Tilgang til desentralisert, rimelig og høykapasitetsdiagnostikk som kan distribueres i samfunnet for desentralisert testing er avgjørende for å bekjempe globale helsekriser. Dette manuskriptet beskriver hvordan man bygger papirbasert diagnostikk for virale RNA-sekvenser som kan oppdages med en bærbar optisk leser.
Tilgang til molekylær diagnostikk med lav byrde som kan distribueres i samfunnet for testing, blir stadig viktigere og har meningsfulle bredere implikasjoner for samfunnets velvære og økonomisk stabilitet. De siste årene har flere nye isotermiske diagnostiske modaliteter dukket opp for å møte behovet for rask, billig molekylær diagnostikk. Vi har bidratt til dette arbeidet gjennom utvikling og pasientvalidering av tåholdbryterbasert diagnostikk, inkludert diagnostikk for myggbårne Zika- og chikungunya-virus, som ga ytelse som kan sammenlignes med gullstandard revers transkripsjon-kvantitativ polymerasekjedereaksjon (RT-qPCR) baserte analyser. Disse diagnostikkene er billige å utvikle og produsere, og de har potensial til å gi diagnostisk kapasitet til lavressursmiljøer. Her gir protokollen alle trinnene som er nødvendige for utvikling av en bryterbasert analyse for Zika-virusdeteksjon. Artikkelen tar leserne gjennom den trinnvise diagnostiske utviklingsprosessen. For det første tjener genomiske sekvenser av Zika-virus som innganger for beregningsdesign av kandidatbrytere ved hjelp av åpen kildekode-programvare. Deretter vises samlingen av sensorene for empirisk screening med syntetiske RNA-sekvenser og optimalisering av diagnostisk følsomhet. Når den er fullført, utføres validering med pasientprøver parallelt med RT-qPCR, og en spesialbygd optisk leser, PLUM. Dette arbeidet gir et teknisk veikart til forskere for utvikling av rimelige tåholdbryterbaserte sensorer for applikasjoner innen menneskers helse, landbruk og miljøovervåking.
RT-qPCR har forblitt gullstandardteknologien for klinisk diagnostikk på grunn av sin utmerkede følsomhet og spesifisitet. Selv om metoden er svært robust, er den avhengig av dyrt, spesialisert utstyr og reagenser som krever temperaturkontrollert distribusjon og lagring. Dette gir betydelige barrierer for tilgjengeligheten av kvalitetsdiagnostikk globalt, spesielt i tider med sykdomsutbrudd og i regioner der tilgangen til velutstyrte laboratorier er begrenset 1,2. Dette ble observert under Zika-virusutbruddet 2015/2016 i Brasil. Med bare fem sentraliserte laboratorier tilgjengelig for å tilby RT-qPCR-testing, resulterte betydelige flaskehalser, noe som begrenset tilgangen til diagnostikk. Dette var spesielt utfordrende for personer i peri-urbane omgivelser, som ble mer alvorlig påvirket av utbruddet 3,4. I et forsøk på å forbedre tilgangen til diagnostikk, viser protokollen en plattform som er utviklet med potensial til å gi desentralisert, rimelig og høykapasitetsdiagnostikk i lavressursinnstillinger. Som en del av dette ble det etablert en diagnostisk oppdagelsesrørledning, som koblet isotermisk forsterkning og syntetiske RNA-bryterbaserte sensorer med papirbaserte cellefrie uttrykkssystemer 5,6.
Cellefrie proteinsyntesesystemer (CFPS), spesielt E. coli-baserte cellefrie systemer, er en attraktiv plattform for et bredt spekter av biosensingsapplikasjoner fra miljøovervåking 7,8 til patogendiagnostikk 5,6,9,10,11,12 . CFPS-systemer består av komponentene som er nødvendige for transkripsjon og oversettelse, og har betydelige fordeler i forhold til helcellebiosensorer. Spesielt er sensing ikke begrenset av en cellevegg, og generelt er de modulære i design, biosafe, billig og kan frysetørkes for bærbar bruk. Evnen til å frysetørke genkretsbaserte reaksjoner på underlag som papir eller tekstiler, muliggjør transport, langtidslagring ved romtemperatur5, og til og med innlemmelse i bærbar teknologi13.
