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Medicine

सुसंगत रमन प्रकीर्णन इमेजिंग का उपयोग करके त्वचा के भीतर फार्मास्युटिकल यौगिकों को विज़ुअलाइज़ करना और परिमाणित करना

Published: November 24, 2021 doi: 10.3791/63264
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Wellman Center for Photomedicine, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School

Summary

त्वचा के भीतर फार्मास्युटिकल यौगिकों की कल्पना करने और मापने के लिए एक सुसंगत रमन प्रकीर्णन इमेजिंग पद्धति का वर्णन किया गया है। यह पेपर त्वचा ऊतक तैयारी (मानव और माउस) और सामयिक सूत्रीकरण आवेदन, spatiotemporal एकाग्रता प्रोफाइल को मापने के लिए छवि अधिग्रहण, और सामयिक दवा वितरण का आकलन करने के लिए प्रारंभिक फार्माकोकाइनेटिक विश्लेषण का वर्णन करता है।

Abstract

सामयिक सूत्रीकरण आवेदन के बाद त्वचीय फार्माकोकाइनेटिक्स (सीपीके) नियामक और दवा विकास वैज्ञानिकों के लिए विशेष रुचि का एक शोध क्षेत्र रहा है ताकि सामयिक जैव उपलब्धता (बीए) को यंत्रवत रूप से समझा जा सके। अर्ध-इनवेसिव तकनीकें, जैसे कि टेप-स्ट्रिपिंग, त्वचीय माइक्रोडायलिसिस, या त्वचीय ओपन-फ्लो माइक्रोपरफ्यूजन, सभी मैक्रोस्केल सीपीके को मापते हैं। जबकि इन तकनीकों ने विशाल सीपीके ज्ञान प्रदान किया है, समुदाय में सेलुलर स्तर पर सक्रिय दवा घटक (एपीआई) प्रवेश और पारगमन की यांत्रिक समझ का अभाव है।

माइक्रोस्केल सीपीके को संबोधित करने के लिए एक noninvasive दृष्टिकोण सुसंगत रमन स्कैटरिंग इमेजिंग (सीआरआई) है, जो बाहरी लेबल या रासायनिक संशोधन की आवश्यकता के बिना आंतरिक आणविक कंपन को चुनिंदा रूप से लक्षित करता है। सीआरआई के पास दो मुख्य तरीके हैं- सुसंगत एंटी-स्टोक्स रमन स्कैटरिंग (कार्स) और उत्तेजित रमन स्कैटरिंग (एसआरएस) - जो एपीआई या निष्क्रिय अवयवों के संवेदनशील और चयनात्मक परिमाणीकरण को सक्षम करते हैं। CARS का उपयोग आमतौर पर संरचनात्मक त्वचा की जानकारी प्राप्त करने या रासायनिक विपरीत की कल्पना करने के लिए किया जाता है। इसके विपरीत, एसआरएस सिग्नल, जो आणविक एकाग्रता के साथ रैखिक है, का उपयोग त्वचा स्तरीकरण के भीतर एपीआई या निष्क्रिय अवयवों को मापने के लिए किया जाता है।

यद्यपि माउस ऊतक का उपयोग आमतौर पर सीआरआई के साथ सीपीके के लिए किया जाता है, सामयिक बीए और बायोएक्वॉलरेंस (बीई) को अंततः नियामक अनुमोदन से पहले मानव ऊतक में मूल्यांकन किया जाना चाहिए। यह पेपर सामयिक बीए और बीई के मूल्यांकन में मात्रात्मक फार्माकोकाइनेटिक सीआरआई अध्ययनों में उपयोग किए जाने वाले पूर्व विवो त्वचा को तैयार करने और छवि बनाने के लिए एक पद्धति प्रस्तुत करता है। यह पद्धति समय के साथ मानव और माउस त्वचा के भीतर विश्वसनीय और पुन: प्रस्तुत करने योग्य एपीआई परिमाणीकरण को सक्षम बनाती है। लिपिड-समृद्ध और लिपिड-गरीब डिब्बों के भीतर सांद्रता, साथ ही साथ समय के साथ कुल एपीआई एकाग्रता की मात्रा निर्धारित की जाती है; इनका उपयोग माइक्रो- और मैक्रोस्केल बीए के अनुमानों के लिए किया जाता है और, संभावित रूप से, बीई।

Introduction

सामयिक दवा उत्पाद आवेदन के बाद सीपीके का आकलन करने के तरीकों ने शास्त्रीय इन विट्रो पारगमन परीक्षण (आईवीपीटी) अध्ययन 1,2,3,4,5 और टेप-स्ट्रिपिंग 6,7,8 से अतिरिक्त तरीकों जैसे ओपन-फ्लो माइक्रोपरफ्यूजन या त्वचीय माइक्रोडायलिसिस 9,10,11 तक विस्तारित किया है, 12,13,14. ब्याज की बीमारी के आधार पर चिकित्सीय कार्रवाई के संभावित रूप से विभिन्न स्थानीय साइटें हैं। इसलिए, दर और सीमा का आकलन करने के लिए तरीकों की एक समान संख्या हो सकती है, जिस तक एक एपीआई कार्रवाई की इच्छित स्थानीय साइट पर पहुंचता है। जबकि उपर्युक्त तरीकों में से प्रत्येक के अपने फायदे हैं, प्रमुख नुकसान माइक्रोस्केल सीपीके जानकारी की कमी है (यानी, यह कल्पना करने में असमर्थता है कि एपीआई कहां जाता है और यह कैसे व्याप्त होता है)।

सामयिक बीए और बीई का अनुमान लगाने के लिए ब्याज की एक noninvasive पद्धति CRI है, जिसे दो इमेजिंग तौर-तरीकों में विभाजित किया जा सकता है: CARS और SRS माइक्रोस्कोपी। ये सुसंगत रमन विधियां गैर-रेखीय रमन प्रभावों के माध्यम से अणुओं की रासायनिक रूप से विशिष्ट इमेजिंग को सक्षम करती हैं। सीआरआई में, दो लेजर पल्स ट्रेनों को एक नमूने के भीतर केंद्रित और स्कैन किया जाता है; लेजर आवृत्तियों के बीच ऊर्जा में अंतर ब्याज की रासायनिक संरचनाओं के लिए विशिष्ट कंपन मोड को लक्षित करने के लिए सेट किया गया है। चूंकि सीआरआई प्रक्रियाएं नॉनलाइनर हैं, एक संकेत केवल माइक्रोस्कोप फोकस पर उत्पन्न होता है, जो ऊतक के तीन आयामी फार्माकोकाइनेटिक टोमोग्राफिक इमेजिंग की अनुमति देता है। सीपीके के संदर्भ में, कार्स का उपयोग ऊतक संरचनात्मक जानकारी प्राप्त करने के लिए किया गया है, जैसे कि लिपिड-समृद्ध त्वचा संरचनाओं का स्थान15। इसके विपरीत, एसआरएस का उपयोग आणविक एकाग्रता को मापने के लिए किया गया है क्योंकि इसका संकेत एकाग्रता के साथ रैखिक है। पूर्व विवो त्वचा के नमूनों के लिए, ट्रांसमिशन मोड17 में एपि-दिशा16 और एसआरएस में कारों को पूरा करना फायदेमंद है। इसलिए, ऊतक के नमूने जो पतले हैं, एसआरएस सिग्नल का पता लगाने और परिमाणीकरण के लिए अनुमति देंगे।

एक मॉडल ऊतक के रूप में, नग्न माउस कान मामूली कमियों के साथ कई फायदे प्रस्तुत करता है। एक लाभ यह है कि ऊतक पहले से ही मोटाई में ~ 200-300 μm है और आगे नमूना तैयारी की आवश्यकता नहीं है। इसके अलावा, कई त्वचा स्तरीकरण को अक्षीय रूप से एक क्षेत्र के माध्यम से ध्यान केंद्रित करके देखा जाता है (उदाहरण के लिए, स्ट्रैटम कॉर्नियम, वसामय ग्रंथियां (एसजी), एडिपोसाइट्स, और चमड़े के नीचे वसा)16,18। यह मानव त्वचा के नमूनों में जाने से पहले त्वचीय पारगमन मार्गों और सामयिक बीए अनुमानों के प्रारंभिक प्रीक्लिनिकल अनुमान के लिए अनुमति देता है। हालांकि, नग्न माउस मॉडल त्वचा संरचना19 में अंतर के कारण विवो परिदृश्यों में एक्सट्रपोलेशन में कठिनाई जैसी सीमाओं को प्रस्तुत करता है। जबकि नग्न माउस कान प्रारंभिक परिणाम प्राप्त करने के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल है, मानव त्वचा मॉडल सोने का मानक है। यद्यपि विवो पारगमन कैनेटीक्स20,21,22 में सटीक रूप से पुनरावृत्ति करने के लिए जमे हुए मानव त्वचा की उपयुक्तता और प्रयोज्यता पर विभिन्न टिप्पणियां की गई हैं, जमे हुए मानव त्वचा का उपयोग इन विट्रो एपीआई पारगमन कैनेटीक्स23,24,25 के मूल्यांकन के लिए एक स्वीकृत विधि है। . यह प्रोटोकॉल माउस और मानव त्वचा में विभिन्न त्वचा परतों की कल्पना करता है, जबकि लिपिड-समृद्ध और लिपिड-गरीब संरचनाओं के भीतर एपीआई सांद्रता को परिमाणित करता है।

