Summary
本文介绍了一种相干拉曼散射成像方法，用于可视化和量化皮肤内的药物化合物。本文介绍了皮肤组织制剂（人和小鼠）和局部制剂的应用，用于量化时空浓度曲线的图像采集，以及用于评估局部药物递送的初步药代动力学分析。
Abstract
局部制剂应用后的皮肤药代动力学（cPK）一直是监管和药物开发科学家特别感兴趣的研究领域，以机械方式了解局部生物利用度（BA）。半侵入性技术，如胶带剥离、真皮微透析或真皮开流微灌注，均可量化大尺度 cPK。虽然这些技术提供了大量的cPK知识，但社区缺乏对细胞水平的活性药物成分（API）渗透和渗透的机制理解。
解决微尺度cPK的一种非侵入性方法是相干拉曼散射成像（CRI），其选择性地靶向内在分子振动，而无需外在标记或化学修饰。CRI有两种主要方法 - 相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）和刺激拉曼散射（SRS） - 能够对API或非活性成分进行灵敏和选择性定量。CARS通常用于获取结构皮肤信息或可视化化学对比度。相比之下，SRS信号与分子浓度呈线性关系，用于量化皮肤分层中的API或非活性成分。
虽然小鼠组织通常用于CPK与CRI，但在监管批准之前，最终必须在人体组织中评估局部BA和生物等效性（BE）。本文提出了一种制备和成像 离体 皮肤的方法，用于定量药代动力学CRI研究，以评估局部BA和BE。随着时间的推移，该方法可在人类和小鼠皮肤内实现可靠且可重复的API定量。定量富脂区和贫脂区室内的浓度，以及随时间推移的总API浓度;这些用于估计微观和宏观尺度的BA，以及潜在的BE。
Introduction
局部药物产品应用后评估cPK的方法已从经典的体外渗透试验（IVPT）研究1，2，3，4，5和胶带剥离6，7，8扩展到其他方法，如开流微灌注或真皮微透析9，10，11，12，13，14.根据感兴趣的疾病，可能存在各种治疗作用的局部部位。因此，可能有相应数量的方法来评估 API 到达预期本地操作站点的速率和程度。虽然上述每种方法都有其优点，但主要缺点是缺乏微尺度的cPK信息（即无法可视化API的去向及其渗透方式）。
一种用于估计局部BA和BE的非侵入性方法是CRI，它可以分为两种成像方式：CARS和SRS显微镜。这些相干拉曼方法能够通过非线性拉曼效应对分子进行化学特异性成像。在CRI中，两个激光脉冲序列在样品内聚焦和扫描;激光频率之间的能量差被设置为特定于目标化学结构的振动模式。由于CRI过程是非线性的，因此仅在显微镜焦点处产生信号，从而允许对组织进行三维药代动力学断层扫描成像。在cPK的背景下，CARS已被用于获取组织结构信息，例如富含脂质的皮肤结构的位置15。相比之下，SRS已被用于量化分子浓度，因为其信号与浓度呈线性关系。对于 离体 皮肤标本，在外延方向16 和SRS传输模式下进行CARS是有利的。因此，薄的组织样品将允许SRS信号检测和定量。
作为模型组织，裸鼠耳朵具有几个优点，但缺点很小。一个优点是组织厚度已经〜200-300μm，不需要进一步的样品制备。此外，通过一个视场轴向聚焦（例如角质层、皮脂腺 （SG）、脂肪细胞和皮下脂肪）可看到多个皮肤分层 16，18。这允许在移动到人体皮肤样本之前对皮肤渗透途径进行初步临床前估计和局部BA估计。然而，裸鼠模型存在局限性，例如由于皮肤结构19的差异而难以外推到体内场景。虽然裸鼠耳朵是获得初步结果的优秀模型，但人体皮肤模型是黄金标准。尽管关于冷冻人体皮肤对准确概括体内渗透动力学的适用性和适用性已有各种评论20，21，22，但使用冷冻人体皮肤是评估体外API渗透动力学的公认方法23，24，25.该协议可视化小鼠和人体皮肤中的各种皮肤层，同时量化富脂质和贫脂结构中的API浓度。
虽然CRI已被用于许多领域以特异性地可视化组织内的化合物，但研究局部应用药物产品的cPK的努力有限。为了使用CRI评估外用产品的局部BA / BE，有必要首先制定标准化方案以进行准确的比较。以前使用CRI将药物递送到皮肤的努力已经证明了数据中的可变性。由于这是CRI的相对较新的应用，因此建立协议对于获得可靠的结果至关重要18，26，27。这种方法仅针对拉曼光谱生物沉默区域中的一个特定波数。然而，大多数API和非活性成分在指纹区域内都有拉曼位移。由于指纹区域组织中产生的固有信号，这在以前已经提出了挑战。最近的激光和计算进步已经消除了这一障碍，这也可以与这里介绍的方法结合使用28。这里介绍的这种方法允许量化API，其在沉默区域（2，000-2，300 cm-1）具有拉曼位移。这不仅限于药物的物理化学性质，这可能是前面提到的一些cPK监测方法29的情况。
该协议必须减少各种制剂的皮肤厚度的样品间差异，因为由于厚样品的光散射，厚人皮样品在药物产品应用后会产生最小的信号。本手稿的目标是提出一种组织制备方法，以确保可重复的成像标准。此外，CRI系统的设置如前所述，以减少潜在的误差源，并最大限度地减少信噪比。但是，本文不会讨论CRI显微镜的指导原理和技术优点，因为之前已经介绍了30。最后，探索广泛的数据分析程序，以允许解释结果以确定实验的成功或失败。
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Protocol
裸鼠耳组织的使用得到了马萨诸塞州总医院机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准，而人体皮肤组织的使用则得到了马萨诸塞州总医院机构审查委员会（IRB）的批准。根据IACUC协议，新鲜安乐死的小鼠是从具有裸鼠菌落的合作者那里获得的。人体组织是通过批准的协议从马萨诸塞州总医院的选择性腹部整形手术中采购的。此外，腹部皮肤以外的特定组织类型是通过身体捐赠机构获得的，也是通过IRB批准的协议获得的。
1. 组织制剂
- 裸鼠耳皮肤组织的制备