Tidligere arbeid har vist at E. coli-cellefrie systemer kan brukes til å oppdage mange analytter, for eksempel giftige metaller som kvikksølv, antibiotika som tetracyklin 7,14, hormonforstyrrende kjemikalier15,16, biomarkører som hippursyre 17, patogenassosierte quorumsfølermolekyler 9,18 og ulovlige stoffer som kokain 17 og gammahydroksybutyrat (GHB)19 . For sekvensspesifikk påvisning av nukleinsyrer har strategier for det meste vært avhengig av bruk av bryterbaserte biosensorer koblet til isotermiske forsterkningsteknikker. Toehold-brytere er syntetiske riboregulatorer (også referert til som bare “brytere” i resten av teksten) som inneholder en hårnålsstruktur som blokkerer nedstrøms oversettelse ved å sekvestrere det ribosomale bindingsstedet (RBS) og startkodonet. Ved interaksjon med målutløseren RNA blir hårnålsstrukturen lettet og påfølgende oversettelse av en reporter åpen leseramme er aktivert20.
Isotermisk forsterkning kan også brukes som molekylær diagnostikk21; Imidlertid er disse metodene utsatt for ikke-spesifikk forsterkning, noe som kan redusere spesifisiteten og dermed nøyaktigheten av testen til under RT-qPCR 22. I arbeidet som er rapportert her, ble isotermisk forsterkning oppstrøms for bryterbaserte sensorer brukt til å gi kombinert signalforsterkning som muliggjør klinisk relevant deteksjon av nukleinsyrer (femtomolar til attomolar). Denne sammenkoblingen av de to metodene gir også to sekvensspesifikke sjekkpunkter som i kombinasjon gir et høyt spesifisitetsnivå. Ved hjelp av denne tilnærmingen har tidligere arbeid vist påvisning av virus som Zika6, Ebola5, Norovirus10, samt patogene bakterier som C. difficile23 og antibiotikaresistent tyfus12. Senest har cellefrie tåholdbrytere blitt demonstrert for SARS-CoV-2-deteksjon i arbeidet med å gi tilgjengelig diagnostikk for COVID-19-pandemien11,12,13.
Følgende protokoll skisserer utvikling og validering av cellefri, papirbasert syntetisk tåholdbryteranalyse for Zika-virusdeteksjon, fra biosensordesign i silico , gjennom monterings- og optimaliseringstrinn, til feltvalidering med pasientprøver. Protokollen begynner med in silico-design av RNA toehold-bryterbaserte sensorer og isotermiske forsterkningsprimere som er spesifikke for Zika viral RNA. Selv om det finnes mange isotermiske amplifikasjonsmetoder, ble det her vist bruk av nukleinsyresekvensbasert amplifikasjon (NASBA) for å øke konsentrasjonen av viralt RNA-mål som er tilstede i reaksjonen, noe som muliggjør klinisk signifikant følsomhet. Praktisk sett har isotermiske forsterkningsmetoder fordelen av å operere ved konstant temperatur, og eliminerer behovet for spesialutstyr, for eksempel termiske syklister, som generelt er begrenset til sentraliserte steder.
Deretter beskrives prosessen med å montere de syntetiske tåholdbrytersensorene med reporterkodingssekvenser gjennom overlappingsforlengelses-PCR, og screening av de syntetiske tåholdbrytersensorene for optimal ytelse i cellefrie systemer ved bruk av syntetisk RNA. For dette settet med Zika-virussensorer har vi valgt lacZ-genet som koder for β-galaktosidase-enzymet, som er i stand til å spalte et kolorimetrisk substrat, klorfenol rød-β-D-galaktopyranosid (CPRG), for å produsere en gul til lilla fargeendring som kan oppdages med øye eller med en plateleser. Når topppresterende syntetiske brytere er identifisert, beskrives prosessen for screening av primere for nukleinsyresekvensbasert isotermisk forsterkning av den tilsvarende målsekvensen ved bruk av syntetisk RNA for å finne sett som gir best følsomhet.
