Summary
Tillgång till decentraliserad, billig och högkapacitetsdiagnostik som kan distribueras i samhället för decentraliserad testning är avgörande för att bekämpa globala hälsokriser. Detta manuskript beskriver hur man bygger pappersbaserad diagnostik för virala RNA-sekvenser som kan detekteras med en bärbar optisk läsare.
Abstract
Tillgång till molekylär diagnostik med låg belastning som kan distribueras i samhället för testning blir allt viktigare och har meningsfulla bredare konsekvenser för samhällenas välbefinnande och ekonomisk stabilitet. Under de senaste åren har flera nya isotermiska diagnostiska metoder dykt upp för att möta behovet av snabb, billig molekylär diagnostik. Vi har bidragit till detta arbete genom utveckling och patientvalidering av tåhållarbaserad diagnostik, inklusive diagnostik för myggburna zika- och chikungunyavirus, vilket gav prestanda jämförbar med guldstandard omvänd transkriptionskvantitativ polymeraskedjereaktion (RT-qPCR) baserade analyser. Dessa diagnostiker är billiga att utveckla och tillverka, och de har potential att ge diagnostisk kapacitet till miljöer med låg resurs. Här ger protokollet alla steg som krävs för att utveckla en switchbaserad analys för Zika-virusdetektering. Artikeln tar läsarna genom den stegvisa diagnostiska utvecklingsprocessen. För det första fungerar genomiska sekvenser av zikavirus som indata för beräkningsdesign av kandidatswitchar med hjälp av programvara med öppen källkod. Därefter visas montering av sensorerna för empirisk screening med syntetiska RNA-sekvenser och optimering av diagnostisk känslighet. När valideringen är klar utförs valideringen med patientprover parallellt med RT-qPCR och en specialbyggd optisk läsare, PLUM. Detta arbete ger en teknisk färdplan till forskare för utveckling av billiga tåhållarbaserade sensorer för applikationer inom människors hälsa, jordbruk och miljöövervakning.
Introduction
RT-qPCR har förblivit guldstandardtekniken för klinisk diagnostik på grund av dess utmärkta känslighet och specificitet. Även om den är mycket robust beror metoden på dyr, specialiserad utrustning och reagenser som kräver temperaturkontrollerad distribution och lagring. Detta utgör betydande hinder för tillgången till kvalitetsdiagnostik globalt, särskilt i tider av sjukdomsutbrott och i regioner där tillgången till välutrustade laboratorier är begränsad 1,2. Detta observerades under zikavirusutbrottet 2015/2016 i Brasilien. Med endast fem centraliserade laboratorier tillgängliga för att tillhandahålla RT-qPCR-testning resulterade betydande flaskhalsar, vilket begränsade tillgången till diagnostik. Detta var särskilt utmanande för individer i stadsnära miljöer, som drabbades hårdare av utbrottet 3,4. I ett försök att förbättra åtkomsten till diagnostik visar protokollet en plattform som har utvecklats med potential att tillhandahålla decentraliserad, billig och högkapacitetsdiagnostik i miljöer med låg resurs. Som en del av detta etablerades en diagnostisk upptäcktspipeline som kopplar isotermisk förstärkning och syntetiska RNA-switchbaserade sensorer med pappersbaserade cellfria uttryckssystem 5,6.
Cellfria proteinsyntessystem (CFPS), särskilt E. coli-baserade cellfria system, är en attraktiv plattform för ett brett spektrum av biosensingapplikationer från miljöövervakning7,8 till patogendiagnostik 5,6,9,10,11,12 . CFPS-system består av de komponenter som är nödvändiga för transkription och översättning och har betydande fördelar jämfört med helcellsbiosensorer. Specifikt är avkänning inte begränsad av en cellvägg och i allmänhet är de modulära i design, biosäkra, billiga och kan frystorkas för bärbar användning. Förmågan att frystorka genkretsbaserade reaktioner på substrat som papper eller textilier möjliggör transport, långvarig lagring vid rumstemperatur5 och till och med införlivande i bärbar teknik13.
Tidigare arbete har visat att E. coli-cellfria system kan användas för att detektera många analyter, till exempel giftiga metaller som kvicksilver, antibiotika som tetracyklin7,14, hormonstörande kemikalier15,16, biomarkörer som hippursyra 17, patogenassocierade kvorumavkänningsmolekyler 9,18 och olagliga ämnen som kokain 17 och gammahydroxibutyrat (GHB)19 . För sekvensspecifik detektion av nukleinsyror har strategier för det mesta förlitat sig på användningen av switchbaserade biosensorer kopplade till isotermiska förstärkningstekniker. Toehold-omkopplare är syntetiska riboregulatorer (även kallade helt enkelt "switchar" i resten av texten) som innehåller en hårnålstruktur som blockerar nedströms översättning genom att binda ribosomalt bindningsställe (RBS) och startkodonet. Vid interaktion med deras målutlösande RNA lindras hårnålsstrukturen och efterföljande översättning av en reporter öppen läsram aktiveras20.
Isotermisk förstärkning kan också användas som molekylär diagnostik21; Dessa metoder är emellertid benägna att ospecifik förstärkning, vilket kan minska testets specificitet och därmed noggrannheten till under RT-qPCR 22. I det arbete som rapporteras här användes isotermisk förstärkning uppströms de switchbaserade sensorerna för att ge kombinerad signalförstärkning som möjliggör kliniskt relevant detektion av nukleinsyror (femtomolar till attomolar). Denna parning av de två metoderna ger också två sekvensspecifika kontrollpunkter som i kombination ger en hög grad av specificitet. Med hjälp av detta tillvägagångssätt har tidigare arbete visat detektion av virus som Zika6, Ebola5, Norovirus10, liksom patogena bakterier som C. difficile23 och antibiotikaresistent tyfus12. Senast har cellfria tåhållare demonstrerats för SARS-CoV-2-detektion i försök att tillhandahålla tillgänglig diagnostik för COVID-19-pandemin11,12,13.
Följande protokoll beskriver utvecklingen och valideringen av cellfri, pappersbaserad syntetisk toehold-switchanalys för zikavirusdetektering, från in silico-biosensordesign , via monterings- och optimeringsstegen, till fältvalidering med patientprover. Protokollet börjar med in silico-designen av RNA-toehold-switchbaserade sensorer och isotermiska förstärkningsprimrar som är specifika för Zika-viralt RNA. Även om det finns många isotermiska förstärkningsmetoder, visades här användningen av nukleinsyrasekvensbaserad förstärkning (NASBA) för att öka koncentrationen av viralt RNA-mål närvarande i reaktionen, vilket möjliggjorde kliniskt signifikant känslighet. Praktiskt taget har isotermiska förstärkningsmetoder fördelen att de arbetar vid konstant temperatur, vilket eliminerar behovet av specialutrustning, såsom termiska cykler, som i allmänhet är begränsade till centraliserade platser.
Därefter beskrivs processen att montera de syntetiska tåhållaromkopplarsensorerna med reporterkodningssekvenser genom överlappningsförlängning PCR och screening av de syntetiska tåhållaromkopplarsensorerna för optimal prestanda i cellfria system med syntetiskt RNA. För denna uppsättning Zika-virussensorer har vi valt lacZ-genen som kodar för enzymet β-galaktosidas, som kan klyva ett kolorimetriskt substrat, klorfenolrött-β-D-galaktopyranosid (CPRG), för att producera en gul till lila färgförändring som kan detekteras av ögat eller med en plattläsare. När högpresterande syntetiska omkopplare har identifierats beskrivs processen för screening av primers för nukleinsyrasekvensbaserad isotermisk förstärkning av motsvarande målsekvens med syntetiskt RNA för att hitta uppsättningar som ger den bästa känsligheten.
Slutligen valideras diagnostikplattformens prestanda på plats i Latinamerika (figur 1). För att bestämma den kliniska diagnostiska noggrannheten utförs den pappersbaserade cellfria analysen med hjälp av Zika-virusprover från patienter; parallellt utförs en guldstandard RT-qPCR-analys för jämförelse. För att övervaka kolorimetriska cellfria analyser möjliggör vi kvantifiering på plats av resultat i regioner där termiska cykler inte är tillgängliga. Den handmonterade plattläsaren som kallas Portable, Low-Cost, User-friendly, Multimodal (PLUM; nedan kallad bärbar plattläsare) introduceras också här24. Den bärbara plattläsaren utvecklades ursprungligen som en kompletterande enhet för cellfri syntetisk tåhållaromkopplardiagnostik och erbjuder ett tillgängligt sätt att inkubera och läsa resultat på ett sätt med hög genomströmning, vilket ger integrerad, datorvisionsbaserad mjukvaruanalys för användare.
Figur 1: Arbetsflöde för testning av patientprover med pappersbaserade cellfria tåhållarreaktioner. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Protocol
Alla förfaranden som involverar mänskliga deltagare ska genomföras i enlighet med etiska normer och relevanta riktlinjer, inklusive de etiska principer för medicinsk forskning på människor som fastställs i Helsingforsdeklarationen från Världsläkarförbundet. Denna studie godkändes av den mänskliga forskningsetiska kommittén under licensprotokollnummer CAAE: 80247417.4.0000.5190. Informerat samtycke från alla patienter som ingår i denna studie upphävdes av Fiocruz-PE Institutional Review Board (IRB) för diagnostiska prover.