- 获得新鲜收获的裸鼠身体后，使用镊子和显微外科剪刀去除耳朵。将一只耳朵放在一个小培养皿中（即35毫米x 10毫米）。将裸鼠身体放入生物危害袋中，按照当地的IACUC协议进行处理。
- 用磷酸盐缓冲盐水（PBS）冲洗每个小鼠耳朵，并用任务刮水器轻轻拍干。重复两次以清除耳朵上可能影响成像质量的任何残留污垢或碎屑（见 图1）。
- 如果要在24小时内使用耳朵，请将其放入冰箱（2-8°C）中带有新鲜PBS的小培养皿（即 35 mm x 10 mm）。如果在收获24小时后将使用耳朵，请将其置于没有PBS的培养皿（35 mm x 10 mm）中，用parafilm覆盖培养皿，并将其置于-20°C冰箱中。
- 人体皮肤组织的制备
- 采购人体组织后，将其放置在生物罩中的大型培养皿（即60 mm x 15 mm）中，以留出足够的空间进行样品制备。
- 将角质层面朝下放置，以便皮下脂肪可及。
- 使用镊子和显微外科剪刀，开始小心地去除皮下脂肪。一旦皮下脂肪不能再用剪刀去除，请切换到10刀片一次性手术刀（或等效手术刀）以去除剩余的皮下脂肪。使用手术刀与皮肤成45°角，同时用镊子保持皮肤静止（见图1）。
注意：为了获得高质量的透射SRS图像，样品需要尽可能薄而不会被刺穿。
图1：用于成像小鼠和人体皮肤的理想厚度的图像。 （A）小鼠耳朵皮肤保持在光线下，可以明显地让光线通过。（B）理想的人体皮肤在制备后保持光照。 请点击此处查看此图的大图。
- 将人体皮肤切成1厘米x 1厘米的碎片。
注意：新鲜的皮肤，可以使用长达24小时而不使用琼脂糖凝胶床，如前所述31。然而，如果保持在琼脂糖凝胶床上，新鲜的皮肤可以使用更长时间。如果以后要使用皮肤，则将皮肤放入样品运输袋中，然后放入-20°C冰箱中。冷冻的皮肤需要使用以下程序解冻以获得最佳效果（参见步骤3.1.2）。
2. 激光和显微镜设置
- 在成像前约30分钟，打开可宽调谐的超快激光器（以下简称激光器）并使其预热。启用激光警告标志/锁定系统，以便在进入时通知人员是否有潜在危险。
注意：使用 IV 类激光器时，必须始终佩戴合适的眼镜。对于这里使用的特定激光器，对于800-1，300nm激光器的工作范围，推荐合适的眼镜是OD ≥ 6。 - 当激光器预热时，启用其余的硬件用于显微镜控制，CARS检测和SRS检测。
- 正确对准显微镜以确保最佳成像。在显微镜控制软件（以下简称MC软件） 的“图像采集 控制”窗口中，单击 透射灯 ，以允许光线来自显微镜的透射灯。
- 确保正确的科勒照明，使显微镜沿垂直轴对齐：关闭虹膜，以便通过目片32看到最少量的光。
- 在通过目镜观察时，打开虹膜以查看多边形是否同时接触所有边。如果在打开光圈之前看不到多边形形状，请调整聚光镜高度。
- 如果多边形形状没有同时接触所有边，请使用调整旋钮调整光圈对齐位置。
注：参见Sanderson等人33 ，了解深入的显微镜设置。 - 将带有盖玻片和含有油样（例如橄榄油，因为油中有许多-CH2-键）的双面粘合剂垫片放置在显微镜载物台支架上。
- 在MC软件的 采集设置 窗口中，找到 显微镜 下拉菜单并将 显微镜物镜 设置为 20x。
- 验证CARS检测滤光片（645 nm/ 50 nm）是否在位置，以可视化和测量显微镜侧端口光电倍增管上的epiCARS信号。
注意：选择该特定滤光片对脂质进行成像，作为在652 nm处产生的反斯托克斯CARS信号，泵浦波长为803 nm和斯托克斯波长为1，040 nm（参见方程（1））。
（1）
其中λ变量的单位为nm;λ泵 浦是泵浦光束波长;λ斯托克斯 是斯托克斯光束波长。 - 通过目镜查看油样的边缘，该边缘将用于验证系统的对准情况。
- 使用显微镜上的焦点旋钮确保边缘处于Z焦点，并调整载物台控制器以获得XY焦点。
- 激光预热后，在激光器的图形用户界面中将泵浦光束设置为 803 nm ，并将电机微调设置为 50.0 。使用的确切电机微调可能因设置而异。
注意：泵浦光束是该激光器上唯一具有可调波长的光束，因为斯托克斯光束波长固定在1，040 nm。此配置以 2850 cm-1 处的 CH 振动为目标（参见等式 （2） 以计算波数目标的泵浦波长）。
（二）
其中
具有相对波数（cm−1）的单位，而 λ 变量的单位为cm。 - 在成像之前检查激光与显微镜的对准;有关激光路径的描述，请参见 图2 。在显微镜的初始设置过程中，在光束路径中安装两个虹膜作为正确对准显微镜的导轨。由于激光的光路会随着时间的推移而漂移，因此请确保激光束路径穿过虹膜的中心，以便它们正确进入显微镜。
- 使用红外查看器，完全关闭所有光圈，并确保光束以两者为中心：首先在最接近激光的光圈上，最后在显微镜入口处。
- 首先，检查泵浦光束以确保光束直通显微镜。泵对准后，检查以确保斯托克斯光束也正确进入显微镜。
- 如果光束未通过虹膜对齐，则使用泵和斯托克斯光束路径的两个反射镜安装座的 x 和 y 调整旋钮，以迭代方式使光束穿过虹膜。
- 一旦光束点在进入显微镜之前重叠，请检查以确保它们正确穿过显微镜。
- 在 MC 软件的 “图像采集控制 ”窗口中，单击用于传输的 TD 通道，单击 ALG1 （模拟通道 1）获取相干反斯托克斯拉曼通道，单击 ALG2 （模拟通道 2）单击受激拉曼散射通道。使用以下设置（如本协议所示）：ALG1 的增益为 1，偏移量为 -1，ALG2 的增益为 1.25，偏移值为 -2。
注：根据系统配置，模拟通道对于单个成像通道可能具有不同的编号。如果SRS探测器就位，则不会有传输信号，因为没有光线可以穿过（即，在此设置中无法同时可视化带有TD和ALG2的图像）。
- 在 MC 软件的 “图像采集控制 ”窗口中，单击用于传输的 TD 通道，单击 ALG1 （模拟通道 1）获取相干反斯托克斯拉曼通道，单击 ALG2 （模拟通道 2）单击受激拉曼散射通道。使用以下设置（如本协议所示）：ALG1 的增益为 1，偏移量为 -1，ALG2 的增益为 1.25，偏移值为 -2。
