Tillgång till decentraliserad, billig och högkapacitetsdiagnostik som kan distribueras i samhället för decentraliserad testning är avgörande för att bekämpa globala hälsokriser. Detta manuskript beskriver hur man bygger pappersbaserad diagnostik för virala RNA-sekvenser som kan detekteras med en bärbar optisk läsare.
Tillgång till molekylär diagnostik med låg belastning som kan distribueras i samhället för testning blir allt viktigare och har meningsfulla bredare konsekvenser för samhällenas välbefinnande och ekonomisk stabilitet. Under de senaste åren har flera nya isotermiska diagnostiska metoder dykt upp för att möta behovet av snabb, billig molekylär diagnostik. Vi har bidragit till detta arbete genom utveckling och patientvalidering av tåhållarbaserad diagnostik, inklusive diagnostik för myggburna zika- och chikungunyavirus, vilket gav prestanda jämförbar med guldstandard omvänd transkriptionskvantitativ polymeraskedjereaktion (RT-qPCR) baserade analyser. Dessa diagnostiker är billiga att utveckla och tillverka, och de har potential att ge diagnostisk kapacitet till miljöer med låg resurs. Här ger protokollet alla steg som krävs för att utveckla en switchbaserad analys för Zika-virusdetektering. Artikeln tar läsarna genom den stegvisa diagnostiska utvecklingsprocessen. För det första fungerar genomiska sekvenser av zikavirus som indata för beräkningsdesign av kandidatswitchar med hjälp av programvara med öppen källkod. Därefter visas montering av sensorerna för empirisk screening med syntetiska RNA-sekvenser och optimering av diagnostisk känslighet. När valideringen är klar utförs valideringen med patientprover parallellt med RT-qPCR och en specialbyggd optisk läsare, PLUM. Detta arbete ger en teknisk färdplan till forskare för utveckling av billiga tåhållarbaserade sensorer för applikationer inom människors hälsa, jordbruk och miljöövervakning.
RT-qPCR har förblivit guldstandardtekniken för klinisk diagnostik på grund av dess utmärkta känslighet och specificitet. Även om den är mycket robust beror metoden på dyr, specialiserad utrustning och reagenser som kräver temperaturkontrollerad distribution och lagring. Detta utgör betydande hinder för tillgången till kvalitetsdiagnostik globalt, särskilt i tider av sjukdomsutbrott och i regioner där tillgången till välutrustade laboratorier är begränsad 1,2. Detta observerades under zikavirusutbrottet 2015/2016 i Brasilien. Med endast fem centraliserade laboratorier tillgängliga för att tillhandahålla RT-qPCR-testning resulterade betydande flaskhalsar, vilket begränsade tillgången till diagnostik. Detta var särskilt utmanande för individer i stadsnära miljöer, som drabbades hårdare av utbrottet 3,4. I ett försök att förbättra åtkomsten till diagnostik visar protokollet en plattform som har utvecklats med potential att tillhandahålla decentraliserad, billig och högkapacitetsdiagnostik i miljöer med låg resurs. Som en del av detta etablerades en diagnostisk upptäcktspipeline som kopplar isotermisk förstärkning och syntetiska RNA-switchbaserade sensorer med pappersbaserade cellfria uttryckssystem 5,6.
Cellfria proteinsyntessystem (CFPS), särskilt E. coli-baserade cellfria system, är en attraktiv plattform för ett brett spektrum av biosensingapplikationer från miljöövervakning7,8 till patogendiagnostik 5,6,9,10,11,12 . CFPS-system består av de komponenter som är nödvändiga för transkription och översättning och har betydande fördelar jämfört med helcellsbiosensorer. Specifikt är avkänning inte begränsad av en cellvägg och i allmänhet är de modulära i design, biosäkra, billiga och kan frystorkas för bärbar användning. Förmågan att frystorka genkretsbaserade reaktioner på substrat som papper eller textilier möjliggör transport, långvarig lagring vid rumstemperatur5 och till och med införlivande i bärbar teknik13.
