöts eftersom tillhandahållande av tolkar inte var möjligt på grund av logistiska och budgetmässiga överväganden. Också uteslutna var patienter vars tumörer inte var tillgängliga för biopsi eller osannolikt att vara tillgängliga i tillräcklig mängd efter rutinmässig patologi.
1. Organoid medium beredning
OBS: Humant organoidmedium för blåscancer kräver tillväxtfaktorer som hjälper till med överlevnad, tillväxt och kontinuerlig expansion av organoider härrörande från dissocierat kliniskt material (tabell 1). För fullständig information om varje tillägg som används i denna procedur, se materialförteckningen.
- Tina frysta ingredienser på is eller i kylskåp vid 2-8 °C. Undvik upprepade frys-/upptiningscykler och arbeta från frysta alikvoter (förvaras vid -20 °C).
- Basalt medium: Förbered basalmediet genom att komplettera avancerade Dulbeccos Modified Eagle Medium/Hams F-12 (adDMEM/F12) med HEPES (10 mM) och glutamin (2 mM). Detta används också som transportmedium och under organoidtvättsteg.
OBS: Avancerad DMEM / F-12 används som basalmedium för att hjälpa till vid expansion av organoider i närvaro av begränsat serum; emellertid, Det kräver tillskott med HEPES och L-glutamin. - Kort centrifugfibroblasttillväxtfaktor 10 (FGF-10), fibroblasttillväxtfaktor 2 (FGF-2), epiteltillväxtfaktor (EGF), SB202190, prostaglandin E2 (PGE2) och A 83-01 före öppning för att säkerställa att komponenterna är i botten av injektionsflaskan.
- Komplett organoidmedium: Komplettera basalmediet med humant noggin- och R-spondin 1-konditionerat medium vid en slutlig koncentration av 5 % v/v, human EGF (50 ng/ml), humant FGF-2 (5 ng/ml), humant FGF-10 (20 ng/ml), A 83-01 (500 nM), SB202190 (10 μM), B27 (1x), nikotinamid (10 mM), N-acetylcystein (1,25 mM), Y-27632 (10 μM), PGE2 (1 μM) och en bredspektrumantibiotisk bildning vid den koncentration som anges av tillverkaren.
- Förvara organoidmedier vid 4 °C i mörker och använd det inom 2 veckor (högst 1 månad). Frys inte. Undvik långvarig exponering för ljuskällor.
OBS: Organoidmediet framställs serumfritt; Serum och penicillin/streptomycin kan dock kompletteras från användare till användare efter behov.
2. En dag före förfarandet som beskrivs i 3
- Upptining av tillväxtfaktor reducerat basalmembran (BME; se materialtabell) över natten i minst 12 timmar före användning i ett kylskåp eller kylrum med 4 °C. Om det behövs, dosera BME i 1 ml alikvoter i ett 1,5 ml polypropen engångsrör för att undvika frys-tina cykler.
- Placera filtrerade pipettspetsar i ett kylskåp eller kylrum på 4 °C.
OBS: Detta avsnitt hänvisar till pipettspetsar som kommer att användas vid hantering av BME för att förhindra för tidig polymerisation och minska beläggningen av BME på ytan av spetsarna. - Sterilisera all kirurgisk utrustning som krävs för proceduren.
3. Generering av blåstumörorganoider
OBS: Detta är ett första steg för SUB-etablering från primära patienttumörer. Denna procedur är anpassad för blåscancervävnader från metoder som fastställts av Gao et al.24.
- Använd en klass II biohazard huva för att förbereda provet. Hämta torr och våt is och skriv ut Patient Specimen Processing Sheet (Supplemental File).
- Ring forskningspersonal till operationssalen när kirurgisk resektion är nästan klar.
OBS: Bekräfta att patienten uppfyller behörighetskriterierna och har undertecknat deltagarens samtyckesformulär. Vävnad tillhandahålls för forskning endast om överskott till krav på klinisk histopatologisk bedömning. - Samla ett nytt makroskopiskt livskraftigt tumörprov från operationen. Se till att provet är nedsänkt i transportmedium (antingen 1x adDMEM/F12 eller 1x Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning (DPBS)) i ett sterilt 50 ml koniskt rör eller urinprovsburk under transitering.
OBS: Vid vissa kliniska centra kan vävnad behöva transporteras till ett patologilaboratorium för att tilldelas för forskning. Under dessa omständigheter rekommenderas att antibiotika och antimykotika tillsätts till transportmediet. Vävnad kan lagras vid 4 ° C i basalmedium i upp till 24 timmar efter operationen och genererar fortfarande livskraftiga organoidkulturer. - Registrera provdetaljer, inklusive vävnadsvikt (g eller mg), provbeskrivning och detaljer om eventuella blod- och urinprover på patientprovbehandlingsbladet (tilläggsfil).
- Ta försiktigt bort transportmediet och ersätt det med 10 ml basalmedia. Låt tumörvävnaden sätta sig genom tyngdkraften.