（1）
（二）
具有相对波数（cm−1）的单位，而 λ 变量的单位为cm。
图2：相干拉曼激光成像路径的布局示意图。 光束根据光斑尺寸进行独立调理，并通过延时级进行匹配，以在样品中产生相干拉曼散射，以实现所需的调谐频率。 请点击此处查看此图的大图。
- 打开功率计，使用高功率热功率传感器，分别测量泵和斯托克斯光束的功率，以进行实验。
注意：在此特定示例中，泵浦光束功率为80 mW，而斯托克斯光束功率在进入显微镜之前为180 mW。 - 在 “图像采集控制 ”窗口中，单击“ 焦点 x2 ”按钮以在 MC 软件中查看图像。
- 在 “采集”设置 窗口中，确保将像素比和停留时间设置为实验的所需参数。
注：该协议使用了1，024 x 1，024像素比和2 μs/像素的停留时间。 - 通过疏通泵浦光束并观察 TD 通道来确认激光相对于显微镜的对准。
注意：如果使用正确的探测器设置在图像中以中心显示光束，则激光器正确对准。 - 否则，请使用潜望镜上的 X 和 Y 调整旋钮将光束重新定位到图像的中心。
- 通过在CARS和SRS通道中看到相同的图像来确认激光和显微镜的对准。
- 要获取对准图像，请单击“图像采集控制”窗口中的XY扫描按钮，并设置相应的滤波模式（例如，卡尔曼线3）。
- 使用描述性文件名保存这组图像，以随时间推移进行比较并确认系统性能/对齐方式。
3. 脂质成像
- 小鼠耳朵和人体组织
- 如果使用新鲜纸巾，请跳过步骤3.1.2。
- 从-20°C冰箱中取出小鼠耳皮，并将其置于孵育室（32°C）中10分钟。从孵育室中取出小鼠耳朵。
注意：请参阅步骤 1.1.2。用于小鼠耳朵皮肤准备。粗暴处理或刮擦组织可导致组织的机械降解、破坏或破坏，尤其是角质层。 - 如果使用裸鼠耳朵，请将耳朵的前部朝向35毫米0号培养皿的玻璃底部放置。如果使用人体皮肤，将其与角质层面朝下放置，因为这将允许从浅层到更深层的药物定量（图1）。
注意：裸鼠耳朵的后部更容易出现外壳缺陷。如果在倒置显微镜上不将人体皮肤的角质层侧朝下放置，则由于散射了相当多的光，并且看不到渗透到角质层中的药物，因此无法看到真皮层。 - 一旦组织在玻璃底部居中，使用棉头涂抹器以确保皮肤平坦并与玻璃底培养皿的盖玻片表面完全接触。
注意：如果皮肤不是完全平坦，则在对皮肤进行成像时，此步骤可能会导致困难。 - 将垫圈放在皮肤上，以防止成像时有任何移动。确保通过垫圈的中心孔可以看到组织，以进行SRS传输检测。
- 取出载玻片载物台插入物，并用具有单个培养皿插入物的孵育室替换它。
- 将玻璃底培养皿与皮肤组织一起放在孵育室的单培养皿附件中。
注意：或者，使用6孔板一次成像多个皮肤样品和配方。 - 降低MC软件 “采集设置” 窗口中的像素比（例如，从1，024 x 1，024降低到512 x 512），以获得更快的振镜扫描速度，同时更改Z深度以查找角质层（小鼠见 图3A 或人类 图3E ）。
- 找到角质层后，在 “采集设置” 窗口中将该轴向位置注册为零位置，并更改每个特定实验的像素比（例如，1，024 x 1，024）。
图 3：使用 SRS 获得的皮肤深度示例。 顶部图像来自裸鼠耳朵皮肤，描绘了以下内容：（A）角质层，（B）皮脂腺，（C）脂肪细胞，（D）皮下脂肪。底部的图像集是从人体皮肤获得的，描绘了以下内容：（ E ）角质层，（ F ）状真皮和（ G ）皮脂腺。比例尺 = 100 μm。小鼠和人类皮肤图像都是使用1024像素x 1024像素的20倍物镜采集的;人类SG以512 x 512像素拍摄。缩写：SRS =受激拉曼散射;SG = 皮脂腺。 请点击此处查看此图的大图。
4. 局部制剂的应用
- 将预定制剂剂量移液到皮肤上（例如，10μL/ cm2）。
注意：配方的粘度将在移液器的选择中发挥作用。建议将正置换式移液器用于粘性配方，如乳膏或凝胶，以及使用空气置换式移液器进行溶液处理。在该实验中，鲁索利替尼是丙二醇（丙烷-1，2-二醇）简单溶液中的模型化合物。 - 使用注射器上的柱塞尖端或戴手套的手指，顺时针运动摩擦配方30秒。注意将制剂应用于以后的cPK分析的时间（请参阅下面的步骤6.15-6.17）。
注意：应用的持续时间取决于实验;每个可能都不同。 - 在分配的配方渗透时间过后，去除多余的配方，并将配方一侧朝向玻璃底培养皿放置皮肤。
注意：使用精密的任务刮水器或单个方向（例如，从北到南）的小型（约1英寸）3D打印刮刀去除配方。
5. 药物定量的实验设置
- 将泵束设置为 803 nm。使用光电二极管检查泵和斯托克斯光束功率，以确保它们是实验所需的功率。单独疏通每个光束以测量功率并重新阻挡光束。
注意：在此具体示例中，泵束功率为100 mW，而斯托克斯光束功率为180 mW。 - 将玻璃底培养皿放入孵育室中，并插入一个玻璃底培养皿。用夹子固定培养皿，以防止在成像过程中移动。
- 打开 MC 软件中的传输灯。透过目镜观察，使用调节旋钮调整轴向焦点，以确保组织在焦点范围内。
- 疏通泵和斯托克斯梁。确保已启用 ALG1 和 ALG2 通道，然后单击 MC 软件上的“ 焦点 x2 ”以可视化 CARS 和 SRS 通道中的外观。确保SRS光电二极管位于聚光镜上方。
- 在设备下拉菜单中，单击多区域延时 （MATL）。查找要出现的 XY 阶段警告;当舞台移动以查找其机械原点时，单击“确定”。
- 在 MATL 模块中，转到 “查看 ”，然后单击 MC 软件中的“ 注册点列表 ”。开始添加 1） 皮肤内的特定深度（即角 质层、SG、脂肪细胞、皮下脂肪，如在具有脂质调谐对比度的实时成像期间确定的）或 2） XY 位置（如果要采集整个深度堆栈）。有关示例 ，请参见图 3 。
- 一旦识别出角质层，滚动轴向焦点（或z焦点）以确定上面提到的特定组织分层。有关人类和小鼠皮肤中的示例，请参见 图 3 。