OBS: PLUM-enheten kommer hädanefter att kallas en "bärbar plattläsare".
1. Beräkningsdesign av nukleinsyrasekvensbaserade förstärkningsprimrar
- Skanna Zika-genomet för att identifiera en uppsättning kandidatregioner för förstärkning som är cirka 200 nukleotider (nt) till 300 nt långa genom att sätta den genomiska sekvensen i NCBI / NukleotidBLAST25,26. Jämför genomet med referens-RNA-sekvenser (refseq_rna) och sök efter platser som förblir mycket bevarade och inte har homologi med det mänskliga genomet (andra BLAST-parametrar förblir oförändrade). Välj minst två platser för att utforma den syntetiska tåhållaromkopplaren.
- Använd urvalskriterierna för Deiman et al.27 för att generera par av framåt- och bakåtnukleinsyrasekvensbaserade förstärkningsprimrar för varje kandidatförstärkningsregion. I korthet, följ dessa kriterier för att designa primers: (1) GC-innehåll mellan 40% -60%; (2) 20 till 24 nt i längd med DNA-smälttemperatur över 41 °C; 3) inga körningar av fyra eller flera identiska nukleotider, (4) den slutliga 3'-nukleotiden är en A-bas; (5) låg primer sekundär struktur och dimer bildning sannolikhet. Skärm 8-10 primerpar för varje målregion (rekommenderas).
- Lägg till prefixsekvensen som innehåller T7-promotorsekvensen AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGG (T7-promotorsekvens understruken) till 5'-änden av de främre primersna för att möjliggöra transkription av amplikonerna med användning av T7 RNA-polymeras (RNAP). Beställ primers som DNA-oligos från ett DNA-syntesföretag.
2. Beräkningsdesign av tåhållare
- Installera NUPACK28 version 3.2 (nukleinsyra design suite) baserat på instruktionerna på webbplatsen29. Använd ett UNIX-operativsystem och MATLAB (numerisk beräkningsplattform) som programmeringsspråk (rekommenderas).
- Identifiera de målsekvenser (t.ex. virusgenom) som är specifika för patogenen av intresse för tåhållaromkopplarens konstruktioner som i steg 1.1. Välj zikamålsekvenserna från de nukleinsyrasekvensbaserade amplikonerna som genereras i steg 1.2.
OBS: I praktiken kan antingen de nukleinsyrasekvensbaserade förstärkningsprimrarna eller de syntetiska tåhållbrytarna utformas och testas först, beroende på användarnas behov. Om särskilda målregioner av intresse redan har fastställts (t.ex. från befintliga publikationer eller diagnostiska protokoll) kan design och screening av toehold-omkopplare ske först, följt av design och screening för nukleinsyrasekvensbaserade förstärkningsprimrar. Om det inte finns några etablerade målregioner, screena först nukleinsyrasekvensbaserade förstärkningsprimrar mot hela genomet för att begränsa de valda målen medan du väljer för primerförstärkningseffektivitet. Om flera sekvenser för patogenen är tillgängliga är det bäst att designa nukleinsyrasekvensbaserade förstärkningsprimrar som fokuserar på mycket konserverade regioner (snarare än att screena hela genomet). - Ladda ner och installera den nödvändiga MATLAB-programvaran på datorn.
- Ställ in miljövariablerna så att nukleinsyradesignsvitens funktioner kan anropas i programvaran. För att göra detta, öppna programvaran och öppna (eller skapa) en startup.m-fil i standardarbetsmappen. Kopiera sedan följande kodrader till filen startup.m och slutligen lägg till mappen som innehåller nukleinsyradesignpaketets binärer till PATH:
NUPACKINSTALL = '/Användare/[user_name]/.../nupack3.2.2';
setenv('NUPACKINSTALL',NUPACKINSTALL);
setenv('PATH',[getenv('PATH'),sprintf(':%s/build/bin',NUPACKINSTALL)]); - Öppna programvaran för numerisk datorplattform och navigera till mappen för designprogramvara. Kör designalgoritmerna som är tillgängliga på https://github.com/AlexGreenLab/TSGEN.
- Mata in målsekvenserna i design_input_file.csv som finns i ingångsundermappen. Indata inkluderar namn, yttre sekvens, inre sekvens, temperatur, utdatanamn och utdatasekvens enligt definitionen i tabell 1. Om inga grundningsplatser är bestämda ännu för målet, håll inre och yttre sekvenser desamma. Endast rapportörens första 29 nt kommer att beaktas under designprocessen. När du är klar sparar och stänger du det uppdaterade kalkylbladet.
OBS: Utgångssekvensen är sekvensen för reporterproteinet som planeras att användas för analysen (t.ex. lacZ). Genom att ange de inre och yttre sekvenserna säkerställer du att algoritmen inte genererar syntetiska tåhållaromkopplare som överlappar någon av primersna. Det säkerställer också att analysen känner igen tre unika platser i Zika-genomet för att förbättra dess specificitet. - Välj de parametrar som ska användas för designfunktionen: toehold_switch_design_run(num_designs,input_file, alternativ). Fyll i parametervärdena som:
- num_designs - antalet toppdesigner för varje målutgång av programvaran. Standardvärdet är 6 och kan ändras efter behov (minst sex designer för varje mål rekommenderas).
- input_file - den här parametern anger namnet på filen som tillhandahåller indatasekvensinformationen. Standardvärdet är "design_input_file.csv" och kan ändras efter behov.
- Välj bland följande alternativ - (1) SeriesA och SeriesB: den eller de versioner av tåhållaromkopplaren som koden kommer att generera. Ställ in SeriesB på 1 och SeriesA på 0 för att generera serie B toehold switch, vilket är det format som används i Zika-virusdiagnostiken6; (2) Parallell: ställ in på 1 för att utnyttja flera kärnor för att beräkna designen; annars, ställ in på 0; (3) Antisense: ställ in på 1 för att generera tåhållaromkopplare som hybridiserar antisense-sekvensen (dvs. det omvända komplementet) av målinmatningen; annars ställer du in på 0.
- Kör designfunktionen med de valda parametrarna: toehold_switch_design_run(num_designs,input_file,options). Algoritmen börjar sedan generera tåhållaromkopplaren för de intressanta målen.
- När designen är klar letar du reda på designsekvenserna för den övre tåhållaren och motsvarande målsekvenser i final_designs mappen i form av kalkylblad i .csv format. Toehold-omkopplarens DNA-sekvenser som genereras av algoritmen kommer att innehålla T7-promotorsekvensen vid 5'-änden och den bevarade 21 nt-länksekvensen AACCTGGCGGCAGCGCAAAAG vid 3'-änden.
- Screena de resulterande designsekvenserna för top toehold-omkopplare mot andra vanliga virus genom att sätta dem på NCBI-BLAST och kontrollera sekvenshomologi. Acceptera sekvenser med 40% homologi eller mindre.
- Beställ tåhållarbytets hårnålssekvenser som DNA-oligos och montera dem senare med reportergenen till fullt fungerande omkopplare. Beställ nödvändiga PCR-primers för efterföljande sensormontering beroende på vilket reporterprotein du väljer.
| Parameter | Definition |
| Namn | De önskade namnen på utgångsväxelsekvenserna. |
| Yttre sekvens | Fullständigt NASBA-transkript producerat från förstärkning. |
| Inre sekvens | Den yttre sekvensen exklusive primerbindningsställena. Den matchar den yttre sekvensen men utesluter de delar av transkriptionerna som binder till de främre och bakre primersna. |
| Temperatur | Temperaturen som används av algoritmerna för att beräkna RNA-strukturerna. |
| Utdatanamn | Namnet på utgångsgenen (t.ex. lacZ, gfp). |
| Utdatasekvens | Sekvensen av utgångsgenen. |
Tabell 1: Definitionen av varje parameter som används i programvaran toehold switchdesign.
3. Konstruktion av tåhållare med PCR
OBS: Dessa steg beskriver konstruktionen av LacZ-tåhållare med överlappningsförlängning PCR. Här används DNA-oligo som en framåtriktad primer och T7-terminatorn används som en omvänd primer. Vi använder pCOLADuet-LacZ-plasmiden som mall för lacZ-genen (addgene: 75006). Alla andra DNA-mallar som innehåller motsvarande sekvens kan användas som mallar, förutsatt att T7-terminatorn ingår i den slutliga konstruktionen.
- När syntetiska DNA-oligos har mottagits från den kommersiella leverantören, förbered lösningar av syntetiskt DNA och omvänd amplifieringsprimer i en koncentration av 10 μM i nukleasfritt vatten. Montera reaktioner i PCR-rör på is enligt tabell 2.
PCR-volymer kan skalas efter behov. Använd en minimal mängd (0,1-1 ng) pCOLADuet-LacZ DNA-mall för att undvika behovet av ytterligare ett plasmidborttagningssteg eller bakgrunds-LacZ-signal. För högre DNA-mallmängder, följ PCR med en DpnI-restriktionsenzymsmältning för att ta bort den återstående plasmidmallen. - Placera reaktionerna i en termisk cykler enligt de cykelförhållanden som anges i tabell 3. Analysera PCR-produkterna på en agarosgel (figur 2; se tilläggsprotokoll och30).