OBS: Transportmedium betraktas som kliniskt avfall och måste samlas i en lämpligt märkt avfallsbehållare i en lämplig mängd dekontamineringslösning. När vätskan har dekontaminerats kemiskt kan den kasseras enligt institutionella riktlinjer för farligt avfall. - Ta bort tumörvävnaden med pincett och lägg den i en steril 90 mm petriskål (figur 2A). Registrera vävnadens vikt i mg eller g på det kliniska provbehandlingsarket och dissektionsgallret (figur 2B).
- Ta bort icke-cancerös vävnad (inklusive fettvävnad) och makroskopiskt synliga nekrotiska regioner med sterila pincett och engångsskalpellblad monterat på skalpellhandtaget (Figur 2C). Tvätta tumörbitar 1-2 gånger med kall 1x DPBS. Samla tumörbitarna och överför dem till en ny steril 90 mm petriskål.
OBS: Eftersom skalpellbladen är vassa, var försiktig när du skär manuellt. Tumörintilliggande fettvävnad kan identifieras av tydligt mjuka, gelatinösa, bleka områden omedelbart intill den visuella tumöromkretsen. Makroskopisk fettvävnad och fokalt mörka regioner som representerar områden av nekros kommer att kräva personlig bedömning vid dissekering från en excisionell blåstumörbiopsi. - Ta ett fotografi, rita ett diagram över vävnad och planera vävnadsdissektion på ett kliniskt bearbetningsnät (figur 2B och figur 2C).
OBS: Det är viktigt att hålla en visuell rekord och grov skiss av de enskilda makroskopiska tumöregenskaperna och dissektionen för varje enskilt fall. - Dissekera tumörvävnadsbitar och allokera för histopatologiska (figur 2D) och molekylära analyser (figur 2E).
- För histologiska analyser: Placera cirka 50 mg tumörvävnad i en märkt engångsplasthistologikassett (Figur 2D). Sänk ner histologikassetten i en behållare med 5x till 10x volym 10% neutralt buffrat formalin (NBF). Inkubera över natten på RT.
- Ta bort 10% NBF och ersätt med 70% (w / w) etanol nästa dag för förvaring vid 4 ° C tills vävnaden kan bearbetas med rutinmässigt vävnadsbehandlingsprotokoll
- För molekylära analyser: Snäppfrys minst en 1-3 mm3 tumörbit i en RNase/DNasfri 1,5 ml kryovial med flytande kväve och förvara vid -80 °C (Figur 2E).
- Dispensera 5 ml organoidmedium (tabell 1) i 90 mm petriskål som innehåller de återstående tumörbitarna.
- Hacka vävnad mekaniskt så fint som möjligt (0,5-1 mm3 stycken eller mindre) med ett sterilt #10 skalpellblad.
OBS: Större fragment eller hela bitar av vävnad (>3 mm3) tar betydligt längre tid att smälta och minskar provets livskraft. Utelämna ovanstående steg om vävnaden är uppdelad och fragmenten är tillräckligt små för att pipettera med en 5 ml serologisk pipettspets. - Överför finmalen vävnad till ett 50 ml koniskt rör och tillsätt 4 ml organoidmedium, 1 ml 10x kollagenas/hyaluronidas och 0,1 mg/ml deoxiribonukleas 1 (DNas 1) för att undvika cellklumpning.
OBS: Enzymlösningen ska vara nyberedd varje gång. Öka mediets volym till ungefär 10x den synliga mängden tumörfragment för stora prover. - Inkubera den malet tumörvävnaden och enzymlösningen i 1-2 timmar på en orbital shaker eller rotator (150 rpm) i en inkubator (37 ° C, 5% CO2) för att dissociera fragment i en cellsuspension och bryta ner kollagener. Detta kan kontrolleras med histologisk analys (figur 3A).
OBS: Om mängden vävnad är stor eller ingen uppenbar dissociation observeras efter 1-1,5 timmar, öka inkubationstiden och kontrollera dissociationsnivån var 30: e minut. Tidpunkten för detta steg beror på provet och måste bestämmas empiriskt varje gång. En märkbart tydligare lösning med vävnadsfragment som inte kan urskiljas för ögat (eller mycket få fragment) indikerar framgångsrik matsmältning. - Avsluta matsmältningen med tillsats av 2x volym (20 ml) basalmedium till provet.
- Centrifugera provet vid 261 x g i 5 min vid rumstemperatur (RT), aspirera och kassera supernatanten.
- För att lysförorena röda blodkroppar (RBC), återsuspendera pelletsen erhållen från ovanstående steg i 5 ml ammoniumklorid-kaliumbuffert (ACK). Inkubera röret vid RT i 3 minuter eller tills fullständig lys av RBC: erna ses (suspensionen blir klar).
OBS: Om RBC inte observeras som en liten röd klump i pelletsen kan detta steg utelämnas. - Tillsätt 20 ml av basalmediet i röret. Centrifugera röret vid 261 x g i 5 min vid RT och aspirera supernatanten.
- Vid detta steg, placera en 10 ml alikvot av 2x och 1x organoid medium i ett 37 ° C vattenbad för att värma.