- 在成像特定深度而不是完整 Z 深度堆栈的情况下，对于每个皮肤分层，单击“注册点”将其添加到 MATL 队列中。对于全深度堆栈，请单击采集参数窗口中具有深度选择的每个 XY 位置的“注册点”。
- 在 MATL 软件中注册所有所需的 XY（全 Z 深度堆栈）或 XYZ（特定皮肤分层）位置后，以在整个图像和 cPK 分析实验中保持一致的方式更改文件目录和名称（参见步骤 6.15- 6.17）。
- 在 MATL 模块中将重复次数设置为 1 ，然后单击 就绪。等待 Play 从灰色箭头变为黑色箭头，表示软件已准备就绪。按 “播放 ”开始对初步脂质堆栈（以下简称 脂质图像）成像。
注意：这将用于在分析过程中分离单个组织分层的富脂和脂质贫乏区域。周期和总时间显示在注册点列表的右下角。 - 一旦循环完成，堵塞泵和斯托克斯梁。根据目标波数或拉曼振动，将激光图形用户界面上的波长更改为所需波长。
注：例如，泵梁的843 nm用于使用等式（2）以2，250 cm-1为目标，电机微调更改为50.1。这里介绍的示例药物，鲁索利替尼，含有一种腈，其靶向为2，250 cm-1。针对皮肤结构的波数将始终相同（2，850 cm-1）;但是，API的波数可以是任何波数，但必须先验地知道或计算。 - 调整手动延时级（图2），以确保新波长和泵浦光束功率的时间重叠。确保相同的功率用于脂质和API成像，这是 先验建立的。
- 使用每个周期的持续时间来计算每个实验所需的重复总数。只需将实验的总所需时间过程除以周期持续时间。
注意：周期持续时间是图像大小、像素停留时间、卡尔曼平均值和每个周期图像数量的函数。优化这些参数将缩短周期时间，从而提高时间分辨率。 - 选择总循环重复次数后，松开泵束，使用光电二极管检查功率，并确保其与所需功率相匹配。最后，疏通斯托克斯光束以进行成像。
- 按 “播放 ”开始自动成像设定点。
- MATL成像完成后，将泵浦光束切换回803 nm，并将功率调整回步骤5.1中使用的原始脂质成像功率。
- 与前面的步骤一样，在整个研究中更改实验后图像的文件名以保持一致。
- 将重复次数设置为 1。
- 单击 “就绪|”播放 按钮以获取后时间过程脂质堆栈，并确保在成像过程中没有组织运动（图4）。
图4：通过可视化皮脂腺证明裸鼠耳朵皮肤中的组织运动。 有限组织运动的例子在 A 和 B中描绘，而实质性组织运动在 C 和 D中描绘。（A）显示施用制剂时的皮脂腺和（B）施用后120分钟的相同深度。（C）制剂施用时和制剂施用后（D）120分钟的小鼠皮脂腺;皮脂腺几乎看不见，这表明该实验在整个实验期间没有测量皮脂腺的吸收。比例尺 = 100 μm。图像为 1024 像素 x 1024 像素。 请点击此处查看此图的大图。
6. 数据分析
- 将图像采集为 .OIB （或 .OIR 取决于显微镜和MC软件）文件类型，每个XYZ位置都有一个单独的子文件夹。
- 通过重命名以下结尾 _lipid.oib的脂质图像，使用API通道图像编译脂质图像。
- 对每个皮肤分层执行以下步骤（为简单起见，此处仅使用 SG 分层进行演示;参见 图 3B）。
- 将SG脂质图像导入ImageJ（或斐济）34 ，然后选中标记为 拆分通道 的框，将文件拆分为CARS和SRS通道。
注意：斐济会将文件拆分为实验期间跨通道数获取的图像数。 - 通过单击分析感兴趣区域 （ROI） 管理器|工具|投资回报率经理。
- 使用 SRS 通道（例如， C = 1），在图像中划定 SG。
注意：由于目标 -CH2- 振动，SG 是明亮的位置。 - 通过单击 ROI 管理器中的 添加 [t] 或按键盘上的 t，将其添加到 ROI 管理器。对映像中的每个 SG 重复此过程。
- 要掩盖富含脂质的区域，请选择每个 ROI，然后单击“ 更多 ”选项卡 |或（联合）|添加到 投资回报率管理器。
- 要遮盖脂质贫乏区域，请使用斐济菜单中的 矩形 工具，并在整个图像周围绘制一个正方形。将其添加到 ROI 管理器。
- 除了在 ROI 管理器中选择所有富含脂质区域的 ROI 之外，还可以单击新添加的方形 ROI。在“ 更多”下，选择“ XOR ”以生成脂质贫乏区域的蒙版，并将其添加到 ROI 管理器中。
- 将SG脂质图像导入ImageJ（或斐济）34 ，然后选中标记为 拆分通道 的框，将文件拆分为CARS和SRS通道。
- 将 API 映像加载到斐济。
- 使用以下菜单序列按数字顺序（即 Image0001、Image0002、Image0003 等）连接 图像：图像|堆栈|工具|连接。
- 或者，通过将其中一个图像加载到斐济，然后在设置页面上选择一个名为“组具有相似名称的文件”的选项来导入这些图像。
注意：这提供了导入具有相似文件名的所有图像并自动连接它们的功能。
- 或者，通过将其中一个图像加载到斐济，然后在设置页面上选择一个名为“组具有相似名称的文件”的选项来导入这些图像。
- 在激活串联图像的同时，转到 ROI 管理器，选择富含脂质的区域（即 SG），单击“ 更多”，然后选择“ 多重测量”。等待“ 结果 ”窗口出现。
- 在默认测量设置中查找面积、平均值、最小值、最大值和中位数。如果需要其他指标进行分析，请通过选中“设置测量值”窗口中的相关复选框来启用这些选项（分析|设置测量值...）。
- 将数据从 结果 窗口导出到电子表格，并添加标题为“ 区域”的列。
- 将 富含脂质 的区域的每行数据添加富脂。将 脂质贫乏 的区域添加到脂质以外的区域。
- 添加标题为 图层 的列，并添加已分析的相应图层（补充表 S1）。
- 对血脂贫瘠区域重复步骤 6.5 - 6.7，同时选择适当的 ROI。
- 要可视化数据，请保存电子表格并将其导入到JupyterLab（包matplotlib）35 或R（包ggplot2）36中。将数据绘制为图像数量与平均强度的函数，以估计浓度时间数据。（图 5）。