- Rena PCR-produkterna med hjälp av ett spinnkolonnbaserat PCR-reningssats och eluera DNA i 15-30 μL nukleasfritt vatten, enligt tillverkarens instruktioner. Kvantifiera DNA med hjälp av en spektrofotometer.
| Komponent | Volym | Koncentration |
| 5X Q5 reaktionsbuffert | 10 μl | 1x |
| 10 mM dNTP | 1 μL | 200 μM |
| 10 mM framåtriktad primer (syntetisk switch DNA FW) | 2,5 μl | 0,5 μM |
| 10 mM omvänd primer (T7 terminator RV) | 2,5 μl | 0,5 μM |
| Mall-DNA (pCOLADuet-LacZ) | variabel | <1 ng |
| Q5 DNA-polymeras med hög återgivning | 0,5 μL | 0,02 U/μL |
| Nukleasfritt vatten | till 50 μl | - |
Tabell 2: PCR-komponenterna som används för att konstruera tåhållare.
| Steg | Temperatur | Tid | |
| Inledande denaturering | 98 °C | 30 sekunder | |
| 35 cykler | Denaturering | 98 °C | 10 sekunder |
| Glödgning | 60 °C | 20 sekunder | |
| Förlängning | 72 °C | 1.45 minuter | |
| Slutlig förlängning | 72 °C | 5 minuter | |
| Hålla | 4 °C | - | |
Tabell 3: Cykelförhållanden som används vid konstruktion av tåhållare med PCR.
4. Beredning av syntetiskt RNA-mål (Trigger)
- Använd en molekylärbiologisk designprogramvara för att modifiera de syntetiska trigger-RNA-mallarna (valda i steg 1.1) för att inkludera en uppströms T7-promotorsekvens, vilket säkerställer att hela mallen förblir kort (<200 bp). Designa framåt- och bakåtprimrar för att förstärka triggersekvensprimern (för oligosekvenser, se Tilläggsprotokoll).
- Beställ sekvenserna som DNA-oligos. När de har mottagits, rekonstituera det syntetiska trigger-DNA:t och amplifieringsprimrarna till 10 μM i nukleasfritt vatten. Montera motsvarande PCR i tunnväggiga rör på is enligt tabell 2 och använd 0,5 μL av trigger-DNA-ultrameren (slutlig koncentration på 0,1 μM) som mall-DNA.
- Placera reaktionerna i en termisk cykler och använd de cykelförhållanden som anges i tabell 3. Använd en förlängningstid på 15 s. Bedöm kvaliteten och rena trigger-PCR-produkter enligt beskrivningen i steg 3.3 och tilläggsprotokoll.
OBS: För att påskynda processen kan kolumnrenade PCR-produkter också användas direkt för initial screening av tåhållare.
5. In vitro-transkription av utvalda triggersekvenser
- Montera reaktionskomponenter på is enligt tabell 4.
- Inkubera in vitro-transkriptionsreaktioner (IVT) vid 37 °C i 4 timmar, följt av DNase I-behandling för att avlägsna mall-DNA. För DNase I-steget, tillsätt 70 μl nukleasfritt vatten, 10 μl 10x DNase I-buffert och 2 μL DNase I (RNasfritt) och inkubera vid 37 °C i 15 minuter. Om du inte går vidare till steg 5.4 omedelbart, inaktivera DNase I med tillsats av 50 mM EDTA och värm inaktivering vid 65 °C i 10 minuter.
- Valfritt steg: Utför denaturering av polyakrylamidgelelektrofores (t.ex. urea-PAGE) analys på IVT-produkterna för att bedöma RNA-kvalitet enligt beskrivningen i tilläggsprotokollet.
- Rena utlösaren IVT-produkter med hjälp av ett kolumnbaserat RNA-rengöringssats enligt tillverkarens instruktioner och kvantifiera sedan RNA-koncentrationen och renheten med hjälp av spektrofotometri. Se tilläggsprotokoll för instruktioner om hur man bestämmer molaritet och kopieringsnummer / μL för RNA.
| Komponent | Volym | Koncentration |
| 10X reaktionsbuffert | 1,5 μL | 0,75x |
| 25 mM NTP-blandning | 6 μl | 7,5 miljoner |
| Mall utlöser DNA | X μL | 1 μg |
| T7 RNA-polymerasblandning | 1,5 μL | - |
| Nukleasfritt vatten | X μL | Till 20 μl |
Tabell 4: In vitro-transkription (IVT) av utvalda triggersekvenser.
6. Inledande screening av omkopplarna
I det här avsnittet beskrivs stegen för att ställa in cellfria, pappersbaserade tåhållarreaktioner och hur du söker efter högpresterande tåhållarbrytare. Det BSA-blockerade filterpapper som används i steg 6.10 bör förberedas i förväg enligt beskrivningen i tilläggsprotokollet.
- Bered en HLRG-stamlösning genom att lösa 25 mg av pulvret i 1 ml nukleasfritt vatten. Förvara lösningen alltid på is och förvara vid -20 °C för långvarig användning.
- Bestäm antalet reaktioner som ska ställas in. För varje utvärderad tåhållaromkopplare, inkludera en ingen mallkontroll (ingen switch och inget mål-RNA - annars känd som cellfri ensam kontroll) för att ta hänsyn till eventuella bakgrundssignaler som kan uppstå från huvudmixen. Inkludera en switch endast kontroll för att bedöma bakgrundsomkopplarens läckande eller OFF-hastighet i frånvaro av mål-RNA.
- Montera en cellfri reaktionsmasterblandning av lösning A, lösning B, RNas-hämmare och HLRG på is enligt standardprotokollet som anges i tabell 5.
OBS: Stegen som beskrivs här är för en huvudblandning som är tillräcklig för en tredubbel uppsättning av 1,8 μl reaktioner med tillsats av 10% volym för att ta hänsyn till pipetteringsfel. Huvudmixvolymen bör justeras efter behov beroende på antalet tåhållare som screenas. - För varje tredubbel cellfri reaktion, dispensera huvudblandningen i ett PCR-rör och håll alla rör på is. För röret som avsatts som den cellfria ensamma kontrollen, tillsätt nukleasfritt vatten till en slutlig volym på 5,84 μl, blanda genom pipettering upp och ner och centrifugera kort. För resten av rören, tillsätt PCR-renat tåhållaromkopplare DNA till en slutlig koncentration av 33 nM.
- För rör som avsatts som enbart omkopplare, tillsätt nukleasfritt vatten till en slutlig volym på 5,84 μl. För rör som avsatts för att testa tåhållbrytaren och mål-RNA-kombinationen, tillsätt in vitro-transkriberat mål-RNA till en slutlig koncentration på 1 μM. Tillsätt sedan nukleasfritt vatten till en slutlig volym på 5,84 μl. Blanda alla reaktioner noggrant genom att pipettera upp och ner och centrifugera kort.
- Tillsätt 30 μl nukleasfritt vatten till brunnarna som omger reaktionsbrunnarna på en 384-brunns svart, klarbottnad platta. Detta minimerar avdunstningen under experimentets gång och förbättrar reproducerbarheten.
OBS: Om du använder den bärbara plattläsarenheten, placera en PCR-folie över plattan och använd en precisionskniv för att skära ut brunnarna som är avsedda för din reaktion, liksom var och en av de fyra hörnbrunnarna. PCR-folien förhindrar överexponering av den bärbara plattläsarkameran från tomma brunnar. - Skär BSA-blockerade filterpappersskivor med en 2 mm biopsistans och pincett och placera dem i reaktionsbrunnarna antingen genom att mata ut stansen eller med pincett (se tilläggsprotokoll för beredning av BSA-blockerat filterpapper). Fördela tre volymer på 1,8 μL från varje reaktionsrör på filterpappersskivorna i 384-brunnsplattan och håll alla prover, liksom 384-brunnsplattan, alltid på is.
OBS: Om du använder den bärbara plattläsarenheten, tillsätt 1,8 μL HLRG (0,6 mg / ml) till vart och ett av de fyra hörnen på 384-brunnsplattan. Den gula färgen från CPRG ger mönsterigenkänning till den bärbara plattläsaren för justering av den digitala flerbrunnsplattmallen i bildanalys. Täck plattans brunnar med PCR-film för att förhindra avdunstning. - Lägg tallriken i en tallriksläsare, läs OD570 vid 37 °C varje min i 130 min.
| Komponent | Volym | Slutlig koncentration per reaktion |
| Lösning A | 2,38 μl | 40% |
| Lösning B | 1,78 μl | 30% |
| RNas-hämmare | 0,03 μL | 0,5% v/v |
| HLRG (25 mg/ml) | 0,14 μL | 0,6 mg/ml |
| Toehold-omkopplare | X μL | 33 nM |
| Mål-RNA | X μL | 1 μM |
| Nukleasfritt vatten | till 5,94 μl | - |
| Total volym: | 5,94 μL | |
Tabell 5: PURExpress cellfria transkriptionsöversättningsreaktionskomponenter.
7. Identifiera högpresterande tåhållare
Det här avsnittet beskriver hur du analyserar data från steg 6 för att välja de bäst presterande tåhållaromkopplarna att gå vidare med.