जबकि सीआरआई का उपयोग विशेष रूप से ऊतकों के भीतर यौगिकों की कल्पना करने के लिए कई क्षेत्रों में किया गया है, शीर्ष रूप से लागू दवा उत्पादों के सीपीके की जांच करने के लिए सीमित प्रयास किए गए हैं। सीआरआई का उपयोग करके सामयिक उत्पादों के सामयिक बीए / बीई का मूल्यांकन करने के लिए, सटीक तुलना करने के लिए पहले एक मानकीकृत प्रोटोकॉल होना आवश्यक है। त्वचा को दवा वितरण के लिए सीआरआई का उपयोग करने वाले पिछले प्रयासों ने डेटा के भीतर परिवर्तनशीलता का प्रदर्शन किया है। चूंकि यह सीआरआई का एक अपेक्षाकृत नया अनुप्रयोग है, इसलिए एक प्रोटोकॉल स्थापित करना विश्वसनीय परिणाम18,26,27 प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है। यह दृष्टिकोण केवल रमन स्पेक्ट्रम के जैविक मूक क्षेत्र में एक विशिष्ट तरंग संख्या को लक्षित करता है। हालांकि, अधिकांश एपीआई और निष्क्रिय अवयवों में फिंगरप्रिंट क्षेत्र के भीतर रमन शिफ्ट होते हैं। इसने पहले फिंगरप्रिंट क्षेत्र में ऊतक से उत्पन्न होने वाले अंतर्निहित संकेत के कारण चुनौतियों का सामना किया है। हाल ही में लेजर और कम्प्यूटेशनल अग्रिमों ने इस बाधा को हटा दिया है, जिसका उपयोग यहां प्रस्तुत दृष्टिकोण के साथ संयोजन में भी किया जा सकताहै। यहां प्रस्तुत यह दृष्टिकोण एक एपीआई के परिमाणीकरण के लिए अनुमति देता है, जिसमें मूक क्षेत्र (2,000-2,300 सेमी -1) में रमन शिफ्ट होता है। यह दवा के फिजियोकेमिकल गुणों तक सीमित नहीं है, जो कुछ पहले उल्लिखित सीपीके निगरानी पद्धतियों के लिए मामला हो सकताहै।

प्रोटोकॉल को विभिन्न तैयारियों के लिए त्वचा की मोटाई में नमूना-से-नमूना परिवर्तनशीलता को कम करना चाहिए, क्योंकि मोटी मानव त्वचा के नमूने मोटे नमूने द्वारा प्रकाश बिखरने के कारण दवा उत्पाद आवेदन के बाद न्यूनतम संकेत का उत्पादन करेंगे। इस पांडुलिपि का एक लक्ष्य एक ऊतक तैयारी पद्धति पेश करना है जो पुनरुत्पादक इमेजिंग मानकों का आश्वासन देता है। इसके अलावा, सीआरआई सिस्टम को त्रुटि के संभावित स्रोतों को कम करने के साथ-साथ सिग्नल-टू-शोर को कम करने के लिए वर्णित किया गया है। हालांकि, यह पेपर सीआरआई माइक्रोस्कोप के मार्गदर्शक सिद्धांतों और तकनीकी गुणों पर चर्चा नहीं करेगा क्योंकि यह पहले30 को कवर किया गया है। अंत में, व्यापक डेटा विश्लेषण प्रक्रिया का पता लगाया जाता है ताकि एक प्रयोग की सफलता या विफलता को निर्धारित करने के लिए परिणामों की व्याख्या की अनुमति दी जा सके।

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Protocol

नग्न माउस कान ऊतक के उपयोग को मैसाचुसेट्स जनरल हॉस्पिटल इंस्टीट्यूशनल एनिमल केयर एंड यूज कमेटी (आईएसीयूसी) द्वारा अनुमोदित किया गया था, जबकि मानव त्वचा ऊतक के उपयोग को मैसाचुसेट्स जनरल हॉस्पिटल इंस्टीट्यूशनल रिव्यू बोर्ड (आईआरबी) द्वारा अनुमोदित किया गया था। आईएसीयूसी प्रोटोकॉल के अनुसार, नए सिरे से euthanized चूहों को नग्न चूहों के उपनिवेशों के साथ सहयोगियों से प्राप्त किया गया था। मानव ऊतक को मैसाचुसेट्स जनरल अस्पताल में एक अनुमोदित प्रोटोकॉल के माध्यम से वैकल्पिक एब्डोमिनोप्लास्टी प्रक्रियाओं से प्राप्त किया गया था। इसके अलावा, पेट की त्वचा के अलावा अन्य विशिष्ट ऊतक प्रकारों को एक शरीर दान प्राधिकरण के माध्यम से अधिग्रहित किया गया था, एक आईआरबी-अनुमोदित प्रोटोकॉल के माध्यम से भी।

1. ऊतक की तैयारी

  1. नग्न माउस कान त्वचा ऊतक की तैयारी
    1. ताजा काटे गए नग्न माउस निकायों को प्राप्त करने के बाद, संदंश और माइक्रोसर्जिकल कैंची का उपयोग करके कान ों को हटा दें। एक छोटे से पेट्री डिश (यानी, 35 मिमी x 10 मिमी) में एक कान रखें। स्थानीय IACUC प्रोटोकॉल के अनुसार निपटान करने के लिए एक biohazard बैग में नग्न माउस शरीर जगह.
    2. फॉस्फेट-बफ़र्ड खारा (पीबीएस) के साथ प्रत्येक माउस कान को कुल्ला करें और धीरे से इसे एक कार्य वाइपर के साथ सुखाएं। कान पर किसी भी अवशिष्ट गंदगी या मलबे को हटाने के लिए दो बार दोहराएं जो इमेजिंग गुणवत्ता को प्रभावित कर सकता है ( चित्रा 1 देखें)।
    3. यदि कान का उपयोग 24 घंटे के भीतर किया जाना है, तो इसे रेफ्रिजरेटर (2-8 डिग्री सेल्सियस) में ताजा पीबीएस के साथ एक छोटे पेट्री डिश (यानी, 35 मिमी x 10 मिमी) में रखें। यदि कान का उपयोग कटाई के 24 घंटे के बाद किया जाएगा, तो इसे पीबीएस के बिना पेट्री डिश (35 मिमी x 10 मिमी) में रखें, डिश को पैराफिल्म के साथ कवर करें, और इसे -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में रखें।
  2. मानव त्वचा ऊतक की तैयारी
    1. मानव ऊतक की खरीद के बाद, इसे नमूना तैयारी के लिए पर्याप्त स्थान की अनुमति देने के लिए जैविक हुड में एक बड़े पेट्री डिश (यानी, 60 मिमी x 15 मिमी) में रखें।
    2. स्ट्रैटम कॉर्नियम साइड को नीचे की ओर इस तरह रखें कि चमड़े के नीचे की वसा सुलभ हो।
    3. संदंश और माइक्रोसर्जिकल कैंची का उपयोग करके, चमड़े के नीचे की वसा को सावधानीपूर्वक हटाना शुरू करें। एक बार जब चमड़े के नीचे की वसा को कैंची के साथ हटाया नहीं जा सकता है, तो शेष चमड़े के नीचे की वसा को हटाने के लिए 10-ब्लेड डिस्पोजेबल स्केलपेल (या समकक्ष) पर स्विच करें। त्वचा को संदंश के साथ अभी भी पकड़ते समय त्वचा के लिए 45 ° कोण पर स्केलपेल का उपयोग करें (चित्रा 1 देखें)।
      नोट: उच्च गुणवत्ता वाले संचरण एसआरएस छवियों के लिए, नमूनों को पंचर किए बिना जितना संभव हो उतना पतला होना चाहिए।

Figure 1
चित्र1: इमेजिंग माउस और मानव त्वचा के लिए आदर्श मोटाई की छवियां( ए) माउस कान की त्वचा प्रकाश तक आयोजित की जाती है, जो स्पष्ट रूप से प्रकाश को प्रकाश के माध्यम से दे सकती है। (बी) आदर्श मानव त्वचा तैयारी के बाद प्रकाश तक आयोजित की जाती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

  1. मानव त्वचा को 1 सेमी x 1 सेमी टुकड़ों में विभाजित करें।
    नोट: ताजा त्वचा, एक agarose जेल बिस्तर के उपयोग के बिना 24 ज तक के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, के रूप में पहले31 वर्णित है. हालांकि, ताजा त्वचा का उपयोग लंबे समय तक किया जा सकता है यदि एक एगरोज जेल बिस्तर पर रखा जाता है। यदि त्वचा का उपयोग बाद में किया जाना है, तो त्वचा को एक नमूना परिवहन बैग में रखा जाता है और फिर -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में रखा जाता है। इष्टतम परिणामों के लिए नीचे दी गई प्रक्रिया का उपयोग करके जमे हुए त्वचा को पिघलाने की आवश्यकता है (चरण 3.1.2 देखें)।