- Filtrera provet genom en förvåt reversibel 100 μm sil i ett nytt 50 ml rör för att avlägsna stort olösligt material.
OBS: Stort osmält material (>100 μm) som samlas in av filtret kan innehålla celler av intresse och kan odlas i 90 mm petriskål eller 6-brunns cellodlingsplatta i organoidmedium för att härleda 2D-kulturer (figur 1 (steg 5) och figur 3B). - Filtrera eluatet genom en förvåt reversibel 37 μm sil för att samla enstaka celler och små kluster för isolering av encell och immunceller (Tube 37-1; Figur 1 (steg 6) och figur 3B).
OBS: Utbytet av tumörceller under detta steg kan ökas genom att passera den filtrerade cellsuspensionen genom silen igen. - Vänd silen på 37 μm och använd 10 ml basala medier för att samla små och måttliga kluster (37-100 μm) (rör 70-1; Figur 3B).
- Fyll på vart och ett av de nya 50 ml rören (rör 70-1 och 37-1) med DPBS till 40 ml. Centrifugera suspensionen vid 261 x g i 5 min vid RT. Aspirera och kassera supernatanten.
- Tillsätt 10 ml basalmedia till rör 37-1 och räkna cellerna med trypanblått uteslutningsfärgämne och en automatiserad cellräknare (enligt tillverkarens specifikationer). Bestäm cellnummer och livskraft hos celler.
- Centrifugera resten av provet vid 261 x g i 5 min vid RT. Aspirera mediet och ersätt det med cellfrysningslösning eller basala medier innehållande 10% fetalt bovint serum (FBS), 1% penicillin /streptomycin och 10% dimetylsulfoxid (DMSO).
- Placera prover i 1,5 ml kryovialer och förvara dem i en cellfrysbehållare. Överför omedelbart behållaren till en frys på -80 °C för optimal kylningshastighet. Efter frysförvaring över natten vid -80 °C, överför kryovialerna till kryogen vätske- eller luftfaslagring (-196 °C) för långvarig lagring.
- Resuspend celler från rör 70-1 med 500 μL förvärmt 2x organoidmedium.
OBS: Sådddensiteten måste vara hög för framgångsrik organoidförökning. Volymen av det organoida mediet och därefter BME bör ändras empiriskt på antalet celler isolerade från filtreringssteget. Detta steg ger en relevant utgångspunkt baserat på studier i vårt laboratorium. - Tillsätt BME till celler (i förhållandet 1: 1 med 2x organoidmedium) med iskalla P1000 sterila filterpipettspetsar och blanda försiktigt för att suspendera celler. Pipetterar snabbt och noggrant 100 μL rekonstituerade celler / BME-blandning till brunnar i en ultralåg fastsättning platt botten 96-brunnsplatta. Placera 96-brunnsplattan i en inkubator (37 ° C, 5% CO2) i 20-30 minuter för att stelna.
- Lägg till 1: 2-förhållandet 1x organoidmedium ovanpå BME-cellsuspension beroende på den empiriskt bedömda volymen. Tillsätt i den relevanta utgångspunkten 50 μL 1x organoidmedium ovanpå 100 μL rekonstituerade celler/BME-blandning.
- Placera 96-brunnsplattan i en inkubator (37 °C, 5 % CO2) i 20 min för att balansera.
- Ta cellodlingsplattan ur inkubatorn och montera den på en provhållare på scenen i ett mikroskop. Bedöm organoider visuellt under faskontrast eller ljusfältsinställningar.
OBS: Bilder förvärvas bäst av ett inverterat faskontrastmikroskop utrustat med differentialinterferens (DIC) optik, digitalkamera och tillhörande programvara för att observera bildandet av sfäriska PDO: er som förberedelse för slutpunktsanalys.- Om distinkta kluster är synliga, placera cellodlingsplattan i en elektroniskt uppvärmd mikroskopkammare på scenen (37 ° C, 5% CO2) för levande cellavbildning under de första 24-72 h.
- Se till att den flexibla uppvärmda kragen är fäst vid linsen för att minska termisk drift och luftfuktaren är fylld med dH20.
- Utför den första avbildningen med en 4x eller 10x objektivlins (N.A. 0.30, W.D. 15.2 mm). Time-lapse var 5-10 minut på faskontrastinställningen.
- Kontrollera om den framgångsrika isoleringen kännetecknas av utseendet på >10 självorganiserande organoider per brunn efter en 24-72 timmarsperiod.
- Låt kulturer fortsätta i upp till två veckor om organoidantalet är lågt (Figur 3C).
- Fyll på mediet var 2-3: e dag med 50 μL förvärmt organoidmedium för att fylla på utarmade tillväxtfaktorer och total volym.
- Hämta bilder (enligt beskrivningen i steg 3.30) på dag 1, 2 och 3 (timelapse-serier) och på dag 5, 7 och 10 innan de passerar (om tillämpligt).
