Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Visualisering og kvantificering af farmaceutiske forbindelser i huden ved hjælp af sammenhængende Raman Scattering Imaging

Published: November 24, 2021 doi: 10.3791/63264
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Wellman Center for Photomedicine, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School

Summary

En sammenhængende Raman scattering imaging metode til at visualisere og kvantificere farmaceutiske forbindelser i huden er beskrevet. Dette papir beskriver hudvævsforberedelse (human og mus) og topisk formuleringsapplikation, billedoptagelse for at kvantificere spatiotemporale koncentrationsprofiler og foreløbig farmakokinetisk analyse for at vurdere topisk lægemiddellevering.

Abstract

Kutan farmakokinetik (cPK) efter anvendelse af topisk formulering har været et forskningsområde af særlig interesse for forskere inden for regulering og lægemiddeludvikling til mekanisk at forstå topisk biotilgængelighed (BA). Semi-invasive teknikker, såsom tape-stripping, dermal mikrodialyse eller dermal open-flow mikroperfusion, kvantificerer alle makroskala cPK. Mens disse teknikker har givet stor cPK-viden, mangler samfundet en mekanistisk forståelse af aktiv farmaceutisk ingrediens (API) penetration og gennemtrængning på cellulært niveau.

En ikke-invasiv tilgang til at håndtere mikroskala cPK er sammenhængende Raman scattering imaging (CRI), som selektivt målretter mod iboende molekylære vibrationer uden behov for ydre etiketter eller kemisk modifikation. CRI har to hovedmetoder - sammenhængende anti-Stokes Raman scattering (CARS) og stimuleret Raman scattering (SRS) - der muliggør følsom og selektiv kvantificering af API'er eller inaktive ingredienser. CARS bruges typisk til at udlede strukturel hudinformation eller visualisere kemisk kontrast. I modsætning hertil bruges SRS-signalet, som er lineært med molekylær koncentration, til at kvantificere API'er eller inaktive ingredienser inden for hudstratifikationer.

Selvom musevæv almindeligvis er blevet brugt til cPK med CRI, skal topisk BA og bioækvivalens (BE) i sidste ende vurderes i humant væv inden lovgivningsmæssig godkendelse. Dette papir præsenterer en metode til at forberede og afbilde ex vivo-hud , der skal anvendes i kvantitative farmakokinetiske CRI-undersøgelser i evalueringen af topisk BA og BE. Denne metode muliggør pålidelig og reproducerbar API-kvantificering inden for hud til mennesker og mus over tid. Koncentrationerne inden for lipidrige og lipidfattige rum samt den samlede API-koncentration over tid kvantificeres; disse anvendes til estimater af mikro- og makroskala BA og potentielt BE.

Introduction

Metoder til vurdering af cPK efter anvendelse af topisk lægemiddelprodukt er udvidet fra klassiske in vitro-permeationstest (IVPT) undersøgelser 1,2,3,4,5 og tape-stripping 6,7,8 til yderligere metoder såsom open-flow mikroperfusion eller dermal mikrodialyse 9,10,11, 12,13,14. Der er potentielt forskellige lokale steder med terapeutisk virkning afhængigt af sygdommen af interesse. Der kan derfor være et tilsvarende antal metoder til at vurdere, hvor hurtigt og i hvilket omfang en API kommer til det tilsigtede lokale handlingssted. Mens hver af de ovennævnte metoder har sine fordele, er den største ulempe manglen på cPK-information i mikroskala (dvs. manglende evne til at visualisere, hvor API'en går, og hvordan den gennemsyrer).

En ikke-invasiv metode af interesse for at estimere topisk BA og BE er CRI, som kan opdeles i to billeddannelsesmetoder: CARS og SRS-mikroskopi. Disse sammenhængende Raman-metoder muliggør kemisk specifik billeddannelse af molekyler via ikke-lineære Raman-effekter. I CRI fokuseres og scannes to laserpulstog i en prøve; forskellen i energi mellem laserfrekvenserne er indstillet til at målrette vibrationstilstande, der er specifikke for de kemiske strukturer af interesse. Da CRI-processer er ikke-lineære, genereres der kun et signal ved mikroskopfokus, hvilket muliggør tredimensionel farmakokinetisk tomografisk billeddannelse af vævet. I forbindelse med cPK er CARS blevet brugt til at opnå vævsstrukturel information, såsom placeringen af lipidrige hudstrukturer15. I modsætning hertil er SRS blevet brugt til at kvantificere molekylær koncentration, da dets signal er lineært med koncentration. For ex vivo hudprøver er det fordelagtigt at udføre CARS i epi-retning16 og SRS i transmissionstilstand17. Derfor vil vævsprøver, der er tynde, muliggøre SRS-signaldetektion og kvantificering.

Som modelvæv giver det nøgne museøre flere fordele med mindre ulemper. En fordel er, at vævet allerede er ~ 200-300 μm i tykkelse og ikke kræver yderligere prøveforberedelse. Derudover ses flere hudstratifikationer ved aksialt fokusering gennem et synsfelt (f.eks. Stratum corneum, talgkirtler (SG'er), adipocytter og subkutant fedt)16,18. Dette giver mulighed for foreløbig præklinisk estimering af kutane permeationsveje og topiske BA-estimater, inden de flyttes til humane hudprøver. Den nøgne musemodel præsenterer imidlertid begrænsninger såsom vanskeligheder med ekstrapolering til in vivo-scenarier på grund af forskelle i hudstruktur19. Mens det nøgne museøre er en fremragende model til at opnå foreløbige resultater, er den menneskelige hudmodel guldstandarden. Selv om der har været forskellige kommentarer til egnetheden og anvendeligheden af frossen menneskelig hud til nøjagtigt at rekapitulere in vivo-permeationskinetik 20,21,22, er brugen af frossen menneskelig hud en accepteret metode til evaluering af in vitro API-permeationskinetik 23,24,25 . Denne protokol visualiserer forskellige hudlag i mus og menneskelig hud, mens den kvantificerer API-koncentrationer inden for lipidrige og lipidfattige strukturer.

Mens CRI er blevet brugt på tværs af adskillige felter til specifikt at visualisere forbindelser i væv, har der været begrænset indsats for at undersøge cPK af topisk anvendte lægemiddelprodukter. For at evaluere den aktuelle BA / BE af aktuelle produkter ved hjælp af CRI er det nødvendigt først at have en standardiseret protokol på plads for at foretage nøjagtige sammenligninger. Tidligere bestræbelser på at bruge CRI til lægemiddellevering til huden har vist variabilitet inden for dataene. Da dette er en relativt ny anvendelse af CRI, er etablering af en protokol afgørende for at opnå pålidelige resultater 18,26,27. Denne tilgang er kun rettet mod et specifikt bølgetal i det biologiske tavse område af Raman-spektret. Imidlertid har de fleste API'er og inaktive ingredienser Raman-skift inden for fingeraftryksområdet. Dette har tidligere givet udfordringer på grund af det iboende signal, der stammer fra vævet i fingeraftryksområdet. Nylige laser- og beregningsmæssige fremskridt har fjernet denne barriere, som også kan bruges i kombination med den tilgang, der præsenteres her28. Denne tilgang, der præsenteres her, giver mulighed for kvantificering af en API, som har et Raman-skift i det tavse område (2.000-2.300 cm-1). Dette er ikke begrænset til lægemidlets fysiokemiske egenskaber, hvilket kan være tilfældet for nogle tidligere nævnte cPK-overvågningsmetoder29.