2. लेजर और माइक्रोस्कोप सेटअप

  1. इमेजिंग से लगभग 30 मिनट पहले, व्यापक रूप से ट्यूनेबल अल्ट्राफास्ट लेजर (इसके बाद लेजर के रूप में संदर्भित) पर स्विच करें और इसे गर्म करने की अनुमति दें। प्रवेश पर संभावित खतरे के बाहर कर्मियों को सूचित करने के लिए लेजर चेतावनी चिह्न / लॉक सिस्टम को सक्षम करें।
    नोट: उचित eyewear हमेशा जब वर्ग चतुर्थ लेज़रों के साथ काम कर पहना जाना चाहिए. यहां उपयोग किए जाने वाले विशिष्ट लेजर के लिए, अनुशंसित उचित eyewear लेजर 800-1,300 एनएम की कार्य सीमा के लिए OD ≥ 6 है।
  2. जबकि लेजर गर्म हो रहा है, माइक्रोस्कोप नियंत्रण, कारों का पता लगाने, और एसआरएस का पता लगाने के लिए शेष हार्डवेयर सक्षम करें।
  3. इष्टतम इमेजिंग सुनिश्चित करने के लिए माइक्रोस्कोप को ठीक से संरेखित करें। माइक्रोस्कोप नियंत्रण सॉफ्टवेयर (इसके बाद एमसी सॉफ्टवेयर) में छवि अधिग्रहण नियंत्रण विंडो में, माइक्रोस्कोप के ट्रांसिल्यूमिनेशन लैंप से प्रकाश आने की अनुमति देने के लिए ट्रांसमिशन लैंप पर क्लिक करें।
  4. ऊर्ध्वाधर अक्ष के साथ माइक्रोस्कोप को संरेखित करने के लिए सही कोहलर रोशनी सुनिश्चित करें: आईरिस को बंद करें ताकि आंख के टुकड़े32 के माध्यम से प्रकाश की न्यूनतम मात्रा देखी जा सके।
  5. आईपीस के माध्यम से देखते हुए, यह देखने के लिए आईरिस खोलें कि क्या बहुभुज सभी पक्षों को एक साथ छूता है। संघनित्र ऊंचाई को समायोजित करें यदि आईरिस खोलने से पहले एक बहुभुज आकार नहीं देखा जा सकता है।
  6. यदि बहुभुज आकार एक ही समय में सभी पक्षों को स्पर्श नहीं करता है, तो समायोजन knobs का उपयोग करके एपर्चर संरेखण स्थिति को समायोजित करें।
    नोट: एक में गहराई से माइक्रोस्कोप सेटअप के लिए Sanderson et al.33 देखें।
  7. माइक्रोस्कोप स्टेज होल्डर पर एक कवरस्लिप और डबल-साइडेड चिपकने वाले स्पेसर के साथ एक माइक्रोस्कोप स्लाइड रखें जिसमें तेल का नमूना (उदाहरण के लिए, जैतून का तेल, क्योंकि तेलों के भीतर कई -CH2- बांड होते हैं)।
  8. MC सॉफ़्टवेयर की अधिग्रहण सेटिंग्स विंडो में, माइक्रोस्कोप ड्रॉपडाउन मेनू ढूँढें और माइक्रोस्कोप उद्देश्य को 20x पर सेट करें।
  9. सत्यापित करें कि CARS डिटेक्शन फ़िल्टर (645 nm/50 nm) माइक्रोस्कोप साइड पोर्ट फोटोमल्टीप्लायर ट्यूब के साथ epiCARS सिग्नल को विज़ुअलाइज़ करने और मापने की स्थिति में है।
    नोट: इस विशिष्ट फ़िल्टर को इमेजिंग लिपिड के लिए चुना जाता है क्योंकि 803 एनएम के पंप तरंग दैर्ध्य और 1,040 एनएम के स्टोक्स तरंग दैर्ध्य के लिए 652 एनएम पर उत्पन्न एंटी-स्टोक्स कार्स सिग्नल (Eq. (1) देखें)।
    Equation 1 (1)
    जहां π चर में एनएम की इकाइयां होती हैं; πपंप पंप बीम तरंग दैर्ध्य है; और πस्टोक्स स्टोक्स बीम तरंग दैर्ध्य है।
  10. तेल के नमूने के किनारे को खोजने के लिए आईपीस के माध्यम से देखें, जिसका उपयोग सिस्टम के संरेखण को सत्यापित करने के लिए किया जाएगा।
  11. सुनिश्चित करें कि किनारे माइक्रोस्कोप पर फोकस knobs का उपयोग कर जेड फोकस में है और XY फ़ोकस प्राप्त करने के लिए चरण नियंत्रक को समायोजित करें।
  12. लेजर गर्म होने के बाद, लेजर के ग्राफिकल यूजर इंटरफेस में 50.0 पर सेट मोटर ठीक धुन के साथ पंप बीम को 803 एनएम पर सेट करें। उपयोग की जाने वाली सटीक मोटर ठीक धुन सेटअप से सेटअप में भिन्न हो सकती है।
    नोट: पंप बीम इस लेजर पर एक समायोज्य तरंग दैर्ध्य के साथ एकमात्र बीम है क्योंकि स्टोक्स बीम तरंग दैर्ध्य 1,040 एनएम पर तय किया गया है। यह कॉन्फ़िगरेशन 2850 सेमी -1 पर सीएच कंपन को लक्षित करता है (वेवनंबर लक्ष्यीकरण के लिए पंप तरंग दैर्ध्य की गणना करने के लिए Eq. (2) देखें)।
    Equation 2 (2)
    जहां Equation 3 सापेक्ष तरंग संख्या (सेमी-1) की इकाइयां हैं, और π चर में सेमी में इकाइयां हैं।
  13. इमेजिंग से पहले माइक्रोस्कोप में लेजर के संरेखण की जांच करें; लेजर पथ के चित्रण के लिए चित्र2 देखें। माइक्रोस्कोप के प्रारंभिक सेटअप के दौरान, माइक्रोस्कोप में सही संरेखण के लिए गाइड के रूप में बीम पथ में दो आईरिस स्थापित करें। जैसा कि लेजर का ऑप्टिकल पथ समय के साथ बहाव कर सकता है, यह सुनिश्चित करें कि लेजर बीम पथ आईरिस के केंद्र को पार करते हैं ताकि वे सही ढंग से माइक्रोस्कोप में प्रवेश कर सकें।
  14. IR व्यूअर का उपयोग करके, सभी irises को पूरी तरह से बंद करें और सुनिश्चित करें कि बीम दोनों पर केंद्रित है: पहले आईरिस पर लेजर के निकटतम और अंत में माइक्रोस्कोप प्रविष्टि बंदरगाह पर।
  15. सबसे पहले, यह सुनिश्चित करने के लिए पंप बीम की जांच करें कि बीम सीधे माइक्रोस्कोप में जा रहा है। एक बार पंप संरेखित होने के बाद, यह सुनिश्चित करने के लिए जांचें कि स्टोक्स बीम भी माइक्रोस्कोप में सही ढंग से जाता है।
    1. यदि बीम को आईरिस के माध्यम से संरेखित नहीं किया जाता है, तो पंप और स्टोक्स बीमपाथ के लिए दो दर्पण माउंट के एक्स और वाई समायोजन knobs का उपयोग करके आईरिस के माध्यम से बीम को पुनरावर्ती रूप से चलते हैं।
  16. एक बार जब बीम स्पॉट माइक्रोस्कोप में प्रवेश करने से पहले ओवरलैप हो रहे हैं, तो यह सुनिश्चित करने के लिए जांचें कि वे माइक्रोस्कोप को सही ढंग से पार कर रहे हैं।
    1. MC सॉफ़्टवेयर की छवि अधिग्रहण नियंत्रण विंडो में, संचरण के लिए TD चैनल पर क्लिक करें, सुसंगत विरोधी स्टोक्स रमन चैनल के लिए ALG1 (एनालॉग चैनल 1), और उत्तेजित रमन प्रकीर्णन चैनल के लिए ALG2 (एनालॉग चैनल 2). निम्न सेटिंग्स का उपयोग करें (इस प्रोटोकॉल के रूप में): 1 का लाभ और ALG1 के लिए -1 का ऑफसेट, 1.25 का लाभ और ALG2 के लिए -2 का ऑफसेट।
      नोट:: सिस्टम कॉन्फ़िगरेशन के आधार पर, एनालॉग चैनलों अलग-अलग इमेजिंग चैनलों के लिए भिन्न क्रमांकन हो सकता है। यदि एसआरएस डिटेक्टर जगह में है, तो कोई ट्रांसमिशन सिग्नल नहीं होगा क्योंकि कोई भी प्रकाश के माध्यम से प्राप्त नहीं हो सकता है (यानी, कोई भी इस सेटअप में एक साथ टीडी और एएलजी 2 के साथ छवियों की कल्पना नहीं कर सकता है)।

Figure 2
चित्रा 2: सुसंगत रमन लेजर इमेजिंग पथ के लिए योजनाबद्ध लेआउट। बीम स्वतंत्र रूप से स्पॉट आकार के लिए वातानुकूलित होते हैं और वांछित ट्यूनिंग आवृत्ति के लिए नमूनों में सुसंगत रमन प्रकीर्णन उत्पन्न करने के लिए समय देरी चरण के माध्यम से मिलान किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

  1. पावर मीटर को चालू करें और, एक उच्च शक्ति थर्मल पावर सेंसर का उपयोग करके, प्रयोग के लिए पंप और स्टोक्स बीम की शक्ति को व्यक्तिगत रूप से मापें।
    नोट: इस विशिष्ट उदाहरण में, पंप बीम पावर 80 mW था, जबकि स्टोक्स बीम पावर माइक्रोस्कोप के प्रवेश से पहले 180 mW था।
  2. छवि अधिग्रहण नियंत्रण विंडो में, MC सॉफ़्टवेयर में छवि देखने के लिए फ़ोकस x2 बटन पर क्लिक करें।
  3. अधिग्रहण सेटिंग्स विंडो में, सुनिश्चित करें कि पिक्सेल अनुपात और रहने का समय प्रयोग के लिए वांछित पैरामीटर पर सेट हैं।
    नोट: इस प्रोटोकॉल में 1,024 x 1,024 पिक्सेल अनुपात और 2 μs/पिक्सेल का रहने का समय उपयोग किया गया था।
  4. पंप बीम को अनब्लॉक करके और टीडी चैनल को देखकर माइक्रोस्कोप के संबंध में लेजर संरेखण की पुष्टि करें।
    नोट:: लेजर ठीक से संरेखित है यदि बीम सही डिटेक्टर सेटिंग्स के साथ छवि में केंद्रित देखा जाता है।
  5. अन्यथा, छवि के केंद्र में बीम को पुनर्स्थापित करने के लिए पेरिस्कोप पर एक्स और वाई समायोजन knobs का उपयोग करें।
  6. दोनों CARS और SRS चैनलों में एक ही छवि को देखकर लेजर और माइक्रोस्कोप संरेखण की पुष्टि करें।
  7. संरेखण छवि प्राप्त करने के लिए, उपयुक्त फ़िल्टर मोड सेट (जैसे, Kalman रेखा 3) के साथ छवि अधिग्रहण नियंत्रण विंडो में XY स्कैन बटन क्लिक करें.
  8. समय के साथ तुलना करने और सिस्टम प्रदर्शन/संरेखण की पुष्टि करने के लिए एक वर्णनात्मक फ़ाइल नाम के साथ छवियों के इस सेट को सहेजें।