Tidigare arbete har visat att E. coli-cellfria system kan användas för att detektera många analyter, till exempel giftiga metaller som kvicksilver, antibiotika som tetracyklin7,14, hormonstörande kemikalier15,16, biomarkörer som hippursyra 17, patogenassocierade kvorumavkänningsmolekyler 9,18 och olagliga ämnen som kokain 17 och gammahydroxibutyrat (GHB)19 . För sekvensspecifik detektion av nukleinsyror har strategier för det mesta förlitat sig på användningen av switchbaserade biosensorer kopplade till isotermiska förstärkningstekniker. Toehold-omkopplare är syntetiska riboregulatorer (även kallade helt enkelt “switchar” i resten av texten) som innehåller en hårnålstruktur som blockerar nedströms översättning genom att binda ribosomalt bindningsställe (RBS) och startkodonet. Vid interaktion med deras målutlösande RNA lindras hårnålsstrukturen och efterföljande översättning av en reporter öppen läsram aktiveras20.
Isotermisk förstärkning kan också användas som molekylär diagnostik21; Dessa metoder är emellertid benägna att ospecifik förstärkning, vilket kan minska testets specificitet och därmed noggrannheten till under RT-qPCR 22. I det arbete som rapporteras här användes isotermisk förstärkning uppströms de switchbaserade sensorerna för att ge kombinerad signalförstärkning som möjliggör kliniskt relevant detektion av nukleinsyror (femtomolar till attomolar). Denna parning av de två metoderna ger också två sekvensspecifika kontrollpunkter som i kombination ger en hög grad av specificitet. Med hjälp av detta tillvägagångssätt har tidigare arbete visat detektion av virus som Zika6, Ebola5, Norovirus10, liksom patogena bakterier som C. difficile23 och antibiotikaresistent tyfus12. Senast har cellfria tåhållare demonstrerats för SARS-CoV-2-detektion i försök att tillhandahålla tillgänglig diagnostik för COVID-19-pandemin11,12,13.
Följande protokoll beskriver utvecklingen och valideringen av cellfri, pappersbaserad syntetisk toehold-switchanalys för zikavirusdetektering, från in silico-biosensordesign , via monterings- och optimeringsstegen, till fältvalidering med patientprover. Protokollet börjar med in silico-designen av RNA-toehold-switchbaserade sensorer och isotermiska förstärkningsprimrar som är specifika för Zika-viralt RNA. Även om det finns många isotermiska förstärkningsmetoder, visades här användningen av nukleinsyrasekvensbaserad förstärkning (NASBA) för att öka koncentrationen av viralt RNA-mål närvarande i reaktionen, vilket möjliggjorde kliniskt signifikant känslighet. Praktiskt taget har isotermiska förstärkningsmetoder fördelen att de arbetar vid konstant temperatur, vilket eliminerar behovet av specialutrustning, såsom termiska cykler, som i allmänhet är begränsade till centraliserade platser.
Därefter beskrivs processen att montera de syntetiska tåhållaromkopplarsensorerna med reporterkodningssekvenser genom överlappningsförlängning PCR och screening av de syntetiska tåhållaromkopplarsensorerna för optimal prestanda i cellfria system med syntetiskt RNA. För denna uppsättning Zika-virussensorer har vi valt lacZ-genen som kodar för enzymet β-galaktosidas, som kan klyva ett kolorimetriskt substrat, klorfenolrött-β-D-galaktopyranosid (CPRG), för att producera en gul till lila färgförändring som kan detekteras av ögat eller med en plattläsare. När högpresterande syntetiska omkopplare har identifierats beskrivs processen för screening av primers för nukleinsyrasekvensbaserad isotermisk förstärkning av motsvarande målsekvens med syntetiskt RNA för att hitta uppsättningar som ger den bästa känsligheten.