Protokollen skal reducere variationen mellem prøver og prøver i hudtykkelsen for forskellige præparater, da tykke humane hudprøver vil producere minimalt signal efter påføring af lægemiddelprodukt på grund af lysspredning af den tykke prøve. Et mål med dette manuskript er at præsentere en vævsforberedelsesmetode, der sikrer reproducerbare billeddannelsesstandarder. Derudover er CRI-systemet opsat som beskrevet for at reducere potentielle fejlkilder samt minimere signal-til-støj. Dette dokument vil imidlertid ikke diskutere de vejledende principper og tekniske fordele ved CRI-mikroskopet, da dette tidligere er blevet dækket30. Endelig undersøges den omfattende dataanalyseprocedure for at muliggøre fortolkning af resultaterne for at bestemme et eksperiments succes eller fiasko.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Brugen af nøgent museørevæv blev godkendt af Massachusetts General Hospital Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC), mens brugen af humant hudvæv blev godkendt af Massachusetts General Hospital Institutional Review Board (IRB). Ifølge IACUC-protokoller blev der opnået nyligt aflivede mus fra samarbejdspartnere med nøgne muskolonier. Humant væv blev indkøbt fra elektive abdominoplastikprocedurer på Massachusetts General Hospital via en godkendt protokol. Derudover blev specifikke vævstyper bortset fra abdominal hud erhvervet via en kropsdonationsmyndighed, også gennem en IRB-godkendt protokol.

1. Forberedelse af væv

  1. Forberedelse af nøgent museøre hudvæv
    1. Efter at have erhvervet friskhøstede nøgne musekroppe, skal du fjerne ørerne ved hjælp af tang og mikrokirurgisk saks. Læg det ene øre i en lille petriskål (dvs. 35 mm x 10 mm). Anbring den nøgne musekrop i en biohazardpose, der skal bortskaffes i overensstemmelse med lokale IACUC-protokoller.
    2. Skyl hvert museøre med fosfatbufret saltvand (PBS) og dup det forsigtigt tørt med en opgavevisker. Gentag to gange for at fjerne resterende snavs eller snavs på øret, der kan påvirke billedkvaliteten (se figur 1).
    3. Hvis øret skal bruges inden for 24 timer, anbringes det i en lille petriskål (dvs. 35 mm x 10 mm) med frisk PBS i køleskab (2-8 °C). Hvis øret skal bruges efter 24 timers høst, skal du placere det i en petriskål (35 mm x 10 mm) uden PBS, dække fadet med parafilm og placere det i en -20 °C fryser.
  2. Fremstilling af humant hudvæv
    1. Efter udtagning af humant væv anbringes det i en stor petriskål (dvs. 60 mm x 15 mm) i en biologisk hætte for at give tilstrækkelig plads til prøveforberedelse.
    2. Placer stratum corneum-siden nedad, så det subkutane fedt er tilgængeligt.
    3. Brug tang og mikrokirurgisk saks til forsigtigt at fjerne det subkutane fedt. Når subkutant fedt ikke længere kan fjernes med saksen, skal du skifte til en 10-bladet engangsskalpel (eller tilsvarende) for at fjerne det resterende subkutane fedt. Brug skalpellen i en vinkel på 45° i forhold til huden, mens du holder huden stille med tang (se figur 1).
      BEMÆRK: For at have SRS-billeder af høj kvalitet skal prøverne være så tynde som muligt uden at blive punkteret.

Figure 1
Figur 1: Billeder af ideel tykkelse til billeddannelse af mus og menneskehud. (A) Musens ørehud holdt op mod lys, som synligt kan lade lys komme igennem. (B) Ideel menneskelig hud holdt op til lys efter tilberedning. Klik her for at se en større version af denne figur.

  1. Sektion den menneskelige hud i stykker på 1 cm x 1 cm.
    BEMÆRK: Frisk hud, kan anvendes i op til 24 timer uden brug af en agarose gel seng, som beskrevet tidligere31. Frisk hud kan dog bruges i længere tid, hvis den opbevares på en agarosegelseng. Hvis huden skal anvendes senere, anbringes huden i en prøvetransportpose og anbringes derefter i en -20 °C fryser. Frossen hud skal optøes ved hjælp af nedenstående procedure for at opnå optimale resultater (se trin 3.1.2).

2. Opsætning af laser og mikroskop

  1. Ca. 30 minutter før billeddannelse skal du tænde for den bredt indstillelige ultrahurtige laser (i det følgende benævnt laseren) og lade den varme op. Aktivér laseradvarselsskiltet/låsesystemet for at underrette personale uden for potentiel fare ved indrejse.
    BEMÆRK: Der skal altid bæres korrekte briller, når du arbejder med klasse IV-lasere. For den specifikke laser, der anvendes her, er de anbefalede korrekte briller OD ≥ 6 for laserens arbejdsområde 800-1.300 nm.
  2. Mens laseren varmer op, skal du aktivere den resterende hardware til mikroskopstyring, CARS-detektion og SRS-detektion.
  3. Juster mikroskopet korrekt for at sikre optimal billeddannelse. I vinduet Image Acquisition Control i mikroskopstyringssoftwaren (herefter MC-softwaren) skal du klikke på transmissionslampen for at tillade lys at komme fra mikroskopets transillumineringslampe.
  4. Sørg for korrekt Köhler-belysning for at justere mikroskopet langs den lodrette akse: Luk iris ned, så der ses en minimal mængde lys gennem øjenstykket32.
  5. Mens du kigger gennem okularet, skal du åbne iris for at se, om polygonen berører alle sider samtidigt. Juster kondensatorens højde, hvis en polygonform ikke kan ses, før irisen åbnes.
  6. Hvis polygonformen ikke berører alle sider på samme tid, skal du justere blændejusteringspositionen ved hjælp af justeringsknapperne.
    BEMÆRK: Se Sanderson et al.33 for en dybdegående mikroskopopsætning.
  7. Anbring et mikroskop dias med en dækslip og dobbeltsidet klæbende afstandsrum indeholdende en olieprøve (f.eks. Olivenolie, da der er mange -CH2- bindinger i olier) på mikroskopets trinholder.
  8. I vinduet Anskaffelsesindstillinger i MC-softwaren skal du finde rullemenuen mikroskop og indstille mikroskopmålet til 20x.
  9. Kontroller, at CARS-detektionsfilteret (645 nm/50 nm) er i position til at visualisere og måle epiCARS-signalet langs mikroskopets sideportfotomultiplikatorrør.
    BEMÆRK: Dette specifikke filter er valgt til billeddannelse af lipider som anti-Stokes CARS-signalet genereret ved 652 nm for en pumpebølgelængde på 803 nm og en Stokes-bølgelængde på 1.040 nm (se Eq. (1)).
    Equation 1 (1)
    Hvor λ-variablerne har enheder af nm; λpumpe er pumpestrålens bølgelængde; og λStokes er Stokes-strålens bølgelængde.
  10. Kig gennem okularet for at finde kanten af olieprøven, som vil blive brugt til at verificere justeringen af systemet.
  11. Sørg for, at kanten er i Z-fokus ved hjælp af fokusknapperne på mikroskopet, og juster scenecontrolleren for at opnå XY-fokus.
  12. Når laseren er varmet op, skal du indstille pumpestrålen til 803 nm med motorens finjustering indstillet til 50,0 i laserens grafiske brugergrænseflade. Den nøjagtige motorfinjustering, der bruges, kan variere fra opsætning til opsætning.
    BEMÆRK: Pumpestrålen er den eneste stråle med en justerbar bølgelængde på denne laser, da Stokes-strålens bølgelængde er fastgjort til 1.040 nm. Denne konfiguration er rettet mod CH-vibrationen ved 2850 cm-1 (se Eq. (2) for at beregne pumpens bølgelængde for bølgetalsmålretning).
    Equation 2 (2)
    Hvor Equation 3 har enheder med relativt bølgetal (cm-1), og λ variabler har enheder i cm.
  13. Kontroller laserens justering i mikroskopet inden billeddannelse; se figur 2 for afbildning af laserbanen. Under den indledende opsætning af mikroskopet skal du installere to iriser i strålebanen som vejledninger til korrekt justering i mikroskopet. Da laserens optiske vej kan drive over tid, skal du sørge for, at laserstrålebanerne krydser irisens centrum, så de kommer korrekt ind i mikroskopet.
  14. Brug IR-fremviseren til at lukke alle iriserne helt og sikre, at strålen er centreret om begge: først på iris nærmest laseren og til sidst ved mikroskopindgangsporten.
  15. Kontroller først pumpestrålen for at sikre, at strålen går lige ind i mikroskopet. Når pumpen er justeret, skal du kontrollere, at Stokes-strålen også går korrekt ind i mikroskopet.
    1. Hvis bjælkerne ikke er justeret gennem iriserne, skal du iterativt gå bjælkerne gennem iriserne ved hjælp af x- og y-justeringsknapperne på de to spejlbeslag til pumpen og Stokes-strålestierne.
  16. Når strålepletterne overlapper hinanden, inden de kommer ind i mikroskopet, skal du kontrollere, at de krydser mikroskopet korrekt.
    1. I vinduet Image Acquisition Control i MC-softwaren skal du klikke på TD-kanalen til transmission, ALG1 (analog kanal 1) for den sammenhængende anti-Stokes Raman-kanal og ALG2 (analog kanal 2) for den stimulerede Raman-spredningskanal. Brug følgende indstillinger (som i denne protokol): forstærkning på 1 og en forskydning på -1 for ALG1, forstærkning på 1,25 og forskydning på -2 for ALG2.
      BEMÆRK: Afhængigt af systemkonfigurationen kan analoge kanaler have forskellig nummerering for individuelle billedbehandlingskanaler. Hvis SRS-detektoren er på plads, vil der ikke være noget transmissionssignal, da intet lys kan komme igennem (dvs. man kan ikke visualisere billeder med TD og ALG2 samtidigt i denne opsætning).