- Börja dataanalysen genom att först normalisera till OD 570-bakgrundsabsorbansen. För att göra detta, subtrahera OD 570-mätningarna av reaktioner som inte har någon omkopplare eller mål-RNA (dvs. cellfria ensamma brunnar) från de andra OD570-mätningarna.
- Jämna ut normaliserade data med ett trepunkts glidande medelvärde och justera minimivärdet för varje brunn till noll. Se figur 3 för ett exempel på normaliserade tidsförloppsdata som samlats in för tåhållarknapparna 27B, 33B och 47B.
- Använd dessa bearbetade data för att beräkna vikförändringen (eller ON/OFF-förhållandet) genom att bestämma skillnaden i färgförändringshastigheten (dvs. förändring i OD570 över tid) mellan tåhållaren och mål- och switchen ensamma brunnar (se tilläggsprotokoll för beräkning av förhållandet; Figur 4).
- Välj omkopplare med den högsta PÅ / AV-vikningsändringen för ytterligare karakterisering. Utelämna de dåligt presterande tåhållaromkopplarna som visar den lägsta vikförändringen.
8. Nukleinsyrasekvensbaserad förstärkningsprimerscreening och känslighet
OBS: I följande steg görs först en skärm för funktionella isotermiska förstärkningsprimrar, och sedan bedöms deras känslighet genom att bestämma antalet mål-RNA-kopior per μL syntetiskt RNA som en given tåhållare på ett tillförlitligt sätt kan detektera i kombination med isotermisk förstärkning. Efter isotermisk förstärkning, utför cellfria reaktioner för att identifiera framgångsrika nukleinsyrasekvensbaserade förstärkningsprimeruppsättningar. Det kan dock vara mer kostnadseffektivt att köra polyakrylamid eller agarosgeler på nukleinsyrasekvensbaserade förstärkningsreaktioner för att först begränsa poolen av kandidatprimeruppsättningar. I så fall kan nukleinsyrasekvensbaserade förstärkningsprimersatser som genererar ett band på gelén vid lämplig ampliconstorlek listas för efterföljande cellfri screening.
- Gör en 25 μM stamlösning av alla framåt- och bakåtprimersatser i nukleasfritt vatten (se tilläggsprotokoll). Bestäm antalet nukleinsyrasekvensbaserade förstärkningsreaktioner och efterföljande cellfria reaktioner som behöver ställas in. Detta beror på antalet tåhållare och respektive primeruppsättningar.
OBS: Vid screening av primers är det viktigt att alltid inkludera en ingen mallkontroll för varje primeruppsättning för att ta hänsyn till eventuella bakgrundsartefakter som kan uppstå på grund av primer-associerad ospecifik förstärkning. - Ställ in en 5 μl reaktion enligt följande (skala detta efter behov). Tina alla reagenser på is. Sätt ihop en reaktionsmasterblandning av reaktionsbufferten, nukleotidblandningen och RNas-hämmaren enligt tabell 6. Blanda noggrant genom att pipettera upp och ner tills den vita fällningen är solubiliserad och fördela sedan alikvoter i PCR-rör.
- Om masterblandningen är avsedd för screening av nukleinsyrasekvensbaserade förstärkningsprimrar, uteslut först primersna från masterblandningen (dispensera 2,55 μL mastermix). Annars, om du utför primerkänslighetsanalys, kan primersna inkluderas i huvudblandningen (i vilket fall dispensera 2,75 μL alikvoter). Tillsätt enzymblandningen efter denaturerings- och jämviktsstegen.
- Vid screening av nukleinsyrasekvensbaserade förstärkningsprimrar, tillsätt de främre och bakre primersna till lämpliga rör. På en termisk cykler, ställ in inkubationsprotokollet enligt beskrivningen i tabell 7.
- Tillsätt 1 μl antingen nukleasfritt vatten eller 1 μl målutlösnings-RNA vid 2 pM eller cirka 106 kopior/μl och se till att märka rören därefter. Blanda med försiktig pipettering och snurra kort ner rören.
OBS: För screening av primeruppsättningar, använd en koncentration av målutlösnings-RNA som är tillräckligt hög för att inte påverka den nedre detektionsgränsen för den isotermiska förstärkningsmetoden, men ändå inte tillräckligt hög för att ge aktivering av tåhållomkopplaren om ingen förstärkning skulle inträffa. - Flytta rören till den termiska cykeln och starta inkubationen. Efter 12 min, ta bort rören och tillsätt 1,25 μL av enzymblandningen till varje rör. Blanda genom att pipettera upp och ner och centrifugera rören kort.
OBS: Vid denna tidpunkt kan rören hållas vid rumstemperatur; Enzymblandningen bör dock hållas på is tills den tillsätts till rören. - Sätt tillbaka rören till den termiska cykeln och hoppa över hållsteget på 41 °C för att starta reaktionsinkubationen på 1 timme.
OBS: Efter inkubation kan reaktionerna placeras på is för bearbetning samma dag eller frysas vid -20 °C för senare bearbetning. - Följ steg 6.2-6.7 och tabell 8 för att montera pappersbaserade cellfria tåhållarreaktioner för att bedöma primerprestanda. Analysera data enligt beskrivningen i steg 7.1-7.2 och figur 3.
OBS: Förutom de tidigare nämnda kontrollerna är det viktigt att även inkludera den negativa kontrollen för att ta hänsyn till eventuella bakgrundssignaler som kan uppstå från reaktionen. Dessutom är det viktigt att också inkludera en kontroll med omkopplaren och 2 pM (slutlig koncentration) av mål-RNA, som en no-NASBA-förstärkningskontroll. - Identifiera kandidatprimerpar för att gå vidare med känslighetsanalys. Primerpar väljs baserat på om aktivering av tåhållaren sker efter tillsats av den inkuberade reaktionen. Om det behövs, upprepa primerskärmen med fler primerkombinationer.
- Håll RNA-prover på is hela tiden, gör följande seriella utspädningsuppsättning av mål-RNA i nukleasfritt vatten: 104, 103, 10 2, 101 och 100 RNA-kopior / μL. Upprepa nukleinsyrasekvensbaserad förstärkning och cellfria reaktioner med de valda primeruppsättningarna (steg 8.2-8.7), testa den seriella utspädningsserien för att identifiera de primeruppsättningar som ger bäst känslighet. Se figur 5 för ett exempel på resultat för att bestämma primeruppsättningens känslighet.
OBS: Helst bör den valda tåhållaren och primerparet detektera så få som 1-100 mål-RNA-kopior per μL av RNA (stamlösningskoncentration). - Upprepa det nukleinsyrasekvensbaserade förstärkningskänslighetsexperimentet i biologiskt trefaldigt. Detta steg tjänar till att bekräfta reproducerbarheten av resultaten innan du går till experiment med patientprover.
- Valfri: För att ha en tillförlitlig källa till switch-DNA för långvarig användning och för transport, klona de valda switchsekvenserna till en plasmid med någon konventionell kloningsmetod. På samma sätt kan målutlösar-RNA-sekvensen också klonas till en valfri plasmid för lagring.
| Komponent | Volym per reaktion | Slutlig koncentration |
| NASBA-reaktionsbuffert | 1,67 μl | 1x |
| NASBA Nucleotid-blandning | 0,833 μL | 1x |
| 25 μM framåtriktad primer | 0,1 μL | 0,5 μM |
| 25 μM omvänd primer | 0,1 μL | 0,5 μM |
| RNas-hämmare (40 U/μl) | 0,05 μL | 0,4 U/μl |
| Mål-RNA | 1 μL | |
| NASBA-enzymblandning | 1,25 μL | 1x |
| Total volym | 5 μl |
Tabell 6: NASBA-reaktionskomponenter.
| Steg | Temperatur | Tid |
| Denaturering | 65 °C | 2 minuter |
| Jämvikt | 41 °C | 10 minuter |
| Hålla | 41 °C | ∞ |
| Inkubation | 41 °C | 1 timme |
| Hålla | 4 °C | - |
Tabell 7: Reaktionsförhållanden för NASBA.
| Komponent | Volym | Slutlig koncentration per reaktion |
| Lösning A | 2,38 μl | 40% |
| Lösning B | 1,78 μl | 30% |
| RNas-hämmare | 0,03 μL | 0,5% v/v |
| HLRG (25 mg/ml) | 0,14 μL | 0,6 mg/ml |
| Toehold-omkopplare | X μL | 33 nM |
| Mål-RNA (om tillämpligt) | X μL | 1 μM |
| NASBA (om tillämpligt) | 0,85 μL | 1:7 |
| Nukleasfritt vatten | till 5,94 μl | - |
| Total volym: | 5,94 μL | |
Tabell 8: Pappersbaserade cellfria reaktionskomponenter.
9. Insamling av patientprover och viral RNA-extraktion
OBS: Detta avsnitt beskriver protokollet för att samla in patientprover och extrahera RNA med hjälp av ett RNA-reningssats. Protokollet nedan används för att erhålla serum från perifert blod. Proverna som användes i denna studie samlades in från patienter som uppvisade feber, exantema, artralgi eller andra relaterade symtom på arbovirusinfektion i delstaten Pernambuco, Brasilien.
