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Biology

पत्ती बीटल के मेजबान-आंत माइक्रोबायोटा इंटरैक्शन स्टडीज के लिए ऊतक सुसंस्कृत रोपाई के साथ एक्सनिक कीड़े तैयार करना और पालन करना

Published: October 8, 2021 doi: 10.3791/63195
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 1
1State Key Laboratory of Biocatalysis and Enzyme Engineering, School of Life Sciences, Hubei University, 2Institute of Plant Protection, Wuhan Institute of Landscape Architecture, 3McKetta Department of Chemical Engineering, University of Texas at Austin

Summary

एक एक्सेनिक कीट प्राप्त करने के लिए, इसकी अंडे की सतह को निष्फल किया जाता है, और हैच किए गए लार्वा को बाद में एक्सेनिक पत्तियों का उपयोग करके पाला जाता है। यह विधि एंटीबायोटिक दवाओं को प्रशासित किए बिना या कृत्रिम आहार विकसित किए बिना एक्सेनिक कीट तैयारी के लिए एक कुशल तरीका प्रदान करती है, जिसे अन्य पत्ती खाने वाले कीड़ों पर भी लागू किया जा सकता है।

Abstract

कीट की हिम्मत को विविध बैक्टीरिया द्वारा उपनिवेशित किया जाता है जो मेजबान के शारीरिक लक्षणों को गहराई से प्रभावित कर सकते हैं। एक एक्सेनिक कीट में एक विशेष बैक्टीरियल तनाव का परिचय आंत माइक्रोबियल फ़ंक्शन को सत्यापित करने और आंत माइक्रोब-होस्ट इंटरैक्शन अंतर्निहित तंत्र को स्पष्ट करने के लिए एक शक्तिशाली तरीका है। एंटीबायोटिक दवाओं का प्रशासन या अंडे की सतहों को स्टरलाइज़ करना कीड़ों से आंत के बैक्टीरिया को हटाने के लिए दो आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले तरीके हैं। हालांकि, कीड़ों पर एंटीबायोटिक दवाओं के संभावित प्रतिकूल प्रभावों के अलावा, पिछले अध्ययनों से संकेत मिलता है कि एंटीबायोटिक दवाओं को खिलाने से आंत के बैक्टीरिया को खत्म नहीं किया जा सकता है। इस प्रकार, रोगाणु मुक्त कृत्रिम आहार आम तौर पर एक्सेनिक कीड़ों को बनाए रखने के लिए नियोजित किए जाते हैं, जो एक थकाऊ और श्रम-गहन प्रक्रिया है जो प्राकृतिक भोजन में पोषण संबंधी घटकों के समान पूरी तरह से नहीं हो सकती है। यहां वर्णित एक पत्ती बीटल (प्लाजियोडेरा वर्सिकोलोरा) के एक्सेनिक लार्वा को तैयार करने और बनाए रखने के लिए एक कुशल और सरल प्रोटोकॉल है। विशेष रूप से, बीटल अंडे की सतहों को निष्फल किया गया था, जिसके बाद रोगाणु मुक्त चिनार के पत्तों का उपयोग एक्सेनिक लार्वा को पीछे करने के लिए किया गया था। कीड़ों की एक्सेनिक स्थिति को संस्कृति-निर्भर और संस्कृति-स्वतंत्र परख के माध्यम से और पुष्टि की गई थी। सामूहिक रूप से, अंडे कीटाणुशोधन और रोगाणु मुक्त खेती के संयोजन से, एक्सेनिक पी वर्सिकोलोरा प्राप्त करने के लिए एक कुशल और सुविधाजनक विधि विकसित की गई थी, जो अन्य पत्ती खाने वाले कीड़ों के लिए आसानी से हस्तांतरणीय उपकरण प्रदान करती है।