3. लिपिड इमेजिंग

  1. माउस कान और मानव ऊतक
    1. यदि ताजा ऊतक का उपयोग कर रहे हैं, तो चरण 3.1.2 को छोड़ दें।
    2. माउस कान की त्वचा को -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से निकालें और इसे 10 मिनट के लिए एक इनक्यूबेशन कक्ष (32 डिग्री सेल्सियस) में रखें। माउस कान को इनक्यूबेशन कक्ष से निकालें।
      नोट:: चरण 1.1.2 देखें। माउस कान त्वचा की तैयारी के लिए. ऊतक के खुरदुरे हैंडलिंग या स्क्रैपिंग के परिणामस्वरूप यांत्रिक गिरावट, विनाश, या ऊतक का विघटन हो सकता है, विशेष रूप से स्ट्रैटम कॉर्नियम।
    3. यदि एक नग्न माउस कान का उपयोग कर रहे हैं, तो कान के पूर्वकाल भाग को 35 मिमी, नंबर 0 डिश के कांच के नीचे की ओर सामना करना पड़ रहा है। यदि मानव त्वचा का उपयोग कर रहे हैं, तो इसे स्ट्रैटम कॉर्नियम चेहरे के साथ रखें क्योंकि यह सतही परतों से गहरी परतों तक दवा के परिमाणीकरण की अनुमति देगा (चित्रा 1)।
      नोट: नग्न माउस कान का पिछला हिस्सा आवास से अपूर्णताओं के लिए अधिक प्रवण है। यदि मानव त्वचा को उल्टे माइक्रोस्कोप पर नीचे की ओर सामना करने वाले स्ट्रैटम कॉर्नियम साइड के साथ नहीं रखा जाता है, तो कोई भी डर्मिस के पीछे देखने में सक्षम नहीं होगा क्योंकि प्रकाश की उचित मात्रा बिखरी हुई है, और स्ट्रैटम कॉर्नियम में पर्मिंग दवा को देखा नहीं जा सकता है।
    4. एक बार जब ऊतक को कांच के तल पर केंद्रित कर दिया जाता है, तो यह सुनिश्चित करने के लिए एक कपास-इत्तला वाले ऐप्लिकेटर का उपयोग करें कि त्वचा सपाट है और ग्लास-बॉटम डिश की कवरस्लिप सतह के साथ पूर्ण संपर्क है।
      नोट:: यह एक कदम है कि कठिनाई का कारण बन सकता है जबकि त्वचा इमेजिंग यदि यह पूरी तरह से सपाट नहीं है।
    5. इमेजिंग करते समय किसी भी आंदोलन को रोकने के लिए त्वचा के शीर्ष पर एक वॉशर रखें। सुनिश्चित करें कि ऊतक एसआरएस संचरण का पता लगाने के लिए वॉशर के केंद्र छेद के माध्यम से दिखाई दे रहा है।
    6. स्लाइड चरण सम्मिलित करें निकालें और इसे इनक्यूबेशन कक्ष के साथ बदलें, जिसमें एकल डिश सम्मिलित करें।
    7. इनक्यूबेशन कक्ष के एकल पकवान अनुलग्नक में त्वचा के ऊतकों के साथ ग्लास-बॉटम डिश रखें।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, एक बार में कई त्वचा के नमूनों और योगों की छवि के लिए एक 6-अच्छी तरह से प्लेट का उपयोग करें।
    8. MC सॉफ़्टवेयर की अधिग्रहण सेटिंग्स विंडो में पिक्सेल अनुपात को कम करें (उदाहरण के लिए, 1,024 x 1,024 से 512 x 512 तक) तेजी से गैल्वो स्कैनिंग गति के लिए, जबकि Z-गहराई स्ट्रैटम कॉर्नियम को खोजने के लिए बदल जाती है (माउस के लिए चित्रा 3A या मानव के लिए चित्रा 3E देखें)।
    9. स्ट्रैटम कॉर्नियम पाए जाने के बाद, उस अक्षीय स्थिति को अधिग्रहण सेटिंग्स विंडो में शून्य स्थिति होने के लिए पंजीकृत करें और प्रत्येक विशिष्ट प्रयोग के लिए पिक्सेल अनुपात बदलें (उदाहरण के लिए, 1,024 x 1,024)।

Figure 3
चित्रा 3: उदाहरण त्वचा की गहराई एसआरएस का उपयोग करके प्राप्त की गई। छवियों का शीर्ष सेट नग्न माउस कान की त्वचा से निम्नलिखित को दर्शाता है: (ए) स्ट्रैटम कॉर्नियम, (बी) वसामय ग्रंथियां, (सी) एडिपोसाइट्स, (डी) चमड़े के नीचे वसा। छवियों के निचले सेट को मानव त्वचा से प्राप्त किया जाता है जो निम्नलिखित को दर्शाता है: (ई) स्ट्रैटम कॉर्नियम, (एफ) पैपिलरी डर्मिस, और (जी) एक वसामय ग्रंथि। स्केल सलाखों = 100 μm. माउस और मानव त्वचा दोनों छवियों को 1024 पिक्सेल x 1024 पिक्सेल पर 20x उद्देश्य का उपयोग करके अधिग्रहित किया गया था; मानव एसजी 512 x 512 पिक्सेल पर लिया गया था। संक्षेप: SRS = उत्तेजित रमन प्रकीर्णन; एसजी = वसामय ग्रंथि। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

4. सामयिक सूत्रीकरण का अनुप्रयोग

  1. पिपेट त्वचा पर पूर्व निर्धारित सूत्रीकरण खुराक (उदाहरण के लिए, 10 μL / सेमी2)।
    नोट: सूत्रीकरण की चिपचिपाहट पिपेट विकल्प में एक भूमिका निभाएगी। चिपचिपा योगों के लिए एक सकारात्मक विस्थापन पिपेट के उपयोग, जैसे क्रीम या जैल, और समाधान के लिए एक वायु विस्थापन पिपेट की सिफारिश की जाती है। इस प्रयोग में, रुक्सोलिटिनिब प्रोपलीन ग्लाइकोल (प्रोपेन -1,2-डायोल) के एक सरल समाधान में मॉडल यौगिक था।
  2. एक सिरिंज, या एक gloved उंगली से प्लंजर टिप का उपयोग करते हुए, 30 s के लिए एक दक्षिणावर्त गति में सूत्रीकरण रगड़। बाद में cPK विश्लेषण के लिए सूत्रीकरण लागू किया जाता है जब समय नोट करें (नीचे चरण 6.15-6.17 देखें)।
    नोट:: अनुप्रयोग की अवधि प्रयोग पर निर्भर है; हर एक अलग हो सकता है।
  3. सूत्रीकरण के लिए आवंटित समय बीत जाने के बाद, अतिरिक्त सूत्रीकरण को हटा दें और त्वचा को कांच के नीचे के पकवान की ओर सामना करने वाले सूत्रीकरण पक्ष के साथ रखें।
    नोट: सूत्रीकरण को एक नाजुक कार्य वाइपर या एक छोटे (~ 1 इंच) 3-डी मुद्रित स्क्वीजी का उपयोग करके एक ही दिशा में हटा दिया जाता है (उदाहरण के लिए, उत्तर से दक्षिण तक)।