OBS: Organoider (observerade som generellt runda strukturer där du inte kan se kanterna på enskilda celler) passeras vanligtvis 7-10 dagar efter installationen, beroende på isoleringens framgång. Före eller efter passering kan organoider behandlas med cytotoxiska eller terapeutiska medel i upp till 6 dagar och läkemedelssvaret mäts med hjälp av cellviabilitets- och cytotoxicitetsanalyser. Alternativt kan organoider hämtas från BME (med användning av 1 mg / ml dispas) och kryokrediterad (biobanked), beredd för molekylär testning eller inbäddad och bedömd histologiskt (figur 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
3D-organoider etablerades framgångsrikt från humana blåscancerpatienter TURBT och cystektomivävnader. Kortfattat belyser denna teknik en snabb bildning av 3D-multicellulära strukturer som är både livskraftiga och lämpliga för andra slutpunktsanalyser såsom histologisk utvärdering, molekylär karakterisering (genom immunohistokemi eller kvantitativ realtids-PCR) och läkemedelsscreening. Under proceduren (figur 1) kunde de olika eluaterna under våra filtreringsfaser (figur 1, steg 1-6) utnyttjas för att kryokonservera enskilda celler för isolering av tumörinfiltrerande immunceller (TILs) och generering av en enda cellbiobank. Förfarandet gör det möjligt för flera aspekter av en heterogen primär tumör att biobankas på lämpligt sätt och på ett sätt som kan spåras mellan patienter (figur 2A, B), inklusive histologi (figur 2C, D) och färskfrysta prover (figur 2E).
En 2 timmars matsmältning med kommersiellt tillgänglig kollagenas / hyaluronidas och DNase 1 möjliggör tillräcklig matsmältning av 0,5-1 mm3 bitar av den mer komplexa cystektomibiopsivävnaden, inklusive de neoplastiska cellerna i lamina propria och muskelskikt i urinblåsan (Figur 3A). Större fragment efter matsmältningen (>100 mikron) har visat sig lämpliga för odling i standardvävnadsodlingsplattor av alla storlekar för isolering av nya 2D-kulturer (figur 3B). Emellertid krävs omfattande molekylär karakterisering för att validera cancerursprunget för sådana cellinjer. Organoider som framgångsrikt genereras med detta protokoll genomgår processer för dynamisk självmontering, inklusive faser av aggregering, komprimering och slutlig bildning, varigenom de bildas i snäva cellulära strukturer (figur 3C) som kan bedömas för svar på standardbehandlingar. Figur 3C belyser organoidernas effektiva självmonteringsegenskaper. Histologiskt rekapitulerar dessa strukturer den ursprungliga patienttumören (Figur 4). Organoider som genereras i denna procedur är lämpliga för en mängd olika ändamål, inklusive ytterligare karakterisering, biobankning och läkemedelseffekttestning (figur 5).
Figur 1: Schematisk representation av organoidvävnadsodling från insamling av tumörprover från kirurgi till endpointanalyser. URN, enhetsrekordnummer; TIL, Tumörinfiltrerande lymfocyt. (1) Vävnaden mals mekaniskt i en 90 mm petriskål så fint som möjligt med ett sterilt skalpellblad (0,5-1 mm3 stycken). (2) Tumörbitar resuspenderas i ett enzymatiskt dissociationsmedium bestående av organoidmediet, kollagenas / hyaluronidas och DNas 1. (3) Malet tumörvävnad och enzymlösning inkuberas i 1–2 timmar på en rotatorinkubator (150 rpm, 37 °C, 5 % CO2) och pelleteras därefter (4) för att dissociera fragment till en finare cellsuspension. Provet genomgår filtrering genom förvåta reversibla (5) 100 μm och (6) 37 μm silar i nya 50 ml rör för att avlägsna stora olösliga material och isolera 37-100 μm kluster. Efter (7) centrifugering av fraktionen isolerad från baksidan av 37 μm-silen suspenderas cellklusterna i (8) BME och organoidmedier före (9) levande cellavbildning. Skapad med BioRender.com. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Steril tumörvävnadshantering för organoidetablering. (A) Vid excision och transport till laboratoriet placeras provet i en steril petriskål, vägs och dissekeras därefter. (B) Ett provdissektionsnät används för att markera provexemplaret för olika processer. Ett exempel på dissektion visas i (C) där prover tas från tumörperiferin så mycket som möjligt för att undvika områden med central nekros och kommenteras (infälld) innan (D) grossing vävnaden före vävnadsfixering. Skalstång: 6 mm. Infälld skalstång: 4 mm. (E) Små färska fragment tas för efterföljande frysning och biobankning. Skalstång: 5 mm. Element i denna bild skapades med BioRender.com. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Enzymatisk härledning och dynamisk sammansättning av blåstumörorganoider. (A) Representativa bilder av hematoxylin och eosin (H & E) färgad föräldrablåscancervävnad (patologi granskad som T3bN0) vid omedelbar fixering (vänster) och 2 timmar efter matsmältningen med 1x kollagenas / hyaluronidas (höger). Skalstång: 500 μm. Infälld skalstång: 50 μm. (B) Representativa bilder av isoleringarna >100 μm, 37-1 och 70-1 (dag 2). Skalstaplar anges i bilden. (C) Representativa bilder visas för organoidisolering av blåscancer under 48 timmar och dag 7 organoid H &E-färgning. Skalstång: 50 μm. Skalbar för bilden i insatsen: 20 μm. DIC: differentiell interferenskontrast. Delar av denna bild skapades med BioRender.com Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Blåscancer-härledda organoidkulturer upprätthåller den histologiska arkitekturen hos föräldratumörer. Representativ H&E-bild av låggradig blåscancer (Ta) och motsvarande ljusfältsbild av organoid vid dag 7 av kulturen. Den högra panelen visar tillhörande H&E-färgning av dag 7 organoid. Skalstänger anges i figuren. LG: låg kvalitet, BC: blåscancer, H & E: hematoxylin och eosin och DIC: differentiell interferenskontrast. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Nedströms applikationer med patient-härledda organoider från blåscancer. Skapad med BioRender.com. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Tillsats | Slutlig koncen. | Lager Conc. | Lösningsmedel | |
| Basala medier | Glutamax | 2 mM | 1 M | NaCl |
| HEPES | 10 mM | 1 M | NaCl/NaHPO4 buffrad lösning | |
| Kosttillskott för komplett media | R-spondin 1 konditionerade medier | 5 % v/v | Konditionerade medier | Avancerad DMEM/F-12 |
| Noggin konditionerade media | 5 % v/v | Konditionerade medier | Avancerad DMEM/F-12 | |
| Fonden | 50 ng/ml | 0,5 mg/ml | PBS/0,1 % BSA | |
| FGF-10 | 20 ng/ml | 100 μg/ml | PBS/0,1 % BSA | |
| FGF-2 | 5 ng/ml | 50 μg/ml | PBS/0,1 % BSA | |
| Nikotinamid | 10 mM | 1 M | 1 g i 8,2 ml ddH20 | |
| N-acetyl-L-cystein | 1,25 mM | 500 mM | 40 ml ddH20 | |
| En 83-01 | 0,5 μM | 50 mM | DMSO | |
| SB202190 | 10 μM | 50 mM | DMSO | |
| Y27632 | 10 μM | 100 mM | ddH20 | |
| B-27 tillsats | 1X | 50x | ||
| Prostaglandin E2 | 1 μM | 10 mM | DMSO | |
| Primocin | 100 μg/ml | 50 mg/ml | ||
Tabell 1: Kosttillskott som används för basala och kompletta organoida medier
Kompletterande fil: Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Medan 3D-organoidprotokoll som härrör från blåscancervävnad fortfarande är i sin linda, är de ett område för aktiv forskning och klinisk undersökning. Här beskrivs ett optimerat protokoll för att framgångsrikt etablera PDOs för blåscancer som är lämpliga för både NMIBC- och MIBC-prover. Detta arbetsflöde integreras parallellt i sjukhusbaserade kliniska prövningar och överväger periodisering av biobanksprov, inklusive histologisk provbehandling och färskfryst vävnadsbankning, vilket är ett viktigt övervägande för kliniska organoidrörledningar. Detta protokoll bygger på befintliga metoder och ger en konsoliderad metod för att bygga en pipeline för organoid precisionsmedicin.
Den nuvarande framgångsgraden för detta protokoll - som andra - är cirka 70%25. Det förväntas att detta kommer att förbättras när isoleringstekniker och karakterisering av blåscancertumörmikromiljön utvecklas. Som förväntat påverkar kvaliteten på det ursprungliga provet framgångsgraden och är ett viktigt begränsande steg. Prover erhållna från kemoterapi naiva patienter ger den högsta framgångsgraden, medan de från patienter som har fått neoadjuvant kemoterapi kan ha ett minskat antal livskraftiga celler26,27. Vanligtvis ger blåscancerprover (från både TURBT och cystektomier) en riklig mängd prover med hög tumörcellalitet. Detta möjliggör robust generering av organoider som sträcker sig mellan 30-100 μm inom en tillväxtperiod på 24-72 timmar (givet att vissa <40 μm kluster behålls i filtreringsstegen). Viktigt är att heterogeniteten som observerats i organoidprover (dvs. cystiska formationer och tätare strukturer) indikerar att detta protokoll ger förhållanden som är lämpliga för att härleda heterogena tumörcellpopulationer.