Introduction

स्तनधारियों के समान, कीट पाचन तंत्र भोजन पाचन और अवशोषण के लिए एक गुहा है। अधिकांश कीड़े विविध कॉमेन्सल बैक्टीरिया को बंद करते हैं जो उनकी हिम्मत में पनपते हैं और मेजबान1 द्वारा आपूर्ति किए गए पोषण पर रहते हैं। आंत कम्मेन्सल समुदाय का कीड़ों में कई शारीरिक प्रक्रियाओं पर गहरा प्रभाव पड़ता है, जिसमें खाद्य पाचन और विषहरण 2,3,4, पोषण और विकास 5,6,7, रोगजनकों और परजीवी के खिलाफ रक्षा 8,9,10,11, रासायनिक संचार12,13 और व्यवहार14 शामिल हैं , 15. दिलचस्प बात यह है कि कुछ आंत माइक्रोबायोटा संकाय रूप से रोगजनक हो सकते हैं या संक्रमण को बढ़ाने के लिए रोगजनकों पर हमला करके हेरफेर किया जा सकता है, यह दर्शाता है कि आंत के बैक्टीरिया कुछ मामलों में हानिकारक हो सकते हैं16,17,18। आंत बैक्टीरिया जैव प्रौद्योगिकी अनुप्रयोगों और कीट प्रबंधन के लिए एक माइक्रोबियल संसाधन के रूप में भी काम कर सकते हैं। उदाहरण के लिए, फाइटोफैगस और ज़ाइलोफैगस कीड़ों से लिग्नोसेलुलोज-डाइजेस्टिंग बैक्टीरिया का उपयोग जैव ईंधन19 के विकास के लिए पौधों की कोशिकाओं को पचाने के लिए किया गया था। बायोएक्टिव अणुओं को व्यक्त करने वाले इंजीनियर आंत सिम्बियन्स का फैलाव कृषि और वानिकी कीटों और संक्रामक रोगों19,20,21 को प्रसारित करने वाले मच्छरों का प्रबंधन करने के लिए एक उपन्यास और आशाजनक रणनीति है, जिसका उपयोग लाभकारी कीड़ों की फिटनेस में सुधार करने के लिए भी किया जा सकता है। यह दर्शाते हुए कि विवो में एक आंत जीवाणु कैसे व्यवहार करता है, इस प्रकार इसके कार्य का पूरी तरह से लाभ उठाने और विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए इसका शोषण करने के लिए प्राथमिकता माना जाता है।

जानवर आंत 1 में 1 से >1000 सहजीवी माइक्रोबियल प्रजातियों को बंद कर सकतेहैं। नतीजतन, यह सटीक रूप से सत्यापित करना मुश्किल है कि व्यक्तिगत बैक्टीरियल टैक्सा या उनकी असेंबली एक जानवर के अंदर कैसे प्रदर्शन करती है, और क्या मेजबान या उसके माइक्रोबियल भागीदार एक विशिष्ट कार्य चलाते हैं। इसलिए, मोनो- या बहु-प्रजाति उपनिवेशीकरण द्वारा ग्नोटोबायोटिक कीड़े प्राप्त करने के लिए एक्सेनिक लार्वा तैयार करना बैक्टीरियल फ़ंक्शन और कीड़ों के साथ बातचीत की जांच करने के लिए आवश्यक है23. वर्तमान में, एंटीबायोटिक कॉकटेल का प्रशासन और कीट अंडे की सतह को स्टरलाइज़ करना आंतके बैक्टीरिया 14,24,25,26 को हटाने के लिए सामान्य तरीके हैं। हालांकि, एंटीबायोटिक आहार आंत के बैक्टीरिया को पूरी तरह से खत्म नहीं कर सकते हैं और मेजबान कीट शरीर विज्ञान27,28 पर नकारात्मक प्रभाव डालते हैं। नतीजतन, एंटीबायोटिक-उपचारित कीड़ों का उपयोग कुछ आंत बैक्टीरिया की वास्तविक क्षमताओं को अस्पष्ट कर सकता है। सौभाग्य से, अंडों की सतह नसबंदी इस समस्याको नकार सकती है 23,29, जिसका प्रयोगात्मक कीड़ों पर कोई या नगण्य प्रभाव नहीं पड़ता है। इसके अलावा, कृत्रिम आहार पूरी तरह से प्राकृतिक कीट भोजन जैसा नहीं हो सकता है, और कृत्रिम आहार विकसित करना एक महंगा और श्रम-उपभोग करने वाली प्रक्रिया30,31 है।