- 将电子表格导入 RStudio 以执行非间室分析 （NCA），以便对 CRI 数据进行药代动力学分析。
- 添加 标题为时间的列。
- 对于 Image0001，计算配方应用与第一幅图像之间的持续时间。
注意：这是第一个时间点。周期持续时间用于计算随时间增加的剩余图像（以及时间点）。例如，如果自应用程序以来的时间是30分钟，Image0001的时间点为30分钟，周期持续时间为8分钟，Image0002的时间点为38分钟，Image0003的时间点为46分钟，依此类推。 - 在 RStudio 中（使用非复合包）37 对从电子表格导入的强度-时间数据运行 NCA，对一个图层/区域进行以下调用：
sNCA（x = 时间，y = 平均值，剂量 = 1，时间单位 = “s”，剂量单位 =“mg”）
其中x指时间点，y指强度，剂量可留为一，计算为制剂中药物的mM剂量或产品剂量。
注意：NCA输出将提供C最大值 和AUC等参数。然而，由于这是 离体 皮肤，这些参数实际上是Jmax 和AUC通量全部。 - 除了跨实验条件的统计比较外，还可以通过绘制Jmax 和AUC通量-所有 指标（图6）来直观地比较它们。参见 图6 ，了解 离体 CRI研究的分析示例。
注意：适当的统计测试取决于每个特定数据集。同样重要的是要注意，所有药代动力学参数都是对数正态分布的，任何比较都必须使用对数变换（自然对数或log10）数据。
图 5：强度与时间曲线的关系。 （A）通量曲线已达到饱和，因此强度仅降低的示例。每个ROI都有不同的通量曲线，以证明可能获取的数据中的异质性。（B）开始成像后浓度增加的一个例子。每个ROI是同一实验的相同组织中的不同视野（由不同的颜色迹线表示）。除了全球浓度之外，还能够阐明API/配方更喜欢哪种局部环境，如富脂和脂质贫乏区域所示。 A 中呈现的曲线表明药物没有吸收到组织中，因为API已经渗透并且一旦成像开始就开始离开组织。然而，在 B中，组织尚未达到饱和度，并且仍然有API的吸收，然后消除。将图像分割为富脂质和贫脂将有助于阐明API（或非活性物质）的定位以及渗透途径进入皮肤（即角质层）。富含脂质的区域内的较高浓度表明API定位于所研究层的脂质结构内，这有助于靶向药物递送信息。缩写：ROI = 感兴趣的区域;API = 活性药物成分。 请点击此处查看此图的大图。
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Representative Results
如果组织在实验完成后没有在轴向（<10μm）或横向方向上显着移动，则认为成像成功（图4）。如果目标 API 的 SRS 测量值不代表初始深度，则立即表明初始深度的定量是层特异性的。通过对每个感兴趣的 XY 位置进行 z 轴成像来缓解这种情况，权衡是时间分辨率。如果在这些研究中使用冷冻皮肤，则与新鲜皮肤相比，API的渗透和渗透速度很快，并且从配方应用到开始成像之间的最短时间至关重要。另一个考虑因素是用于实验的物镜。如果使用60倍物镜，则在单个视场（FOV）内选择平坦表面相对容易;然而，对于20倍物镜，视野要大得多，因此，组织制备的关键步骤是确保皮肤与玻璃底成像皿的均匀接触。与 FOV 内的原始深度相比，平坦的 FOV 和相似的深度是获得积极结果的两个关键因素。
除了图像的动态范围外，激光的对准也必须非常小心地解决。激光脉冲序列与显微镜的错位会导致一系列问题，包括低信号电平或不均匀激发的FOV，这可能会导致低对比度图像。另一个考虑因素是确保在采集图像时利用强度值的整个动态范围;否则，成像数据被压缩，并且可能难以检测浓度差异。
另一个考虑因素是，皮肤异质性可能会引起同一数据集中计算的微尺度通量图谱的变化。强度（浓度的代表）开始高并在实验持续时间内降低（图5A），而其他研究表明，在实验持续时间内通量增加后通量减少（图5B）。目前，由于实验设置，绝对浓度定量不能立即发生。因此，施用后浓度下降可能是目标深度内饱和的结果，而定量仅代表API消除。如果动态范围不够大或皮肤太厚，目视检查将使浓度看起来停滞不前，因此在成像过程中不会发生任何变化。这是次优动态范围和皮肤厚度的函数，这表明需要重复实验。
然后，对每个图谱的浓度时间曲线进行NCA测量，以估计暴露、最大通量和到最大通量的时间。在实验条件下进行统计分析（图6），以进一步研究导致暴露潜在差异的协变量。比较全局cPK参数将深入了解哪种配方提供更高的通量或更大的暴露量。相比之下，微量级cPK参数（即 富脂和脂质贫乏区域）将提供对局部生物分布和渗透途径的见解。例如，当比较具有相同API浓度且非活性成分不同的两种制剂时，一种制剂可能倾向于通过富含脂质的区域渗透到角质层，而不是脂质贫乏区域。该观察结果表明，这种特定的配方将渗透“推动”到富含脂质的区域，以便于渗透和渗透。
图6：来自小鼠耳组织的浓度-时间曲线的示例NCA分析。 （A）针对同一API的两种配方之间tmax （发生最大浓度的时间）分析的示例。该分析表明，与凝胶制剂相比，2-（2-乙氧基乙氧基）乙醇提供延长的API渗透，无论皮肤层如何。还可以看出，SC层的tmax 比SG长，这表明即使成像持续时间已经结束，2-（2-乙氧基乙氧基）乙醇制剂也继续输送API。（B） 在A 中相同配方/API组合之间的总暴露分析示例，但在皮肤深处。此数字从18 修改而来。缩写：SC = 角质层;SG = 皮脂腺;AD = 脂肪细胞;SCF = 皮下脂肪。 请点击此处查看此图的大图。
补充表 S1：从手动图像分析中获取的示例数据集。 这些列表示从本手稿的数据分析部分获得的信息（即框架，面积， 平均值，最小值，最大值，中位数），同时添加了用于cPK分析的其他列（即图层，区域，time_minutes）。这些数据可以通过NCA进行分析并绘制，以可视化SG皮肤层内的浓度曲线。 请按此下载此表格。