Vårt optimerade protokoll kan utföras på begränsat utgångsmaterial (vilket är fallet från vissa elektiva operationer, inklusive TURBT-procedurer eller prover som förvärvats från patienter vid en klinisk prövning), vilket möjliggör införlivande av flera analyser för att maximera provvärdet. Detta protokoll innehåller metoder för att beskriva steg för att odla 2D-odling från främmande tumörceller av intresse som kan finnas i stora olösliga vävnader som bearbetas under det första filtreringssteget. Liksom andra forskargrupper som föreslår bearbetning av prover inom 24 timmar efter operationen28,29 observeras att vävnadshypoxi som uppstår inom denna tidsram inte utesluter att generera livskraftiga organoider. Optimering krävs för att bestämma densiteten hos cellsådd (inhemska kluster) per brunn. Enligt vår erfarenhet kan alltför många kluster resultera i dålig tillväxt av kulturerna, medan kulturer med låg visuell densitet kan leda till celldöd. Detta kan bestämmas av användaren empiriskt i samband med deras volymer som kan spädas inom ett intervall efter behov. Dessutom innehåller TURBT-prover ofta brända kanter på grund av resektionsprocessen, som är uppenbara som framträdande nekrotiska regioner. Ett kritiskt steg är noggrann isolering av makroskopisk tumörvävnad och efterföljande dissektion. Detta är av största vikt för att härleda livskraftiga kulturer och måste kommuniceras med det kirurgiska teamet. I vissa fall kan detta vara en första begränsning av förfarandet.
En ytterligare begränsning av den nuvarande tekniken är frånvaron av tumörmikromiljön parallellt med organoiderna. En nödvändig utveckling kommer att vara framtida samodlingssystem för att öka cellulär komplexitet och tillhandahålla andra komponenter i tumörmikromiljön (dvs. stroma och immunceller). Eftersom organoider definieras som självorganiserande strukturer med förmågan att självföreviga sin tillväxt, kommer ytterligare arbete att krävas för att belysa de diskreta cancerstamcellerna (såsom CD44 och CD49) vilket kan möjliggöra förbättrade in vitro-tillväxtegenskaper 31,32,33. Att med säkerhet fastställa att PDO: erna härrör från tumörvävnad är kritiskt, eftersom bidraget från normala urotelceller i funktionella och molekylära analyser kommer att förvirra undersökningar av läkemedelsresistens. Ibland är tumörursprunget för urotelcellerna i PDO: erna tydligt på grund av användningen av metastatisk vävnad eller papillära tumörer (som är fallet här; se figur 4), men när källvävnaden skärs ut från blåsans slemhinna och därmed innehåller marginaler av det godartade urotelet är det viktigt att bekräfta att de resulterande PDO: erna består av tumörceller med hjälp av molekylära tekniker. Således krävs immunohistokemiska och genomiska jämförelser mellan de etablerade organoiderna och den primära tumören från vilken de härleddes30.
När det gäller antalet och storleksfördelningen av organoiderna per brunn är det svårt att upprätthålla enhetlig pläteringstäthet av 3D-organoider för cytotoxicitetsanalys. Detta mildras något genom att isolera definierade intervall med hjälp av filtren, men det är fortfarande en begränsning om små kluster och större organoider isoleras i samma brunn. Stora partikelsorterare kan mildra detta problem men är inte allmänt tillgängliga i medicinska forskningslaboratorier. Icke desto mindre har tekniker som mäter livskraftssignaler före och efter behandling använts framgångsrikt i organoider i blåscancer34. När denna teknik utvecklas kommer detta att göra det möjligt för forskare att utveckla ett bibliotek med blåscancer-PDO: er med varierande genomiska profiler och farmakodynamiska svar som kan utforskas för att undersöka nya terapier. Dessutom tillåter provinsamlingsförfarandet och dissociationsmetoden som beskrivs här samtidiga preparat för tumörrumslig profilering, multiparametrisk flödescytometri och encells-RNA-sekvensering. Sammantaget möjliggör detta ett brett spektrum av kraftfulla slutpunkter som kan sammanföras för att utforska en patients tumörheterogenitet och tillämplighet av läkemedel som immunterapier.
Sammanfattningsvis beskriver vi ett protokoll för att etablera och utvärdera kulturer av 3D-patient-härledda blåscancerorganoider i tillkomsten av precisionsmedicinska slutpunkter. Det är viktigt att notera att stegen och anteckningarna som beskrivs här är rutinmässiga metoder som används för att isolera PDO: er för blåscancer i vårt laboratorium. Odlingsmediet som användes i vårt förfarande beskrevs ursprungligen för prostatacancerceller och har nu visat sig vara lämpligt för odling av blåscancer. Viktigt är att detta protokoll är centraliserat, lämpligt för rutinmässig användning i laboratorier och i stort sett tillämpligt över urologiska cancertyper. I kombination med högkvalitativ molekylär fenotypning och läkemedelsresponsslutpunkter kommer denna teknik att ge ett användbart verktyg för att snabbt utforska den exakta terapeutiska hanteringen av patienter med blåscancer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Vi erkänner det tekniska biståndet från Translational Research Institute Histology core och Biological Resource Facility. Denna forskning stöddes av finansiering från ett Princess Alexandra Research Foundation-pris (I.V., E.D.W.) och Medical Research Future Fund (MRFF) Rapid Applied Research Translation Program (Centre for Personalised Analysis of Cancers (CPAC; E.D.W., I.V.). Translational Research Institute får stöd från den australiensiska regeringen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.2 mL cryogenic vial | Corning | 430487 | |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | Sigma-Aldrich | T9661-500EA | polypropylene single-use tube |