Figure 2
Figur 2: Skematisk layout til sammenhængende Raman laserbilleddannelsessti. Bjælker er uafhængigt betinget af spotstørrelse og matchet via tidsforsinkelsestrin for at generere sammenhængende Raman-spredning i prøver for den ønskede indstillingsfrekvens. Klik her for at se en større version af denne figur.

  1. Tænd for effektmåleren, og mål effekten af pumpen og Stokes-strålerne individuelt til eksperimentet ved hjælp af en termisk effektsensor med høj effekt.
    BEMÆRK: I dette specifikke eksempel var pumpestråleeffekten 80 mW, mens Stokes-stråleeffekten var 180 mW før indgangen til mikroskopet.
  2. I vinduet Image Acquisition Control skal du klikke på knappen Focus x2 for at se billedet i MC-softwaren.
  3. I vinduet Indstillinger for anskaffelse skal du sikre dig, at pixelforholdet og opholdstiden er indstillet til de ønskede parametre for eksperimentet.
    BEMÆRK: Et forhold på 1,024 x 1,024 pixel og en opholdstid på 2 μs / pixel blev brugt i denne protokol.
  4. Bekræft laserjusteringen i forhold til mikroskopet ved at fjerne blokeringen af pumpestrålen og se på TD-kanalen .
    BEMÆRK: Laseren er justeret korrekt, hvis strålen ses centreret i billedet med de korrekte detektorindstillinger.
  5. Ellers skal du bruge X- og Y-justeringsknapper på periskopet til at flytte strålen til midten af billedet.
  6. Bekræft laser- og mikroskopjustering ved at se det samme billede i både CARS- og SRS-kanalerne.
  7. For at hente justeringsbilledet skal du klikke på XY-scanningsknappen i vinduet Kontrol af billedoptagelse med det relevante filtertilstandssæt (f.eks. Kalman Line 3).
  8. Gem dette sæt billeder med et beskrivende filnavn for at sammenligne over tid og bekræfte systemets ydeevne/justering.

3. Lipid billeddannelse

  1. Mus øre og humant væv
    1. Hvis du bruger frisk væv, skal du springe trin 3.1.2 over.
    2. Fjern museøreskind fra -20 °C fryseren, og anbring det i et inkubationskammer (32 °C) i 10 minutter. Fjern museøret fra inkubationskammeret.
      BEMÆRK: Se trin 1.1.2. til forberedelse af museøreskind. Grov håndtering eller skrabning af vævet kan resultere i mekanisk nedbrydning, ødelæggelse eller forstyrrelse af vævet, især stratum corneum.
    3. Hvis du bruger et nøgent museøre, skal du placere den forreste del af øret, der vender mod glasbunden på en 35 mm, nr. 0 skål. Hvis du bruger menneskelig hud, skal du placere den med stratum corneum med forsiden nedad, da dette vil muliggøre lægemiddelkvantificering fra de overfladiske lag til de dybere lag (figur 1).
      BEMÆRK: Den bageste del af det nøgne museøre er mere tilbøjelig til ufuldkommenheder fra huset. Hvis menneskets hud ikke er placeret med stratum corneum side vendt nedad på det omvendte mikroskop, vil man ikke være i stand til at se forbi dermis, da der er en hel del lys spredt, og stoffet, der gennemsyrer stratum corneum, kan ikke ses.
    4. Når vævet er centreret på glasbunden, skal du bruge en applikator med bomuldsspids for at sikre, at huden er flad og har fuldstændig kontakt med dæksflipsoverfladen på glassbundsfadet.
      BEMÆRK: Dette er et trin, der kan forårsage vanskeligheder, mens du forestiller huden, hvis den ikke er helt flad.
    5. Placer en skive oven på huden for at forhindre bevægelse under billeddannelse. Sørg for, at vævet er synligt gennem skivens midterhul til SRS-transmissionsdetektion.
    6. Fjern glidetrinindsatsen, og udskift den med inkubationskammeret, som har den enkelte skålindsats.
    7. Anbring glassbundsfadet med hudvævet i inkubationskammerets enkeltfadsfastgørelse.
      BEMÆRK: Alternativt kan du bruge en 6-brønds plade til at afbilde flere hudprøver og formuleringer på én gang.
    8. Reducer pixelforholdet i vinduet Anskaffelsesindstillinger i MC-softwaren (f.eks. fra 1.024 x 1.024 til 512 x 512) for hurtigere galvo-scanningshastighed, mens Z-dybden ændres for at finde stratum corneum (se figur 3A for mus eller figur 3E for mennesker).
    9. Når stratum corneum er fundet, skal du registrere den aksiale position til at være nulpositionen i vinduet Indstillinger for anskaffelse og ændre pixelforholdet for hvert specifikt eksperiment (f.eks. 1.024 x 1.024).

Figure 3
Figur 3: Eksempel på huddybder opnået ved hjælp af SRS. Det øverste sæt billeder er fra nøgen museøreskind, der viser følgende: (A) stratum corneum, (B) talgkirtler, (C) adipocytter, (D) subkutant fedt. Det nederste sæt billeder er fremstillet af menneskelig hud, der viser følgende: (E) stratum corneum, (F) papillær dermis og (G) en talgkirtel. Skalastænger = 100 μm. Både muse- og menneskelige hudbilleder blev erhvervet ved hjælp af et 20x mål på 1024 pixels x 1024 pixels; den menneskelige SG blev taget ved 512 x 512 pixels. Forkortelser: SRS = stimuleret Raman spredning; SG = talgkirtel. Klik her for at se en større version af denne figur.

4. Anvendelse af topisk formulering

  1. Pipette den forudbestemte formuleringsdosis på huden (f.eks. 10 μL/cm2).
    BEMÆRK: Formuleringens viskositet vil spille en rolle i pipettevalget. Det anbefales at anvende en positiv forskydningspipette til viskøse formuleringer, såsom cremer eller geler, og en luftforskydningspipette til opløsninger. I dette eksperiment var ruxolitinib modelforbindelsen i en simpel opløsning af propylenglycol (propan-1,2-diol).
  2. Brug stempelspidsen fra en sprøjte eller en behandsket finger til at gnide formuleringen i en bevægelse med uret i 30 s. Bemærk det tidspunkt, hvor formuleringen anvendes til senere cPK-analyse (se trin 6.15-6.17 nedenfor).
    BEMÆRK: Varigheden af ansøgningen afhænger af eksperimentet; hver enkelt kan være anderledes.
  3. Når den tildelte tid for formuleringen til at gennemsyre er gået, skal du fjerne den overskydende formulering og placere huden med formuleringssiden vendt mod glassbundsfadet.
    BEMÆRK: Formuleringen fjernes ved hjælp af en delikat opgavevisker eller en lille (~ 1 tommer) 3D-trykt gummiskraber i en enkelt retning (f.eks. Fra nord til syd).