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Discussion
局部BA / BE的评估是一个研究领域，需要多方面的方法，因为没有一种方法可以完全表征 体内 cPK。该协议提出了一种基于相干拉曼成像的局部药物产品BA / BE评估方法。可能被忽视的第一点是皮肤样品必须有多薄，特别是对于定量传输SRS成像。如果皮肤太厚（即光 不能轻易通过），SRS检测器测量的信号很少甚至没有，因此它将提供较差的浓度数据。必须注意正确制备这些组织样本，因为这可以成就或破坏实验。就裸鼠耳朵而言，除了用PBS冲洗并拍干以去除耳朵上残留的污垢外，几乎不需要准备。
小鼠耳朵的厚度通常为几百μm，这是传输SRS的最佳选择。人体皮肤样本通常为几毫米厚，包括皮下脂肪，尽管厚度高度可变，具体取决于皮肤组织的解剖来源和供体的年龄。因此，必须尽可能多地去除多余的组织，以准确量化表皮和真皮中随着时间的推移的脂质结构和API浓度。如果忽略了组织制备步骤，则实验设置的其余步骤将在很大程度上不合适，因为起始条件不是最佳的。
激光/显微镜设置是下一个挑战或潜在的绊脚石。激光在光束路径中未对准并最终进入显微镜会导致对比度差，从而导致成像效果差。建议先设置CARS频道，因为它的信号更容易找到。泵和斯托克斯脉冲序列必须在时间和空间上重叠。当SRS探测器被翻转时，使用显微镜MC软件中的透射探测器检查泵浦激光器的对准。在MC软件中查看CARS频道（ALG1）时，斯托克斯光束被解锁。但是，如果没有来自油样的信号，首先需要对齐斯托克斯光束，然后调整时间重叠。可能需要迭代这两个调整，直到信号得到优化。通过虹膜上的红外查看器查看两个光束的空间重叠，同时调整时间延迟阶段（图2）以使光束在时间上重叠。这两个对准步骤对于确保CARS信号生成至关重要。
一旦信号在CARS通道中很明显，SRS通道（ALG2）就是下一个要设置的通道。缺乏信号的潜在问题是锁相位或增益设置太低，或者锁相软件中的失调设置得太高。此外，可以调整聚光器位置，将透射光聚焦到光电二极管上，从而优化SRS信号。激光/显微镜设置不当将导致缺乏信号，从而降低浓度估计值并缺乏渗透信息。泵浦和斯托克斯光束的激光功率可以针对单个研究进行优化。然而，对于每个实验，光束的功率是相同的，这一点至关重要。重复之间的不同激光功率会产生错误的浓度差异，这将是由于设置而不是API /配方。
每项研究都需要一个独特的剂量持续时间（即制剂 留在皮肤上的持续时间），并且必须独立研究以量化皮肤API渗透/渗透，因为这是配方依赖性的。开发方案时的另一个考虑因素是制剂应用的闭塞性质。重要的是要知道制剂是设计为在闭塞性还是非闭塞性条件下施用。这里介绍的CRI方法使用倒置显微镜;这意味着皮肤表面是面朝下并在闭塞设置下。直立显微镜可以提供非闭塞性疾病的机会;然而，皮肤表面可能不平坦，这将使这些类型的实验具有挑战性。
必须承认，这些实验的闭塞性质不是典型的临床用途;然而，在这些研究中分析出渗透途径。这里介绍的CRI方法提供了可视化和量化微观尺度变化的能力，这些变化与真皮微透析，真皮开流微灌注，胶带剥离或IVPT研究等方法无法区分。快速波数调谐的最新发展为皮肤结构和静音区域外的多个振动键的并行量化铺平了道路。然而，进一步的计算方法解析出特定分析物对皮肤的贡献仍在开发中28。这与 体内 CRI研究也特别相关，尽管在这种设置中在台式上使用的功率（聚焦时约为50 mW）可能不允许用于临床。这种方法的潜力可以从实验室工作台转化为临床，可以使研究人员能够量化药物在同一环境中的 体内 和 离体 渗透，以发展对局部药物开发进步至关重要的体 外 - 体内 关系。
从一次实验运行中获取的大量数据可以从每个站点的10张图像到每个站点的70张图像不等。如果每块组织有多个位点，这会导致千兆字节的信息。图像本身提供全局浓度时间数据，并按原样进行量化，无需预处理。然而，这并不能最大化CRI的效用，因为除了渗透途径数据之外，还可以提取局部生物分布数据。图像分割非常耗时，但提供了其他方法无法提供的详细信息。例如，可以估计通过角质层（富脂或贫脂）的首选渗透途径，这可以深入了解哪些非活性成分可能有助于特定途径或是否具有药物依赖性。一个实验的分析可能需要几个小时到几天的时间，具体取决于图像的数量和实验持续时间。因此，自动化方法将有助于数据分析，并在皮肤分层中提供富脂和脂质贫乏区域的一致注释18。
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Disclosures
CLE是CARS显微镜专利的发明人，这些专利已授权给多家显微镜制造商。所有其他作者没有利益冲突需要披露。
Acknowledgments
作者要感谢埃文斯小组的Fotis Iliopoulos博士和Daniel Greenfield博士对本手稿的讨论和校对。此外，作者还希望得到LEO Pharma的支持。 图 2 是使用 BioRender.com 创建的。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue Preparation | |||
| Autoclavable Biohazard Bags | FisherBrand | 22-044562 | As refered to in text: biohazard bags https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-polyethylene-biohazard-autoclave-bags-without-sterilization-indicator-8/22044562?searchHijack=true&searchTerm= 22044562&searchType=RAPID& matchedCatNo=22044562 |