| 100 µM reversible strainer | STEMCELL Technologies | #27270 | |
| 100 mm Petri dish | Corning | 430167 | |
| 10x Collagenase/ Hyaluronidase | STEMCELL Technologies | #07912 | |
| 37 µM reversible strainer | STEMCELL Technologies | #27250 | |
| 37°C incubator | |||
| 37°C water bath | |||
| 50 mL falcon tube | Corning | CLS430829-500EA | |
| 6-well plate | Corning | CLS3516 | |
| 70% (w/w) ethanol | |||
| -80°C freezer | |||
| 96 well ultra low attachment plate (Black) | Sigma-Aldrich | CLS3474-24EA | |
| A 83-01 | BioScientific | 2939 | Prevents the growth-inhibitory effects of TGF-β |
| ACK lysis buffer | STEMCELL Technologies | #07850 | |
| adDMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12634028 | Base medium |
| Animal-free recombinant EGF | Sigma-Aldrich | 518179 | Growth factor |
| Automated cell counter (TC20) | Bio-rad | 1450102 | |
| B27 additive | Gibco | 17504044 | Increases sphere-forming efficiency |
| Cell Counting Slides | Bio-rad | 1450015 | |
| Centrifuge | Eppendorf | EP022628188 | |
| Computer system | |||
| CryoStor CS10 | STEMCELL Technologies | #07930 | Cell freezing solution |
| Dispase II, powder | Thermofisher | 17105041 | To enzymatically disrupt Matrigel |
| DNAse 1 | STEMCELL Technologies | #07900 | |
| DPBS | Thermofisher | 14190144 | |
| Dry and wet ice | |||
| Esky | |||
| Farmdyne (Iodine 16g/L) | Ecolab | ||
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma | HT501128 | Histological tissue fixative |
| Glutamax (L-alanine-L-glutamine) | Invitrogen | 35050061 | Source of nitrogen for the synthesis of proteins, nucleic acids |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | All-purpose buffer |
| Histology cassette | ProSciTech | RCH44-W | |
| Human FGF-10 | Peprotech | 100-26-25 | Growth factor |
| Human FGF-2 | Peprotech | 100-18B-50 | Growth factor |
| Liquid nitrogen | |||
| Matrigel (Growth Factor Reduced (GFR), phenol red-free, LDEV free) | In Vitro Technologies | 356231 | Basement membrane extract (BME) |
| Mr. Frosty freezing container | ThermoFisher | 5100-0001 | cell freezing container |
| N-acetyl-L-cysteine (NAC) | Sigma | A7250 | Anti-oxidant required to protect against ROS-induced cytotoxicity |
| Nicotinamide | Sigma | N0636-100G | SIRT-1 inhibitor |
| NikonTs2U inverted microscope | Nikon | MFA510BB | |
| NIS-Elements Advanced Research | Nikon | MQS31000 | |
| Noggin conditioned media | In-house | BMP inhibitor | |
| Pipetboy acu 2 | Integra | 155000 | |
| Pipettes (p20, p100, p1000) with tips | |||
| Primocin | Jomar Bioscience | ant-pm2 | Combination of antibacterial and antifungal compounds to protect cell cultures from contaminations |
| Prostaglandin E2 (PGE2) | Tocris | 2296 | support proliferation of cells |
| Rotary tube mixer | Ratek | RSM7DC | |
| R-spondin 1 conditioned media | In-house | WNT signalling regulator | |
| SB202190 | Jomar Bioscience | s1077-25mg | Selective p38 MAP kinase inhibitor |
| Scale | |||
| Scalpel handle | Livingstone | WBLDHDL03 | |
| Scalpels, #11 blade | Medical and Surgical Requisites | EU-211-1 | |
| Serological pipettes (5, 10, 25 mL) | |||
| Specimen Waste Bags | Medical Search | SU09125X16 | |
| Urine specimen jar | |||
| Y27632 | Jomar Bioscience | s1049-10mg | Selective ROCK inhibitor. Increases survival of dissociated epithelial cells |
References
- Saginala, K., et al.
- Lindskrog, S. V., et al. An integrated multi-omics analysis identifies prognostic molecular subtypes of non-muscle-invasive bladder cancer. Nature Communications. 12 (1), 2301 (2021).
- Isharwal, S., Konety, B. Non-muscle invasive bladder cancer risk stratification. Indian Journal of Urology. 31 (4), 289-296 (2015).
- Lozano, F., Raventos, C. X., Carrion, A., Trilla, E., Morote, J. Current status of genetic urinary biomarkers for surveillance of non-muscle invasive bladder cancer: a systematic review. BMC Urology. 20 (1), 99 (2020).
- Batista, R., et al. TERT promoter mutation as a potential predictive biomarker in bcg-treated bladder cancer patients. Internation Journal of Molecular Science. 21 (3), 947 (2020).
- Patel, V. G., Oh, W. K., Galsky, M. D. Treatment of muscle-invasive and advanced bladder cancer in 2020. Cancer Journal for Clinicians. 70 (5), 404-423 (2020).