Slutligen valideras diagnostikplattformens prestanda på plats i Latinamerika (figur 1). För att bestämma den kliniska diagnostiska noggrannheten utförs den pappersbaserade cellfria analysen med hjälp av Zika-virusprover från patienter; parallellt utförs en guldstandard RT-qPCR-analys för jämförelse. För att övervaka kolorimetriska cellfria analyser möjliggör vi kvantifiering på plats av resultat i regioner där termiska cykler inte är tillgängliga. Den handmonterade plattläsaren som kallas Portable, Low-Cost, User-friendly, Multimodal (PLUM; nedan kallad bärbar plattläsare) introduceras också här24. Den bärbara plattläsaren utvecklades ursprungligen som en kompletterande enhet för cellfri syntetisk tåhållaromkopplardiagnostik och erbjuder ett tillgängligt sätt att inkubera och läsa resultat på ett sätt med hög genomströmning, vilket ger integrerad, datorvisionsbaserad mjukvaruanalys för användare.
Figur 1: Arbetsflöde för testning av patientprover med pappersbaserade cellfria tåhållarreaktioner. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Det kombinerade pappersbaserade systemet som beskrivs här kan ge kliniskt relevant molekylär diagnostik, med prestanda som är funktionellt jämförbar med RT-qPCR, till behovspunkten6. Det är viktigt att för fjärrinställningar kan tillgängligheten för diagnostik på plats minska tiden till resultat från dagar till timmar. Genom att markera programmerbarheten för detta tillvägagångssätt kan pipelinen som har beskrivits användas för att upptäcka praktiskt taget alla patogenmål. Vi har parat ihop molekylverktygen med en specialbyggd bärbar plattläsare, som är kompakt och kompatibel med batteridrift (8–9 timmar) och tillhandahåller dataanalys ombord för att möjliggöra distribuerade applikationer. I annat arbete har vi validerat den kombinerade hårdvaru- och zikavirusdiagnostikplattformen med 268 patientprover, parallellt med RT-qPCR, och funnit en diagnostisk noggrannhet på 98,5%24. Sammantaget är vårt mål att möjliggöra tekniköverföring av denna plattform till forskare så att den kan återanvändas och förbättras av samhället för att tillgodose ouppfyllda diagnostiska behov.
Designprocessen för in silico toehold switch har integrerats och automatiserats i en pipeline som kan delas in i tre steg. Det första steget genererar en pool av tåhållarswitchdesigner som hybridiserar till målsekvensen i steg om en nukleotid. Det andra steget undersöker den sekundära strukturen och tillgängligheten av tåhållare och eliminerar sensorer med för tidiga stoppkodoner i ramen. En bedömningsfunktion som tar hänsyn till flera faktorer (t.ex. defektnivå för toehold-omkopplaren, tillgänglighet för toehold-omkopplare och målwebbplatsens tillgänglighet) implementeras sedan för att välja topptåomkopplare baserat på övergripande poäng. I det sista steget genereras en lista med sekvenser för de översta tåhållaromkopplardesignerna och deras motsvarande målutlösare. De översta sensorsekvenserna bör screenas för specificitet mot det mänskliga transkriptomet och närbesläktade virusgenom med hjälp av NCBI/Primer-BLAST25. Det är också bästa praxis att screena sensorns målplatser för sekvensbevarande i Zika-virusgenomet för att säkerställa att sensorerna ger bred och robust detektering. Flera versioner av toehold switch design programvara har utvecklats och designalgoritmen tillåter användare att generera två versioner, antingen serie A 6 eller serie B toehold switchar6. I den här artikeln har fokus legat på serie B toehold switch design.