- Samla in perifera blodprover från misstänkta arbovirusinfekterade patienter. Utför venipunktur (helblodsrör) med en standard aseptisk teknik. Märk provrören med en anonym kod och datum för provtagning.
- Centrifugera blod för att separera serumet vid 2 300 x g i 10 minuter. Förbered alikvoter av serum (200 μL) som kommer att användas för RNA-extraktion i 1,5 ml rör med en pipett.
OBS: Om det inte är möjligt att utföra RNA-extraktionen strax efter provtagningen bör serumprover förvaras vid -80 °C före nedströmsapplikationer. - Pipettera 560 μL beredd buffert-AVL (viral lysbuffert) innehållande bärar-RNA i ett 1,5 ml rör. Tillsätt 140 μl serum till buffert-AVL/bärar-RNA-blandningen i röret. Blanda med pulsvirvel i 15 s.
- Inkubera i 10 minuter vid rumstemperatur och centrifugera sedan provet kort för att samla upp innehållet i botten av röret. Tillsätt 560 μl etanol (96%-100%) till provet och blanda genom pulsvirvel i 15 s. Efter blandning, centrifugera provet för att samla innehållet i botten av röret.
- Tillsätt försiktigt 630 μl av lösningen från steg 9.4 till centrifugeringskolonnen utan att väta fälgen. Efter detta steg stänger du locket och centrifugerar vid 6 000 x g i 1 min. Placera spinnkolonnen i ett rent 2 ml uppsamlingsrör och kassera det använda uppsamlingsröret som innehåller filtratet.
- Öppna försiktigt snurrkolonnen och upprepa steg 9.5. Öppna försiktigt spinnkolonnen och tillsätt 500 μL buffert AW1 (tvättbuffert 1). Stäng locket och centrifugera vid 6 000 x g i 1 min. Placera spinnkolonnen i ett rent 2 ml uppsamlingsrör och kassera det använda uppsamlingsröret som innehåller filtratet.
- Öppna försiktigt spinnkolonnen och tillsätt 500 μL buffert AW2 (tvättbuffert 2). Stäng locket och centrifugera vid 20 000 x g i 3 minuter. Placera spinnkolonnen i ett rent 2 ml uppsamlingsrör och kassera det använda uppsamlingsröret som innehåller filtratet.
- För att undvika kontaminering av restbuffert AW2, vilket kan orsaka problem i nedströms enzymatiska reaktioner, placera spinnkolonnen i ett rent 2 ml uppsamlingsrör och kassera det använda uppsamlingsröret med filtratet. Centrifugera vid 20 000 x g i 1 min.
- Placera spinnkolonnen i ett rent 1,5 ml rör och kassera det använda uppsamlingsröret med filtratet. Öppna försiktigt spinnkolonnen och tillsätt 60 μL buffert-AVE (elueringsbuffert) som är jämviktad med rumstemperatur. Efter detta steg stänger du locket och inkuberar vid rumstemperatur i 1 min.
- Centrifugera vid 6 000 x g i 1 min. Det eluterade RNA kan sedan användas som ingång för NASBA- och RT-qPCR:erna parallellt.
- Följ steg 8.3 till 8.11 för att utföra den nukleinsyrasekvensbaserade förstärkningen och pappersbaserade cellfria reaktioner med användning av 1 μL extraherat patient-RNA, vilket säkerställer att negativa och positiva kontrollreaktioner inkluderas. Efter reaktionerna, förbered reaktionsplattan med 384 brunnar och kör analysen i den bärbara plattläsaranordningen vid 37 °C (se detaljer i tilläggsprotokollet).
OBS: Två RNA-koncentrationer på 104 och 102 PFU/ml, extraherade från odlat zikavirus, används som positiva kontroller för alla experiment under den kliniska valideringen. Förutom de tidigare nämnda kontrollerna är det viktigt att även inkludera avtryckaren (10 ng/μL) som en positiv kontroll. - I slutet av varje experiment kan rådata (.csv fil) från den prtable plattläsaren laddas upp till en säker databas online. Dessutom genererar den bärbara plattläsaren en rapport som anger om proverna är positiva eller negativa för zikavirus (figur 6); Se avsnittet om representativa resultat för exempel på alla grafer som erhållits under inkubationen (figur 7).
OBS: Användare kan också överföra filer från den bärbara plattläsaren till sin egen dator via USB.
10. Bärbar plattläsare
- Den bärbara plattläsarenheten (figur 8) kan användas som ett alternativ till en konventionell plattläsare24. För protokollet och representativa resultat, se tilläggsprotokoll.
11. RT-qPCR för zikavirusdetektering
OBS: Detta avsnitt beskriver stegen för att utföra RT-qPCR för zikavirusdetektering från patientprover (se tilläggsprotokoll).
- För att undvika kontaminering, montera RT-qPCR-komponenterna i ett område isolerat från förstärkningsprocessen (t.ex. renhuv). Placera RT-qPCR-bufferten, enzymerna och primern/sonderna på is eller ett kallblock. Efter detta, lägg till reaktionerna på en 384-brunnsplatta på is enligt tabell 9.
OBS: Negativ (extraktionskontroll och icke-mallkontroll [NTC]) och positiv kontroll (104 PFU/ml) rekommenderas för alla experiment. - Efter tillsats av reagenserna till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör, blanda reaktionen genom att pipettera upp och ner (virvla inte) och fördela 6,5 μL i varje brunn. Lägg till 3,5 μL av varje RNA-mall i tre exemplar.
- Placera en PCR-film över toppen av plattan. Centrifugera 384-brunnsplattan vid 600 x g i 2 minuter.
- Placera plattan i en RT-qPCR-maskin med hjälp av följande cykelförhållanden som beskrivs i tabell 10. För att analysera resultaten, använd RT-qPCR-maskindesign- och analysprogramvaran och ta hänsyn till det automatiska tröskelvärdet och baslinjen (se detaljer i tilläggsprotokollet).
| Komponent | Volym | Koncentration |
| 2X QuantiNova Sond RT-PCR Master Mix | 5 μl | 1 X |
| 100 μM framåtriktad primer | 0,08 μL | 0,8 μM |
| 100 μM omvänd primer | 0,08 μL | 0,8 μM |
| 25 μM sond | 0,04 μl | 0,1 μM |
| QuantiNova ROX referensfärg | 0,05 μL | 1 X |
| QuantiNova Probe RT-mix | 0,1 μL | 1 X |
| Mall RNA | 3,5 μL | - |
| Nukleasfritt vatten | till 10 μl | - |
Tabell 9: RT-qPCR-komponenter för att förstärka Zika-virus-RNA baserat på Centers for Disease Control and Prevention-CDC USA-protokollet för att upptäcka Zika-virus från patientprover31.
| Steg | Temperatur | Tid | |
| Omvänd transkription | 45 °C | 15 minuter | |
| PCR första aktiveringssteget | 95 °C | 5 minuter | |
| 45 cykler | Denaturering | 95 °C | 5 s |
| Kombinerad glödgning/förlängning | 60 °C | 45 s | |
Tabell 10: Cykelförhållanden för RT-qPCR.
Representative Results
Efter beräkningsdesignrörledningen utfördes konstruktionen av tre tåomkopplare av PCR. PCR-produkterna analyserades med hjälp av agarosgelelektrofores (figur 2). Närvaron av ett klart band runt 3,000 bp, ungefär storleken på lacZ-genen kopplad till en tåomkopplare, indikerar vanligtvis en framgångsrik reaktion. Alternativt indikerar en fil utan band, flera band eller ett band av fel storlek en misslyckad PCR. Vid misslyckad PCR bör reaktionsbetingelserna och/eller primersekvenserna optimeras.
De monterade tåhållarbrytarna screenades för att bedöma varje sensor mot dess respektive in vitro-transkriberade trigger-RNA (figur 3). Medan alla tre sensorerna visade en ökad OD 570-absorbans, hade switch27B (figur 3A) den snabbaste hastigheten. Switcharna 33B och, i mindre utsträckning, 47B visade en ökad OD570-absorbans i frånvaro av målutlösar-RNA, vilket indikerar att dessa omkopplare har viss bakgrundsaktivitet eller läckande (figur 3B, C) - en egenskap som inte önskas i en kandidatsensor eftersom det kan minska specificiteten. För att tydligare identifiera sensorn med det högsta ON/OFF-signalförhållandet beräknades vikförändringen av OD570-absorbansen (se kompletterande information avsnitt 5) och plottades (figur 4). Från denna analys är det tydligt att switch 27B är den sensor som har bäst prestanda med ett ON / OFF-förhållande på cirka 60.
Känsligheten hos den bäst presterande tåhållomkopplaren (27B) utvärderades sedan genom att bestämma den lägsta RNA-koncentrationen som krävs för att aktivera tåhållomkopplaren i kombination med en NASBA-reaktion. Grafen illustrerar att de bäst presterande zikasensorerna kan detektera RNA vid koncentrationer så låga som 1,24 molekyler per μL (motsvarande ~ 2 aM; Figur 5).