- Williams, S. B., et al. Estimated costs and long-term outcomes of patients with high-risk non-muscle-invasive bladder cancer treated with bacillus calmette-guérin in the veterans affairs health system. JAMA Network Open. 4 (3), 213800 (2021).
- Zhu, S., et al. Preclinical models for bladder cancer research. Hematology/Oncology Clinics of North America. 35 (3), 613-632 (2021).
- lvarez-Maestro, M., Guerrero-Ramos, F., Rodríguez-Faba, O., Domínguez-Escrig, J. L., Fernández-Gómez, J. M. Current treatments for BCG failure in non-muscle invasive bladder cancer (NMIBC). Actas Urológicas Españolas (English Edition). 45 (2), 93-102 (2021).
- Berry, D. L., et al. Treatment decision making in patients with bladder cancer. Bladder Cancer. 1 (2), 151-158 (2015).
- Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nature Protocols. 11 (2), 347-358 (2016).
- Kato, M., Sasaki, T., Inoue, T. Current experimental human tissue-derived models for prostate cancer research. International Journal of Urology. 28 (2), 150-162 (2021).
- Liu, L., Yu, L., Li, Z., Li, W., Huang, W. Patient-derived organoid (PDO) platforms to facilitate clinical decision making. Journal of Translational Medicine. 19 (1), 40 (2021).
- Joshi, A., Roberts, M. J., Alinezhad, S., Williams, E. D., Vela, I. Challenges, applications and future directions of precision medicine in prostate cancer - the role of organoids and patient-derived xenografts. British Journal of Urology International. 126 (1), 65-72 (2020).
- Pan, C. X., et al. Development and characterization of bladder cancer patient-derived xenografts for molecularly guided targeted therapy. PLoS One. 10 (8), 0134346 (2015).
- Gopinathan, A., Tuveson, D. A. The use of GEM models for experimental cancer therapeutics. Disease models & mechanisms. 1 (2-3), 83-86 (2008).
- Kemp, C. J. Animal models of chemical carcinogenesis: driving breakthroughs in cancer research for 100 years. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (10), 865-874 (2015).
- Day, C. P., Merlino, G., Van Dyke, T. Preclinical mouse cancer models: a maze of opportunities and challenges. Cell. 163 (1), 39-53 (2015).
- Kobayashi, T., Owczarek, T. B., McKiernan, J. M., Abate-Shen, C. Modelling bladder cancer in mice: opportunities and challenges. Nature Reviews Cancer. 15 (1), 42-54 (2015).
- Liu, W., et al. Conditional reprogramming: Modeling urological cancer and translation to clinics. Clinical Translational Medicine. 10 (2), 95 (2020).
- Yoshida, G. J. Applications of patient-derived tumor xenograft models and tumor organoids. Journal of Hematological Oncology. 13 (1), 4 (2020).
- Kim, J., Koo, B. K., Knoblich, J. A. Human organoids: model systems for human biology and medicine. Nature Reviews Molecular Cellular Biology. 21 (10), 571-584 (2020).
- Marshall, L. J., Triunfol, M., Seidle, T. Patient-derived xenograft vs. organoids: a preliminary analysis of cancer research output, funding and human health impact in 2014-2019. Animals. 10 (10), 1923 (2020).
- Gao, D., et al. Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
- Lee, S. H., et al. Tumor evolution and drug response in patient-derived organoid models of bladder cancer. Cell. 173 (2), 515-528 (2018).
- Kim, I. H., Lee, H. J. Perioperative immunotherapy for muscle-invasive bladder cancer. Translational Andrology and Urology. 9 (6), 2976-2985 (2020).
- Raphael, M. J., Booth, C. M. Neoadjuvant chemotherapy for muscle-invasive bladder cancer: Underused across the 49(th) parallel. Canadian Urological Association Journal. 13 (2), 29-31 (2019).
- Tiriac, H., French, R., Lowy, A. M. Isolation and characterization of patient-derived pancreatic ductal adenocarcinoma organoid models. Journal of Visualized Experiments. (155), e60364 (2020).
- Pleguezuelos-Manzano, C., et al. Establishment and culture of human intestinal organoids derived from adult stem cells. Current Protocols in Immunology. 130 (1), 106 (2020).
- Fusco, P., et al. Patient-derived organoids (PDOs) as a novel in vitro model for neuroblastoma tumours. BMC Cancer. 19 (1), 970 (2019).
- Mullenders, J., et al. Mouse and human urothelial cancer organoids: A tool for bladder cancer research. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (10), 4567-4574 (2019).
- Vasyutinv, I., Zerihun, L., Ivan, C., Atala, A. Bladder organoids and spheroids: potential tools for normal and diseased tissue modelling. Anticancer Research. 39 (3), 1105-1118 (2019).
- Santos, C. P., et al. Urothelial organoids originating from Cd49fhigh mouse stem cells display Notch-dependent differentiation capacity. Nature Communications. 10 (1), 4407 (2019).
- Whyard, T., Liu, J., Darras, F. S., Waltzer, W. C., Romanov, V. Organoid model of urothelial cancer: establishment and applications for bladder cancer research. Biotechniques. 69 (3), 193-199 (2020).