5. Eksperimentel opsætning til lægemiddelkvantificering

  1. Indstil pumpestrålen til 803 nm. Kontroller pumpen og Stokes strålekræfter med fotodioden for at sikre, at de er de ønskede kræfter til eksperimentet. Fjern blokeringen af hver stråle individuelt for at måle effekten og blokere bjælkerne igen.
    BEMÆRK: I dette specifikke eksempel var pumpestråleeffekten 100 mW, mens Stokes-stråleeffekten var 180 mW.
  2. Anbring glassbundsfadet i et inkubationskammer med en indsats til en glasbundsskål. Fastgør fadet med clips for at forhindre bevægelse under billeddannelsen.
  3. Tænd transmissionslampen i MC-softwaren. Når du kigger gennem okularet, skal du justere det aksiale fokus med justeringsknappen for at sikre, at vævet er i fokus.
  4. Fjern blokeringen af både pumpen og Stokes-bjælkerne. Sørg for, at ALG1- og ALG2-kanaler er aktiveret, og klik derefter på Fokus x2 på MC-softwaren for at visualisere huden i CARS- og SRS-kanalerne. Sørg for, at SRS-fotodioden er på plads over kondensatoren.
  5. Klik på Multi Area Time Lapse (MATL) i rullemenuen Enhed. Se efter en XY Stage Warning, der skal vises; Når scenen bevæger sig for at finde sin mekaniske oprindelse, skal du klikke på OK.
  6. I MATL-modulet skal du gå til Vis og derefter klikke på Registreret punktliste i MC-softwaren. Begynd at tilføje enten 1) specifikke dybder i huden (dvs. stratum corneum, SG'er, adipocytter, subkutant fedt som bestemt under levende billeddannelse med lipid-tunet kontrast) eller 2) XY-positioner, hvis der skal tages hele dybdestakke. Se eksempler i figur 3 .
    1. Når stratum corneum er identificeret, skal du rulle gennem det aksiale fokus (eller z-fokus) for at identificere specifikke vævsstratifikationer nævnt ovenfor. Se figur 3 for eksempler inden for menneske- og musehud.
    2. I tilfælde af billeddannelse af specifikke dybder i modsætning til fulde Z-dybdestakke skal du for hver hudstratificering klikke på Registrer punkt for at føje det til MATL-køen. For stakke i fuld dybde skal du klikke på Registrer punkt for hver XY-position med dybdevalg i vinduet anskaffelsesparametre .
    3. Når alle de ønskede XY-positioner (fuld Z-dybdestakke) eller XYZ (specifikke hudstratifikationer) er blevet registreret i MATL-softwaren, skal du ændre filmappen og navnet på en måde, der vil være konsistent gennem eksperimenterne for billed- og cPK-analyser (se trin 6.15-6.17).
  7. Indstil antallet af gentagelser til 1 i MATL-modulet, og klik på Klar. Vent på , at Play skifter fra en grå til en sort pil, hvilket indikerer, at softwaren er klar. Tryk på Afspil for at begynde at afbilde den foreløbige lipidstak (herefter lipidbilleder).
    BEMÆRK: Dette vil blive brugt til at adskille lipidrige og lipidfattige regioner af individuelle vævsstratifikationer under analysen. Cyklussen og den samlede tid er angivet nederst til højre på listen over registrerede punkter.
  8. Når cyklussen er afsluttet, skal du blokere både pumpen og Stokes-bjælkerne. Skift bølgelængden på den lasergrafiske brugergrænseflade til den ønskede bølgelængde baseret på det målrettede bølgetal eller Raman-vibration.
    BEMÆRK: For eksempel bruges 843 nm til pumpestrålen til at målrette 2.250 cm-1 ved hjælp af Eq. (2), og motorens finjustering ændres til 50.1. Eksempellægemidlet, der præsenteres her, ruxolitinib, indeholder en nitril, der kan målrettes mod 2.250 cm-1. Bølgetallet målrettet mod hudstruktur vil altid være det samme (2.850 cm-1); Bølgetallet for en API kan dog være et hvilket som helst bølgetal, men skal være kendt eller beregnet a priori.
  9. Juster det manuelle tidsforsinkelsestrin (figur 2) for at sikre overlapning i tide til den nye bølgelængde og pumpens stråleeffekt. Sørg for, at de samme beføjelser bruges til både lipid- og API-billeddannelse, som er etableret a priori.
  10. Brug varigheden pr. cyklus til at beregne det samlede antal gentagelser, der kræves pr. eksperiment. Du skal blot dividere eksperimentets samlede ønskede tidsforløb med cyklusvarigheden.
    BEMÆRK: Cyklusvarigheden er en funktion af billedstørrelse, pixelopvaringstid, Kalman-gennemsnit og antallet af billeder pr. Cyklus. Optimering af disse parametre vil forkorte cyklustiden og dermed øge den tidsmæssige opløsning.
  11. Når det samlede antal cyklusgentagelser er valgt, skal du fjerne blokeringen af pumpestrålen, kontrollere effekten ved hjælp af fotodioden og sikre, at den svarer til den ønskede effekt. Til sidst skal du fjerne blokeringen af Stokes-strålen for at muliggøre billeddannelse.
  12. Tryk på Afspil for at starte automatisk billeddannelse af sætpunkterne.
  13. Når MATL-billeddannelsen er afsluttet, skal du skifte pumpestrålen tilbage til 803 nm og justere effekten tilbage til den oprindelige lipidbilleddannelseseffekt, der blev brugt i trin 5.1.
  14. Som i de foregående trin skal du ændre filnavnet, så det er konsistent for billeder efter eksperimentet i hele undersøgelsen.
  15. Indstil antallet af gentagelser til 1.
  16. Klik på Klar | Afspil-knappen for at erhverve en lipidstak efter tidsforløbet og sikre, at der ikke har været nogen vævsbevægelse under billeddannelse (figur 4).

Figure 4
Figur 4: Vævsbevægelse i nøgen museørehud demonstreret ved at visualisere talgkirtler. Eksempel på begrænset vævsbevægelse er afbildet i A og B, mens betydelig vævsbevægelse er afbildet i C og D. A) viser talgkirtlerne på tidspunktet for formuleringens påføring og B) samme dybde 120 minutter efter påføring. C) Talgkirtler hos musen på tidspunktet for formuleringens påføring og (D) 120 minutter efter formuleringspåføring talgkirtlerne er næppe synlige, hvilket er en indikation af, at dette eksperiment ikke målte optagelsen i talgkirtlerne i hele forsøgsvarigheden. Skalastænger = 100 μm. Billederne er 1024 pixels x 1024 pixels. Klik her for at se en større version af denne figur.