| Cell Culture Buffers: Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution 1x | Corning | MT21030CV | As refered to in text: PBS https://www.fishersci.com/shop/products/corning-cellgro-cell-culture-buffers-dulbecco-s-phosphate-buffered-salt-solution-1x-8/MT21030CV?searchHijack=true&searchTerm= 21-030-cv&searchType= RAPID&matchedCatNo=21-030-cv |
| Disposable Scalpels | Exel International | 14-840-00 | As refered to in text: scalpel https://www.fishersci.com/shop/products/exel-international-disposable-scalpels-3/1484000?keyword=true |
| High Precision 45° Angle Broad Point Tweezers/Forceps | Fisherbrand | 12-000-132 | As refered to in text: forceps https://www.fishersci.com/shop/products/high-precision-45-angle-broad-point-tweezers-forceps/12000132#?keyword= |
| Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-Ply | Kimberly-Clark Professional Kimtech Science | 06-666 | As refered to in text: task wiper https://www.fishersci.com/shop/products/kimberly-clark-kimtech-science-kimwipes-delicate-task-wipers-7/06666 |
| Parafilm M Laboratory Wrapping Film | Bemis | 13-374-12 | As refered to in text: parafilm https://www.fishersci.com/shop/products/curwood-parafilm-m-laboratory-wrapping-film-4/1337412 |
| Petri Dish (35 mm x 10 mm) | Fisherbrand | FB0875711YZ | As refered to in text: small petri dish https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-specialty-6/FB0875711YZ?keyword=true |
| Petri Dish (60 mm x 15 mm) | Fisherbrand | FB0875713A | As refered to in text: large petri dish https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/FB0875713A?keyword=true |
| Surgical Scissors | Roboz | NC9411473 | As refered to in text: scissors https://www.fishersci.com/shop/products/scissors-327/NC9411473?searchHijack=true&searchTerm= RS-5915SC&searchType=RAPID& matchedCatNo=RS-5915SC |
| Laser/microscope | |||
| 650/60 nm BrightLine single-band bandpass filter | Semrock | As refered to in text: CARS filter - CH2 vibrations (645nm/60nm filter) | |
| Control box IX2-UCB | Olympus | As refered to in text: Control Box | |
| D700/30m | Chroma | As refered to in text: CARS filter - deuterated band https://www.chroma.com/products/parts/d700-30m |
|
| DeepSee Insight | Spectra-Physics | As refered to in text: Laser https://www.spectra-physics.com/f/insight-x3-tunable-laser |
|
| Digital Handheld Optical Power and Energy Meter Console | ThorLabs | PM100D | As refered to in text: power meter https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=3341 |