Til slutt valideres ytelsen til diagnoseplattformen på stedet i Latin-Amerika (figur 1). For å bestemme den kliniske diagnostiske nøyaktigheten utføres den papirbaserte cellefrie analysen ved bruk av Zika-virusprøver fra pasienter; parallelt utføres en gullstandard RT-qPCR-analyse for sammenligning. For å overvåke kolorimetriske cellefrie analyser aktiverer vi kvantifisering av resultater på stedet i områder der termiske sykluser ikke er tilgjengelige. Den håndmonterte plateleseren kalt Portable, Low-Cost, User-friendly, Multimodal (PLUM; heretter kalt bærbar plateleser) introduseres også her24. Opprinnelig utviklet som en følgesvenn enhet for cellefri syntetisk tåholdbryterdiagnostikk, tilbyr den bærbare plateleseren en tilgjengelig måte å inkubere og lese resultater på en høy gjennomstrømningsmåte, og gir integrert, datasynsbasert programvareanalyse for brukere.
Figur 1: Arbeidsflyt for testing av pasientprøver med papirbaserte cellefrie tåholdsbryterreaksjoner. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Det kombinerte papirbaserte systemet beskrevet her kan bringe klinisk relevant molekylær diagnostikk, med ytelse som er funksjonelt sammenlignbar med RT-qPCR, til behovspunktet6. Det er viktig at for eksterne innstillinger kan tilgjengeligheten av diagnostikk på stedet redusere tiden til resultatene fra dager til timer. Ved å fremheve programmerbarheten til denne tilnærmingen, kan rørledningen som er beskrevet, brukes til å oppdage praktisk talt alle patogenmål. Vi har paret de molekylære verktøyene med en spesialbygd bærbar plateleser, som er kompakt og kompatibel med batteridrift (8–9 timer) og gir innebygd dataanalyse for å muliggjøre distribuerte applikasjoner. I annet arbeid har vi validert den kombinerte maskinvare- og Zika-virusdiagnostiske plattformen med 268 pasientprøver, parallelt med RT-qPCR, og funnet en diagnostisk nøyaktighet på 98,5%24. Samlet sett er målet vårt å muliggjøre teknologioverføring av denne plattformen til forskere slik at den kan brukes på nytt og forbedres av samfunnet for å møte udekkede diagnostiske behov.
Designprosessen for in silico toehold-bryteren er integrert og automatisert i en rørledning som kan deles inn i tre trinn. Den første fasen genererer et basseng med tåholdbryterdesign som hybridiserer til målsekvensen i trinn på ett nukleotid. Den andre fasen undersøker tilgjengeligheten av sekundærstrukturen og tåholdbryteren og eliminerer sensorer med for tidlige stoppkodoner i rammen. En scoringsfunksjon som vurderer flere faktorer (f.eks. feilnivå for toehold-bryteren, tilgjengeligheten av toehold-bryteren og tilgjengelighet på målstedet) implementeres deretter for å velge de beste tåholdbryterdesignene basert på samlede poengsummer. I sluttfasen genereres en liste over sekvenser for de øverste tåholdbryterdesignene og deres tilsvarende målutløsere. De øverste sensorsekvensene bør screenes for spesifisitet mot det humane transkriptomet og nært beslektede virale genomer ved bruk av NCBI/Primer-BLAST25. Det er også beste praksis å skjerme sensormålstedene for sekvensbevaring i Zika-virusgenomet for å sikre at sensorene vil gi bred og robust deteksjon. Flere versjoner av toehold switch design programvare er utviklet og designalgoritmen tillater brukere å generere to versjoner, enten serie A 6 eller serie B toehold brytere6. I denne artikkelen har fokuset vært på serie B toehold switch design.