विलो लीफ बीटल, प्लागियोडेरा वर्सिकोलोरा (लाइकरिंग) (कोलोप्टेरा: क्रिसोमेलिडे), एक व्यापक पत्ती खाने वाला कीट है जो मुख्य रूप से सैलिकियस पेड़ों पर फ़ीड करता है, जैसे विलो (सैलिक्स) और चिनार (पॉपुलस एल। 32,33. यहां, विलो पत्ती बीटल का उपयोग एक प्रतिनिधि पत्ती खाने वाले कीट के रूप में किया गया था ताकि रोगाणु मुक्त कीट तैयार करने और पालन करने के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित किया जा सके। हमने निष्फल अंडों से पी वर्सिकोलोरा एक्सेनिक लार्वा को पीछे करने के लिए रोगाणु मुक्त चिनार पत्तियों को प्राप्त करने के लिए पौधे के ऊतक संस्कृति का शोषण किया। वर्सिकोलोरा लार्वा की एक्सेनिक स्थिति को संस्कृति-निर्भर और संस्कृति-स्वतंत्र परख के माध्यम से सत्यापित किया गया था। यह प्रोटोकॉल एक्सेनिक कीड़े बनाए रख सकता है जो कृत्रिम आहार के साथ कीट पालन की तुलना में जंगली स्थिति की बेहतर नकल करते हैं। इससे भी महत्वपूर्ण बात यह है कि यह विधि बहुत कम लागत पर सुविधाजनक है, जो भविष्य के कीट-आंत माइक्रोबायोटा इंटरैक्शन अध्ययनों के लिए एक्सेनिक कीड़े प्राप्त करने की व्यवहार्यता को बढ़ाती है, विशेष रूप से अच्छी तरह से विकसित कृत्रिम आहार के बिना गैर-मॉडल कीड़ों के लिए।

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Protocol

1. कीट पालन

  1. 27 डिग्री सेल्सियस और 70 की स्थिति में एक विकास कक्ष में पी वर्सिकोलोरा आबादी को बनाए रखें ± 16 घंटे प्रकाश / 8 घंटे अंधेरे के फोटोपरियोड के साथ 5% सापेक्ष आर्द्रता। उन्हें छिद्रित प्लास्टिक के बक्से में टाइल वाले गीले अवशोषित कागज के साथ रखें और उन्हें ताजा चिनार शाखाओं को खिलाएं। नमी बनाए रखने और हर दो दिन में शाखाओं को बदलने के लिए अवशोषित कागज पर साफ पानी का छिड़काव करें।
  2. प्यूपेशन के बाद ओविपोज़िशन के लिए वयस्कों को अलग करें। अधिक अंडे प्राप्त करने के लिए उन्हें निविदा पत्तियां खिलाएं।
  3. नए रखे गए अंडे (24 घंटे के भीतर) एकत्र करें। एक्सेनिक लार्वा तैयार करने के लिए 60 घंटे के लिए नम अवशोषित कागज पर अंडे रखें।
    नोट: नए रखे गए अंडे ~ 72 घंटे के बाद हैच करेंगे। अंडे की सतहों को निष्फल करने का सबसे अच्छा समय हैचिंग से एक दिन पहले है; अन्यथा, सफलतापूर्वक हैच किए गए अंडे की संख्या कम हो जाएगी।

2. रोगाणु मुक्त चिनार संवर्धन

  1. मुराशिगे और स्कूग (एमएस) मध्यम और 1 मिलीग्राम / एमएल α-नेफ्थलीन एसिटिक एसिड (एनएए) स्टॉक समाधान तैयार करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
  2. एमएल एनएए स्टॉक समाधान के 500 एमएल को एमएस माध्यम के 500 मिलीलीटर में जोड़ें, अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए हिलाएं, और ~ 50 एमएल प्रति ऊतक संस्कृति कंटेनर डालें और ठोसकरण की प्रतीक्षा करें।
  3. स्केलपेल, अल्कोहल लैंप और संदंश तैयार करें; बायोसेफ्टी हुड में अल्कोहल लैंप लौ में स्केलपेल और संदंश को निष्फल करें।
  4. वृद्धि के ~ 1 महीने (रोगाणु मुक्त ऊतक-सुसंस्कृत रोपाई) पर चिनार रोपाई से एपिकल कलियों या पार्श्व कलियों के साथ 3-4 सेमी स्टेम सेगमेंट काटें, और उन्हें संस्कृति माध्यम, प्रति कंटेनर एक या दो स्टेम सेगमेंट में डालें।
  5. लगभग 30 दिनों के लिए 16 घंटे प्रकाश / 8 घंटे अंधेरे के फोटोपीरियोड के साथ 25 डिग्री सेल्सियस और 50 ± 10 सीडी प्रकाश तीव्रता पर एक विकास कक्ष में इन स्टेम खंडों को सेते हैं। एक्सेनिक लार्वा को खिलाने के लिए रोगाणु मुक्त पत्तियों का उपयोग करें।