| Fluoview Software | Olympus | As refered to in text: Microscope Control software | |
| Frosted Microscope Slides | FisherBrand | As refered to in text: microscope slides https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-frosted-microscope-slides-4/22265446 |
|
| FV1000 | Olympus | As refered to in text: Microscope | |
| Incubation Chamber | Tokai Hit | GM-800 | As refered to in text: incubation chamber |
| Integrating Sphere Photodiode Power Sensor | ThorLabs | S142C | As refered to in text: photodiode https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=3341 |
| Power supply FV31-PSU | Olympus | As refered to in text: Power Supply | |
| Precision 4063, 80MHz Dual Channel Function Generator | BK Precision | As refered to in text: function generator | |
| ProScan – Precision Microscope Automation | Prior Scientific Instruments | As refered to in text: stage controller https://www.prior.com/microscope-automation/inverted-microscope-systems/proscan-linear-stage-highest-precision-microscope-automation |
|
| SecureSeal Imaging Spacers | Grace Biolabs | 654004 | As refered to in text: spacer https://gracebio.com/product/secureseal-imaging-spacers-654004/ |
| SRS Detection Kit | APE | As refered to in text: SRS detector | |
| UPLSAPO 20X NA:0.75 | Olympus | As refered to in text: 20X Objective https://www.olympus-lifescience.com/en/objectives/uplsapo/ |
|
| Lipid/Drug Imaging | |||
| 35 mm Dish, No. 0 Uncoated Coverslip, 14 mm Glass Diameter | MatTek Corporation | NC9711297 | As refered to in text: Glass bottom dish https://www.fishersci.com/shop/products/glass-bottom-mircrowell-dish/nc9711297 |
| Cotton-tipped applicators | FisherBrand | As refered to in text: Cotton-tipped applicator | |
| Distriman Postive Displacement Pipette | Gilson | As refered to in text: Postive Displacement Pipette https://www.fishersci.com/shop/products/gilson-distriman-positive-displacement-repetitive-pipette/F164001G#?keyword= |
|
| Distriman Postive Displacement Pipette Tips | Gilson | As refered to in text: Tips for pipette https://www.fishersci.com/shop/products/gilson-distritip-syringes-6/f164100g?keyword=true |
|
| Data Analysis | |||
| FIJI | Open-source | As refered to in text: FIJI/ImageJ https://imagej.net/software/fiji/ |
|
| Jupyter-Lab | open-source | As refered to in text: JupyterLab https://jupyter.org/ |
|
| Rstudio | Open-source | As refered to in text: Rstudio https://www.rstudio.com/ |
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