Efter att switch 27B identifierats och validerats distribuerades sensormaterialet till teammedlemmarna i Recife i delstaten Pernambuco i Brasilien. I Brasilien bedömdes den kliniska diagnostiska noggrannheten hos zikavirusdiagnostikplattformen med hjälp av patientprover från zikavirus, parallellt med RT-qPCR för jämförelse. För att validera den pappersbaserade zikadiagnosplattformen användes den bärbara plattläsaren, som kan inkubera och läsa kolorimetriska utdata från pappersbaserade sensorer. Färgförändringen från gult till lila används för att identifiera ett positivt prov, medan ett negativt prov förblir gult (figur 6). Ett ytterligare alternativ för att visualisera resultaten som genereras av den bärbara plattläsaren (figur 8) är att plotta det kolorimetriska svaret för varje pappersbaserad reaktion över tiden. Proverna testades i tre exemplar och de som överskred tröskelvärdet (röd linje inställd på 1) ansågs vara positiva, medan prover under tröskelvärdet ansågs vara negativa (figur 6 och figur 7).
Slutligen, för att utvärdera och jämföra den kliniska prestandan hos Zika toehold switch sensor med den nuvarande guldstandardmetoden för att diagnostisera zikavirusinfektion, testades alla patientprover parallellt med RT-qPCR. Förstärkningsdiagrammet för två representativa patientprover testades i tre exemplar för detektion av zikavirus med RT-qPCR (figur 9). Proverna anses vara positiva när cykeltröskelvärdet (Ct) är ≤38. den röda linjen indikerar ett positivt prov och den blå linjen indikerar ett negativt prov för Zika-virus.
Figur 2: Agarosgelelektrofores för att bedöma kvaliteten på PCR-produkter. PCR-produkter analyseras på en 1% agarosgel i 1X TAE, körs vid 80 V i 90 min. Ett enda tydligt band indikerar vanligtvis en framgångsrik reaktion. Bana 1: 1 kb DNA-stege; Körfält 2-4: 27B switch DNA, 33B trigger DNA respektive 47B trigger DNA. Siffrorna till vänster representerar bandstorlek i bp. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Prototyper av tre tåhållare för pappersbaserade zikasensorer. Prestandan hos tre pappersbaserade RNA-tåhållarsensorer mättes vid 37 °C i över 130 minuter. Varje diagram innehåller två spår, en representerar endast switchkontrollen, medan den andra representerar omkopplaren och utlösaren. De tre graferna representerar data som erhållits med hjälp av tåkopplingssensorer 27B (A), 33B (B) och 47B (C). Felstaplar representerar standardfelet för medelvärdet (SEM) från tre replikat. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Högpresterande sensorer identifieras genom att beräkna vikförändringen i absorbans vid 570 nm. Vikningsförändring (eller maximalt ON/OFF-förhållande) beräknas genom att mäta absorbansförhållandet (OD570) vid 130 min mellan omkopplarens enda kontroll och omkopplaren plus utlösaren CFPS-analys. Felstaplar representerar SEM från tre replikat. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Känslighetsbedömning av högpresterande switch. In vitro-transkriberat zika-RNA titreras till NASBA-reaktioner. Efter en inkubation på 1 timme tillsattes reaktionerna till cellfria PURExpress-reaktioner på pappersskivor i förhållandet 1:7. Vikbytet efter 130 min vid 37 °C plottas. Denna siffra har återgetts från24. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 6: Hämtningssida för bärbar plattläsare som lästs in med inspelade bilddata. Den här bilden visar en exempelbild av den slutliga bilden som tagits av den bärbara plåtläsaren under en datainsamlingskörning. Den ursprungliga datum-/tidsstämpeln visas högst upp i bilden. Gul färg indikerar kontroll eller negativa reaktioner, och den lila färgen indikerar en positiv reaktion. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 7: Dataanalysläge. Till vänster väljer användarna de datauppsättningar de vill rita. Diagrammen visas sedan till höger med unika färger för varje prov eller kontrolluppsättning. Den streckade röda linjen fungerar som en tröskel för att bestämma positiva och negativa prover. Prover som testats i tre exemplar som överskrider tröskelvärdet anses vara positiva, medan prover under tröskelvärdet anses vara negativa. Felstaplar representerar standardavvikelse (SD) från tre replikat. Ctrl 1 till Ctrl 5 indikerar kontroller. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8. PLUM, en bärbar plattläsare. Denna bärbara plattläsare fungerar som ett labb-i-en-låda och fungerar som en temperaturkontrollerad plattläsare för att inkubera och övervaka kolorimetriska reaktioner. Denna bärbara enhet kan tillhandahålla kvantitativa och genomströmningsmätningar av de pappersbaserade zikasensorerna på plats. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 9: RT-qPCR-diagram över förstärkningen av två patientprover som testats i tre exemplar för detektion av zikaviruset. Prover anses vara positiva när cykeltröskelvärdet (Ct) är ≤38. Den prickade röda linjen fungerar som ett tröskelvärde för att bestämma positiva och negativa prover. Det röda spåret indikerar ett positivt prov och det blå spåret indikerar ett negativt prov. ΔRn (delta Rn) -värdet representerar den normaliserade storleken på fluorescenssignalen som detekteras av RT-qPCR-instrumentet för alla testade prover. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande protokollfil. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande siffror. Klicka här för att ladda ner dessa siffror.
Discussion
Det kombinerade pappersbaserade systemet som beskrivs här kan ge kliniskt relevant molekylär diagnostik, med prestanda som är funktionellt jämförbar med RT-qPCR, till behovspunkten6. Det är viktigt att för fjärrinställningar kan tillgängligheten för diagnostik på plats minska tiden till resultat från dagar till timmar. Genom att markera programmerbarheten för detta tillvägagångssätt kan pipelinen som har beskrivits användas för att upptäcka praktiskt taget alla patogenmål. Vi har parat ihop molekylverktygen med en specialbyggd bärbar plattläsare, som är kompakt och kompatibel med batteridrift (8–9 timmar) och tillhandahåller dataanalys ombord för att möjliggöra distribuerade applikationer. I annat arbete har vi validerat den kombinerade hårdvaru- och zikavirusdiagnostikplattformen med 268 patientprover, parallellt med RT-qPCR, och funnit en diagnostisk noggrannhet på 98,5%24. Sammantaget är vårt mål att möjliggöra tekniköverföring av denna plattform till forskare så att den kan återanvändas och förbättras av samhället för att tillgodose ouppfyllda diagnostiska behov.
Designprocessen för in silico toehold switch har integrerats och automatiserats i en pipeline som kan delas in i tre steg. Det första steget genererar en pool av tåhållarswitchdesigner som hybridiserar till målsekvensen i steg om en nukleotid. Det andra steget undersöker den sekundära strukturen och tillgängligheten av tåhållare och eliminerar sensorer med för tidiga stoppkodoner i ramen. En bedömningsfunktion som tar hänsyn till flera faktorer (t.ex. defektnivå för toehold-omkopplaren, tillgänglighet för toehold-omkopplare och målwebbplatsens tillgänglighet) implementeras sedan för att välja topptåomkopplare baserat på övergripande poäng. I det sista steget genereras en lista med sekvenser för de översta tåhållaromkopplardesignerna och deras motsvarande målutlösare. De översta sensorsekvenserna bör screenas för specificitet mot det mänskliga transkriptomet och närbesläktade virusgenom med hjälp av NCBI/Primer-BLAST25. Det är också bästa praxis att screena sensorns målplatser för sekvensbevarande i Zika-virusgenomet för att säkerställa att sensorerna ger bred och robust detektering. Flera versioner av toehold switch design programvara har utvecklats och designalgoritmen tillåter användare att generera två versioner, antingen serie A 6 eller serie B toehold switchar6. I den här artikeln har fokus legat på serie B toehold switch design.
Efter kommersiell DNA-syntes kan tåhållaromkopplarna snabbt monteras och sedan testas genom att utföra en initial skärm mot en syntetisk målutlösningssekvens som motsvarar korta regioner (200-300 nt) av målgenomet. För att screena prestanda för tåhållaromkopplarbaserade sensorer är det idealiskt att lägga till målsekvensen i form av RNA. I den här artikeln har de steg som krävs för att lägga till in vitro-transkriberat trigger-RNA beskrivits. Men om det finns tillgängligt kan genommallar i full längd, såsom kvantifierade virala RNA-extrakt eller kommersiella syntetiska RNA-genom eller standarder, användas. Att använda RNA-genom i full längd för initial screening av tåhållare är fördelaktigt eftersom det kan informera om ytterligare faktorer, såsom RNA-sekundär struktur, kommer att påverka sensorns prestanda. För att optimera ON/OFF-förhållandet för kandidatomkopplare kan tåhållaromkopplarens DNA titreras in i den cellfria reaktionen. Detta steg kan också tjäna till att identifiera högpresterande tåhållebrytare (vikförstärkning eller högt ON / OFF-förhållande) och utelämna läckande tåhållebrytare (hög signal i frånvaro av mål-RNA) från nedströms karakteriseringssteg.