5. दवा परिमाणीकरण के लिए प्रयोगात्मक सेटअप

  1. पंप बीम को 803 एनएम पर सेट करें। यह सुनिश्चित करने के लिए कि वे प्रयोग के लिए वांछित शक्तियां हैं, फोटोडायोड के साथ पंप और स्टोक्स बीम शक्तियों की जांच करें। शक्ति को मापने और बीम को फिर से बंद करने के लिए प्रत्येक बीम को व्यक्तिगत रूप से अनब्लॉक करें।
    नोट: इस विशिष्ट उदाहरण में, पंप बीम पावर 100 mW था, जबकि स्टोक्स बीम पावर 180 mW था।
  2. ग्लास-बॉटम डिश को एक ग्लास-बॉटम डिश के लिए एक सम्मिलित करने के साथ एक इनक्यूबेशन कक्ष में रखें। इमेजिंग के दौरान आंदोलन को रोकने के लिए क्लिप के साथ पकवान को सुरक्षित करें।
  3. MC सॉफ़्टवेयर में संचरण लैंप चालू करें. आईपीस के माध्यम से देखते हुए, यह सुनिश्चित करने के लिए कि ऊतक फोकस के भीतर है, समायोजन घुंडी के साथ अक्षीय फोकस को समायोजित करें।
  4. पंप और स्टोक्स बीम दोनों को अनब्लॉक करें। सुनिश्चित करें कि ALG1 और ALG2 चैनल सक्षम हैं, और उसके बाद CARS और SRS चैनलों में त्वचा visualize करने के लिए MC सॉफ़्टवेयर पर फ़ोकस x2 क्लिक करें। सुनिश्चित करें कि एसआरएस फोटोडायोड कंडेनसर के ऊपर की स्थिति में है।
  5. डिवाइस ड्रॉपडाउन मेनू में, मल्टी एरिया टाइम लैप्स (MATL) क्लिक करें. प्रकट होने के लिए XY चरण चेतावनी की तलाश करें; जब चरण अपने यांत्रिक मूल को खोजने के लिए चलता है, तो ठीक क्लिक करें.
  6. MATL मॉड्यूल में, देखें पर जाएँ, और उसके बाद MC सॉफ़्टवेयर में पंजीकृत बिंदु सूची क्लिक करें। या तो जोड़ना शुरू करें 1) त्वचा के भीतर विशिष्ट गहराई (यानी, स्ट्रैटम कॉर्नियम, एसजी, एडिपोसाइट्स, चमड़े के नीचे वसा जैसा कि लिपिड-ट्यून किए गए विपरीत के साथ लाइव इमेजिंग के दौरान निर्धारित किया गया है) या 2) एक्सवाई पदों यदि पूरी गहराई स्टैक लिया जाना है। उदाहरण के लिए चित्र 3 देखें।
    1. एक बार जब स्ट्रैटम कॉर्नियम की पहचान हो जाती है, तो ऊपर उल्लिखित विशिष्ट ऊतक स्तरीकरण की पहचान करने के लिए अक्षीय फोकस (या जेड-फोकस) के माध्यम से स्क्रॉल करें। मानव और माउस त्वचा के भीतर उदाहरणों के लिए चित्र 3 देखें।
    2. पूर्ण Z-गहराई स्टैक के विपरीत इमेजिंग विशिष्ट गहराई के मामले में, प्रत्येक त्वचा स्तरीकरण के लिए, इसे MATL कतार में जोड़ने के लिए रजिस्टर पॉइंट क्लिक करें. पूर्ण-गहराई स्टैक के लिए, अधिग्रहण पैरामीटर विंडो में गहराई चयन के साथ प्रत्येक XY स्थिति के लिए रजिस्टर पॉइंट क्लिक करें.
    3. एक बार जब सभी वांछित XY (पूर्ण Z-गहराई स्टैक) या XYZ (विशिष्ट त्वचा स्तरीकरण) पदों को MATL सॉफ़्टवेयर के भीतर पंजीकृत किया गया है, तो फ़ाइल निर्देशिका और नाम को इस तरह से बदलें जो छवि और cPK विश्लेषण के लिए प्रयोगों में सुसंगत होगा (चरण 6.15- 6.17 देखें)।
  7. MATL मॉड्यूल में 1 करने के लिए दोहराता है की संख्या सेट करें और तैयारक्लिक करें। Play के लिए एक ग्रे से एक काले तीर में बदलने के लिए प्रतीक्षा करें, यह दर्शाता है कि सॉफ़्टवेयर तैयार है। प्रारंभिक लिपिड स्टैक (इसके बाद लिपिड छवियों) इमेजिंग शुरू करने के लिए प्ले दबाएं।
    नोट: इसका उपयोग विश्लेषण के दौरान व्यक्तिगत ऊतक स्तरीकरण के लिपिड-समृद्ध और लिपिड-गरीब क्षेत्रों को अलग करने के लिए किया जाएगा। चक्र और कुल समय पंजीकृत बिंदु सूची के नीचे दाईं ओर इंगित किए गए हैं।
  8. एक बार चक्र पूरा हो जाने के बाद, पंप और स्टोक्स बीम दोनों को ब्लॉक करें। लेजर ग्राफिकल यूजर इंटरफ़ेस पर तरंग दैर्ध्य को लक्षित तरंग संख्या या रमन कंपन के आधार पर वांछित तरंग दैर्ध्य में बदलें।
    नोट: उदाहरण के लिए, पंप बीम के लिए 843 एनएम का उपयोग Eq. (2) का उपयोग करके 2,250 सेमी-1 को लक्षित करने के लिए किया जाता है, और मोटर ठीक धुन को 50.1 में बदल दिया जाता है। यहां प्रस्तुत उदाहरण दवा, रुक्सोलिटिनिब, में एक नाइट्राइल होता है जिसे 2,250 सेमी -1 पर लक्षित किया जा सकता है। त्वचा संरचना के लिए लक्षित तरंग संख्या हमेशा एक ही होगी (2,850 सेमी -1); हालांकि, एक एपीआई के लिए wavenumber किसी भी wavenumber हो सकता है, लेकिन ज्ञात या एक प्राथमिकता की गणना की जानी चाहिए.
  9. नई तरंग दैर्ध्य और पंप बीम शक्ति के लिए समय में ओवरलैप सुनिश्चित करने के लिए मैन्युअल समय देरी चरण (चित्रा 2) को समायोजित करें। सुनिश्चित करें कि लिपिड और एपीआई इमेजिंग दोनों के लिए समान शक्तियों का उपयोग किया जाता है, जो एक प्राथमिकता स्थापित की जाती है।
  10. प्रति प्रयोग आवश्यक पुनरावृत्तियों की कुल संख्या की गणना करने के लिए प्रति चक्र अवधि का उपयोग करें। बस प्रयोग के कुल वांछित समय-पाठ्यक्रम को चक्र की अवधि से विभाजित करें।
    नोट:: चक्र की अवधि छवि आकार, पिक्सेल रहने का समय, Kalman औसत, और प्रति चक्र छवियों की संख्या का एक समारोह है। इन मापदंडों का अनुकूलन चक्र समय को छोटा कर देगा, इस प्रकार अस्थायी संकल्प में वृद्धि होगी।
  11. एक बार चक्र दोहराने की कुल संख्या को चुना गया है, पंप बीम को अनब्लॉक करें, फोटोडायोड का उपयोग करके शक्ति की जांच करें, और सुनिश्चित करें कि यह वांछित शक्ति से मेल खाता है। अंत में, इमेजिंग के लिए अनुमति देने के लिए स्टोक्स बीम को अनब्लॉक करें।
  12. सेट-पॉइंट्स की स्वचालित इमेजिंग शुरू करने के लिए Play दबाएँ .
  13. MATL इमेजिंग पूरा होने के बाद, पंप बीम को 803 एनएम पर वापस स्विच करें और चरण 5.1 में उपयोग की जाने वाली मूल लिपिड-इमेजिंग पावर पर वापस पावर को समायोजित करें।
  14. पिछले चरणों के रूप में, पूरे अध्ययन में पोस्ट प्रयोग छवियों के लिए सुसंगत होने के लिए फ़ाइल नाम बदलें।
  15. दोहराव की संख्या को 1 पर सेट करें.
  16. तैयार | पर क्लिक करें एक पोस्ट टाइम-कोर्स लिपिड स्टैक प्राप्त करने के लिए बटन चलाएं और यह सुनिश्चित करें कि इमेजिंग के दौरान कोई ऊतक आंदोलन नहीं हुआ है (चित्रा 4)।

Figure 4
चित्रा 4: नग्न माउस कान त्वचा में ऊतक आंदोलन वसामय ग्रंथियों visualizing द्वारा प्रदर्शित किया. सीमित ऊतक आंदोलन का उदाहरण ए और बी में दर्शाया गया है, जबकि पर्याप्त ऊतक आंदोलन को सी और डी में दर्शाया गया है। (ए) सूत्रीकरण आवेदन के समय वसामय ग्रंथियों को दिखाता है और (बी) आवेदन के बाद 120 मिनट में एक ही गहराई। (सी) सूत्रीकरण अनुप्रयोग के समय माउस वसामय ग्रंथियां और (डी) सूत्रीकरण आवेदन के 120 मिनट बाद; वसामय ग्रंथियां मुश्किल से दिखाई देती हैं, जो एक संकेत है कि यह प्रयोग पूरे प्रयोगात्मक अवधि के लिए वसामय ग्रंथियों में अपटेक को माप नहीं रहा था। स्केल सलाखों = 100 μm. छवियां 1024 पिक्सेल x 1024 पिक्सेल हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

6. डेटा विश्लेषण

  1. के रूप में छवियों को प्राप्त करें । OIB (या । माइक्रोस्कोप और एमसी सॉफ़्टवेयर के आधार पर OIR) प्रत्येक XYZ स्थिति के साथ फ़ाइल प्रकार जिसमें एक अलग सबफ़ोल्डर होता है।
  2. निम्नलिखित अंत _lipid.oib के साथ लिपिड छवियों का नाम बदलकर एपीआई चैनल छवियों के साथ लिपिड छवियों को संकलित करें।
  3. प्रत्येक त्वचा स्तरीकरण के साथ निम्नलिखित चरणों का प्रदर्शन करें (सादगी के लिए केवल एसजी स्तरीकरण का उपयोग करके यहां प्रदर्शित किया गया है; चित्रा 3 बी देखें)।
    1. ImageJ (या फिजी) 34 में एक SG लिपिड छवि आयात करें और फ़ाइल को CARS और SRS चैनलों में विभाजित करने के लिए स्प्लिट चैनल लेबल वाले बॉक्स को चेक करें.
      नोट:: फिजी चैनलों की संख्या में प्रयोग के दौरान अधिग्रहित छवियों की संख्या में फ़ाइल को विभाजित करेगा।
    2. विश्लेषण | पर क्लिक करके रुचि का क्षेत्र (ROI) प्रबंधक खोलें उपकरण | ROI प्रबंधक.
    3. एसआरएस चैनल का उपयोग करना (उदाहरण के लिए, सी = 1), छवि में एक एसजी का सीमांकन करें।
      नोट: SGs लक्षित -CH2- कंपन के कारण उज्ज्वल स्थान हैं।
    4. ROI प्रबंधक में जोड़ें [t] पर क्लिक करके या कुंजीपटल पर t दबाकर ROI प्रबंधक के लिए यह जोड़ें। छवि के भीतर प्रत्येक एसजी के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएं।
    5. लिपिड-समृद्ध क्षेत्रों को मुखौटा करने के लिए, प्रत्येक ROI का चयन करें और अधिक टैब | पर क्लिक करें OR (संयोजित करें) | ROI प्रबंधक में जोड़ें.
    6. लिपिड-गरीब क्षेत्रों को मुखौटा करने के लिए, फिजी मेनू में आयत उपकरण का उपयोग करें और पूरी छवि के चारों ओर एक वर्ग खींचें। ROI प्रबंधक के लिए यह जोड़ें।
    7. ROI के अलावा नए जोड़े गए वर्ग ROI पर क्लिक करें जो ROI प्रबंधक में सभी लिपिड-समृद्ध क्षेत्रों का चयन करता है। अधिक के तहत, लिपिड-गरीब क्षेत्रों का एक मुखौटा उत्पन्न करने के लिए एक्सओआर का चयन करें और इसे आरओआई प्रबंधक में जोड़ें।
  4. API छवियों को फिजी में लोड करें.
  5. निम्नलिखित मेनू अनुक्रम का उपयोग करके संख्यात्मक क्रम (यानी, Image0001, Image0002, Image0003, आदि) में छवियों को concatenate: छवि | स्टैक्स | उपकरण | Concatenate.
    1. वैकल्पिक रूप से, फिजी में छवियों में से एक को लोड करके और फिर सेटअप पृष्ठ पर समान नामों के साथ समूह फ़ाइलों नामक विकल्प का चयन करके इन छवियों को आयात करें।
      नोट:: यह एक समान फ़ाइल नाम के साथ सभी छवियों को आयात करने और उन्हें स्वचालित रूप से concatenate करने की क्षमता प्रदान करता है।
  6. कॉन्केटेनेटेड छवि सक्रिय होने के दौरान, ROI प्रबंधक पर जाएं, लिपिड-समृद्ध क्षेत्रों (यानी, SG) का चयन करें, अधिक क्लिक करें, और बहु-माप का चयन करें। परिणाम विंडो के प्रकट होने की प्रतीक्षा करें.
  7. डिफ़ॉल्ट माप सेटिंग्स में क्षेत्र, माध्य, न्यूनतम, अधिकतम, और माध्यिका के लिए देखें। यदि अन्य मैट्रिक्स विश्लेषण के लिए वांछित हैं, तो माप सेट करें विंडो में प्रासंगिक चेकबॉक्स की जाँच करके इन विकल्पों को सक्षम करें (विश्लेषण | माप सेट करें...).
  8. परिणाम विंडो से डेटा को किसी स्प्रेडशीट में निर्यात करें और क्षेत्र शीर्षक वाला स्तंभ जोड़ें.
  9. लिपिड-समृद्ध क्षेत्रों के लिए डेटा की प्रत्येक पंक्ति में लिपिड-समृद्ध जोड़ें। उन क्षेत्रों में लिपिड-गरीब जोड़ें जो लिपिड के बाहर थे।
  10. एक स्तंभ शीर्षक परत जोड़ें और विश्लेषण किया गया था जो संबंधित परत जोड़ें (पूरक तालिका S1)।
  11. लिपिड-गरीब क्षेत्रों के लिए चरण 6.5 - 6.7 दोहराएँ, जबकि उपयुक्त ROI का चयन किया जाता है।
  12. डेटा को विज़ुअलाइज़ करने के लिए, स्प्रेडशीट को सहेजें और इसे या तो JupyterLab (पैकेज matplotlib)35 या R (पैकेज ggplot2)36 में आयात करें। एकाग्रता-समय डेटा का अनुमान लगाने के लिए छवि संख्या बनाम माध्य तीव्रता के एक फ़ंक्शन के रूप में डेटा प्लॉट करें। (चित्र 5)।
  13. CRI डेटा के फार्माकोकाइनेटिक विश्लेषण के लिए noncompartmental analysis (NCA) करने के लिए स्प्रेडशीट को RStudio में आयात करें।
  14. समय शीर्षक वाला स्तंभ जोड़ें.
  15. Image0001 के लिए, सूत्रीकरण अनुप्रयोग और पहली छवि के बीच की अवधि की गणना करें।
    नोट:: यह पहली timepoint है। चक्र अवधि का उपयोग शेष छवियों (और इस प्रकार समय बिंदुओं) की गणना करने के लिए किया जाता है जो समय के साथ बढ़ते हैं। उदाहरण के लिए, यदि अनुप्रयोग के बाद से समय 30 मिनट है, तो Image0001 में 30 मिनट का समय बिंदु होगा और 8 मिनट की चक्र अवधि के साथ, Image0002 में 38 मिनट का समय बिंदु होगा, Image0003 में 46 मिनट का समय बिंदु होगा और इसी तरह।
  16. RStudio में NCA चलाएँ (NonCompart पैकेज का उपयोग कर)37 स्प्रेडशीट से आयातित तीव्रता-समय डेटा पर, एक परत/क्षेत्र के लिए निम्न कॉल के साथ:
    sNCA(x = समय, y = माध्य, खुराक = 1, timeUnit = "s", doseUnit ="mg")
    जहां एक्स समय बिंदुओं को संदर्भित करता है, वाई तीव्रता को संदर्भित करता है, और खुराक को एक के रूप में छोड़ा जा सकता है, सूत्रीकरण या उत्पाद खुराक में दवा की एमएम खुराक के रूप में गणना की जाती है।
    नोट:: NCA आउटपुट पैरामीटर जैसे Cअधिकतम और AUCसभी प्रदान करेगा। हालांकि, जैसा कि यह पूर्व विवो त्वचा है, ये पैरामीटर वास्तव में, जेमैक्स और एयूसीफ्लक्स-सभी हैं।
  17. जेअधिकतम और एयूसीफ्लक्स-सभी मैट्रिक्स की तुलना प्रयोगात्मक परिस्थितियों में सांख्यिकीय तुलना के अलावा उन्हें (चित्रा 6) प्लॉट करके नेत्रहीन रूप से तुलना करें। पूर्व विवो सीआरआई अध्ययनों के विश्लेषण के एक उदाहरण के लिए चित्रा 6 देखें।
    नोट:: उपयुक्त सांख्यिकीय परीक्षण (ओं) प्रत्येक विशिष्ट डेटासेट पर आकस्मिक हैं। यह भी ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि सभी फार्माकोकाइनेटिक पैरामीटर लॉग-सामान्य रूप से वितरित किए जाते हैं, और किसी भी तुलना को लॉग-रूपांतरित (प्राकृतिक लॉग या लॉग 10) डेटा का उपयोग करना चाहिए।