6. Analyse af data

  1. Erhverv billeder som . OIB (eller . OIR afhængigt af mikroskopet og MC-softwaren) filtyper, hvor hver XYZ-position har en separat undermappe.
  2. Kompiler lipidbilleder med API-kanalbilleder ved at omdøbe lipidbilleder med følgende slutning _lipid.oib.
  3. Udfør følgende trin med hver hudstratificering (her demonstreret ved kun at bruge SG-stratificeringen for enkelhedens skyld; se figur 3B).
    1. Importer et SG-lipidbillede til ImageJ (eller Fiji)34 , og marker afkrydsningsfeltet Split Channels for at opdele filen i CARS- og SRS-kanalerne.
      BEMÆRK: Fiji vil opdele filen i antallet af billeder, der er erhvervet under eksperimentet på tværs af antallet af kanaler.
    2. Åbn ROI-manageren (Region of Interest) ved at klikke på Analysér | Værktøjer | ROI Manager.
    3. Brug SRS-kanalen (f.eks. C = 1) til at afgrænse en SG i billedet.
      BEMÆRK: SG'er er de lyse steder på grund af målrettet -CH2- vibration.
    4. Føj dette til ROI-manageren ved at klikke på Tilføj [t] i ROI-manageren eller trykke på t på tastaturet. Gentag denne proces for hver SG i billedet.
    5. Hvis du vil maskere lipidrige områder, skal du vælge hvert investeringsafkast og klikke på fanen Mere | ELLER (kombiner) | Føj til ROI manager.
    6. For at maskere lipidfattige områder skal du bruge rektangelværktøjet i FIJI-menuen og tegne en firkant rundt om hele billedet. Føj dette til ROI-manageren.
    7. Klik på det nyligt tilføjede firkantede ROI ud over ROI, der vælger alle lipidrige regioner i ROI-manageren. Under Mere skal du vælge XOR for at generere en maske af de lipidfattige områder og føje den til ROI-manageren.
  4. Indlæs API-billederne i Fiji.
  5. Sammenkæd billederne i numerisk rækkefølge (dvs. Image0001, Image0002, Image0003 osv.) ved hjælp af følgende menusekvens: Billede | Stakke | Værktøjer | Sammenkæd.
    1. Alternativt kan du importere disse billeder ved at indlæse et af billederne i Fiji og derefter vælge en indstilling kaldet Gruppefiler med lignende navne på installationssiden .
      BEMÆRK: Dette giver mulighed for at importere alle billeder med et lignende filnavn og sammenkæde dem automatisk.
  6. Mens du har det sammenkædede billede aktivt, skal du gå til ROI-manageren, vælge de lipidrige områder (dvs. SG), klikke på Mere og vælge Multi-measure. Vent på, at vinduet Resultater vises.
  7. Se efter Area, Mean, Min, Max og Median i standardmålingsindstillingerne. Hvis der ønskes andre metrics til analyse, skal du aktivere disse indstillinger ved at markere det relevante afkrydsningsfelt i vinduet Angiv målinger (Analysér | Indstil målinger...).
  8. Eksporter dataene fra vinduet Resultater til et regneark, og tilføj en kolonne med titlen Region.
  9. Tilføj lipidrig til hver række data for de lipidrige regioner. Tilføj lipidfattig til regioner, der var uden for lipiderne.
  10. Tilføj en kolonne med titlen lag , og tilføj det respektive lag, der blev analyseret (supplerende tabel S1).
  11. Gentag trin 6,5 - 6,7 for de lipidfattige områder, mens det relevante investeringsafkast er valgt.
  12. For at visualisere dataene skal du gemme regnearket og importere det til enten JupyterLab (pakkematplotlib)35 eller i R (pakke ggplot2)36. Plot dataene som en funktion af billednummeret vs. middelintensiteten for at estimere koncentrationstidsdataene. (Figur 5).
  13. Importer regnearket til RStudio for at udføre noncompartmental analysis (NCA) til farmakokinetisk analyse af CRI-dataene.
  14. Tilføj en kolonne med titlen tid.
  15. For Image0001 skal du beregne varigheden mellem formuleringsprogrammet og det første billede.
    BEMÆRK: Dette er det første tidspunkt. Cyklusvarigheden bruges til at beregne de resterende billeder (og dermed tidspunkter), der stiger over tid. For eksempel, hvis tiden siden applikationen er 30 minutter, vil Image0001 have et tidspunkt på 30 minutter og med en cyklusvarighed på 8 minutter, Image0002 vil have et tidspunkt på 38 minutter, Image0003 vil have et tidspunkt på 46 minutter og så videre.
  16. Kør NCA i RStudio (ved hjælp af NonCompart-pakken)37 på de intensitetstidsdata, der importeres fra regnearket, med følgende opfordring til ét lag/område:
    sNCA(x = tid, y = middelværdi, dosis = 1, timeUnit = "s", doseUnit = "mg")
    Hvor x henviser til tidspunkter, henviser y til intensitet, og dosis kan efterlades som en, beregnet som mM-dosis af lægemidlet i formuleringen eller produktdosis.
    BEMÆRK: NCA-udgangen giver parametre som Cmax og AUCall. Men da dette er ex vivo hud, er disse parametre faktisk Jmax og AUCflux-all.
  17. Sammenlign Jmax og AUCflux-all metrics visuelt ved at plotte dem (figur 6) ud over statistiske sammenligninger på tværs af eksperimentelle forhold. Se figur 6 for et eksempel på analysen af ex vivo CRI-undersøgelser.
    BEMÆRK: De(t) relevante statistiske test(er) er betinget af hvert specifikt datasæt. Det er også vigtigt at bemærke, at alle farmakokinetiske parametre er log-normalt fordelt, og enhver sammenligning skal bruge de log-transformerede (naturlige log eller log10) data.

Figure 5
Figur 5: Intensitet vs. tidsprofiler. (A) Et eksempel på fluxprofiler, der har nået mætning og dermed kun et fald i intensiteten ses. Hver ROI har en anden fluxprofil for at demonstrere heterogeniteten i de data, man kan erhverve. (B) Et eksempel på koncentrationer, der stiger, efter at billeddannelsen er begyndt. Hver ROI er et andet synsfelt (angivet med de forskellige farvespor) inden for det samme væv i det samme eksperiment. Ud over globale koncentrationer er der evnen til at belyse, hvilket lokalt miljø en API / formulering foretrækker som angivet af lipidrige og lipidfattige regioner. Profilerne præsenteret i A indikerer, at der ikke er nogen absorption af lægemiddel i vævet, da API'en allerede har gennemsyret og begyndt at forlade vævet, når billeddannelsen er startet. I B har vævet imidlertid ikke nået mætning, og der er stadig absorption af API'en efterfulgt af eliminering. Segmenteringen af billeder i lipidrige og lipidfattige vil hjælpe med at belyse lokaliseringen af API 'en (eller inaktive) og permeationsvejene ind i huden (dvs. stratum corneum). En højere koncentration inden for de lipidrige regioner indikerer, at API'en lokaliserer inden for lipidstrukturen i det undersøgte lag, hvilket hjælper med målrettet lægemiddelleveringsinformation. Forkortelser: ROI = region af interesse; API = aktiv farmaceutisk ingrediens. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Billeddannelse betragtes som vellykket, hvis vævet ikke har bevæget sig signifikant i enten aksial (<10 μm) eller lateral retning efter afslutningen af eksperimentet (figur 4). Dette er en umiddelbar indikation, hvis SRS-målingen for den pågældende API-api ikke er repræsentativ for den oprindelige dybde, for hvilken kvantificeringen er lagspecifik. Dette afbødes ved at afbilde z-stacks for hver XY-position af interesse, hvor afvejningerne er den tidsmæssige opløsning. Hvis frossen hud anvendes i disse undersøgelser, er penetrationen og gennemtrængningen af API'en hurtig sammenlignet med frisk hud, og minimal tid mellem formuleringspåføring og starten af billeddannelse er afgørende. En anden overvejelse er det mål, der blev brugt til eksperimenterne. Hvis du bruger et 60x mål, er det relativt let at vælge en plan overflade inden for et enkelt synsfelt (FOV). For et 20x mål er det viste felt imidlertid meget større, og derfor er et vigtigt trin i vævspræparatet at sikre ensartet kontakt mellem huden og den glasbundne billedskål. Et fladt synsfelt og lignende dybde sammenlignet med den oprindelige dybde i synsfeltet er to nøgler til positive resultater.

Laserens justering ud over billedets dynamiske område skal behandles med den største omhu. Forkert justering af laserpulstogene i mikroskopet kan føre til en lang række problemer, herunder lave signalniveauer eller ujævnt ophidsede FOV'er, hvilket kan give anledning til billeder med lav kontrast. En anden overvejelse er at sikre, at hele det dynamiske område af intensitetsværdier udnyttes, når man erhverver billeder; Ellers komprimeres billeddataene, og koncentrationsforskelle kan være vanskelige at opdage.