För att förbättra detektionsgränsen för de bäst presterande toehold switch-kandidaterna används NASBA för att öka kliniskt relevanta koncentrationer av zikavirus-RNA till en nivå som kan detekteras med tåhållaromkopplare6. Olika kombinationer av framåt- och bakåtprimersatser screenas för att bestämma de bästa NASBA-primer- och tåhållaromkopplarkombinationerna för att möjliggöra detektion vid kliniskt relevanta koncentrationer. När en idealisk primeruppsättning och kombination av tåhållare har identifierats tas analysen vidare till klinisk validering. Det är viktigt att notera att tåhållaromkopplaren och NASBA-screeningstegen kan vara arbets- och resurskrävande och därför är testutveckling bäst lämpad för välresurserade forskningsplatser. Även om vi inte har tillämpat processautomatisering är det troligt att detta kan påskynda den iterativa designen, bygget och testcykeln32. Lyckligtvis kan handläggningstiden från sensordesign och testning till distribution vara anmärkningsvärt kort (mindre än en vecka), vilket gör denna strategi idealisk för tidskritiska situationer, till exempel epidemiska utbrott6.
Även efter att en biosensor med kliniskt relevant känslighet har utvecklats finns det tekniska utmaningar som måste hanteras. Eftersom detta protokoll involverar manuell drift och är ett flerstegsförfarande finns det risk för korskontaminering mellan prover. Vi gör vårt bästa för att minska denna risk genom noggrann laboratoriepraxis. I en nyligen genomförd klinisk prövning av 268 patientprover stötte vi inte på några kontamineringsproblem; Det är dock en viktig faktor24. Med detta i åtanke förblir protokollet en laboratorieanalys och kräver en skicklig användare med kommando över korrekt molekylärbiologisk teknik. Ett ytterligare övervägande för distribution är RNA-isolering från patientprover. Här beskriver vi RNA-isolering med hjälp av kolonnbaserade nukleinsyraextraktionssatser. I övrigt arbete har vi dock visat en effektiv och enkel kokningslysmetod (95 °C i 2 min) för lågbelastad patientprovbehandling6. Denna strategi eliminerar nästan kostnaden för RNA-extraktion och undviker användning av kolonnbaserade nukleinsyraextraktionssatser, vilket kan utgöra en logistikutmaning i miljöer med låga resurser eller problem med försörjningskedjan under kriser, såsom COVID-19-pandemin33.
Som vi har sett under COVID-19-pandemin kan instrumenten som används för att utföra RT-qPCR själva fungera som en flaskhals och begränsa patientens tillgång till testning. Denna faktor, som också till stor del är ekonomisk, leder till ett centraliserat testläge som kan begränsa diagnostisk åtkomst. Till exempel, under Zika-utbrottet 2015/2016, var endast fem nationella referenslaboratorier tillgängliga i Brasilien, vilket orsakade förseningar i patienttestning. Utan att ta hänsyn till den potentiella fördelen med stordriftsfördelar är den nuvarande kostnaden för varor för den bärbara plattläsaren ~ $ 500 USD, som även om den ökade femfaldigt för att ta hänsyn till arbetskraft och kommersiell marginal, fortfarande ger ett prisvärt instrument. Detta kan jämföras med RT-qPCR-instrument som varierar i kostnad från $ 15,000- $ 90,000 USD34. Dessutom är den uppskattade kostnaden per test för den cellfria analysen i Latinamerika cirka $ 5.48 USD, medan kostnaden per test av RT-qPCR i Brasilien var ~ $ 10-11 USD vid tidpunkten för Zika-utbrottet36. Utöver kostnaden för utrustning har den bärbara plattläsaren ett litet fotavtryck (20 cm3), automatisk analys, datauppladdning till molnet via internet och kan köras på batteriström. Dessa funktioner utökar dramatiskt de potentiella inställningarna där testning kan distribueras och utökar samtidigt patientpopulationen som kan betjänas.
Hittills är de vanligaste kommersiella E. coli CFPS-plattformarna S30- och PURE-systemen37; En viktig faktor för att förbättra tillgången till diagnostik i låg- och medelinkomstländer är dock den begränsade inhemska tillgången på dessa reagenser. Ett viktigt steg mot att lösa denna utmaning är utvecklingen av lokal CFPS-produktion. Federici-labbet har nyligen gjort betydande framsteg mot att utveckla en icke-kommersiell plattform för att implementera tåhållaromkopplarbaserade sensorer i lysatbaserade cellfria system och nått en 2,7 fM LOD med zikavirus RNA14. Denna prestation gör det inte bara möjligt att göra reagenserna i användningslandet, vilket undviker importtullar och förseningar, utan arbetskraftskostnaderna skalas också till lokala priser och därmed kan den totala kostnaden sänkas avsevärt. I det arbete som beskrivs av Federici-gruppen var kostnaden för att producera CFPS-uttrycksreaktionen (5 μL) i Chile 6,9 cent (USD)35,38, vilket gav ett dubbelt incitament (förbättrad logistik och kostnad) för att implementera lysatbaserade system 35,38.
Placeringen av RT-qPCR-jämförbar testning i distribuerade diagnostiska nätverk kan ge betydande fördelar jämfört med nuvarande praxis som är beroende av transport av prover till centraliserade RT-qPCR-anläggningar. I stadsnära miljöer, där zikafallen var koncentrerade, bromsar det fysiska avståndet mellan en patient och diagnosanläggningen diagnosen och ökar risken för att resultaten inte når patienten vid en kliniskt relevant tidpunkt. Det är vår förhoppning att det arbete som presenteras här kan bidra till att göra det möjligt för forskarsamhället att genom kunskapsöverföring skapa decentraliserad bioteknik och bärbar hårdvara för människors hälsa, jordbruk och miljöövervakning.
Disclosures
K.P. och A.A.G. är meduppfinnare av pappersbaserad tåsensorrelaterad teknik. Y.G., S.C. och K.P. är medgrundare av LSK Technologies, Inc. M.K., K.P. och A.A.G. är medgrundare av En Carta Diagnostics Ltd. Andra författare har inga intressekonflikter. Patent: PLUM-enhet: Y.G., S.C. och K.P. patentansökan lämnades in av University of Toronto och tilldelades LSK Technologies Inc. Toehold switch patent: A.A.G., P.Y. och J.J. C. "Riboregulator compositions and methods of use", Patent. WO2014074648A3 arkiverad 6 november 2012; Pappersbaserat diagnostiskt patent: K.P. och J.J.C. "Paper-based synthetic gene networks" U.S. patent pending No. US15/963,831 arkiverad 6 december 2013; Zika-patent 1: K.P., A.A.G., M.K.T., D.B., G.L., T.F. och J.J.C., "Portable, Low-Cost Virus Detection and Strain Identification Platform", U. S. Provisional Patent Application No. 62/403,778 inlämnad 4 oktober 2016; Zika-patent 2: K.P., A. A.G., M.K.T., D.B., G.L., T.F. och J.J.C., "Portable, Low-Cost Virus Detection and Strain Identification Platform", USA: s provisoriska patentansökan nr 62/341,221 inlämnad 25 maj 2016.