Figure 5
चित्रा 5: तीव्रता बनाम समय प्रोफाइल. (ए) फ्लक्स प्रोफाइल का एक उदाहरण जो संतृप्ति तक पहुंच गया है और इस प्रकार केवल तीव्रता में कमी देखी जाती है। प्रत्येक ROI में डेटा में विषमता को प्रदर्शित करने के लिए एक अलग फ्लक्स प्रोफ़ाइल होती है जो कोई प्राप्त कर सकता है। (बी) सांद्रता का एक उदाहरण जो इमेजिंग के बाद बढ़ता है, शुरू हो गया है। प्रत्येक ROI एक ही प्रयोग के एक ही ऊतक के भीतर दृश्य का एक अलग क्षेत्र (विभिन्न रंग निशान द्वारा इंगित) है। वैश्विक सांद्रता के अलावा, यह स्पष्ट करने की क्षमता है कि लिपिड-समृद्ध और लिपिड-गरीब क्षेत्रों द्वारा इंगित किए गए अनुसार एपीआई / सूत्रीकरण किस स्थानीय वातावरण को पसंद करता है। ए में प्रस्तुत प्रोफाइल से संकेत मिलता है कि ऊतक में दवा का कोई अवशोषण नहीं है क्योंकि एपीआई पहले से ही व्याप्त हो चुका है और इमेजिंग शुरू होने के बाद ऊतक को छोड़ना शुरू कर दिया है। हालांकि, बी में, ऊतक संतृप्ति तक नहीं पहुंचा है, और अभी भी एपीआई का अवशोषण है जिसके बाद उन्मूलन होता है। लिपिड-समृद्ध और लिपिड-गरीब में छवियों का विभाजन एपीआई (या निष्क्रिय) के स्थानीयकरण और त्वचा में पारगमन मार्गों (यानी, स्ट्रैटम कॉर्नियम) के स्पष्टीकरण में सहायता करेगा। लिपिड-समृद्ध क्षेत्रों के भीतर एक उच्च एकाग्रता इंगित करती है कि एपीआई जांच के तहत परत की लिपिड संरचना के भीतर स्थानीयकृत होता है, जो लक्षित दवा वितरण जानकारी में सहायता करता है। संक्षेप: ROI = ब्याज का क्षेत्र; एपीआई = सक्रिय दवा घटक। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Representative Results

इमेजिंग को सफल माना जाता है यदि ऊतक प्रयोग के पूरा होने पर या तो अक्षीय (<10 μm) या पार्श्व दिशा में महत्वपूर्ण रूप से स्थानांतरित नहीं हुआ है (चित्रा 4)। यह एक तत्काल संकेत है यदि ब्याज के एपीआई के लिए एसआरएस माप प्रारंभिक गहराई का प्रतिनिधि नहीं है, जिसके लिए परिमाणीकरण परत-विशिष्ट है। यह ब्याज की प्रत्येक XY स्थिति के लिए इमेजिंग z-stacks द्वारा कम किया जाता है, जिसमें ट्रेड-ऑफ अस्थायी रिज़ॉल्यूशन होता है। यदि जमे हुए त्वचा का उपयोग इन अध्ययनों में किया जाता है, तो एपीआई की पैठ और पारगमन ताजा त्वचा की तुलना में तेजी से होता है, और सूत्रीकरण आवेदन और इमेजिंग की शुरुआत के बीच न्यूनतम समय अनिवार्य है। एक अन्य विचार प्रयोगों के लिए उपयोग किया जाने वाला उद्देश्य है। यदि 60x उद्देश्य का उपयोग करते हुए, दृश्य के एक क्षेत्र (एफओवी) के भीतर एक सपाट सतह का चयन करना अपेक्षाकृत आसान है; हालांकि, 20x उद्देश्य के लिए, देखा गया क्षेत्र बहुत बड़ा है, और इस प्रकार, ऊतक की तैयारी में एक महत्वपूर्ण कदम ग्लास-बॉटम इमेजिंग डिश के साथ त्वचा का समान संपर्क सुनिश्चित कर रहा है। एफओवी के भीतर मूल गहराई की तुलना में एक फ्लैट एफओवी और समान गहराई सकारात्मक परिणामों की दो कुंजी हैं।

लेजर के संरेखण, छवि की गतिशील सीमा के अलावा, अत्यंत सावधानी के साथ संबोधित किया जाना चाहिए। माइक्रोस्कोप में लेजर पल्स ट्रेनों के misalignment समस्याओं के एक मेजबान को जन्म दे सकते हैं, जिसमें कम सिग्नल स्तर या असमान रूप से उत्साहित एफओवी शामिल हैं, जो कम-विपरीत छवियों को जन्म दे सकते हैं। एक और विचार यह सुनिश्चित करना है कि छवियों को प्राप्त करते समय तीव्रता मूल्यों की पूरी गतिशील सीमा का उपयोग किया जाता है; अन्यथा, इमेजिंग डेटा संकुचित होते हैं, और एकाग्रता अंतर का पता लगाना मुश्किल हो सकता है।

एक और विचार यह है कि त्वचा की विषमता एक ही डेटासेट के भीतर गणना किए गए माइक्रोस्केल फ्लक्स प्रोफाइल में भिन्नता को जन्म दे सकती है। तीव्रता (सांद्रता के लिए एक प्रॉक्सी) प्रयोगात्मक अवधि (चित्रा 5 ए) में उच्च और कमी शुरू होती है, जबकि अन्य अध्ययन प्रयोगात्मक अवधि (चित्रा 5 बी) में प्रवाह में कमी के बाद वृद्धि का संकेत देते हैं। वर्तमान में, प्रयोगात्मक सेटअप के कारण पूर्ण एकाग्रता परिमाणीकरण तुरंत नहीं हो सकता है। इस प्रकार, सांद्रता जो आवेदन के बाद कम हो जाती है, संभवतः ब्याज की गहराई के भीतर एक संतृप्ति का परिणाम है, और परिमाणीकरण केवल एपीआई उन्मूलन का प्रतिनिधित्व करता है। यदि गतिशील सीमा पर्याप्त बड़ी नहीं है या त्वचा बहुत मोटी है, तो दृश्य निरीक्षण सांद्रता को स्थिर दिखने के लिए प्रस्तुत करेगा ताकि इमेजिंग अवधि में कोई परिवर्तन न हो। यह एक सबऑप्टिमल गतिशील रेंज और त्वचा की मोटाई दोनों का एक कार्य है, जो प्रयोग को दोहराने की आवश्यकता का सुझाव देगा।

एकाग्रता-समय प्रोफाइल को तब प्रत्येक प्रोफ़ाइल के एनसीए के अधीन किया जाता है ताकि एक्सपोजर, अधिकतम फ्लक्स और अधिकतम फ्लक्स के समय का अनुमान लगाया जा सके। सांख्यिकीय विश्लेषण (चित्रा 6) प्रयोगात्मक परिस्थितियों में आयोजित किया जाता है ताकि एक्सपोज़र में संभावित अंतर में योगदान देने वाले कोवरिएट्स की आगे की जांच की जा सके। वैश्विक सीपीके मापदंडों की तुलना अंतर्दृष्टि प्रदान करेगी जिसमें सूत्रीकरण एक उच्च प्रवाह या अधिक जोखिम प्रदान करता है। इसके विपरीत, माइक्रोस्केल सीपीके पैरामीटर (यानी, लिपिड-समृद्ध और लिपिड-गरीब क्षेत्र) स्थानीय जैव वितरण और पारगमन मार्गों में अंतर्दृष्टि प्रदान करेंगे। उदाहरण के लिए, एक ही एपीआई एकाग्रता के साथ दो योगों की तुलना करते समय और निष्क्रिय अवयवों में भिन्न होते समय, एक सूत्रीकरण लिपिड-समृद्ध क्षेत्र बनाम लिपिड-गरीब क्षेत्र के माध्यम से स्ट्रैटम कॉर्नियम के माध्यम से प्रवेश कर सकता है। यह अवलोकन इंगित करता है कि यह विशिष्ट सूत्रीकरण आसान प्रवेश और पारगमन के लिए लिपिड-समृद्ध क्षेत्रों की ओर पारगमन को "धक्का" देगा।

Figure 6
चित्रा 6: माउस कान के ऊतकों से एकाग्रता-समय प्रोफ़ाइल का उदाहरण एनसीए विश्लेषण। (ए) एक ही एपीआई के लिए दो योगों के बीच टीमैक्स (समय जिस पर अधिकतम एकाग्रता होती है) विश्लेषण का एक उदाहरण। यह विश्लेषण इंगित करता है कि 2-(2-ethoxyethoxy) इथेनॉल त्वचा की परत की परवाह किए बिना जेल सूत्रीकरण की तुलना में विस्तारित एपीआई पारगमन प्रदान करता है। यह भी देखा जा सकता है कि एससी परत के लिए टीअधिकतम एसजी की तुलना में लंबा है, यह सुझाव देते हुए कि 2-(2-ethoxyethoxy) इथेनॉल सूत्रीकरण एपीआई वितरित करना जारी रख रहा है, भले ही इमेजिंग अवधि समाप्त हो गई हो। (बी) ए में एक ही सूत्रीकरण / एपीआई संयोजन के बीच कुल एक्सपोजर विश्लेषण का एक उदाहरण लेकिन त्वचा में आगे की गहराई पर। यह आंकड़ा18 से संशोधित किया गया है। संक्षेप: SC = stratum corneum; एसजी = वसामय ग्रंथि; AD = adipocyte; SCF = चमड़े के नीचे वसा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक तालिका S1: मैन्युअल छवि विश्लेषण से प्राप्त उदाहरण डेटासेट। कॉलम इस पांडुलिपि के डेटा विश्लेषण अनुभाग (यानी, फ्रेम, क्षेत्र, माध्य, न्यूनतम, अधिकतम, माध्यिका) से प्राप्त जानकारी को इंगित करते हैं, जबकि अतिरिक्त कॉलम को सीपीके विश्लेषण (यानी, परत, क्षेत्र, time_minutes) में उपयोग के लिए जोड़ा गया है। इन आंकड़ों का एनसीए के माध्यम से विश्लेषण किया जा सकता है और एसजी त्वचा परत के भीतर एकाग्रता प्रोफ़ाइल की कल्पना करने के लिए प्लॉट किया जा सकता है। इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

सामयिक बीए / बीई का मूल्यांकन अनुसंधान का एक क्षेत्र है जिसके लिए एक बहुआयामी दृष्टिकोण की आवश्यकता होती है क्योंकि कोई भी विधि विवो सीपीके में पूरी तरह से चिह्नित नहीं हो सकती है। यह प्रोटोकॉल सुसंगत रमन इमेजिंग के आधार पर एक सामयिक दवा उत्पाद के बीए / बीई के मूल्यांकन के लिए एक पद्धति प्रस्तुत करता है। पहले बिंदुओं में से एक जिसे अनदेखा किया जा सकता है, वह यह है कि त्वचा के नमूने कितने पतले होने चाहिए, विशेष रूप से मात्रात्मक संचरण एसआरएस इमेजिंग के लिए। यदि त्वचा बहुत मोटी है (यानी, प्रकाश आसानी से पारित नहीं हो सकता है), तो एसआरएस डिटेक्टर द्वारा मापा गया कोई संकेत नहीं है, और इसलिए यह खराब एकाग्रता डेटा प्रदान करेगा। इन ऊतक नमूनों को ठीक से तैयार करने के लिए देखभाल की जानी चाहिए, क्योंकि यह एक प्रयोग कर सकता है या तोड़ सकता है। नग्न माउस कान के संदर्भ में, पीबीएस के साथ कुल्ला करने और कान पर किसी भी अवशिष्ट गंदगी को हटाने के लिए इसे सूखा थपथपाने के अलावा, थोड़ी तैयारी की आवश्यकता होती है।

माउस कान आमतौर पर कई सौ μm की मोटाई के होते हैं, जो संचरण एसआरएस के लिए इष्टतम होता है। मानव त्वचा के नमूने आमतौर पर कई मिमी मोटे होते हैं, जिसमें चमड़े के नीचे वसा भी शामिल है, हालांकि मोटाई त्वचा के ऊतकों के शारीरिक स्रोत और दाता की उम्र के आधार पर अत्यधिक परिवर्तनशील होती है। इस प्रकार, समय के साथ एपिडर्मिस और डर्मिस में लिपिड संरचनाओं और एपीआई सांद्रता को सटीक रूप से मापने के लिए जितना संभव हो उतना अतिरिक्त ऊतक को हटा दिया जाना चाहिए। यदि ऊतक तैयारी चरण को अनदेखा किया जाता है, तो प्रयोगात्मक सेट-अप के शेष चरण काफी हद तक अनुपयुक्त होंगे क्योंकि शुरुआती स्थितियां इष्टतम नहीं हैं।

लेजर / माइक्रोस्कोप सेटअप अगली चुनौती या संभावित ठोकर ब्लॉक है। बीम पथ में लेजर का misalignment और अंततः माइक्रोस्कोप में खराब विपरीत में परिणाम और इसलिए, खराब इमेजिंग परिणाम। पहले CARS चैनल स्थापित करने की सिफारिश की जाती है, क्योंकि इसका सिग्नल ढूंढना आसान है। पंप और स्टोक्स पल्स ट्रेनों को समय और स्थान दोनों में ओवरलैप किया जाना चाहिए। पंप लेजर के संरेखण माइक्रोस्कोप एमसी सॉफ्टवेयर के भीतर संचरण डिटेक्टर का उपयोग कर की जाँच की है जब एसआरएस डिटेक्टर रास्ते से बाहर फ़्लिप है. MC सॉफ़्टवेयर में CARS चैनल (ALG1) को देखते समय, Stokes बीम का अवरोध लगाया जाता है। हालांकि, यदि तेल के नमूने से कोई संकेत नहीं है, तो पहले स्टोक्स बीम को संरेखित करना और फिर समय ओवरलैप को समायोजित करना आवश्यक है। सिग्नल अनुकूलित होने तक इन दो समायोजनों को पुनरावृत्त करना आवश्यक हो सकता है। दो बीम के स्थानिक ओवरलैप को आईरिस पर एक आईआर दर्शक के माध्यम से देखा जाता है, जबकि समय देरी चरण (चित्रा 2) को समय पर बीम ओवरलैप करने के लिए समायोजित किया जाता है। ये दो संरेखण चरण CARS सिग्नल जनरेशन सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण हैं।

एक बार जब कार्स चैनल में एक संकेत स्पष्ट हो जाता है, तो एसआरएस चैनल (ALG2) सेट अप करने के लिए अगला है। सिग्नल की कमी के लिए संभावित समस्याएं यह हैं कि लॉक-इन चरण या लाभ सेटिंग्स बहुत कम हैं, या ऑफसेट लॉक-इन सॉफ़्टवेयर के भीतर बहुत अधिक सेट है। इसके अलावा, कंडेनसर स्थिति को फोटोडायोड पर प्रेषित प्रकाश पर ध्यान केंद्रित करने के लिए समायोजित किया जा सकता है और इसलिए एसआरएस सिग्नल को अनुकूलित किया जा सकता है। लेजर / माइक्रोस्कोप के अनुचित सेटअप से सिग्नल की कमी हो जाएगी, इस प्रकार एकाग्रता अनुमानों को कम किया जाएगा और पारगमन जानकारी की कमी होगी। पंप और स्टोक्स बीम की लेजर शक्ति को व्यक्तिगत अध्ययन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। हालांकि, यह महत्वपूर्ण है कि बीम की शक्तियां प्रत्येक प्रयोग के लिए समान हैं। प्रतिकृतियों के बीच विभिन्न लेजर शक्तियां एकाग्रता में गलत अंतर देंगी, जो एपीआई / फॉर्मूलेशन के बजाय सेटअप के कारण होगी।

प्रत्येक अध्ययन को एक अद्वितीय खुराक-अवधि के समय की आवश्यकता होगी (यानी, समय की अवधि कि सूत्रीकरण त्वचा पर छोड़ दिया जाता है) और त्वचीय एपीआई प्रवेश / पारगमन को मापने के लिए स्वतंत्र रूप से जांच की जानी चाहिए क्योंकि यह सूत्रीकरण-निर्भर है। एक प्रोटोकॉल विकसित करते समय एक और विचार सूत्रीकरण अनुप्रयोग की occlusive प्रकृति है। यह जानना महत्वपूर्ण है कि क्या सूत्रीकरण को ऑक्लुसिव या गैर-विशिष्ट परिस्थितियों में प्रशासित करने के लिए डिज़ाइन किया गया था। यहां प्रस्तुत सीआरआई पद्धति एक उल्टे माइक्रोस्कोप का उपयोग करती है; इसका मतलब यह है कि त्वचा की सतह चेहरा नीचे और occlusive सेटिंग्स के तहत है. एक ईमानदार माइक्रोस्कोप गैर-विशिष्ट स्थितियों का अवसर प्रदान कर सकता है; हालांकि, त्वचा की सतह सपाट नहीं हो सकती है, जो इन प्रकार के प्रयोगों को चुनौतीपूर्ण बना देगी।

यह स्वीकार किया जाना चाहिए कि इन प्रयोगों की ओक्लसिव प्रकृति विशिष्ट नैदानिक उपयोग नहीं है; फिर भी, पारगमन मार्ग इन अध्ययनों के भीतर पार्स किए जाते हैं। यहां प्रस्तुत सीआरआई विधि माइक्रोस्केल परिवर्तनों को कल्पना करने और निर्धारित करने की क्षमता प्रदान करती है जो अन्यथा त्वचीय माइक्रोडायलिसिस, त्वचीय ओपन-फ्लो माइक्रोपरफ्यूजन, टेप-स्ट्रिपिंग, या आईवीपीटी अध्ययन जैसे तरीकों के साथ अप्रभेद्य हैं। तेजी से wavenumber ट्यूनिंग के हाल के विकास ने त्वचा संरचना के समवर्ती परिमाणीकरण और मूक क्षेत्र के बाहर कई कंपन बांड के लिए मार्ग प्रशस्त किया है। हालांकि, त्वचा से विशिष्ट analytes के योगदान को पार्स करने के लिए आगे कम्प्यूटेशनल तरीके अभी भी विकास के तहत हैं28। यह विवो सीआरआई अध्ययनों के लिए भी विशेष प्रासंगिकता का है, हालांकि इस सेटअप में बेंचटॉप पर उपयोग की जाने वाली शक्तियां (फोकस में लगभग 50 एमडब्ल्यू) नैदानिक उपयोग के लिए अनुमेय नहीं हो सकती हैं। इस पद्धति की क्षमता को एक प्रयोगशाला बेंच से क्लिनिक में अनुवादित करने के लिए जांचकर्ताओं को विवो में दवा के पारगमन के साथ-साथ विट्रो-इन विवो संबंधों को विकसित करने के लिए एक ही सेटिंग में पूर्व विवो को मापने में सक्षम कर सकता है जो सामयिक दवा विकास में प्रगति के लिए महत्वपूर्ण हैं।

एक प्रयोगात्मक रन से प्राप्त डेटा की सरासर मात्रा प्रति साइट 10 छवियों से प्रति साइट 70 छवियों तक कहीं भी हो सकती है। यदि ऊतक के प्रति टुकड़े में कई साइटें हैं, तो यह जानकारी के गीगाबाइट की ओर जाता है। छवियां स्वयं वैश्विक एकाग्रता-समय डेटा प्रदान करती हैं और पूर्व-प्रसंस्करण के बिना, वे जैसे हैं, वैसे ही मात्रा में निर्धारित की जाती हैं। हालांकि, यह सीआरआई की उपयोगिता को अधिकतम नहीं करता है क्योंकि स्थानीय बायोडिस्ट्रिब्यूशन डेटा को पारगमन मार्ग डेटा के अलावा निकाला जा सकता है। छवि विभाजन समय लेने वाला है, लेकिन विस्तृत जानकारी प्रदान करता है जो अन्य तरीकों के साथ संभव नहीं है। उदाहरण के लिए, स्ट्रैटम कॉर्नियम (लिपिड-समृद्ध या लिपिड-गरीब) के माध्यम से पसंदीदा प्रवेश मार्ग का अनुमान लगाना संभव है, जो अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है कि निष्क्रिय सामग्री एक विशिष्ट मार्ग में योगदान कर सकती है या यदि यह दवा-निर्भर है। एक प्रयोग के विश्लेषण में कई घंटे लग सकते हैं, जो छवियों की संख्या और प्रयोगात्मक अवधि पर निर्भर करता है। इसलिए, एक स्वचालित दृष्टिकोण डेटा विश्लेषण में सहायता करेगा और त्वचा के स्तरीकरणमें लिपिड-समृद्ध और लिपिड-गरीब क्षेत्रों का लगातार एनोटेशन प्रदान करेगा।

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Disclosures

CLE CARS माइक्रोस्कोपी के लिए पेटेंट पर एक आविष्कारक है जिसे कई माइक्रोस्कोप निर्माताओं को लाइसेंस दिया गया है। अन्य सभी लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई संघर्ष नहीं है।

Acknowledgments

लेखकों को उनकी चर्चा और इस पांडुलिपि के proofreading के लिए इवांस समूह के डॉ Fotis Iliopoulos और डैनियल Greenfield धन्यवाद करना चाहते हैं. इसके अलावा, लेखक LEO Pharma से समर्थन को स्वीकार करना चाहते हैं। चित्र 2 BioRender.com के साथ बनाया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tissue Preparation
Autoclavable Biohazard Bags FisherBrand 22-044562 As refered to in text: biohazard bags
https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-polyethylene-biohazard-autoclave-bags-without-sterilization-indicator-8/22044562?searchHijack=true&searchTerm= 22044562&searchType=RAPID& matchedCatNo=22044562
Cell Culture Buffers: Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution 1x Corning MT21030CV As refered to in text: PBS
https://www.fishersci.com/shop/products/corning-cellgro-cell-culture-buffers-dulbecco-s-phosphate-buffered-salt-solution-1x-8/MT21030CV?searchHijack=true&searchTerm= 21-030-cv&searchType= RAPID&matchedCatNo=21-030-cv
Disposable Scalpels Exel International 14-840-00 As refered to in text: scalpel
https://www.fishersci.com/shop/products/exel-international-disposable-scalpels-3/1484000?keyword=true
High Precision 45° Angle Broad Point Tweezers/Forceps Fisherbrand 12-000-132 As refered to in text: forceps
https://www.fishersci.com/shop/products/high-precision-45-angle-broad-point-tweezers-forceps/12000132#?keyword=
Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-Ply Kimberly-Clark Professional Kimtech Science 06-666 As refered to in text: task wiper
https://www.fishersci.com/shop/products/kimberly-clark-kimtech-science-kimwipes-delicate-task-wipers-7/06666
Parafilm M Laboratory Wrapping Film Bemis 13-374-12 As refered to in text: parafilm
https://www.fishersci.com/shop/products/curwood-parafilm-m-laboratory-wrapping-film-4/1337412
Petri Dish (35 mm x 10 mm) Fisherbrand FB0875711YZ As refered to in text: small petri dish
https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-specialty-6/FB0875711YZ?keyword=true
Petri Dish (60 mm x 15 mm) Fisherbrand FB0875713A As refered to in text: large petri dish
https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/FB0875713A?keyword=true
Surgical Scissors Roboz NC9411473 As refered to in text: scissors
https://www.fishersci.com/shop/products/scissors-327/NC9411473?searchHijack=true&searchTerm= RS-5915SC&searchType=RAPID& matchedCatNo=RS-5915SC
Laser/microscope
650/60 nm BrightLine single-band bandpass filter Semrock As refered to in text: CARS filter - CH2 vibrations (645nm/60nm filter)
Control box IX2-UCB Olympus As refered to in text: Control Box
D700/30m Chroma As refered to in text: CARS filter - deuterated band
https://www.chroma.com/products/parts/d700-30m
DeepSee Insight Spectra-Physics As refered to in text: Laser
https://www.spectra-physics.com/f/insight-x3-tunable-laser
Digital Handheld Optical Power and Energy Meter Console ThorLabs PM100D As refered to in text: power meter
https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=3341
Fluoview Software Olympus As refered to in text: Microscope Control software
Frosted Microscope Slides FisherBrand As refered to in text: microscope slides
https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-frosted-microscope-slides-4/22265446
FV1000 Olympus As refered to in text: Microscope
Incubation Chamber Tokai Hit GM-800 As refered to in text: incubation chamber
Integrating Sphere Photodiode Power Sensor ThorLabs S142C As refered to in text: photodiode
https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=3341
Power supply FV31-PSU Olympus As refered to in text: Power Supply
Precision 4063, 80MHz Dual Channel Function Generator BK Precision As refered to in text: function generator
ProScan – Precision Microscope Automation Prior Scientific Instruments As refered to in text: stage controller
https://www.prior.com/microscope-automation/inverted-microscope-systems/proscan-linear-stage-highest-precision-microscope-automation
SecureSeal Imaging Spacers Grace Biolabs 654004 As refered to in text: spacer
https://gracebio.com/product/secureseal-imaging-spacers-654004/
SRS Detection Kit APE As refered to in text: SRS detector
UPLSAPO 20X NA:0.75 Olympus As refered to in text: 20X Objective
https://www.olympus-lifescience.com/en/objectives/uplsapo/
Lipid/Drug Imaging
 35 mm Dish, No. 0 Uncoated Coverslip, 14 mm Glass Diameter MatTek Corporation NC9711297 As refered to in text: Glass bottom dish
https://www.fishersci.com/shop/products/glass-bottom-mircrowell-dish/nc9711297
Cotton-tipped applicators FisherBrand As refered to in text: Cotton-tipped applicator
Distriman Postive Displacement Pipette Gilson As refered to in text: Postive Displacement Pipette
https://www.fishersci.com/shop/products/gilson-distriman-positive-displacement-repetitive-pipette/F164001G#?keyword=
Distriman Postive Displacement Pipette Tips Gilson As refered to in text: Tips for pipette
https://www.fishersci.com/shop/products/gilson-distritip-syringes-6/f164100g?keyword=true
Data Analysis
FIJI Open-source As refered to in text: FIJI/ImageJ
https://imagej.net/software/fiji/
Jupyter-Lab open-source As refered to in text: JupyterLab
https://jupyter.org/
Rstudio Open-source As refered to in text: Rstudio
https://www.rstudio.com/

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चिकित्सा अंक 177 सुसंगत रमन प्रकीर्णन सुसंगत विरोधी स्टोक्स रमन प्रकीर्णन उत्तेजित रमन प्रकीर्णन त्वचीय फार्माकोकाइनेटिक्स जैव उपलब्धता bioequivalence
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