Efter kommersiell DNA-syntes kan tåhållaromkopplarna snabbt monteras och sedan testas genom att utföra en initial skärm mot en syntetisk målutlösningssekvens som motsvarar korta regioner (200-300 nt) av målgenomet. För att screena prestanda för tåhållaromkopplarbaserade sensorer är det idealiskt att lägga till målsekvensen i form av RNA. I den här artikeln har de steg som krävs för att lägga till in vitro-transkriberat trigger-RNA beskrivits. Men om det finns tillgängligt kan genommallar i full längd, såsom kvantifierade virala RNA-extrakt eller kommersiella syntetiska RNA-genom eller standarder, användas. Att använda RNA-genom i full längd för initial screening av tåhållare är fördelaktigt eftersom det kan informera om ytterligare faktorer, såsom RNA-sekundär struktur, kommer att påverka sensorns prestanda. För att optimera ON/OFF-förhållandet för kandidatomkopplare kan tåhållaromkopplarens DNA titreras in i den cellfria reaktionen. Detta steg kan också tjäna till att identifiera högpresterande tåhållebrytare (vikförstärkning eller högt ON / OFF-förhållande) och utelämna läckande tåhållebrytare (hög signal i frånvaro av mål-RNA) från nedströms karakteriseringssteg.
För att förbättra detektionsgränsen för de bäst presterande toehold switch-kandidaterna används NASBA för att öka kliniskt relevanta koncentrationer av zikavirus-RNA till en nivå som kan detekteras med tåhållaromkopplare6. Olika kombinationer av framåt- och bakåtprimersatser screenas för att bestämma de bästa NASBA-primer- och tåhållaromkopplarkombinationerna för att möjliggöra detektion vid kliniskt relevanta koncentrationer. När en idealisk primeruppsättning och kombination av tåhållare har identifierats tas analysen vidare till klinisk validering. Det är viktigt att notera att tåhållaromkopplaren och NASBA-screeningstegen kan vara arbets- och resurskrävande och därför är testutveckling bäst lämpad för välresurserade forskningsplatser. Även om vi inte har tillämpat processautomatisering är det troligt att detta kan påskynda den iterativa designen, bygget och testcykeln32. Lyckligtvis kan handläggningstiden från sensordesign och testning till distribution vara anmärkningsvärt kort (mindre än en vecka), vilket gör denna strategi idealisk för tidskritiska situationer, till exempel epidemiska utbrott6.
Även efter att en biosensor med kliniskt relevant känslighet har utvecklats finns det tekniska utmaningar som måste hanteras. Eftersom detta protokoll involverar manuell drift och är ett flerstegsförfarande finns det risk för korskontaminering mellan prover. Vi gör vårt bästa för att minska denna risk genom noggrann laboratoriepraxis. I en nyligen genomförd klinisk prövning av 268 patientprover stötte vi inte på några kontamineringsproblem; Det är dock en viktig faktor24. Med detta i åtanke förblir protokollet en laboratorieanalys och kräver en skicklig användare med kommando över korrekt molekylärbiologisk teknik. Ett ytterligare övervägande för distribution är RNA-isolering från patientprover. Här beskriver vi RNA-isolering med hjälp av kolonnbaserade nukleinsyraextraktionssatser. I övrigt arbete har vi dock visat en effektiv och enkel kokningslysmetod (95 °C i 2 min) för lågbelastad patientprovbehandling6. Denna strategi eliminerar nästan kostnaden för RNA-extraktion och undviker användning av kolonnbaserade nukleinsyraextraktionssatser, vilket kan utgöra en logistikutmaning i miljöer med låga resurser eller problem med försörjningskedjan under kriser, såsom COVID-19-pandemin33.
Som vi har sett under COVID-19-pandemin kan instrumenten som används för att utföra RT-qPCR själva fungera som en flaskhals och begränsa patientens tillgång till testning. Denna faktor, som också till stor del är ekonomisk, leder till ett centraliserat testläge som kan begränsa diagnostisk åtkomst. Till exempel, under Zika-utbrottet 2015/2016, var endast fem nationella referenslaboratorier tillgängliga i Brasilien, vilket orsakade förseningar i patienttestning. Utan att ta hänsyn till den potentiella fördelen med stordriftsfördelar är den nuvarande kostnaden för varor för den bärbara plattläsaren ~ $ 500 USD, som även om den ökade femfaldigt för att ta hänsyn till arbetskraft och kommersiell marginal, fortfarande ger ett prisvärt instrument. Detta kan jämföras med RT-qPCR-instrument som varierar i kostnad från $ 15,000- $ 90,000 USD34. Dessutom är den uppskattade kostnaden per test för den cellfria analysen i Latinamerika cirka $ 5.48 USD, medan kostnaden per test av RT-qPCR i Brasilien var ~ $ 10-11 USD vid tidpunkten för Zika-utbrottet36. Utöver kostnaden för utrustning har den bärbara plattläsaren ett litet fotavtryck (20 cm3), automatisk analys, datauppladdning till molnet via internet och kan köras på batteriström. Dessa funktioner utökar dramatiskt de potentiella inställningarna där testning kan distribueras och utökar samtidigt patientpopulationen som kan betjänas.
Hittills är de vanligaste kommersiella E. coli CFPS-plattformarna S30- och PURE-systemen37; En viktig faktor för att förbättra tillgången till diagnostik i låg- och medelinkomstländer är dock den begränsade inhemska tillgången på dessa reagenser. Ett viktigt steg mot att lösa denna utmaning är utvecklingen av lokal CFPS-produktion. Federici-labbet har nyligen gjort betydande framsteg mot att utveckla en icke-kommersiell plattform för att implementera tåhållaromkopplarbaserade sensorer i lysatbaserade cellfria system och nått en 2,7 fM LOD med zikavirus RNA14. Denna prestation gör det inte bara möjligt att göra reagenserna i användningslandet, vilket undviker importtullar och förseningar, utan arbetskraftskostnaderna skalas också till lokala priser och därmed kan den totala kostnaden sänkas avsevärt. I det arbete som beskrivs av Federici-gruppen var kostnaden för att producera CFPS-uttrycksreaktionen (5 μL) i Chile 6,9 cent (USD)35,38, vilket gav ett dubbelt incitament (förbättrad logistik och kostnad) för att implementera lysatbaserade system 35,38.
Placeringen av RT-qPCR-jämförbar testning i distribuerade diagnostiska nätverk kan ge betydande fördelar jämfört med nuvarande praxis som är beroende av transport av prover till centraliserade RT-qPCR-anläggningar. I stadsnära miljöer, där zikafallen var koncentrerade, bromsar det fysiska avståndet mellan en patient och diagnosanläggningen diagnosen och ökar risken för att resultaten inte når patienten vid en kliniskt relevant tidpunkt. Det är vår förhoppning att det arbete som presenteras här kan bidra till att göra det möjligt för forskarsamhället att genom kunskapsöverföring skapa decentraliserad bioteknik och bärbar hårdvara för människors hälsa, jordbruk och miljöövervakning.
The authors have nothing to disclose.
Författarna tackar alla medlemmar i Green, Pardee och Pena labs samt alla medförfattare till tidigare manuskript som rör det arbete som avslöjas i detta manuskript. SJ R.d.S. stöddes av ett doktorandstipendium sponsrat av Foundation for Science and Technology of Pernambuco (FACEPE), Brasilien, referensnummer IBPG-1321-2.12/18, och stöds för närvarande av ett postdoktoralt stipendium sponsrat av University of Toronto, Kanada. PB stöds av William Knapp Buckley Award från farmaceutiska fakulteten, University of Toronto. M.K. stöddes av Precision Medicine Initiative (PRiME) vid University of Torontos interna stipendienummer PRMF2019-002. Detta arbete stöddes av medel till K.P från Canada Research Chairs Program (Files 950-231075 och 950-233107), University of Toronto’s Major Research Project Management Fund, CIHR Foundation Grant Program (201610FDN-375469) och till L.P, A.A.G. och K.P genom CIHR/IDRC Team Grant: Canada-Latin/America-Caribbean Zika Virus Program (FRN: 149783), samt genom medel till K.P. från Kanadas International Development Research Center (bidrag 109434-001) genom den kanadensiska 2019 Novel Coronavirus (COVID-19) Rapid Research Funding Opportunity. Detta arbete stöddes också av medel till A.A.G. från en Arizona Biomedical Research Commission New Investigator Award (ADHS16-162400), Gates Foundation (OPP1160667), en NIH Director’s New Innovator Award (1DP2GM126892), en NIH R21-utmärkelse (1R21AI136571-01A1) till K.P./A.A.G och ett Alfred P. Sloan Fellowship (FG-2017-9108). Figur 1 skapades med Biorender.com under akademisk licens till K.P.