En anden overvejelse er, at hudheterogenitet kan give anledning til variation i de beregnede mikroskalafluxprofiler inden for det samme datasæt. Intensiteterne (en proxy for koncentrationer) begynder højt og falder over den eksperimentelle varighed (figur 5A), mens andre undersøgelser indikerer en stigning efterfulgt af et fald i fluxen over forsøgsperioden (figur 5B). På nuværende tidspunkt kan absolut koncentrationskvantificering ikke forekomme øjeblikkeligt på grund af forsøgsopstillingen. Således er koncentrationer, der falder efter påføring, muligvis resultatet af en mætning inden for dybden af interesse, og kvantificeringen repræsenterer kun API-elimineringen. Hvis det dynamiske område ikke er stort nok, eller huden er for tyk, vil visuel inspektion få koncentrationerne til at virke stillestående, så der ikke sker nogen ændring i løbet af billeddannelsens varighed. Dette er en funktion af både et suboptimalt dynamisk område og hudtykkelse, hvilket vil tyde på et behov for at gentage eksperimentet.

Koncentrationstidsprofilerne underkastes derefter NCA for hver profil for at estimere eksponeringen, den maksimale flux og tiden til maksimal flux. Statistisk analyse (figur 6) udføres på tværs af eksperimentelle forhold for yderligere at undersøge kovariater, der bidrager til potentielle forskelle i eksponeringer. Sammenligninger af de globale cPK-parametre vil give indsigt i, hvilken formulering der giver en højere flux eller større eksponering. I modsætning hertil vil mikroskala cPK-parametrene (dvs. de lipidrige og lipidfattige regioner) give indsigt i de lokale biodistributions- og permeationsveje. For eksempel, når man sammenligner to formuleringer med den samme API-koncentration og adskiller sig i de inaktive ingredienser, kan en formulering have tendens til at gennemsyre stratum corneum via den lipidrige region versus den lipidfattige region. Denne observation indikerer, at denne specifikke formulering vil "skubbe" gennemtrængningen mod de lipidrige regioner for lettere penetration og gennemtrængning.

Figure 6
Figur 6: Eksempel NCA-analyse af koncentrationstidsprofil fra museørevæv. A) Et eksempel på tmax (tid, hvor den maksimale koncentration forekommer) analyse mellem to formuleringer for den samme aktive stoffer. Denne analyse indikerer, at 2-(2-ethoxyethoxy)ethanolen tilvejebringer udvidet API-gennemtrængning sammenlignet med Gel-formuleringen, uanset hudlaget. Det kan også ses, at tmax for SC-laget er længere end SG, hvilket tyder på, at 2-(2-ethoxyethoxy)ethanolformuleringen fortsætter med at levere API, selv når billeddannelsesvarigheden er afsluttet. B) Et eksempel på total eksponeringsanalyse mellem den samme formulering/API-kombination i A , men i dybder længere inde i huden. Dette tal er ændret fra18. Forkortelser: SC = stratum corneum; SG = talgkirtlen; AD = adipocyt; SCF = subkutant fedt. Klik her for at se en større version af denne figur.

Supplerende tabel S1: Eksempel på datasæt, der er erhvervet fra manuel billedanalyse. Kolonnerne angiver de oplysninger, der er erhvervet fra afsnittet Dataanalyse i dette manuskript (dvs. ramme, område, middelværdi, min, max, median), mens yderligere kolonner er tilføjet til brug i en cPK-analyse (dvs. lag, region, time_minutes). Disse data kan analyseres via NCA og plotes for at visualisere koncentrationsprofilen i SG-hudlaget. Klik her for at downloade denne tabel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Evalueringen af aktuel BA / BE er et forskningsområde, der kræver en mangesidet tilgang, da ingen enkelt metode fuldt ud kan karakterisere in vivo cPK. Denne protokol præsenterer en metode til evaluering af et topisk lægemiddels BA / BE baseret på sammenhængende Raman-billeddannelse. Et af de første punkter, der kan overses, er, hvor tynde hudprøverne skal være, især til kvantitativ transmission SRS-billeddannelse. Hvis huden er for tyk (dvs. lys kan ikke let passere igennem), er der lidt eller intet signal målt af SRS-detektoren, og det vil derfor give dårlige koncentrationsdata. Der skal udvises omhu for at forberede disse vævsprøver korrekt, da dette kan gøre eller bryde et eksperiment. Med hensyn til det nøgne museøre, bortset fra at skylle med PBS og klappe det tørt for at fjerne resterende snavs på øret, kræves der lidt forberedelse.

Museører er typisk af en tykkelse på flere hundrede μm, hvilket er optimalt til transmission SRS. Menneskelige hudprøver er typisk flere mm tykke, herunder subkutant fedt, selvom tykkelsen er meget variabel afhængigt af hudvævets anatomiske kilde og donorens alder. Således skal så meget overskydende væv fjernes som muligt for nøjagtigt at kvantificere lipidstrukturer og API-koncentrationer i epidermis og dermis over tid. Hvis vævsforberedelsestrinnet overses, vil de resterende trin i forsøgsopsætningen stort set være uegnede, da startbetingelserne ikke er optimale.

Laser/mikroskop-opsætningen er den næste udfordring eller potentielle anstødssten. Forkert justering af laseren i strålebanen og i sidste ende ind i mikroskopet resulterer i dårlig kontrast og derfor dårlige billeddannelsesresultater. Det anbefales at oprette CARS-kanalen først, da signalet er lettere at finde. Pumpen og Stokes pulstog skal overlappes i både tid og rum. Justeringen af pumpelaseren kontrolleres ved hjælp af transmissionsdetektoren i mikroskopets MC-software, når SRS-detektoren vendes af vejen. Mens du ser CARS-kanalen (ALG1) i MC-softwaren, blokeres Stokes-strålen ikke. Men hvis der ikke er noget signal fra olieprøven, er det først nødvendigt at justere Stokes-strålen og derefter justere tidsoverlapningen. Det kan være nødvendigt at gentage disse to justeringer, indtil signalet er optimeret. Den rumlige overlapning af de to bjælker ses gennem en IR-fremviser på iriserne, mens tidsforsinkelsestrinnet (figur 2) justeres, så bjælkerne overlapper hinanden i tide. Disse to justeringstrin er afgørende for at sikre CARS-signalgenerering.

Når et signal er tydeligt i CARS-kanalen, er SRS-kanalen (ALG2) den næste, der skal konfigureres. Potentielle problemer med manglende signal er, at lock-in-fasen eller forstærkningsindstillingerne er for lave, eller at forskydningen er indstillet for højt i lock-in-softwaren. Derudover kan kondensatorpositionen justeres for at fokusere det transmitterede lys på fotodioden og dermed optimere SRS-signalet. Den ukorrekte opsætning af laseren/mikroskopet vil føre til mangel på signal, hvilket vil mindske koncentrationsestimater og mangel på permeationsinformation. Pumpens og Stokes-strålernes lasereffekt kan optimeres til individuelle undersøgelser. Det er dog afgørende, at bjælkernes kræfter er de samme for hvert eksperiment. Forskellige laserkræfter mellem replikater vil give falske forskelle i koncentration, hvilket skyldes opsætningen snarere end API/formuleringen.

Hver undersøgelse vil kræve en unik dosisvarighedstid (dvs. varighed af den tid, hvor formuleringen efterlades på huden) og skal undersøges uafhængigt for at kvantificere kutan API-penetration/permeation, da dette er formuleringsafhængigt. En anden overvejelse ved udarbejdelsen af en protokol er formuleringsapplikationens okklusive karakter. Det er vigtigt at vide, om formuleringen var designet til at blive administreret under okklusive eller ikke-eksklusive betingelser. CRI-metoden, der præsenteres her, bruger et omvendt mikroskop; det betyder, at hudoverfladen vender nedad og under okklusive indstillinger. Et opretstående mikroskop kan give mulighed for at have ikke-udelukkende forhold; dog er hudoverfladen muligvis ikke flad, hvilket ville gøre disse typer eksperimenter udfordrende.