Acknowledgments
Författarna tackar alla medlemmar i Green, Pardee och Pena labs samt alla medförfattare till tidigare manuskript som rör det arbete som avslöjas i detta manuskript. SJ R.d.S. stöddes av ett doktorandstipendium sponsrat av Foundation for Science and Technology of Pernambuco (FACEPE), Brasilien, referensnummer IBPG-1321-2.12/18, och stöds för närvarande av ett postdoktoralt stipendium sponsrat av University of Toronto, Kanada. PB stöds av William Knapp Buckley Award från farmaceutiska fakulteten, University of Toronto. M.K. stöddes av Precision Medicine Initiative (PRiME) vid University of Torontos interna stipendienummer PRMF2019-002. Detta arbete stöddes av medel till K.P från Canada Research Chairs Program (Files 950-231075 och 950-233107), University of Toronto's Major Research Project Management Fund, CIHR Foundation Grant Program (201610FDN-375469) och till L.P, A.A.G. och K.P genom CIHR/IDRC Team Grant: Canada-Latin/America-Caribbean Zika Virus Program (FRN: 149783), samt genom medel till K.P. från Kanadas International Development Research Center (bidrag 109434-001) genom den kanadensiska 2019 Novel Coronavirus (COVID-19) Rapid Research Funding Opportunity. Detta arbete stöddes också av medel till A.A.G. från en Arizona Biomedical Research Commission New Investigator Award (ADHS16-162400), Gates Foundation (OPP1160667), en NIH Director's New Innovator Award (1DP2GM126892), en NIH R21-utmärkelse (1R21AI136571-01A1) till K.P./A.A.G och ett Alfred P. Sloan Fellowship (FG-2017-9108). Figur 1 skapades med Biorender.com under akademisk licens till K.P.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 384 well plate covers - aluminum | Sarstedt | 95.1995 | Used to cover the 384-well plates before they are inserted into the PLUM reader |
| 384 well plate covers - transparent | Sarstedt | 95.1994 | Used to cover the 384-well plates before they are inserted into the BioTek plate reader |
| 384 well plates | VWR | CA11006-180 | 2 mm paper-based diagnostics are placed into the wells of these plates for quantification |
| Agarose | BioShop Canada | AGA001.500 | Gel electrophoresis |
| BSA | BioShop Canada | ALB001.500 | Blocking agent for the Whatman filter paper |
| Cell free reactions | New England Biolabs | E6800L | PURExpress |
| CPRG | Roche | 10884308001 | Chlorophenol red-b-D-galactopyranoside |
| Disposable Sterile Biopsy Punches | Integra Miltex | 23233-31 | Used to create 2 mm paper discs that fit into a 384-well plate |
| DNAse I | Thermo Scientific | K2981 | Digests template DNA following incubation of the in vitro transcription reaction |
| DNAse I Kit | Thermo Scientific | 74104 | DNase I Kit For removing template DNA from IVT RNA |
| dNTPs | New England Biolabs | N0446S | Used for PCRs |
| electrophoresis system | Bio-Rad | 1704487 | Used to run the agarose gels |
| Gel imaging station | Bio-Rad | 1708265 | ChemiDoc XRS+ Imaging System |
| IVT kit | New England Biolabs | E2040S | Used for in vitro transcribing template (trigger) RNA for switch screening |
| Nanodrop One | Thermo Scientific | ND-ONE-W | Used for determining nucleic acid concentrations |
| NASBA kit | Life Sciences Advanced Technologies | NWK-1 | Isothermal amplification reaction components |
| Nuclease free H20 | invitrogen | 10977015 | Added to reaction mixes |
| PAGE electrophoresis system | Biorad | 1658001FC | Used to cast and run polyacrylamide gels |
| pCOLADuet-LacZ DNA | Addgene | 75006 | https://www.addgene.org/75006/ |
| Phusion polymerase/reactioin buffer | New England Biolabs | M0530L | Used for PCRs |
| Plate reader | BioTek | BioTek NEO2 | Multi Mode Plate Reader, Synergy Neo2 |
| Primers | Integrated DNA Technologies | Custom oligo synthesis | |
| Q5 polymerase/reaction buffer | New England Biolabs | M0491L | Used for PCRs |
| Qiagen PCR Puriifcation Kit | QIAGEN | 27106 | QIAprep Spin Miniprep Kit |
| RNA loading dye | New England Biolabs | B0363S | 2X RNA loading dye |
| RNA Purification Kit | QIAGEN | EN0521 | QIAamp Viral RNA extraction kit |
| RNase inhibitor | New England Biolabs | M0314S | Used to prevent contamination of RNases A, B, and C |
| RT-qPCR kit | QIAGEN | 208352 | QuantiNova Probe RT-PCR Kit |
| SYBR Gold | Invitrogen S11494 | S11494 | PAGE gel stain for nucleic acids |
| TAE Buffer | BioShop Canada | TAE222.4 | Gel electrophoresis buffer |
| Thermal Cycler | Applied Biosystems | 4484073 | Used for temperature cycling and incubating reactions |
| Whatman 42 filter paper | GE Healthcare | 1442-042 | Used to imbed molecular components for paper-based diagnostics |
References
- Urdea, M., et al. Requirements for high impact diagnostics in the developing world. Nature. 444, Suppl 1 73-79 (2006).
- Yager, P., Domingo, G. J., Gerdes, J. Point-of-care diagnostics for global health. Annual Review of Biomedical Engineering. 10, 107-144 (2008).
- Faria, N. R., et al. Mobile real-time surveillance of Zika virus in Brazil. Genome Medicine. 8 (1), 97 (2016).
- Faria, N. R., et al. Zika virus in the Americas: Early epidemiological and genetic findings. Science. 352 (6283), 345-349 (2016).
- Pardee, K., et al.
- Pardee, K., et al. Rapid, low-cost detection of Zika virus using programmable biomolecular components. Cell. 165 (5), 1255-1266 (2016).
- Duyen, T. T. M., et al. Paper-based colorimetric biosensor for antibiotics inhibiting bacterial protein synthesis. Journal of Bioscience and Bioengineering. 123 (1), 96-100 (2017).
- Jung, J. K., et al. Cell-free biosensors for rapid detection of water contaminants. Nature Biotechnology. 38 (12), 1451-1459 (2020).
- Yang, Y. H., et al. Cell-free Escherichia coli-based system to screen for quorum-sensing molecules interacting with quorum receptor proteins of streptomyces coelicolor. Applied and Environmental Microbiology. 75 (19), 6367 (2009).
- Ma, D., Shen, L., Wu, K., Diehnelt, C. W., Green, A. A. Low-cost detection of norovirus using paper-based cell-free systems and synbody-based viral enrichment. Synthetic Biology. 3 (1), (2018).
- Park, S., Lee, J. W. Detection of coronaviruses using RNA toehold switch sensors. International Journal of Molecular Sciences. 22 (4), 1-13 (2021).
- Amalfitano, E., et al. A glucose meter interface for point-of-care gene circuit-based diagnostics. Nature Communications. 12 (1), 1-10 (2021).
- Nguyen, P. Q., et al. Wearable materials with embedded synthetic biology sensors for biomolecule detection. Nature Biotechnology. 39 (11), 1366-1374 (2021).
- Pellinen, T., Huovinen, T., Karp, M. A cell-free biosensor for the detection of transcriptional inducers using firefly luciferase as a reporter. Analytical Biochemistry. 330 (1), 52-57 (2004).
- Salehi, A. S. M., et al. Cell-free protein synthesis approach to biosensing hTRβ-specific endocrine disruptors. Analytical Chemistry. 89 (6), 3395-3401 (2017).
- Salehi, A. S. M., et al. Biosensing estrogenic endocrine disruptors in human blood and urine: A RAPID cell-free protein synthesis approach. Toxicology and Applied Pharmacology. 345, 19-25 (2018).
- Voyvodic, P. L., et al. Plug-and-play metabolic transducers expand the chemical detection space of cell-free biosensors. Nature Communications. 10 (1), 1-8 (2019).
- Yang, W. C., Patel, K. G., Wong, H. E., Swartz, J. R. Simplifying and streamlining Escherichia coli-based cell-free protein synthesis. Biotechnology Progress. 28 (2), 413-420 (2012).
- Gräwe, A., et al. A paper-based, cell-free biosensor system for the detection of heavy metals and date rape drugs. PLOS One. 14 (3), 0210940 (2019).
- Green, A. A., Silver, P. A., Collins, J. J., Yin, P. Toehold Switches: De-Novo-Designed Regulators of Gene Expression. Cell. 159 (4), 925-939 (2014).
- Craw, P., Balachandran, W. Isothermal nucleic acid amplification technologies for point-of-care diagnostics: a critical review. Lab on a Chip. 12 (14), 2469-2486 (2012).
- Zyrina, N. V., Antipova, V. N. Nonspecific Synthesis in the Reactions of Isothermal Nucleic Acid Amplification. Biochemistry (Moscow). 86 (7), 887-897 (2021).
- Takahashi, M. K., et al. A low-cost paper-based synthetic biology platform for analyzing gut microbiota and host biomarkers. Nature Communications. 9 (1), 1-12 (2018).
- Karlikow, M., et al. Field validation of the performance of paper-based tests for the detection of the Zika and chikungunya viruses in serum samples. Nature Biomedical Engineering. 6 (3), 246-256 (2022).
- Agarwala, R., et al. Database resources of the National Center for Biotechnology Information. Nucleic Acids Research. 44 (1), 7-19 (2016).
- BLAST: Basic Local Alignment Search Tool. , Available from: https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi (2022).
- Deiman, B., Van Aarle, P., Sillekens, P. Characteristics and applications of nucleic acid sequence-based amplification (NASBA). Molecular Biotechnology. 20 (2), 163-179 (2002).
- Zadeh, J. N., Wolfe, B. R., Pierce, N. A. Nucleic acid sequence design via efficient ensemble defect optimization. Journal of Computational Chemistry. 32 (3), 439-452 (2011).
- NUPACK: Nucleic Acid Package. , Available from: http://www.nupack.org/ (2022).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. DNA Gel Electrophoresis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , Cambridge, MA. (2021).
- Lanciotti, R. S., et al. Genetic and serologic properties of Zika virus associated with an epidemic, Yap State, Micronesia, 2007. Emerging Infectious Diseases. 14 (8), 1232 (2008).
- Walsh, D. I., et al. Standardizing automated DNA assembly: Best practices, metrics, and protocols using robots. SLAS Technology. 24 (3), 282 (2019).
- Silva, S. J. R., de Magalhães, J. J. F., de Pena, L. Simultaneous circulation of DENV, CHIKV, ZIKV and SARS-CoV-2 in Brazil: An inconvenient truth. One Health. 12, 100205 (2021).
- Kimura, S., Fujinaga, K., Sekiya, T. PCR machine. Tanpakushitsu kakusan koso. Protein, Nucleic Acid, Enzyme. 41 (5), 514-517 (1996).
- Arce, A., et al. Decentralizing cell-free RNA sensing with the use of low-cost cell extracts. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 727584 (2021).
- Silva, S. J. R., Pardee, K., Balasuriya, U. B. R., Pena, L. Development and validation of a one-step reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) for rapid detection of ZIKV in patient samples from Brazil. Scientific Reports. 11 (1), 1-13 (2021).
- Shimizu, Y. Cell-free translation reconstituted with purified components. Nature Biotechnology. 19 (8), 751-755 (2001).
- Lavickova, B., Maerkl, S. J. A simple, robust, and low-cost method to produce the PURE cell-free system. ACS Synthetic Biology. 8 (2), 455-462 (2019).