384 well plate covers – aluminum | Sarstedt | 95.1995 | Used to cover the 384-well plates before they are inserted into the PLUM reader |
384 well plate covers – transparent | Sarstedt | 95.1994 | Used to cover the 384-well plates before they are inserted into the BioTek plate reader |
384 well plates | VWR | CA11006-180 | 2 mm paper-based diagnostics are placed into the wells of these plates for quantification |
Agarose | BioShop Canada | AGA001.500 | Gel electrophoresis |
BSA | BioShop Canada | ALB001.500 | Blocking agent for the Whatman filter paper |
Cell free reactions | New England Biolabs | E6800L | PURExpress |
CPRG | Roche | 10884308001 | Chlorophenol red-b-D-galactopyranoside |
Disposable Sterile Biopsy Punches | Integra Miltex | 23233-31 | Used to create 2 mm paper discs that fit into a 384-well plate |
DNAse I | Thermo Scientific | K2981 | Digests template DNA following incubation of the in vitro transcription reaction |
DNAse I Kit | Thermo Scientific | 74104 | DNase I Kit For removing template DNA from IVT RNA |
dNTPs | New England Biolabs | N0446S | Used for PCRs |
electrophoresis system | Bio-Rad | 1704487 | Used to run the agarose gels |
Gel imaging station | Bio-Rad | 1708265 | ChemiDoc XRS+ Imaging System |
IVT kit | New England Biolabs | E2040S | Used for in vitro transcribing template (trigger) RNA for switch screening |
Nanodrop One | Thermo Scientific | ND-ONE-W | Used for determining nucleic acid concentrations |
NASBA kit | Life Sciences Advanced Technologies | NWK-1 | Isothermal amplification reaction components |
Nuclease free H20 | invitrogen | 10977015 | Added to reaction mixes |
PAGE electrophoresis system | Biorad | 1658001FC | Used to cast and run polyacrylamide gels |
pCOLADuet-LacZ DNA | Addgene | 75006 | https://www.addgene.org/75006/ |
Phusion polymerase/reactioin buffer | New England Biolabs | M0530L | Used for PCRs |
Plate reader | BioTek | BioTek NEO2 | Multi Mode Plate Reader, Synergy Neo2 |
Primers | Integrated DNA Technologies | Custom oligo synthesis | |
Q5 polymerase/reaction buffer | New England Biolabs | M0491L | Used for PCRs |
Qiagen PCR Puriifcation Kit | QIAGEN | 27106 | QIAprep Spin Miniprep Kit |
RNA loading dye | New England Biolabs | B0363S | 2X RNA loading dye |
RNA Purification Kit | QIAGEN | EN0521 | QIAamp Viral RNA extraction kit |
RNase inhibitor | New England Biolabs | M0314S | Used to prevent contamination of RNases A, B, and C |
RT-qPCR kit | QIAGEN | 208352 | QuantiNova Probe RT-PCR Kit |
SYBR Gold | Invitrogen S11494 | S11494 | PAGE gel stain for nucleic acids |
TAE Buffer | BioShop Canada | TAE222.4 | Gel electrophoresis buffer |
Thermal Cycler | Applied Biosystems | 4484073 | Used for temperature cycling and incubating reactions |
Whatman 42 filter paper | GE Healthcare | 1442-042 | Used to imbed molecular components for paper-based diagnostics |