Det må erkendes, at den okklusive karakter af disse forsøg ikke er den typiske kliniske anvendelse; ikke desto mindre analyseres permeationsveje inden for disse undersøgelser. CRI-metoden, der præsenteres her, giver mulighed for at visualisere og kvantificere mikroskalaændringer, der ellers ikke kan skelnes fra hinanden med metoder som dermal mikrodialyse, dermal open-flow mikroperfusion, tape-stripping eller IVPT-undersøgelser. Den seneste udvikling af hurtig bølgetalsindstilling har banet vejen for den samtidige kvantificering af hudstrukturen og flere vibrationsbindinger uden for det tavse område. Yderligere beregningsmetoder til at analysere specifikke analytters bidrag fra hudens er dog stadig under udvikling28. Dette er også af særlig relevans for in vivo CRI-undersøgelser, selv om de kræfter, der anvendes på bordpladen i denne opsætning (ca. 50 mW i fokus), muligvis ikke er tilladt til klinisk brug. Potentialet i denne metode, der skal oversættes fra en laboratoriebænk til klinikken, kan gøre det muligt for efterforskere at kvantificere lægemidlets gennemtrængning in vivo såvel som ex vivo i samme indstilling for at udvikle in vitro-in vivo-relationer , der er afgørende for fremskridt inden for topisk lægemiddeludvikling.

Den store mængde data, der er erhvervet fra en eksperimentel kørsel, kan være alt fra 10 billeder pr. Websted til 70 billeder pr. Websted. Hvis der er flere steder pr. Stykke væv, fører dette til gigabyte information. Billederne selv giver globale koncentrationstidsdata og kvantificeres som de er, uden forbehandling. Det maksimerer dog ikke nytten af CRI, da lokale biodistributionsdata kan ekstraheres ud over permeationsvejsdata. Billedsegmenteringen er tidskrævende, men giver detaljerede oplysninger, der ikke er mulige med andre metoder. For eksempel er det muligt at estimere den foretrukne penetrationsvej gennem stratum corneum (lipidrig eller lipidfattig), som kan give indsigt i, hvilke inaktive ingredienser der kan bidrage til en bestemt vej, eller om den er stofafhængig. Analyse af et eksperiment kan tage flere timer til dage, afhængigt af antallet af billeder og eksperimentel varighed. Derfor vil en automatiseret tilgang hjælpe med dataanalyse og give konsekvent annotation af lipidrige og lipidfattige regioner på tværs af hudstratifikationer18.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