Etter kommersiell DNA-syntese kan tåholdbryterne raskt settes sammen, og deretter testes ved å utføre en innledende skjerm mot en syntetisk målutløsersekvens som tilsvarer korte regioner (200-300 nt) av målgenomet. For screening av ytelsen til tåholdbryterbaserte sensorer, er det ideelt å legge til målsekvensen i form av RNA. I denne artikkelen er trinnene som kreves for å legge til in vitro transkribert utløser-RNA skissert. Imidlertid, hvis tilgjengelig, kan full-lengde genommaler som kvantifiserte virale RNA-ekstrakter eller kommersielle syntetiske RNA-genomer eller standarder brukes. Bruk av RNA-genomer i full lengde for innledende toehold-bryterscreening er gunstig, da det kan informere om flere faktorer, for eksempel RNA-sekundærstruktur, vil påvirke sensorens ytelse. For å optimalisere ON/OFF-forholdet mellom kandidatbrytere, kan toehold-bryterens DNA titreres til den cellefrie reaksjonen. Dette trinnet kan også tjene til å identifisere høytytende tåholdbrytere (foldforsterkning eller høyt ON / AV-forhold) og utelate lekkende tåholdbrytere (høyt signal i fravær av mål-RNA) fra nedstrøms karakteriseringstrinn.
For å forbedre deteksjonsgrensen for de beste toehold-bryterkandidatene, brukes NASBA til å øke klinisk relevante konsentrasjoner av mål Zika viral RNA til et nivå som kan oppdages av toehold-brytere6. Ulike kombinasjoner av fremre og bakover primersett screenes for å bestemme de beste NASBA-primer- og tåholdbryterkombinasjonene for å muliggjøre deteksjon ved klinisk relevante konsentrasjoner. Når et ideelt primersett og toehold-bryterkombinasjon er identifisert, blir analysen tatt frem til klinisk validering. Det er viktig å merke seg at toehold-bryteren og NASBA-screeningsstadiene kan være arbeids- og ressurskrevende, og derfor er testutvikling best egnet for ressurssterke forskningssteder. Selv om vi ikke har brukt prosessautomatisering, er det sannsynlig at dette kan akselerere den iterative design-, bygge- og testsyklusen32. Heldigvis kan behandlingstiden fra sensordesign og testing til distribusjon være bemerkelsesverdig kort (mindre enn en uke), noe som gjør denne strategien ideell for tidskritiske situasjoner, for eksempel epidemiske utbrudd6.
Selv etter at en biosensor med klinisk relevant sensitivitet er utviklet, er det tekniske utfordringer som må løses. Siden denne protokollen innebærer manuell betjening og er en flertrinnsprosedyre, er det fare for krysskontaminering mellom prøvene. Vi gjør vårt beste for å redusere denne risikoen gjennom nøye laboratoriepraksis. I en nylig klinisk studie av 268 pasientprøver møtte vi ingen forurensningsproblemer; Det er imidlertid et viktig hensyn24. Med dette i bakhodet forblir protokollen en laboratorieanalyse og krever en dyktig bruker med kommando av riktige molekylærbiologiske teknikker. En ekstra vurdering for distribusjon er RNA-isolasjonen fra pasientprøver. Her beskriver vi RNA-isolasjon ved hjelp av kolonnebaserte nukleinsyreekstraksjonssett. I andre arbeider har vi imidlertid vist en effektiv og enkel kokelysemetode (95 °C i 2 min) for pasientprøvebehandling med lav belastning6. Denne strategien eliminerer nesten kostnadene forbundet med RNA-ekstraksjon og unngår bruk av kolonnebaserte nukleinsyreekstraksjonssett, noe som kan utgjøre en logistikkutfordring i lavressursinnstillinger eller forsyningskjedeproblemer under kriser, for eksempel COVID-19-pandemien33.
Som vi har sett under COVID-19-pandemien, kan instrumentene som brukes til å utføre RT-qPCR selv tjene som en flaskehals og begrense pasientens tilgang til testing. Denne faktoren, som også i stor grad er økonomisk, fører til en sentralisert testmodus som kan begrense diagnostisk tilgang. For eksempel, under Zika-utbruddet 2015/2016, var bare fem nasjonale referanselaboratorier tilgjengelige i Brasil, noe som forårsaket forsinkelser i pasienttesting. Uten å vurdere den potensielle fordelen med stordriftsfordeler, er dagens varekostnad for den bærbare plateleseren ~ $ 500 USD, som selv om den økes fem ganger for å ta hensyn til arbeidskraft og kommersiell margin, fortsatt gir et rimelig instrument. Dette sammenligner godt med RT-qPCR-instrumenter som varierer i pris fra $ 15.000 – $ 90.000 USD34. Videre er den estimerte kostnaden per test for den cellefrie analysen i Latin-Amerika rundt $ 5.48 USD, mens kostnaden per test av RT-qPCR i Brasil var ~ $ 10-11 USD på tidspunktet for Zika-utbruddet36. Utover kostnadene for utstyr har den bærbare plateleseren et lite fotavtrykk (20 cm3), automatisk analyse, dataopplasting til skyen via internett, og kan kjøres på batteristrøm. Disse funksjonene utvider dramatisk de potensielle innstillingene der testing kan distribueres og samtidig utvider pasientpopulasjonen som kan betjenes.
Til dags dato er de vanligste kommersielle E. coli CFPS-plattformene S30 og PURE systems37; Et viktig hensyn for å forbedre tilgangen til diagnostikk i lav- og mellominntektsland er imidlertid den begrensede innenlandske tilgjengeligheten av disse reagensene. Et viktig skritt mot å løse denne utfordringen er utviklingen av lokal CFPS-produksjon. Federici-laboratoriet har nylig gjort betydelige fremskritt mot å utvikle en ikke-kommersiell plattform for å implementere toehold-bryterbaserte sensorer i lysatbaserte cellefrie systemer, og nå en 2,7 fM LOD med Zika-virus RNA14. Ikke bare tillater denne oppnåelsen at reagensene kan gjøres i brukslandet, og unngår importtariffer og forsinkelser, men lønnskostnadene skaleres også til lokale priser, og dermed kan den totale kostnaden reduseres betydelig. I arbeidet skissert av Federici-gruppen var kostnadene ved å produsere CFPS-uttrykksreaksjonen (5 μL) i Chile 6,9 cent (USD) 35,38, noe som gir et dobbelt insentiv (forbedret logistikk og kostnad) for å implementere lysatbaserte systemer 35,38.
Plasseringen av RT-qPCR-sammenlignbar testing i distribuerte diagnostiske nettverk kan gi betydelige fordeler i forhold til dagens praksis som er avhengig av transport av prøver til sentraliserte RT-qPCR-anlegg. I peri-urbane omgivelser, hvor Zika-tilfeller var konsentrert, reduserer den fysiske avstanden mellom en pasient og det diagnostiske anlegget diagnosen og øker risikoen for at resultatene ikke når pasienten på et klinisk relevant tidspunkt. Det er vårt håp at arbeidet som presenteres her kan bidra til at forskningsmiljøet, gjennom overføring av kunnskap, kan skape desentralisert bioteknologi og bærbar maskinvare for menneskers helse, landbruk og miljøovervåking.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker alle medlemmer av Green, Pardee og Pena laboratorier, samt alle medforfattere av tidligere manuskripter knyttet til arbeidet som er beskrevet i dette manuskriptet. SJRDS ble støttet av et doktorgradsstipend sponset av Foundation for Science and Technology of Pernambuco (FACEPE), Brasil, referansenummer IBPG-1321-2.12/18, og støttes for tiden av et postdoktorstipend sponset av University of Toronto, Canada. PB støttes av William Knapp Buckley Award fra Fakultet for farmasi, University of Toronto. M.K. ble støttet av Precision Medicine Initiative (PRiME) ved University of Toronto interne fellesskap nummer PRMF2019-002. Dette arbeidet ble støttet av midler til K.P fra Canada Research Chairs Program (Files 950-231075 og 950-233107), University of Toronto’s Major Research Project Management Fund, CIHR Foundation Grant Program (201610FDN-375469), og til L.P, A.A.G. og K.P gjennom CIHR / IDRC Team Grant: Canada-Latin/America-Caribbean Zika Virus Program (FRN: 149783), samt av midler til K.P. fra Canadas International Development Research Center (stipend 109434-001) gjennom Canadian 2019 Novel Coronavirus (COVID-19) Rapid Research Funding Opportunity. Dette arbeidet ble også støttet av midler til AAG fra en Arizona Biomedical Research Commission New Investigator Award (ADHS16-162400), Gates Foundation (OPP1160667), en NIH Director’s New Innovator Award (1DP2GM126892), en NIH R21-pris (1R21AI136571-01A1) til K.P./A.A.G, og et Alfred P. Sloan Fellowship (FG-2017-9108). Figur 1 ble opprettet med Biorender.com under akademisk lisens til K.P.
384 well plate covers – aluminum | Sarstedt | 95.1995 | Used to cover the 384-well plates before they are inserted into the PLUM reader |
384 well plate covers – transparent | Sarstedt | 95.1994 | Used to cover the 384-well plates before they are inserted into the BioTek plate reader |
384 well plates | VWR | CA11006-180 | 2 mm paper-based diagnostics are placed into the wells of these plates for quantification |
Agarose | BioShop Canada | AGA001.500 | Gel electrophoresis |
BSA | BioShop Canada | ALB001.500 | Blocking agent for the Whatman filter paper |
Cell free reactions | New England Biolabs | E6800L | PURExpress |
CPRG | Roche | 10884308001 | Chlorophenol red-b-D-galactopyranoside |
Disposable Sterile Biopsy Punches | Integra Miltex | 23233-31 | Used to create 2 mm paper discs that fit into a 384-well plate |
DNAse I | Thermo Scientific | K2981 | Digests template DNA following incubation of the in vitro transcription reaction |
DNAse I Kit | Thermo Scientific | 74104 | DNase I Kit For removing template DNA from IVT RNA |
dNTPs | New England Biolabs | N0446S | Used for PCRs |
electrophoresis system | Bio-Rad | 1704487 | Used to run the agarose gels |
Gel imaging station | Bio-Rad | 1708265 | ChemiDoc XRS+ Imaging System |
IVT kit | New England Biolabs | E2040S | Used for in vitro transcribing template (trigger) RNA for switch screening |
Nanodrop One | Thermo Scientific | ND-ONE-W | Used for determining nucleic acid concentrations |
NASBA kit | Life Sciences Advanced Technologies | NWK-1 | Isothermal amplification reaction components |
Nuclease free H20 | invitrogen | 10977015 | Added to reaction mixes |
PAGE electrophoresis system | Biorad | 1658001FC | Used to cast and run polyacrylamide gels |
pCOLADuet-LacZ DNA | Addgene | 75006 | https://www.addgene.org/75006/ |
Phusion polymerase/reactioin buffer | New England Biolabs | M0530L | Used for PCRs |
Plate reader | BioTek | BioTek NEO2 | Multi Mode Plate Reader, Synergy Neo2 |
Primers | Integrated DNA Technologies | Custom oligo synthesis | |
Q5 polymerase/reaction buffer | New England Biolabs | M0491L | Used for PCRs |
Qiagen PCR Puriifcation Kit | QIAGEN | 27106 | QIAprep Spin Miniprep Kit |
RNA loading dye | New England Biolabs | B0363S | 2X RNA loading dye |
RNA Purification Kit | QIAGEN | EN0521 | QIAamp Viral RNA extraction kit |
RNase inhibitor | New England Biolabs | M0314S | Used to prevent contamination of RNases A, B, and C |
RT-qPCR kit | QIAGEN | 208352 | QuantiNova Probe RT-PCR Kit |
SYBR Gold | Invitrogen S11494 | S11494 | PAGE gel stain for nucleic acids |
TAE Buffer | BioShop Canada | TAE222.4 | Gel electrophoresis buffer |
Thermal Cycler | Applied Biosystems | 4484073 | Used for temperature cycling and incubating reactions |
Whatman 42 filter paper | GE Healthcare | 1442-042 | Used to imbed molecular components for paper-based diagnostics |