3. अंडे की सतह नसबंदी और एक्सेनिक लार्वा का पालन करना

  1. आटोक्लेव पेट्री डिश, पेंटब्रश, फिल्टर पेपर, आसुत पानी, और एलबी (लुरिया-बर्टानी) अगर माध्यम युक्त एक पेट्री डिश।
  2. एक पेट्री डिश में पक्षपाती अंडे के साथ पत्तियों को रखें, संदंश का उपयोग करके पत्तियों से अंडे को सावधानीपूर्वक हटा दें, और उन्हें एक और पेट्री डिश में स्थानांतरित करें।
    नोट: यह चरण बहुत सावधानी से किया जाना चाहिए क्योंकि अंडे पत्तियों के अनुयायी हैं।
  3. 8 मिनट के लिए 75% इथेनॉल के साथ इन अंडों को धोलें, और बाँझ पानी के साथ धोने को चार बार दोहराएं।
  4. अंडे को एलबी अगर माध्यम पर स्थानांतरित करें ताकि हैचिंग के लिए नमी को संरक्षित किया जा सके।
    नोट: एलबी अगर माध्यम का उपयोग करने से यह सत्यापित करने में मदद मिल सकती है कि कीटाणुरहित अंडा रोगाणु मुक्त है या नहीं।
  5. पेट्री डिश को एक विकास कक्ष में रखें और 24 घंटे के भीतर अंडे सेच करने की प्रतीक्षा करें।
  6. एक जैव सुरक्षा हुड में, एक पेट्री डिश में गीले फिल्टर पेपर के तीन टुकड़ों को टाइल करें, कागज पर रोगाणु मुक्त चिनार के पत्तों को रखें, लार्वा इकट्ठा करें और उन्हें पत्तियों पर रखें, पेट्री डिश को पैराफिल्म के साथ सील करें, और उन्हें 27 डिग्री सेल्सियस पर एक विकास कक्ष में सेते हैं और 70 ± 16 घंटे प्रकाश / 8 घंटे अंधेरे के फोटोपीरियड के साथ 5% सापेक्ष आर्द्रता।
    नोट: ऊतक-सुसंस्कृत पत्तियां नाजुक होती हैं और जल्दी से पानी खो सकती हैं। इस प्रकार, पत्तियों को पेट्री डिश में स्थानांतरित करते समय नम फिल्टर पेपर का उपयोग करना आवश्यक है।
  7. हर दो दिन में पत्तियों को बदलें।
  8. पारंपरिक रूप से पाले गए समूहों के लिए, पत्तियों से अंडे को नम फिल्टर पेपर युक्त पेट्री डिश में स्थानांतरित करें और इन लार्वा को रोगाणु मुक्त चिनार पत्तियों के साथ खिलाएं।

4. संस्कृति-निर्भर परख के साथ एक्सेनिक लार्वा का सत्यापन

  1. बेतरतीब ढंग से रोगाणु मुक्त और पारंपरिक रूप से पाले गए समूहों से तीन 1सेंट, 2 वें, और 3वें इंस्टार लार्वा का चयन करें।
  2. एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत बाँझ कैंची और संदंश के साथ 3वें इंस्टार लार्वा को विच्छेदन करें और माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में उनकी हिम्मत इकट्ठा करें। ट्यूबों में बरकरार 1सेंट और 2इंस्टार लार्वा ले लीजिए।
    नोट: पूरे 1सेंट और 2वें इंस्टार लार्वा को इकट्ठा करें क्योंकि वे विच्छेदन करने के लिए बहुत छोटे हैं, और उनकी हिम्मत बरकरार रखते हैं।
  3. 1.5 एमएल ट्यूबों में फॉस्फेट-बफर खारा और तीन स्टील गेंदों के 100 μL जोड़ें और एक मनका-पिटाई होमोजेनाइज़र का उपयोग करके ऊतकों को होमोजेनेट्स में पीस लें।
  4. एक बाँझ ग्लास फैलाने वाली रॉड का उपयोग करके एलबी अगर माध्यम और प्लेट में होमोजेनेट के 100 μL जोड़ें।
  5. 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटों प्लेस और बैक्टीरियल कालोनियों का निरीक्षण करें।

5. संस्कृति-स्वतंत्र परख के साथ एक्सनिक व्यक्तियों का सत्यापन

  1. एक डीएनए निष्कर्षण किट का उपयोग करके ऊतकों (धारा 4 में प्राप्त) के कुल डीएनए निकालें।
  2. 260 एनएम पर एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके डीएनए एकाग्रता को मापें।
  3. पीसीआर के साथ सार्वभौमिक 16 एस आरआरएनए प्राइमरों का उपयोग करके बैक्टीरियल 16 एस आरआरएनए जीन को बढ़ाएं। 1.1x पीसीआर मास्टर मिश्रण के 18 μL ( सामग्री की तालिका देखें), 27F प्राइमर के 0.5 μL (5'-ACGGATACCTTGTTAC-3'), 1495R प्राइमर के 0.5 μL (5'-ACGGATACCTTGTAC-3') और 100 एनजी टेम्पलेट डीएनए के साथ प्रतिक्रिया प्रणाली सेट करें। 3 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर पीसीआर की स्थिति सेट करें; 30 एस के लिए 95 डिग्री सेल्सियस के 28 चक्र, 1 मिनट के लिए 55 डिग्री सेल्सियस, और 1 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस; 10 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस द्वारा पीछा किया। आगे के विश्लेषण तक पीसीआर उत्पादों को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  4. न्यूक्लिक एसिड डाई के साथ पीसीआर उत्पादों को मिलाएं और 1 एक्स टीएई बफर में 1% एगारोज जेल पर वैद्युतकणसंचलन का उपयोग करके उनका विश्लेषण करें। एक संदर्भ के रूप में एक डीएनए मार्कर के 10 μL का उपयोग करें।
  5. यूवी ट्रांसल्यूमिनेटर के साथ जेल का निरीक्षण करें और 1,500 बीपी के आसपास लक्ष्य टुकड़े की तलाश करें।

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Representative Results

पी वर्सिकोलोरा के जीवन चरणों को चित्रा 1 में दिखाया गया है। वयस्क पुरुष वयस्क मादा (चित्रा 1 ए) की तुलना में छोटा है। खेत में, बीटल अपने अंडों को एक पत्ती पर क्लस्टर करता है; यहां, चार अंडे एक पत्ती (चित्रा 1 बी) से अलग किए गए थे। एक्सेनिक कीट पालन के लिए उपयोग किए जाने वाले चिनार स्टेम सेगमेंट और रोपाई चित्रा 2 में दिखाए गए हैं। एक 3rd इंस्टार लार्वा की आंत चित्रा 3 में दिखाया गया है, और आंत खंडों सफेद कोष्ठक के साथ चिह्नित कर रहे हैं।

यद्यपि किसी भी रोगाणु-मुक्त समूह में कोई जीवाणु कालोनियों को नहीं देखा गया था, लेकिन उन्हें सभी पारंपरिक रूप से पाले गए समूहों (चित्रा 4) में देखा गया था, यह दर्शाता है कि निष्फल अंडों से लार्वा जिन्हें ऊतक-सुसंस्कृत चिनार के पत्तों को खिलाया गया था, उनमें कोई बैक्टीरिया नहीं होता है। ~ 1,500 बीपी पीसीआर बैंड सभी पारंपरिक रूप से पाले गए समूहों में दिखाई दिए। इसके विपरीत, रोगाणु मुक्त समूहों या नकारात्मक नियंत्रण (चित्रा 5) में कोई बैंड नहीं देखा गया था, जिसका अर्थ है कि एक्सेनिक लार्वा में कोई आंत बैक्टीरिया मौजूद नहीं था। लार्वा विकास समय, जीवित रहने की दर, या रोगाणु मुक्त और पारंपरिक रूप से पाले गए पी वर्सीकोलोरा लार्वा के बीच उपस्थिति में कोई अंतर नहीं था। हालांकि, रोगाणु मुक्त लार्वा का शरीर द्रव्यमान 5वें दिन पारंपरिक रूप से पाले गए लार्वा की तुलना में थोड़ा अधिक था, हालांकि प्यूपेशन16 से पहले द्रव्यमान समान हो जाएंगे। इन परिणामों ने एक्सेनिक लार्वा तैयार करने और पीछे करने के लिए इस प्रोटोकॉल की व्यवहार्यता की पुष्टि की।

Figure 1
चित्रा 1: विलो पत्ती बीटल के जीवन चरण, प्लेगियोडेरा वर्सिकोलोरा। (ए) महिला और पुरुष वयस्क; (बी) अंडे; (सी) 1सेंट इंस्टार लार्वा; (डी) 2वें इंस्टार लार्वा; (ई) 3वें इंस्टार लार्वा; और (एफ) प्यूपा। स्केल बार = 1 मिमी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: पोपलर स्टेम सेगमेंट और रोपाई (ए) एपिकल कलियों के साथ स्टेम सेगमेंट; (बी) स्टेम सेगमेंट 10 दिनों के बाद जड़ें बढ़ीं; (सी) एक महीने पुराना अंकुर। स्केल पट्टियाँ = 1 सेमी. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: एक तीसरे-इंस्टार लार्वा की आंत। फोरगट, मिडगट और हिंडगट को कोष्ठक के साथ लेबल किया गया है। स्केल बार = 1 मिमी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: एलबी अगर प्लेटों पर आंत या पूरे कीट होमोजेनेट्स को संवर्धन करके आंत बैक्टीरिया उन्मूलन की प्रभावकारिता की पुष्टि। लार्वा खिलाया रोगाणु मुक्त चिनार पत्तियों में कोई बैक्टीरिया नहीं देखा गया था, जबकि बैक्टीरिया पारंपरिक रूप से पाले गए समूहों में मनाया गया था। परख के लिए 1सेंट, 2वें, और 3वें इंस्टार लार्वा का उपयोग किया गया था। प्रत्येक समूह में तीन लार्वा को बेतरतीब ढंग से चुना गया था। संक्षेप: जीएफ = रोगाणु मुक्त लार्वा; सीआर = पारंपरिक रूप से पाले गए लार्वा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: सार्वभौमिक 16 एस आरआरएनए जीन प्राइमरों का उपयोग करके पीसीआर परख द्वारा आंत बैक्टीरिया उन्मूलन की प्रभावकारिता की पुष्टि। 16 एस आरआरएनए जीन का लक्ष्य बैंड ~ 1,500 बीपी है 1एसटी, 2एनडी, और 3वें इंस्टार लार्वा का उपयोग परख के लिए किया गया था। जीएफ समूहों में कोई लक्ष्य बैंड नहीं देखा गया था। संक्षेप: नेकां = नकारात्मक नियंत्रण; जीएफ = रोगाणु मुक्त; सीआर = पारंपरिक रूप से पाला जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

रोगाणु मुक्त लार्वा की तैयारी और विशिष्ट बैक्टीरियल उपभेदों को पुन: पेश करके ग्नोटोबायोटिक लार्वा प्राप्त करना मेजबान-माइक्रोब इंटरैक्शन अंतर्निहित तंत्र को स्पष्ट करने के लिए शक्तिशाली तरीके हैं। नए हैच किए गए लार्वा दो मुख्य तरीकों से आंत माइक्रोबायोटा प्राप्त करते हैं: मां से संतानों तक ऊर्ध्वाधर संचरण या भाई-बहनों और पर्यावरण से क्षैतिज अधिग्रहण34। अंडे की सतह35 के संदूषण के माध्यम से संतानों को माता-पिता के हस्तांतरण से पूर्व को पूरा किया जा सकता है। इस प्रकार, कीट अंडे की सतहों27,28,29 को स्टरलाइज़ करके एक्सेनिक लार्वा प्राप्त करना अत्यधिक व्यवहार्य है। कई एंटीबायोटिक दवाओं के कॉकटेल का प्रशासन एक्सेनिक कीड़े विकसित करने का एक और तरीका है लेकिन इसके कई नुकसानहैं 28. इसके विपरीत, अंडे की सतह नसबंदी के बाद एक एक्सेनिक आहार एक्सेनिक कीड़े 23,28,29 विकसित करने के लिए बेहतर है।

अधिकांश पत्ती लेने वाले बीटल के अंडे दिखाई देते हैं, आसानी से अधिग्रहित होते हैं, और कीटाणुरहित करने में सरल होते हैं। यह मुख्य कारण है कि इसी तरह के अध्ययनों की तुलना में कीटाणुशोधन के लिए एक साधारण अभिकर्मक (75% इथेनॉल) और कम समय (8 मिनट) का उपयोग किया गया था (उदाहरण के लिए, स्टिंकबग प्लूटिया स्टैली के लिए 40 मिनट अंडे के कीटाणुशोधन के साथ 75% इथेनॉल और फॉर्मल्डेहाइड एक्सेनिक कीड़े कीट प्राप्त करने के लिए; 1% सक्रिय क्लोरीन और 75% इथेनॉल के साथ ड्रोसोफिला के अंडे की सतह नसबंदी के 6 मिनट; और लाल हथेली वीविल राइन्कोफोरस फेरुगिनियस के साथ अंडे की सतह नसबंदी के 10 मिनट 10% सोडियम हाइपोक्लोराइट के साथ समाधान) 23,29,36. छोटे अंडों के साथ कीट प्रजातियों के लिए, कीटाणुनाशकों और नसबंदी अवधि के उपयोग को अनुकूलित करने की आवश्यकता है क्योंकि उपचार परिणामों को काफी प्रभावित कर सकता है।

कुछ मामलों में, अंडे की सतह नसबंदी 29,37 के बाद एक्सेनिक कीट पालन के लिए रोगाणु मुक्त कृत्रिम आहार नियोजित किएजाते हैं। हालांकि, कीड़ों के लिए एक उपयुक्त कृत्रिम आहार विकसित करना एक थकाऊ और श्रम-उपभोग करने वाली प्रक्रिया है। आहार में पोषक तत्व बड़े पैमाने पर कीट शरीर विज्ञान (जैसे, विकास का समय, प्रतिरक्षा) और आंत माइक्रोबायोटा 6,35 को प्रभावित करते हैं। इस प्रकार, एक कीट के लिए एक योग्य कृत्रिम आहार में प्राकृतिक भोजन के समान पोषण संरचना होनी चाहिए, जिसे प्राप्त करना मुश्किल है, खासकर फाइटोफैगस कीड़ों के लिए। इस प्रोटोकॉल में, हमने कीड़ों को एक्सेनिक मेजबान पौधों के साथ खिलाया, जो कृत्रिम आहार की कमियों को दूर करता है। महत्वपूर्ण बात यह है कि यहां उपयोग किए जाने वाले चिनार के पौधे के साथ, बीज की सतह-नसबंदी या स्टेम सेक्शन कीटाणुशोधन38 द्वारा तम्बाकू, आलू, टमाटर, गेहूं और चावल जैसी कई आर्थिक रूप से महत्वपूर्ण फसलों से ऊतक-सुसंस्कृत रोपाई प्राप्त करना भी मुश्किल नहीं है। ध्यान दें, पौधों में एंडोफाइट्स ऊतक-सुसंस्कृत रोपाई39 में मौजूद हो सकते हैं और शूट टिप मेरिस्टेम संस्कृति प्रौद्योगिकी40 के माध्यम से समाप्त किया जा सकता है। अंत में, यह प्रोटोकॉल रोगाणु मुक्त कीड़ों को बनाए रखने के लिए एक नई विधि प्रदान करता है, जो कीट-आंत बैक्टीरिया इंटरैक्शन अध्ययनों को सुविधाजनक बनाने के लिए एक आसान उपकरण है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए ब्याज का कोई संघर्ष नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (31971663) और कास्ट (2020क्यूएनआरसी001) द्वारा युवा अभिजात वर्ग वैज्ञानिक प्रायोजन कार्यक्रम द्वारा वित्त पोषित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 µm syringe filters Millipore SLGP033RB
1 mg/mL NAA stock solution a. Prepare 0.1 M NaOH solution (dissolve 0.8 g NaOH in 200 mL of distilled water).
b. Add 0.2 g NAA in a 250 mL beaker, add little 0.1 M NaOH solution until NAA dissolved, and adjust the final volume to 200 mL with distilled water.
c. Filter the solution to remove bacteria with a 0.22 µm syringe filter and a 50 mL sterile syringe, subpackage the solution in 1.5 mL centrifuge tubes and restore at -20 °C.
1.5 mL microcentrifuge tubes Sangon Biotech F600620
10x PBS stock solution Biosharp Life Sciences BL302A
2 M KOH solution Dissolve 22.44 g KOH (molecular weight: 56.1) in 200 mL of distilled water and autoclave it for 20 min at 121 °C.
250 mL and 2,000 mL beakers Shubo sb16455
50 mL sterile syringes Jinta JT0125789
500 mL measuring cylinder Shubo sb1601
50x TAE stock solution a. Dissolve 242 g Tris and 18.612 g EDTA in 700 mL of distilled water.
b. Adjust pH to 7.8 with about 57.1 mL of acetic acid.
c. Adjust the final volume to 1,000 mL.
d. The stock solution was diluted to 1x TAE buffer when used.
75% ethanol Xingheda trade
α-naphthalene acetic acid (NAA) Solarbio Life Sciences 86-87-3
Absorbing paper 22.3 cm x 15.3 cm x 9 cm
Acetic acid Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd
Agar Coolaber 9002-18-0
Agarose Biowest 111860
Autoclave Panasonic MLS-3781L-PC
Bead-beating homogenizer Jing Xin XM-GTL64
DNA extraction kit MP Biomedicals 116560200
EDTA Saiguo Biotech 1340
Filter paper Jiaojie 70 mm diameter
Gel electrophoresis unit Bio-rad 164-5052
Gel Signal Green nucleic acid dye TsingKe TSJ003
Germ-free poplar seedlings Shan Xin poplar from Ludong University in Shandong Province
Golden Star Super PCR Master Mix (1.1×) TsingKe TSE101
Growth chamber Ruihua HP400GS-C
LB agar medium a. Dissolve 5 g tryptone, 5 g NaCl, 2.5 g yeast extract in 300 mL of distilled water.
b. Adjust the final volume to 500 mL, transfer the solution to a 1,000 mL conical flask, and add 7.5 g agar.
c. Autoclave the medium for 20 min at 121 °C.
Mini centrifuge DRAGONLAB D1008
MS basic medium Coolaber PM1121-50L M0245
MS solid medium for germ-free poplar seedling culture a. Dissolve 4.43 g MS basic medium powder and 30 g sucrose in 800 mL of distilled water.
b. Adjust the pH to about 5.8 with 2 M KOH by a pH meter.
c. Adjust the final volume to 1,000 mL, separate into two parts, transfer into two 1,000 mL conical flasks, and add 2.6 g agar per 500 mL.
d. Autoclave for 20 min at 121 °C.
NanoDrop 1000 spectrophotometer Thermo Fisher Scientific
Paintbrush 1 cm width, used to collect the eggs
Parafilm Bemis PM-996
PCR Thermal Cyclers Eppendorf 6331000076
Petri dishes Supin 90 mm diameter
pH meter METTLER TOLEDO FE20
Pipettes 0.2-2 µL Gilson ECS000699
Pipettes 100-1,000 µL Eppendorf 3120000267
Pipettes 20-200 µL Eppendorf 3120000259
Pipettes 2-20 µL Eppendorf 3120000232
Plant tissue culture container Chembase ZP21 240 mL
Plastic box 2.35 L
Potassium hydroxide (KOH) Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd
Primers for amplifying the bacterial 16S rRNA gene Sangon Biotech 27-F: 5’-ACGGATACCTTGTTACGAC-3’, 1492R: 5’-ACGGATACCTTGTTACGAC-3’
Sodium chloride (NaCl) Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd
Sodium hydroxide (NaOH) Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd
Steel balls 0.25 mm used to grind tissues
Stereomicroscope OLYMPUS SZ61
Sucrose Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd
Trans2K plus II DNA marker Transgene Biotech BM121-01
Tris base Biosharp Life Sciences 1115
Tryptone Thermo Fisher Scientific  LP0037
UV transilluminator Monad Biotech QuickGel 6100
Vortexer Scilogex MX-S
Willow branches Sha Lake Park, Wuhan, China
Willow leaf beetle Huazhong Agricultural University, Wuhan, China
Yeast extract Thermo Fisher Scientific LP0021

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References

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जीवविज्ञान अंक 176
पत्ती बीटल के मेजबान-आंत माइक्रोबायोटा इंटरैक्शन स्टडीज के लिए ऊतक सुसंस्कृत रोपाई के साथ एक्सनिक कीड़े तैयार करना और पालन करना
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Ma, M., Liu, P., Yu, J., Han, R., Xu, L. Preparing and Rearing Axenic Insects with Tissue Cultured Seedlings for Host-Gut Microbiota Interaction Studies of the Leaf Beetle. J. Vis. Exp. (176), e63195, doi:10.3791/63195 (2021).

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