CLE er opfinder af patenter på CARS-mikroskopi, der er licenseret til flere mikroskopproducenter. Alle andre forfattere har ingen interessekonflikter at oplyse.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne takke Dr. Fotis Iliopoulos og Daniel Greenfield fra Evans' Gruppe for deres diskussion og korrekturlæsning af dette manuskript. Derudover vil forfatterne gerne kvittere for støtten fra LEO Pharma. Figur 2 blev oprettet med BioRender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tissue Preparation
Autoclavable Biohazard Bags FisherBrand 22-044562 As refered to in text: biohazard bags
https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-polyethylene-biohazard-autoclave-bags-without-sterilization-indicator-8/22044562?searchHijack=true&searchTerm= 22044562&searchType=RAPID& matchedCatNo=22044562
Cell Culture Buffers: Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution 1x Corning MT21030CV As refered to in text: PBS
https://www.fishersci.com/shop/products/corning-cellgro-cell-culture-buffers-dulbecco-s-phosphate-buffered-salt-solution-1x-8/MT21030CV?searchHijack=true&searchTerm= 21-030-cv&searchType= RAPID&matchedCatNo=21-030-cv
Disposable Scalpels Exel International 14-840-00 As refered to in text: scalpel
https://www.fishersci.com/shop/products/exel-international-disposable-scalpels-3/1484000?keyword=true
High Precision 45° Angle Broad Point Tweezers/Forceps Fisherbrand 12-000-132 As refered to in text: forceps
https://www.fishersci.com/shop/products/high-precision-45-angle-broad-point-tweezers-forceps/12000132#?keyword=
Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-Ply Kimberly-Clark Professional Kimtech Science 06-666 As refered to in text: task wiper
https://www.fishersci.com/shop/products/kimberly-clark-kimtech-science-kimwipes-delicate-task-wipers-7/06666
Parafilm M Laboratory Wrapping Film Bemis 13-374-12 As refered to in text: parafilm
https://www.fishersci.com/shop/products/curwood-parafilm-m-laboratory-wrapping-film-4/1337412
Petri Dish (35 mm x 10 mm) Fisherbrand FB0875711YZ As refered to in text: small petri dish
https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-specialty-6/FB0875711YZ?keyword=true
Petri Dish (60 mm x 15 mm) Fisherbrand FB0875713A As refered to in text: large petri dish
https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/FB0875713A?keyword=true
Surgical Scissors Roboz NC9411473 As refered to in text: scissors
https://www.fishersci.com/shop/products/scissors-327/NC9411473?searchHijack=true&searchTerm= RS-5915SC&searchType=RAPID& matchedCatNo=RS-5915SC
Laser/microscope
650/60 nm BrightLine single-band bandpass filter Semrock As refered to in text: CARS filter - CH2 vibrations (645nm/60nm filter)
Control box IX2-UCB Olympus As refered to in text: Control Box
D700/30m Chroma As refered to in text: CARS filter - deuterated band
https://www.chroma.com/products/parts/d700-30m
DeepSee Insight Spectra-Physics As refered to in text: Laser
https://www.spectra-physics.com/f/insight-x3-tunable-laser
Digital Handheld Optical Power and Energy Meter Console ThorLabs PM100D As refered to in text: power meter
https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=3341
Fluoview Software Olympus As refered to in text: Microscope Control software
Frosted Microscope Slides FisherBrand As refered to in text: microscope slides
https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-frosted-microscope-slides-4/22265446
FV1000 Olympus As refered to in text: Microscope
Incubation Chamber Tokai Hit GM-800 As refered to in text: incubation chamber
Integrating Sphere Photodiode Power Sensor ThorLabs S142C As refered to in text: photodiode
https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=3341
Power supply FV31-PSU Olympus As refered to in text: Power Supply
Precision 4063, 80MHz Dual Channel Function Generator BK Precision As refered to in text: function generator
ProScan – Precision Microscope Automation Prior Scientific Instruments As refered to in text: stage controller
https://www.prior.com/microscope-automation/inverted-microscope-systems/proscan-linear-stage-highest-precision-microscope-automation
SecureSeal Imaging Spacers Grace Biolabs 654004 As refered to in text: spacer
https://gracebio.com/product/secureseal-imaging-spacers-654004/
SRS Detection Kit APE As refered to in text: SRS detector
UPLSAPO 20X NA:0.75 Olympus As refered to in text: 20X Objective
https://www.olympus-lifescience.com/en/objectives/uplsapo/
Lipid/Drug Imaging
 35 mm Dish, No. 0 Uncoated Coverslip, 14 mm Glass Diameter MatTek Corporation NC9711297 As refered to in text: Glass bottom dish
https://www.fishersci.com/shop/products/glass-bottom-mircrowell-dish/nc9711297
Cotton-tipped applicators FisherBrand As refered to in text: Cotton-tipped applicator
Distriman Postive Displacement Pipette Gilson As refered to in text: Postive Displacement Pipette
https://www.fishersci.com/shop/products/gilson-distriman-positive-displacement-repetitive-pipette/F164001G#?keyword=
Distriman Postive Displacement Pipette Tips Gilson As refered to in text: Tips for pipette
https://www.fishersci.com/shop/products/gilson-distritip-syringes-6/f164100g?keyword=true
Data Analysis
FIJI Open-source As refered to in text: FIJI/ImageJ
https://imagej.net/software/fiji/
Jupyter-Lab open-source As refered to in text: JupyterLab
https://jupyter.org/
Rstudio Open-source As refered to in text: Rstudio
https://www.rstudio.com/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Finnin, B., Walters, K. A., Franz, T. J. In vitro skin permeation methodology. In Transdermal and topical drug delivery: principles and methodology. Transdermal and topical drug delivery: principles and practice. Benson, H. E., Watkinson, A. C. , John Wiley & Sons. Hoboken NJ USA. 85-108 (2012).
  2. Shin, S. H., et al. On the road to development of an in vitro permeation test (IVPT) model to compare heat effects on transdermal delivery systems: exploratory studies with nicotine and fentanyl. Pharmaceutical Research. 34 (9), 1817-1830 (2017).
  3. Hossain, A., et al. Preparation, characterisation, and topical delivery of terbinafine. Pharmaceutics. 11 (10), 548 (2019).
  4. Santos, L. L., Swofford, N. J., Santiago, B. G. In vitro permeation test (IVPT) for pharmacokinetic assessment of topical dermatological formulations. Current Protocols in Pharmacology. 91 (1), 79 (2020).
  5. Iliopoulos, F., Caspers, P. J., Puppels, G. J., Lane, M. E. Franz cell diffusion testing andquantitative confocal Raman spectroscopy: In vitro-in vivo correlation. Pharmaceutics. 12 (9), 887 (2020).
  6. Cordery, S., et al. Topical bioavailability of diclofenac from locally-acting, dermatological formulations. International Journal of Pharmaceutics. 529 (1-2), 55-64 (2017).
  7. Pensado, A., et al. Stratum corneum sampling to assess bioequivalence between topicalacyclovir products. Pharmaceutical Research. 36 (12), 1-16 (2019).
  8. Zhang, Y., et al. Dermal delivery of niacinamide-in vivo studies. Pharmaceutics. 13 (5), 726 (2021).
  9. Bodenlenz, M., et al. Open flow microperfusion as a dermal pharmacokinetic approach to evaluate topical bioequivalence. Clinical Pharmacokinetics. 56 (1), 91-98 (2017).
  10. Eirefelt, S., et al. Evaluating dermal pharmacokinetics and pharmacodymanic effect of soft topical PDE4 inhibitors:Open flow microperfusion and skin biopsies. Pharmaceutical Research. 37 (12), 1-12 (2020).
  11. Stagni, G., O'Donnell, D., Liu, Y. J., Kellogg, J. D. L., Shepherd, A. M. Iontophoretic current and intradermal microdialysis recovery in humans. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 41 (1), 49-54 (1999).
  12. Garcia Ortiz, P., Hansen, S. H., Shah, V. P., Menne, T., Benfeldt, E. Impact of adultatopic dermatitis on topical drug penetration: assessment by cutaneous microdialysis and tape stripping. Acta Dermato-Venereologica. 89 (1), 33-38 (2009).
  13. Joshi, A., Patel, H., Joshi, A., Stagni, G. Pharmacokinetic applications of cutaneous microdialysis: Continuous+intermittent vs continuous-only sampling. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 83, 16-20 (2017).
  14. Kuzma, B. A., et al. Evaluation of local bioavailability of metronidazole from topical formulations using dermal microdialysis: Preliminary study in a Yucatan mini-pig model. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 159, 105741 (2021).
  15. Begley, R., Harvey, A., Byer, R. L.Coherent anti-Stokes Raman spectroscopy. Applied Physics Letters. 25 (7), 387-390 (1974).
  16. Evans, C. L., et al. Chemical imaging of tissue in vivo with video-rate coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (46), 16807-16812 (2005).
  17. Hill, A. H., Manifold, B., Fu, D. Tissue imaging depth limit of stimulated Raman scattering microscopy. Biomedical Optics Express. 11 (2), 762-774 (2020).
  18. Feizpour, A., Marstrand, T., Bastholm, L., Eirefelt, S., Evans, C. L. Label-free quantification of pharmacokinetics in skin with stimulated Raman scattering microscopy and deep learning. Journal of Investigative Dermatology. 141 (2), 395-403 (2021).
  19. Ghosh, B., Reddy, L. H., Kulkarni, R. V., Khanam, J. Comparison of skin permeability of drugs in mice and human cadaver skin. Indian Journal of Experimental Biology. 38 (1), 42-45 (2000).
  20. Nielsen, J. B., Plasencia, I., Sørensen, J. A., Bagatolli, L. Storage conditions of skin affect tissue structure and subsequent in vitro percutaneous penetration. Skin Pharmacology and Physiology. 24 (2), 93-102 (2011).
  21. Barbero, A. M., Frasch, H. F. Effect of frozen human epidermis storage duration and cryoprotectant on barrier function using two model compounds. Skin Pharmacology and Physiology. 29 (1), 31-40 (2016).
  22. Babu, R., et al. The influence of various methods of cold storage of skin on the permeation of melatonin and nimesulide. Journal of Controlled Release. 86 (1), 49-57 (2003).
  23. Skelly, J. P., et al. FDA and AAPS report of the workshop on principles and practices of in vitro percutaneous penetration studies: relevance to bioavailability and bioequivalence. Pharmaceutical Research. 4 (3), 265-267 (1987).
  24. OECD. Guidance document for the conduct of skin absorption studies. OECD. , (2004).
  25. OECD. Test no. 428: Skin absorption: In vitro method. OECD. , (2004).
  26. Saar, B. G., et al. Video-rate molecular imaging in vivo with stimulated Raman scattering. Science. 330 (6009), 1368-1370 (2010).
  27. Saar, B. G., Contreras-Rojas, L. R., Xie, X. S., Guy, R. H. Imaging drug delivery to skin with stimulated Raman scattering microscopy. Molecular Pharmaceutics. 8 (3), 969-975 (2011).
  28. Pence, I. J., Kuzma, B. A., Brinkmann, M., Hellwig, T., Evans, C. L. Multi-windowsparse spectral sampling stimulated Raman scattering microscopy. Biomedical Optics Express. 12 (10), 6095-6114 (2021).
  29. Herkenne, C., et al. In vivo methods for the assessment of topical drug bioavailability. Pharmaceutical Research. 25 (1), 87-103 (2008).
  30. Alfonso-Garcıa, A., Mittal, R., Lee, E. S., Potma, E. O. Biological imaging with coherent Raman scattering microscopy: a tutorial. Journal of Biomedical Optics. 19 (7), 071407 (2014).
  31. Osseiran, S., et al. Longitudinal monitoring of cancer cell subpopulations in monolayers, 3D spheroids, and xenografts using the photoconvertible dye DiR. Scientific Reports. 9 (1), 1-10 (2019).
  32. Evennett, P. Kohler illumination: a simple interpretation. Proceedings of the Royal Microscopical Society. 28 (4), 189-192 (1983).
  33. Sanderson, J. Fundamentals of microscopy. Current Protocols in Mouse Biology. 10 (2), 76 (2020).
  34. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  35. Hunter, J. D. Matplotlib: A 2D graphics environment. Computing in Science & Engineering. 9 (3), 90-95 (2007).
  36. Wickham, H. ggplot2: Elegant Graphics for Data Analysis. , Springer-Verlag. New York. (2016).
  37. Kim, H., Han, S., Cho, Y. S., Yoon, S. K., Bae, K. Development of R packages:'Non-Compart' and 'ncar' for noncompartmental analysis (NCA). Translational and Clinical Pharmacology. 26 (1), 10-15 (2018).

Tags

Medicin udgave 177 sammenhængende Raman-spredning sammenhængende anti-Stokes Raman-spredning stimuleret Raman-spredning kutan farmakokinetik biotilgængelighed bioækvivalens
Visualisering og kvantificering af farmaceutiske forbindelser i huden ved hjælp af sammenhængende Raman Scattering Imaging
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kuzma, B. A., Pence, I. J., Ho, A.,… More

Kuzma, B. A., Pence, I. J., Ho, A., Evans, C. L. Visualizing and Quantifying Pharmaceutical Compounds within Skin using Coherent Raman Scattering Imaging. J. Vis. Exp. (177), e63264, doi:10.3791/63264 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter