Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

הדמיה וכימות של תרכובות פרמצבטיות בתוך העור באמצעות הדמיית פיזור ראמן קוהרנטית

Published: November 24, 2021 doi: 10.3791/63264
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Wellman Center for Photomedicine, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School

Summary

מתוארת מתודולוגיית הדמיית פיזור ראמאן קוהרנטית להדמיה וכימות של תרכובות תרופתיות בתוך העור. מאמר זה מתאר הכנת רקמות עור (אדם ועכבר) ויישום פורמולציה מקומית, רכישת תמונה לכימות פרופילי ריכוז מרחביים-טמפורליים, וניתוח פרמקוקינטי ראשוני להערכת אספקת תרופות מקומית.

Abstract

פרמקוקינטיקה עורית (cPK) לאחר יישום פורמולציה מקומית הייתה תחום מחקר שמעניין במיוחד מדעני רגולציה ופיתוח תרופות כדי להבין באופן מכניסטי את הזמינות הביולוגית המקומית (BA). טכניקות פולשניות למחצה, כגון הפשטת סרט, מיקרודיאליזה עורית או מיקרופרפוזיה של זרימה פתוחה עורית, מכמתות כולן cPK בקנה מידה מאקרו. בעוד שטכניקות אלה סיפקו ידע עצום ב-cPK, הקהילה חסרה הבנה מכניסטית של חדירה וחדירה של חומרים פרמצבטיים פעילים (API) ברמה התאית.

גישה לא פולשנית אחת לטיפול ב-cPK בקנה מידה זעיר היא הדמיית פיזור ראמאן (CRI) קוהרנטית, המכוונת באופן סלקטיבי לתנודות מולקולריות פנימיות ללא צורך בתוויות חיצוניות או בשינוי כימי. ל-CRI יש שתי שיטות עיקריות - פיזור ראמאן אנטי-סטוקסי קוהרנטי (CARS) ופיזור ראמאן מגורה (SRS) - המאפשרות כימות רגיש וסלקטיבי של ממשקי API או רכיבים לא פעילים. CARS משמש בדרך כלל להפקת מידע מבני על העור או להדמיית ניגודיות כימית. לעומת זאת, אות ה-SRS, שהוא ליניארי עם ריכוז מולקולרי, משמש לכימות ממשקי API או מרכיבים לא פעילים בתוך ריבוד העור.

למרות שרקמת עכבר משמשת בדרך כלל ל-cPK עם CRI, יש להעריך בסופו של דבר BA מקומי וביו-אקוויוולנטיות (BE) ברקמה אנושית לפני אישור רגולטורי. מאמר זה מציג מתודולוגיה להכנה ותמונה של עור ex vivo לשימוש במחקרי CRI פרמקוקינטיים כמותיים בהערכת תואר ראשון ו- BE מקומיים. מתודולוגיה זו מאפשרת כימות API אמין וניתן לשחזור בתוך עור האדם והעכבר לאורך זמן. הריכוזים בתוך תאים עשירים בשומנים ועניים בשומנים, כמו גם ריכוז ה-API הכולל לאורך זמן מכמתים; אלה משמשים לאומדנים של BA בקנה מידה זעיר ומאקרו, וייתכן שגם BE.

Introduction

מתודולוגיות להערכת cPK לאחר יישום מוצר תרופתי מקומי התרחבו ממחקרים קלאסיים של בדיקות חדירה במבחנה (IVPT) 1,2,3,4,4,5 והפשטת קלטת 6,7,8 למתודולוגיות נוספות כגון מיקרופרפוזיה בזרימה פתוחה או מיקרודיאליזה עורית 9,10,11, 12,13,14. ישנם אתרים מקומיים שונים של פעולה טיפולית בהתאם למחלה המעניינת. לפיכך, ייתכן שיש מספר מתאים של מתודולוגיות כדי להעריך את הקצב והמידה שבהם API מגיע לאתר הפעולה המקומי המיועד. בעוד שלכל אחת מהמתודולוגיות הנ"ל יש יתרונות, החיסרון העיקרי הוא היעדר מידע cPK בקנה מידה זעיר (כלומר, חוסר היכולת לדמיין לאן ה- API הולך וכיצד הוא מחלחל).

מתודולוגיה לא פולשנית אחת המעניינת להערכת BA ו- BE אקטואליים היא CRI, אותה ניתן לפרק לשני אופני הדמיה: CARS ומיקרוסקופיה SRS. שיטות ראמאן קוהרנטיות אלה מאפשרות הדמיה ספציפית מבחינה כימית של מולקולות באמצעות אפקטים לא ליניאריים של ראמאן. ב-CRI, שתי רכבות פולס לייזר ממוקדות ונסרקות בתוך דגימה; ההבדל באנרגיה בין תדרי הלייזר מוגדר כך שיתמקד במצבי רטט ספציפיים למבנים הכימיים המעניינים. מכיוון שתהליכי CRI אינם ליניאריים, אות נוצר רק במוקד המיקרוסקופ, מה שמאפשר הדמיה טומוגרפית פרמקוקינטית תלת-ממדית של הרקמה. בהקשר של cPK, CARS שימשה לקבלת מידע מבני של רקמות, כגון המיקום של מבני עור עשירים בשומנים15. לעומת זאת, נעשה שימוש ב-SRS כדי לכמת את הריכוז המולקולרי מכיוון שהאות שלו ליניארי עם ריכוז. עבור דגימות עור ex vivo , זה יתרון לבצע CARS בכיוון epi16 ו- SRS במצב תיבת הילוכים17. לכן, דגימות רקמה דקות יאפשרו זיהוי וכימות אותות SRS.

כרקמה לדוגמה, אוזן העכבר העירומה מציגה מספר יתרונות עם חסרונות קלים. יתרון אחד הוא שהעובי של הרקמה כבר כ-200-300 מיקרומטר ואינו דורש הכנת דגימה נוספת. בנוסף, מספר ריבודי עור נראים על ידי התמקדות אקסיאלית דרך שדה ראייה אחד (למשל, שכבת קרנית, בלוטות חלב (SGs), אדיפוציטים ושומן תת עורי)16,18. זה מאפשר הערכה פרה-קלינית ראשונית של מסלולי חדירה עוריים והערכות BA מקומיות לפני המעבר לדגימות עור אנושיות. עם זאת, מודל העכבר העירום מציג מגבלות כגון קושי באקסטרפולציה לתרחישי in vivo עקב הבדלים במבנה העור19. בעוד שאוזן העכבר העירום היא מודל מצוין להשגת תוצאות ראשוניות, מודל העור האנושי הוא תקן הזהב. למרות שהיו פרשנויות שונות על ההתאמה והישימות של עור אנושי קפוא כדי לשחזר במדויק קינטיקה של חדירה in vivo 20,21,22, השימוש בעור אדם קפוא הוא שיטה מקובלת להערכת קינטיקה של חדירת API במבחנה 23,24,25 . פרוטוקול זה מדמיין שכבות עור שונות בעור העכברים ובני האדם תוך כימות ריכוזי ה-API בתוך מבנים עשירים בשומנים ועניים בשומנים.

בעוד ש-CRI שימשה בתחומים רבים כדי להמחיש באופן ספציפי תרכובות בתוך רקמות, היו מאמצים מוגבלים לחקור את ה-cPK של מוצרי תרופות המיושמים באופן מקומי. כדי להעריך את ה- BA/ BE האקטואלי של מוצרים מקומיים באמצעות CRI, יש צורך תחילה בפרוטוקול סטנדרטי כדי לבצע השוואות מדויקות. מאמצים קודמים שהשתמשו ב-CRI לצורך אספקת תרופות לעור הוכיחו שונות בתוך הנתונים. מכיוון שמדובר ביישום חדש יחסית של CRI, הקמת פרוטוקול היא קריטית כדי להשיג תוצאות אמינות 18,26,27. גישה זו מכוונת רק למספר גל ספציפי אחד באזור השקט הביולוגי של ספקטרום הראמן. עם זאת, לרוב ממשקי ה-API והמרכיבים הלא פעילים יש תזוזות Raman בתוך אזור טביעת האצבע. זה הציב בעבר אתגרים בשל האות האינהרנטי הנובע מהרקמה באזור טביעת האצבע. ההתקדמות האחרונה בלייזר ובחישוב הסירה את המחסום הזה, שניתן להשתמש בו גם בשילוב עם הגישה המוצגת כאן28. גישה זו המוצגת כאן מאפשרת כימות של API, בעל תזוזת ראמאן באזור השקט (2,000-2,300 ס"מ-1). זה לא מוגבל לתכונות הפיזיוכימיות של התרופה, מה שעשוי להיות המקרה עבור כמה מתודולוגיות ניטור cPK שהוזכרו קודם לכן29.

הפרוטוקול חייב להפחית את השונות בין דגימה לדגימה בעובי העור לצורך תכשירים שונים, שכן דגימות עור אנושיות עבות יפיקו אות מינימלי לאחר יישום מוצר התרופה עקב פיזור קל על ידי הדגימה העבה. מטרתו של כתב יד זה היא להציג מתודולוגיה להכנת רקמות המבטיחה תקני הדמיה הניתנים לשחזור. בנוסף, מערכת CRI מוגדרת כמתואר כדי להפחית מקורות שגיאה פוטנציאליים, כמו גם למזער אות לרעש. עם זאת, מאמר זה לא ידון בעקרונות המנחים וביתרונות הטכניים של מיקרוסקופ CRI שכן זה כוסה בעבר30. לבסוף, הליך ניתוח הנתונים המקיף נבחן כדי לאפשר פרשנות של התוצאות כדי לקבוע את הצלחת הניסוי או כישלונו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

השימוש ברקמת אוזן עכבר עירום אושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של בית החולים הכללי של מסצ'וסטס (IACUC), בעוד שהשימוש ברקמת עור אנושית אושר על ידי מועצת הביקורת המוסדית של בית החולים הכללי של מסצ'וסטס (IRB). על פי הפרוטוקולים של IACUC, עכברים שזה עתה הומתו הושגו ממשתפי פעולה עם מושבות עכברים עירומים. רקמות אנושיות נרכשו מניתוחים אלקטיביים של עבדות אבדומינופלסטיה בבית החולים הכללי של מסצ'וסטס באמצעות פרוטוקול מאושר. בנוסף, סוגי רקמות ספציפיים שאינם עור בטן נרכשו באמצעות רשות לתרומת גוף, גם באמצעות פרוטוקול שאושר על ידי IRB.

1. הכנת רקמות

  1. הכנת רקמת עור עור של אוזן עכבר עירום
    1. לאחר רכישת גופות עכברים עירומים שזה עתה נקטפו, הסירו את האוזניים באמצעות מלקחיים ומספריים מיקרו-כירורגיים. מניחים אוזן אחת בצלחת פטרי קטנה (כלומר, 35 מ"מ x 10 מ"מ). הניחו את גוף העכבר העירום בשקית ביו-האזרד שיש להיפטר ממנה בהתאם לפרוטוקולים המקומיים של IACUC.
    2. שטפו כל אוזן עכבר עם מי מלח עם מאגר פוספט (PBS) וטפחו עליה בעדינות עם מגב משימה. חזרו על הפעולה פעמיים כדי להסיר שאריות לכלוך או פסולת על האוזן שעלולים להשפיע על איכות ההדמיה (ראו איור 1).
    3. אם יש להשתמש באוזן תוך 24 שעות, הניחו אותה בצלחת פטרי קטנה (כלומר, 35 מ"מ x 10 מ"מ) עם PBS טרי במקרר (2-8 מעלות צלזיוס). אם האוזן תשמש לאחר 24 שעות של קציר, הניחו אותה בצלחת פטרי (35 מ"מ x 10 מ"מ) ללא PBS, כסו את המנה בפרפילם והניחו אותה במקפיא של -20 מעלות צלזיוס.
  2. הכנת רקמת עור אנושית
    1. לאחר רכישת רקמות אנושיות, הניחו אותה בצלחת פטרי גדולה (כלומר, 60 מ"מ x 15 מ"מ) במכסה המנוע הביולוגי כדי לאפשר מספיק מקום להכנת דגימה.
    2. מניחים את שכבת הקרנית בצד הפונה כלפי מטה כך שהשומן התת עורי יהיה נגיש.
    3. באמצעות מלקחיים ומספריים מיקרו-כירורגיים, מתחילים להסיר בזהירות את השומן התת עורי. ברגע שלא ניתן עוד להסיר שומן תת עורי עם המספריים, עברו לאזמל חד פעמי בעל 10 להבים (או שווה ערך) כדי להסיר את השומן התת עורי הנותר. השתמשו באזמל בזווית של 45° על העור תוך החזקת העור ללא מלקחיים (ראו איור 1).
      הערה: כדי לקבל תמונות SRS שידור באיכות גבוהה, הדגימות צריכות להיות דקות ככל האפשר מבלי להיות מנוקבות.

Figure 1
איור 1: תמונות בעובי אידיאלי להדמיית עור עכברים ובני אדם. (B) עור אנושי אידיאלי שנאחז באור לאחר ההכנה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

  1. חתכו את עור האדם לחתיכות של 1 ס"מ על 1 ס"מ.
    הערה: ניתן להשתמש בעור טרי עד 24 שעות ללא שימוש במיטת ג'ל אגרוזה, כפי שתואר קודם לכן31. עם זאת, ניתן להשתמש בעור טרי במשך זמן רב יותר אם שומרים על מיטת ג'ל אגרוזה. אם יש להשתמש בעור מאוחר יותר, העור מונח בשקית הובלת דגימה ולאחר מכן מונח במקפיא של -20 מעלות צלזיוס. יש להפשיר עור קפוא באמצעות ההליך שלהלן לקבלת תוצאות מיטביות (ראה שלב 3.1.2).

2. הגדרת לייזר ומיקרוסקופ

  1. כ-30 דקות לפני ההדמיה, הפעילו את הלייזר האולטרה-מהיר בעל הכוונון הרחב (להלן הלייזר) ואפשרו לו להתחמם. אפשר למערכת השלט/נעילה של אזהרת לייזר להודיע לאנשי צוות מחוץ לסכנה פוטנציאלית בעת הכניסה.
    הערה: תמיד יש ללבוש משקפיים מתאימים בעת עבודה עם לייזרים מסוג CLASS IV. עבור הלייזר הספציפי המשמש כאן, המשקפיים הנכונים המומלצים הם OD ≥ 6 עבור טווח העבודה של הלייזר 800-1,300 ננומטר.
  2. בזמן שהלייזר מתחמם, אפשרו את החומרה הנותרת לבקרת מיקרוסקופ, זיהוי CARS וזיהוי SRS.
  3. יישרו את המיקרוסקופ כראוי כדי להבטיח הדמיה אופטימלית. בחלון בקרת רכישת תמונה בתוכנת בקרת המיקרוסקופ (להלן תוכנת MC), לחץ על מנורת השידור כדי לאפשר לאור להגיע ממנורת ההעברה של המיקרוסקופ.
  4. הקפידו על תאורת Köhler נכונה כדי ליישר את המיקרוסקופ לאורך הציר האנכי: סגרו את הקשתית כלפי מטה כך שכמות מינימלית של אור תיראה דרך פיסת העין32.
  5. תוך כדי התבוננות דרך העינית, פתחו את הקשתית כדי לראות אם המצולע נוגע בכל הצדדים בו זמנית. התאם את גובה המעבה אם לא ניתן לראות צורת מצולע לפני פתיחת הקשתית.
  6. אם צורת המצולע אינה נוגעת בכל הצדדים בו-זמנית, התאם את מיקום יישור הצמצם באמצעות ידיות הכוונון.
    הערה: ראה Sanderson et al.33 להגדרת מיקרוסקופ מעמיקה.
  7. מקם שקופית מיקרוסקופ עם מכסה ומרווח דבק דו-צדדי המכיל דגימת שמן (למשל, שמן זית, מכיוון שיש הרבה קשרי CH2- בתוך שמנים) על מחזיק הבמה של המיקרוסקופ.
  8. בחלון הגדרות הרכישה של תוכנת MC, מצא את התפריט הנפתח של המיקרוסקופ והגדר את מטרת המיקרוסקופ לפי 20.
  9. ודא כי מסנן הזיהוי של CARS (645 ננומטר / 50 ננומטר) נמצא בעמדה לדמיין ולמדוד את אות ה- epiCARS לאורך צינור הפוטומולטיפלייר של יציאת הצד של המיקרוסקופ.
    הערה: מסנן ספציפי זה נבחר להדמיית שומנים כאות ANTI-Stokes CARS שנוצר ב-652 ננומטר עבור אורך גל משאבה של 803 ננומטר ואורך גל של סטוקס של 1,040 ננומטר (ראו Eq. (1)).
    Equation 1 (1)
    כאשר למשתני λ יש יחידות של nm; משאבת λ היא אורך הגל של קרן המשאבה; ו-λסטוקס הוא אורך הגל של קרן סטוקס.
  10. חפש דרך העינית כדי למצוא את קצה דגימת השמן, אשר ישמש כדי לאמת את היישור של המערכת.
  11. ודא שהקצה נמצא בפוקוס Z באמצעות ידיות המיקוד במיקרוסקופ והתאם את בקר הבמה כדי להשיג מיקוד XY.
  12. לאחר שהלייזר התחמם, הגדר את קרן המשאבה ל-803 ננומטר כאשר המנגינה העדינה של המנוע נקבעה ל-50.0 בממשק המשתמש הגרפי של הלייזר. המנגינה העדינה המדויקת של המנוע שבה נעשה שימוש עשויה להיות שונה מההגדרה להגדרה.
    הערה: קרן המשאבה היא הקרן היחידה עם אורך גל מתכוונן בלייזר זה מכיוון שאורך הגל של קרן סטוקס קבוע על 1,040 ננומטר. תצורה זו מכוונת לרטט CH ב- 2850 cm-1 (ראה Eq. (2) כדי לחשב את אורך הגל של המשאבה עבור מיקוד מספר גל).
    Equation 2 (2)
    כאשר Equation 3 יש יחידות של מספר גל יחסי (cm−1), ולמשתנים λ יש יחידות בס"מ.
  13. בדוק את יישור הלייזר למיקרוסקופ לפני ההדמיה; ראו איור 2 לתיאור נתיב הלייזר. במהלך ההתקנה הראשונית של המיקרוסקופ, התקינו שני אירוסים בנתיב הקרן כמנחי יישור נכון למיקרוסקופ. מכיוון שהנתיב האופטי של הלייזר יכול להיסחף עם הזמן, ודא שמסלולי קרן הלייזר חוצים את מרכז הקשתיות כך שהם נכנסים כראוי למיקרוסקופ.
  14. באמצעות מציג ה-IR, סגרו את כל הקשתיות לחלוטין וודאו שהקרן מרוכזת בשניהם: תחילה בקשתית הקרובה ביותר ללייזר ולבסוף ביציאת הכניסה למיקרוסקופ.
  15. ראשית, בדוק את קרן המשאבה כדי לוודא שהקרן נכנסת ישר למיקרוסקופ. לאחר שהמשאבה מיושרת, בדקו כי גם קרן סטוקס נכנסת למיקרוסקופ בצורה נכונה.
    1. אם הקורות אינן מיושרות דרך הקשתיות, הובילו את הקורות דרך הקשתיות באמצעות ידיות הכוונון x ו-y של שני תושבות המראה עבור המשאבה ונתיבי האלומה של סטוקס.
  16. לאחר שכתמי הקרן חופפים לפני הכניסה למיקרוסקופ, בדקו שהם חוצים את המיקרוסקופ בצורה נכונה.
    1. בחלון בקרת רכישת התמונה של תוכנת MC, לחץ על ערוץ TD לשידור, ALG1 (ערוץ אנלוגי 1) עבור ערוץ ראמאן הקוהרנטי נגד סטוקס, ו- ALG2 (ערוץ אנלוגי 2) עבור ערוץ פיזור Raman המגורה. השתמש בהגדרות הבאות (כמו בפרוטוקול זה): רווח של 1 והיסט של -1 עבור ALG1, רווח של 1.25 והיסט של -2 עבור ALG2.
      הערה: בהתאם לתצורת המערכת, לערוצים אנלוגיים עשוי להיות מספור שונה עבור ערוצי הדמיה בודדים. אם גלאי ה-SRS נמצא במקומו, לא יהיה אות שידור מכיוון ששום אור לא יכול לעבור (כלומר, לא ניתן לדמיין תמונות עם TD ו-ALG2 בו-זמנית בהגדרה זו).

Figure 2
איור 2: פריסה סכמטית לנתיב הדמיית לייזר ראמן קוהרנטי. אלומות מותנות באופן עצמאי לגודל נקודה ומותאמות באמצעות שלב השהיית זמן כדי ליצור פיזור ראמאן קוהרנטי בדגימות עבור תדר הכוונון הרצוי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

  1. הפעילו את מד ההספק, ובאמצעות חיישן כוח תרמי בהספק גבוה, מודדים את עוצמת המשאבה וקורות סטוקס בנפרד לצורך הניסוי.
    הערה: בדוגמה ספציפית זו, הספק קרן המשאבה היה 80 mW, בעוד שהספק הקרן של סטוקס היה 180 mW לפני הכניסה למיקרוסקופ.
  2. בחלון בקרת רכישת תמונה , לחץ על לחצן פוקוס x2 כדי להציג את התמונה בתוכנת MC.
  3. בחלון הגדרות הרכישה , ודא שיחס הפיקסלים וזמן השהייה מוגדרים לפרמטרים הרצויים לניסוי.
    הערה: בפרוטוקול זה נעשה שימוש ביחס של 1,024 x 1,024 פיקסלים ובזמן השהייה של 2 מיקרו-μs/pixel.
  4. אשר את יישור הלייזר ביחס למיקרוסקופ על ידי הסרת החסימה של קרן המשאבה והתבוננות בתעלת ה- TD .
    הערה: הלייזר מיושר כראוי אם הקרן נראית ממורכזת בתמונה עם הגדרות הגלאי הנכונות.
  5. אחרת, השתמש בידיות כוונון X ו- Y על הפריסקופ כדי למקם מחדש את הקרן במרכז התמונה.
  6. אשר את יישור הלייזר והמיקרוסקופ על-ידי ראיית אותה תמונה גם בערוצי CARS וגם בערוץ SRS.
  7. כדי להשיג את תמונת היישור, לחץ על לחצן סריקת XY בחלון בקרת רכישת תמונה עם ערכת מצב הסינון המתאימה (לדוגמה, שורת קלמן 3).
  8. שמור קבוצה זו של תמונות עם שם קובץ תיאורי להשוואה לאורך זמן ולאשר את ביצועי המערכת/ יישור.

3. הדמיית שומנים

  1. אוזן עכבר ורקמות אנושיות
    1. אם אתם משתמשים ברקמות טריות, דלגו על שלב 3.1.2.
    2. הסר את עור אוזן העכבר מהמקפיא בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס והניח אותו בתא דגירה (32 מעלות צלזיוס) למשך 10 דקות. הסר את אוזן העכבר מתא הדגירה.
      הערה: ראה שלב 1.1.2. להכנת עור אוזן העכבר. טיפול גס או גירוד של הרקמה עלולים לגרום לפירוק מכני, הרס או הפרעה של הרקמה, במיוחד של שכבת הקרנית.
    3. אם אתם משתמשים באוזן עכבר עירומה, הניחו את החלק הקדמי של האוזן הפונה לכיוון תחתית הזכוכית של צלחת 35 מ"מ, מס' 0. אם אתם משתמשים בעור האדם, הניחו אותו עם שכבת הקרנית עם הפנים כלפי מטה, שכן הדבר יאפשר כימות תרופות מהשכבות השטחיות לשכבות העמוקות יותר (איור 1).
      הערה: החלק האחורי של אוזן העכבר העירום נוטה יותר לפגמים מהשיכון. אם העור האנושי לא ממוקם עם צד הקרנית של השכבה הפונה כלפי מטה במיקרוסקופ ההפוך, לא ניתן יהיה לראות מעבר לדרמיס מכיוון שיש כמות נכבדה של אור מפוזרת, ולא ניתן לראות את התרופה המחלחלת לתוך שכבת הקרנית.
    4. לאחר שהרקמה התרכזה בתחתית הזכוכית, השתמשו באפליקטור בעל קצה כותנה כדי לוודא שהעור שטוח ויש לו מגע מלא עם משטח הכיסוי של המנה התחתונה מזכוכית.
      הערה: זהו שלב שיכול לגרום לקושי בעת הדמיית העור אם הוא אינו שטוח לחלוטין.
    5. הניחו מכונת כביסה על גבי העור כדי למנוע כל תנועה בזמן ההדמיה. ודא שהרקמה נראית דרך החור המרכזי של מכונת הכביסה לצורך זיהוי שידור SRS.
    6. הסר את תוספת שלב השקופיות והחלף אותה בתא הדגירה, הכולל את תוספת המנה הבודדת.
    7. מניחים את התבשיל התחתון מזכוכית עם רקמת העור בצלחת הבודדת של תא הדגירה.
      הערה: לחלופין, השתמש בצלחת של 6 בארות כדי לדמות מספר דוגמאות עור ופורמולות בו-זמנית.
    8. הקטן את יחס הפיקסלים בחלון הגדרות הרכישה של תוכנת MC (לדוגמה, מ- 1,024 x 1,024 x 1,024 ל- 512 x 512) לקבלת מהירות סריקה מהירה יותר של galvo בזמן שעומק ה- Z משתנה כדי למצוא את שכבת הקרנית (ראה איור 3A עבור עכבר או איור 3E עבור בני אדם).
    9. לאחר שנמצאה שכבת הקרנית, רשום את המיקום הצירי כמיקום האפס בחלון הגדרות הרכישה ושנה את יחס הפיקסלים עבור כל ניסוי ספציפי (לדוגמה, 1,024 x 1,024).

Figure 3
איור 3: עומקי עור לדוגמה המתקבלים באמצעות SRS. קבוצת התמונות העליונה היא מעור אוזן עכבר עירום המתאר את הדברים הבאים: (A) שכבת קרנית, (B) בלוטות החלב, (C) אדיפוציטים, (D) שומן תת עורי. הקבוצה התחתונה של התמונות מתקבלת מעור האדם המתארת את הדברים הבאים: (E) שכבת קרנית, (F) דרמיס פפילרי, ו-(G) בלוטת חלב. סרגלי קנה מידה = 100 מיקרומטר. גם תמונות של עכבר וגם של עור אדם נרכשו באמצעות מטרה של פי 20 ב-1024 פיקסלים x 1024 פיקסלים; ה- SG האנושי צולם ברזולוציה של 512 x 512 פיקסלים. קיצורים: SRS = פיזור ראמאן מגורה; SG = בלוטת החלב. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

4. יישום ניסוח אקטואלי

  1. פיפטה את מינון הפורמולה שנקבע מראש על העור (למשל, 10 μL/cm2).
    הערה: צמיגות הפורמולציה תשחק תפקיד בבחירת הפיפטה. מומלץ להשתמש בפיפטה תזוזה חיובית לפורמולות צמיגות, כגון קרמים או ג'לים, ופיפטה תזוזת אוויר לתמיסות. בניסוי זה, רוקסוליטיניב הייתה תרכובת המודל בתמיסה פשוטה של פרופילן גליקול (פרופאן-1,2-דיול).
  2. באמצעות קצה הבוכנה ממזרק, או אצבע עם כפפות, משפשפים את הפורמולה בתנועה עם כיוון השעון במשך 30 שניות. שים לב לזמן שבו הניסוח מיושם לניתוח cPK מאוחר יותר (ראה שלבים 6.15-6.17 להלן).
    הערה: משך היישום תלוי בניסוי; כל אחד מהם עשוי להיות שונה.
  3. לאחר שחלף הזמן המוקצב לפורמולה לחלחל, הסירו את הפורמולה העודפת והניחו את העור כשצד הפורמולה פונה לכיוון המנה התחתונה של הזכוכית.
    הערה: הניסוח מוסר באמצעות מגב משימה עדין או סקוגי מודפס תלת-ממדי קטן (כ-1 אינץ') בכיוון אחד (למשל, מצפון לדרום).

5. מערך ניסיוני לכימות תרופות

  1. הגדר את קרן המשאבה ל- 803 ננומטר. בדוק את המשאבה ואת כוחות הקרן של סטוקס עם הפוטודיודה כדי לוודא שהם הכוחות הרצויים לניסוי. בטל את החסימה של כל קרן בנפרד כדי למדוד את ההספק ולחסום מחדש את הקורות.
    הערה: בדוגמה ספציפית זו, הספק קרן המשאבה היה 100 mW, בעוד כוח הקרן של סטוקס היה 180 mW.
  2. מניחים את התבשיל התחתון מזכוכית בתא דגירה עם תוספת לתבשיל אחד עם תחתית. אבטחו את המנה עם קליפסים כדי למנוע תנועה במהלך ההדמיה.
  3. הפעל את מנורת השידור בתוכנת MC. במבט דרך העינית, התאימו את המיקוד הצירי בידית ההתאמה כדי לוודא שהרקמה נמצאת בפוקוס.
  4. בטל את החסימה גם את המשאבה וגם את קורות סטוקס. ודא שערוצי ALG1 ו- ALG2 מופעלים ולאחר מכן לחץ על Focus x2 בתוכנת MC כדי להמחיש את העור בערוצי CARS ו- SRS. ודא שהפוטודיודה של SRS נמצאת במיקום מעל המעבה.
  5. בתפריט הנפתח התקן, לחץ על חלוף זמן מרובה אזורים (MATL). חפשו אזהרת שלב XY שתופיע; כאשר הבמה נעה כדי למצוא את המקור המכני שלה, לחץ על אישור.
  6. במודול MATL , עבור אל תצוגה ולאחר מכן לחץ על רשימת נקודות רשומות בתוך תוכנת MC. התחילו להוסיף 1) עומקים ספציפיים בתוך העור (כלומר, שכבת קרנית, SGs, אדיפוציטים, שומן תת עורי כפי שנקבע במהלך הדמיה חיה עם ניגודיות מכוונת שומנים) או 2) מיקומי XY אם יש ליטול ערימות עומק שלמות. ראו איור 3 לדוגמאות.
    1. לאחר זיהוי שכבת הקרנית, גלול דרך המיקוד הצירי (או z-focus) כדי לזהות ריבודי רקמות ספציפיים שהוזכרו לעיל. ראו איור 3 לדוגמאות בתוך עור האדם והעכבר.
    2. במקרה של הדמיה של עומקים ספציפיים לעומת ערימות מלאות של עומק Z, עבור כל ריבוד עור, לחץ על Register Point כדי להוסיף אותו לתור ה-MATL. לערימות בעומק מלא, לחץ על נקודת רישום עבור כל מיקום XY עם בחירת עומק בחלון הפרמטרים של הרכישה .
    3. לאחר שכל מיקומי XY (ערימות עומק Z מלאות) או XYZ (ריבודי עור ספציפיים) הרצויים נרשמו בתוך תוכנת MATL, שנה את ספריית הקבצים ואת השם באופן שיהיה עקבי לאורך כל הניסויים לניתוחי תמונה ו- cPK (ראה שלבים 6.15- 6.17).
  7. הגדר את מספר החזרות ל - 1 במודול MATL ולחץ על מוכן. המתן עד ש-Play ישתנה מחץ אפור לחץ שחור, מה שמצביע על כך שהתוכנה מוכנה. לחץ על Play כדי להתחיל לדמיין את ערימת השומנים הראשונית (להלן תמונות ליפידים).
    הערה: זה ישמש להפרדת אזורים עשירים בשומנים ועניים בשומנים של ריבוד רקמות בודדות במהלך הניתוח. המחזור והזמן הכולל מסומנים בפינה השמאלית התחתונה של רשימת הנקודות הרשומות.
  8. לאחר שהמחזור הושלם, חסמו גם את המשאבה וגם את קורות סטוקס. שנה את אורך הגל בממשק המשתמש הגרפי של הלייזר לאורך הגל הרצוי בהתבסס על מספר הגל הממוקד או רטט ראמאן.
    הערה: לדוגמה, 843 ננומטר עבור אלומת המשאבה משמש כדי לכוון 2,250 cm-1 באמצעות Eq. (2), והכוונון העדין של המנוע משתנה ל- 50.1. התרופה לדוגמה שהוצגה כאן, רוקסוליטיניב, מכילה ניטריל שניתן לכוון אליו ב-2,250 ס"מ-1. מספר הגל המיועד למבנה העור יהיה תמיד זהה (2,850 ס"מ-1); עם זאת, מספר הגלים עבור API יכול להיות כל מספר גלים, אך חייב להיות ידוע או מחושב מראש.
  9. התאם את שלב השהיית הזמן הידני (איור 2) כדי להבטיח חפיפה בזמן עבור אורך הגל החדש וכוח קרן המשאבה. ודא שאותם כוחות משמשים הן להדמיית שומנים והן להדמיית API, אשר הוקמו מראש.
  10. השתמש במשך הזמן לכל מחזור כדי לחשב את המספר הכולל של החזרות הנדרשות לכל ניסוי. כל שעליך לעשות הוא לחלק את סך הזמן הרצוי של מהלך הניסוי בזה של משך המחזור.
    הערה: משך המחזור הוא פונקציה של גודל התמונה, זמן השהייה של הפיקסלים, ממוצע קלמן ומספר התמונות בכל מחזור. אופטימיזציה של פרמטרים אלה תקצר את זמן המחזור, ובכך תגדיל את הרזולוציה הזמנית.
  11. לאחר בחירת המספר הכולל של מחזור חוזר, בטל את נעילת קרן המשאבה, בדוק את ההספק באמצעות הפוטודיודה וודא שהוא תואם את זה של ההספק הרצוי. לבסוף, בטל את החסימה של קרן סטוקס כדי לאפשר הדמיה.
  12. לחץ על הפעל כדי להתחיל בהדמיה אוטומטית של נקודות ההגדרה.
  13. לאחר השלמת הדמיית MATL, החלף את קרן המשאבה בחזרה ל- 803 ננומטר והתאם את הכוח בחזרה לעוצמת הדמיית השומנים המקורית ששימשה בשלב 5.1.
  14. כמו בשלבים קודמים, שנה את שם הקובץ כך שיהיה עקבי עבור תמונות לאחר הניסוי לאורך כל המחקר.
  15. הגדר את מספר החזרות ל - 1.
  16. לחץ על מוכן | הפעילו כפתור כדי לרכוש ערימת שומנים לאחר מהלך הזמן ולוודא שלא הייתה תנועת רקמה במהלך ההדמיה (איור 4).

Figure 4
איור 4: תנועת רקמות בעור אוזן עכבר עירום הודגמה על ידי הדמיה של בלוטות החלב. דוגמה לתנועת רקמה מוגבלת מתוארת ב-A וב-B, בעוד שתנועת רקמה משמעותית מתוארת ב-C וב-D. (A) מראה את בלוטות החלב בזמן יישום הפורמולציה ו-(B) את אותו עומק ב-120 דקות לאחר היישום. (C) בלוטות החלב של העכבר בזמן יישום הפורמולציה ו-(ד) 120 דקות לאחר יישום הפורמולציה; בלוטות החלב בקושי נראות לעין, וזו אינדיקציה לכך שניסוי זה לא מדד את הקליטה לבלוטות החלב במשך כל משך הניסוי. סרגלי קנה מידה = 100 מיקרומטר. התמונות הן 1024 פיקסלים x 1024 פיקסלים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

6. ניתוח נתונים

  1. לרכוש תמונות כ - . OIB (או . OIR בהתאם למיקרוסקופ ותוכנת MC) סוגי קבצים כאשר לכל מיקום XYZ יש תיקיית משנה נפרדת.
  2. הידור תמונות שומנים עם תמונות ערוץ API על ידי שינוי שם של תמונות שומנים עם הסיום הבא _lipid.oib.
  3. בצע את השלבים הבאים עם כל ריבוד עור (המודגם כאן באמצעות ריבוד SG בלבד למען הפשטות; ראו איור 3B).
    1. ייבא תמונת ליפיד SG לתוך ImageJ (או פיג'י)34 וסמן את התיבה שכותרתה ערוצים מפוצלים כדי לפצל את הקובץ לערוצי CARS ו- SRS.
      הערה: פיג'י תפצל את הקובץ למספר התמונות שנרכשו במהלך הניסוי במספר הערוצים.
    2. פתח את מנהל אזור העניין (ROI) על-ידי לחיצה על נתח | כלים | מנהל החזר ההשקעה.
    3. באמצעות ערוץ SRS (לדוגמה, C = 1), תוחם SG בתמונה.
      הערה: SGs הם המיקומים הבהירים עקב רטט ממוקד -CH2.
    4. הוסף זאת למנהל ההחזר על ההשקעה על-ידי לחיצה על הוסף [t] במנהל ההחזר על ההשקעה או לחיצה על t במקלדת. חזור על תהליך זה עבור כל SG בתוך התמונה.
    5. כדי להסוות אזורים עשירים בשומנים, בחר כל ROI ולחץ על הכרטיסיה עוד | OR (שילוב) | הוסף למנהל ההחזר על ההשקעה.
    6. כדי להסוות אזורים עניים בשומנים, השתמשו בכלי המלבן בתפריט FIJI וציירו ריבוע סביב התמונה כולה. הוסף זאת למנהל ההחזר על ההשקעה.
    7. לחץ על החזר ההשקעה המרובע החדש שנוסף בנוסף להחזר ההשקעה שבוחר את כל האזורים העשירים בשומנים במנהל ההחזר על ההשקעה. תחת עוד, בחר XOR כדי ליצור מסכה של האזורים העניים בשומנים והוסף אותה למנהל ההחזר על ההשקעה.
  4. טען את תמונות ה- API לתוך פיג'י.
  5. שרשור את התמונות בסדר מספרי (כלומר, Image0001, Image0002, Image0003 וכו') באמצעות רצף התפריטים הבא: תמונה | ערימות | כלים | שרשור.
    1. לחלופין, יבא תמונות אלה על-ידי טעינת אחת התמונות לתוך פיג'י ולאחר מכן בחירה באפשרות הנקראת קבצי קבוצה עם שמות דומים בדף ההתקנה .
      הערה: פעולה זו מספקת את היכולת לייבא את כל התמונות עם שם קובץ דומה ושרשור אותן באופן אוטומטי.
  6. בזמן שהתמונה המשורשרת פעילה, עבור אל מנהל ההחזר על ההשקעה, בחר את האזורים העשירים בשומנים (כלומר, ה- SG), לחץ על עוד ובחר רב-מדידה. המתן עד שחלון התוצאות יופיע.
  7. חפש אזור, ממוצע, דקה, מקסימום וחציון בהגדרות המדידה המוגדרות כברירת מחדל. אם מדדים אחרים רצויים לניתוח, הפעל אפשרויות אלה על-ידי סימון תיבת הסימון הרלוונטית בחלון הגדרת מדידות (נתח | הגדר מדידות...).
  8. ייצא את הנתונים מחלון התוצאות לגיליון אלקטרוני והוסף עמודה שכותרתה אזור.
  9. הוסיפו את השומנים העשירים בשומנים לכל שורת נתונים עבור האזורים העשירים בשומנים. הוסיפו את השומנים העניים לאזורים שהיו מחוץ לשומנים.
  10. הוסף שכבה עם כותרת עמודה והוסף את השכבה המתאימה שנותחה (טבלה משלימה S1).
  11. חזור על שלבים 6.5 - 6.7 עבור האזורים העניים בשומנים בזמן שנבחר החזר ההשקעה המתאים.
  12. כדי לדמיין את הנתונים, שמור את הגיליון האלקטרוני ויבא אותם ל- JupyterLab (חבילת matplotlib)35 או ב- R (חבילה ggplot2)36. התאם את הנתונים כפונקציה של מספר התמונה לעומת העוצמה הממוצעת כדי להעריך את נתוני זמן הריכוז. (איור 5).
  13. ייבא את הגיליון האלקטרוני ל- RStudio כדי לבצע ניתוח לא-תחרותי (NCA) עבור הניתוח הפרמקוקינטי של נתוני CRI.
  14. הוסף עמודה שכותרתה שעה.
  15. עבור Image0001, חשב את משך הזמן בין יישום הניסוח לתמונה הראשונה.
    הערה: זוהי נקודת הזמן הראשונה. משך המחזור משמש לחישוב התמונות הנותרות (ולכן נקודות הזמן) הגדלות עם הזמן. לדוגמה, אם הזמן מאז היישום הוא 30 דקות, Image0001 תהיה נקודת זמן של 30 דקות ועם משך מחזור של 8 דקות, Image0002 תהיה נקודת זמן של 38 דקות, Image0003 תהיה נקודת זמן של 46 דקות וכן הלאה.
  16. הפעל את NCA ב- RStudio (באמצעות חבילת NonCompart)37 על נתוני זמן העוצמה המיובאים מהגיליון האלקטרוני, עם הקריאה הבאה לשכבה/אזור אחד:
    sNCA(x = זמן, y = ממוצע, מינון = 1, timeUnit = "s", מינוןUnit = "mg")
    כאשר x מתייחס לנקודות זמן, y מתייחס לעוצמה, וניתן להשאיר את המינון כאחד, מחושב כמינון ה- mM של התרופה בפורמולציה או במינון המוצר.
    הערה: פלט ה- NCA יספק פרמטרים כגון Cmax ו- AUCall. עם זאת, מכיוון שמדובר בעור ex vivo , פרמטרים אלה הם, למעשה, Jmax ו- AUCflux-all.
  17. השווה באופן חזותי את המדדים Jmax ו-AUC flux-all על-ידי התווייתם (איור 6) בנוסף להשוואות סטטיסטיות בין תנאי ניסוי. ראו איור 6 כדוגמה לניתוח של מחקרי EX vivo CRI.
    הערה: המבחנים הסטטיסטיים המתאימים מותנים בכל מערך נתונים ספציפי. חשוב גם לציין שכל הפרמטרים הפרמקוקינטיים מתפלגים בדרך כלל, וכל ההשוואות חייבות להשתמש בנתונים המומרים ביומן (יומן טבעי או log10).

Figure 5
איור 5: עוצמה לעומת פרופילי זמן. (A) דוגמה לפרופילי שטף שהגיעו לרוויה ולכן רואים רק ירידה בעוצמתם. לכל החזר השקעה יש פרופיל שטף שונה כדי להדגים את ההטרוגניות בנתונים שאדם עשוי לרכוש. (B) דוגמה לריכוזים שעולים לאחר תחילת ההדמיה. כל ROI הוא שדה ראייה שונה (המסומן על ידי עקבות הצבעים השונים) בתוך אותה רקמה של אותו ניסוי. בנוסף לריכוזים הגלובליים, קיימת היכולת להבהיר איזו סביבה מקומית API/פורמולציה מעדיפה כפי שמצוין על ידי אזורים עשירים בשומנים ועניים בשומנים. הפרופילים המוצגים ב-A מצביעים על כך שאין ספיגה של תרופה לתוך הרקמה מכיוון שה-API כבר חלחל והחל לעזוב את הרקמה לאחר תחילת ההדמיה. עם זאת, ב - B, הרקמה לא הגיעה לרוויה, ועדיין יש קליטה של ה- API ואחריה חיסול. סגמנטציה של תמונות לעשירים בשומנים ולעניים בשומנים תסייע בהבהרת הלוקליזציה של ה-API (או הלא פעילים) ומסלולי החדירה לעור (כלומר, שכבת הקרנית). ריכוז גבוה יותר באזורים העשירים בשומנים מצביע על כך שה-API מתמקם בתוך מבנה השומנים של השכבה הנחקרת, מה שמסייע במידע ממוקד על אספקת תרופות. קיצורים: ROI = אזור עניין; API = מרכיב תרופתי פעיל. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הדמיה נחשבת למוצלחת אם הרקמה לא נעה באופן משמעותי בכיוון צירי (<10 מיקרומטר) או לרוחב עם השלמת הניסוי (איור 4). זוהי אינדיקציה מיידית אם מדידת ה- SRS עבור ה- API של העניין אינה מייצגת את העומק הראשוני, שעבורו הכימות הוא ספציפי לשכבה. זה מתמתן על ידי הדמיית z-stacks עבור כל מיקום XY של עניין, כאשר הפשרה היא הרזולוציה הזמנית. אם נעשה שימוש בעור קפוא במחקרים אלה, החדירה והחדירה של ה-API מהירות בהשוואה לעור טרי, וזמן מינימלי בין יישום הפורמולציה לתחילת ההדמיה הוא הכרחי. שיקול נוסף הוא המטרה המשמשת לניסויים. אם משתמשים במטרה של 60x, בחירת משטח שטוח בתוך שדה ראייה יחיד (FOV) היא קלה יחסית; עם זאת, עבור מטרה של פי 20, השדה הנצפה גדול בהרבה, ולכן, שלב מפתח בהכנת הרקמה הוא הבטחת מגע אחיד של העור עם צלחת ההדמיה של תחתית הזכוכית. FOV שטוח ועומק דומה בהשוואה לעומק המקורי בתוך ה- FOV הם שני מפתחות לתוצאות חיוביות.

יש להתייחס ליישור הלייזר, בנוסף לטווח הדינמי של התמונה, בזהירות מרבית. חוסר התאמה של רכבות פולס הלייזר לתוך המיקרוסקופ יכול להוביל לשורה של בעיות, כולל רמות אות נמוכות או FOVs נרגשים באופן לא אחיד, מה שעלול להוליד תמונות עם ניגודיות נמוכה. שיקול נוסף הוא להבטיח שכל הטווח הדינמי של ערכי העוצמה ינוצל בעת רכישת תמונות; אחרת, נתוני ההדמיה נדחסים, והבדלי ריכוז עשויים להיות קשים לזיהוי.

שיקול נוסף הוא שהטרוגניות העור עשויה לגרום לשונות בפרופילי השטף המחושבים בקנה מידה זעיר בתוך אותו מערך נתונים. העוצמות (פרוקסי לריכוזים) מתחילות גבוהות ויורדות במהלך משך הניסוי (איור 5A), בעוד שמחקרים אחרים מצביעים על עלייה ואחריה ירידה בשטף במהלך משך הניסוי (איור 5B). נכון לעכשיו, כימות ריכוז מוחלט לא יכול להתרחש באופן מיידי בשל ההתקנה הניסויית. לפיכך, ריכוזים שיורדים לאחר היישום הם אולי תוצאה של רוויה בעומק העניין, והכימות מייצג רק את חיסול ה- API. אם הטווח הדינמי אינו גדול מספיק או שהעור עבה מדי, בדיקה חזותית תהפוך את הריכוזים להיראות קפואים כך שלא יתרחש שינוי לאורך משך ההדמיה. זוהי פונקציה הן של טווח דינמי לא אופטימלי והן של עובי העור, מה שירמז על צורך לחזור על הניסוי.

פרופילי זמן הריכוז כפופים לאחר מכן ל-NCA של כל פרופיל כדי להעריך את החשיפה, השטף המרבי והזמן לשטף המרבי. ניתוח סטטיסטי (איור 6) נערך על פני תנאי ניסוי כדי לחקור עוד יותר את הקווריאטים התורמים להבדלים פוטנציאליים בחשיפות. השוואות של הפרמטרים הגלובליים של cPK יספקו תובנה לגבי איזה ניסוח מספק שטף גבוה יותר או חשיפה גדולה יותר. לעומת זאת, הפרמטרים של cPK בקנה מידה זעיר (כלומר, האזורים העשירים בשומנים ועניים בשומנים) יספקו תובנה לגבי מסלולי הביו-חלוקה והחדירה המקומיים. לדוגמה, כאשר משווים בין שתי פורמולציות עם אותו ריכוז API ושונות ברכיבים הלא פעילים, נוסחה אחת עשויה לנטות לחלחל דרך שכבת הקרנית דרך האזור העשיר בשומנים לעומת זה של האזור העני בשומנים. תצפית זו מצביעה על כך שפורמולציה ספציפית זו "תדחוף" את החדירה לעבר האזורים העשירים בשומנים כדי להקל על החדירה והחדירה.

Figure 6
איור 6: ניתוח NCA לדוגמה של פרופיל זמן ריכוז מרקמת אוזן העכבר. (A) דוגמה לניתוח tmax (זמן שבו מתרחש ריכוז מרבי) בין שני ניסוחים עבור אותו API. ניתוח זה מצביע על כך שאתנול 2-(2-אתוקסיאתוקסי) מספק חדירת API מורחבת בהשוואה לזו של נוסחת הג'ל, ללא קשר לשכבת העור. ניתן גם לראות כי ה-tmax עבור שכבת ה-SC ארוך יותר מה-SG, מה שמרמז על כך שפורמולציית האתנול 2-(2-אתוקסיאתוקסי) ממשיכה לספק API גם כאשר משך ההדמיה הסתיים. (B) דוגמה לניתוח חשיפה כולל בין אותו שילוב של פורמולציה/API ב-A אך בעומקים נוספים לתוך העור. נתון זה שונהמ-18. קיצורים: SC = שכבת קרנית; SG = בלוטת החלב; AD = אדיפוציט; SCF = שומן תת עורי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

טבלה משלימה S1: ערכת נתונים לדוגמה שנרכשה מניתוח תמונה ידני. העמודות מציינות את המידע שנרכש מהמקטע Data Analysis של כתב יד זה (כלומר, מסגרת, אזור, ממוצע, דקה, מקסימום, חציון), בעוד שעמודות נוספות נוספו לשימוש בניתוח cPK (כלומר, שכבה, אזור, time_minutes). ניתן לנתח נתונים אלה באמצעות NCA ולהתוות אותם כדי להמחיש את פרופיל הריכוז בשכבת העור SG. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ההערכה של BA/BE אקטואלי היא תחום מחקר הדורש גישה רבת פנים מכיוון שאף שיטה אחת לא יכולה לאפיין באופן מלא את in vivo cPK. פרוטוקול זה מציג מתודולוגיה להערכת BA/BE של מוצר תרופתי מקומי המבוסס על הדמיית ראמאן קוהרנטית. אחת הנקודות הראשונות שניתן להתעלם מהן היא עד כמה דקות דגימות העור חייבות להיות, במיוחד עבור הדמיית SRS של העברה כמותית. אם העור עבה מדי (כלומר, אור לא יכול לעבור בקלות), יש מעט מאוד אות שנמדד על ידי גלאי SRS, ולכן הוא יספק נתוני ריכוז ירודים. יש להקפיד על הכנת דגימות רקמות אלה כראוי, שכן זה יכול לעשות או לשבור ניסוי. מבחינת אוזן העכבר העירומה, מלבד שטיפה עם PBS וטפיחה יבשה כדי להסיר כל שאריות לכלוך על האוזן, נדרשת הכנה מועטה.

אוזני עכבר הן בדרך כלל בעובי של כמה מאות מיקרומטר, וזה אופטימלי להעברת SRS. דגימות עור אנושיות הן בדרך כלל בעובי של כמה מ"מ, כולל שומן תת עורי, אם כי העובי משתנה מאוד בהתאם למקור האנטומי של רקמת העור ולגיל התורם. לפיכך, יש להסיר כמה שיותר רקמות עודפות כדי לכמת במדויק את מבני השומנים ואת ריכוזי ה-API באפידרמיס ובדרמיס לאורך זמן. אם מתעלמים משלב הכנת הרקמה, אז השלבים הנותרים של המערך הניסיוני יהיו במידה רבה לא מתאימים מכיוון שתנאי ההתחלה אינם אופטימליים.

מערך הלייזר/מיקרוסקופ הוא האתגר הבא או אבן נגף פוטנציאלית. חוסר התאמה של הלייזר בנתיב הקרן ובסופו של דבר לתוך המיקרוסקופ גורם לניגודיות ירודה, ולכן לתוצאות הדמיה גרועות. מומלץ להגדיר תחילה את ערוץ CARS, מכיוון שהאות שלו קל יותר למצוא. יש לחפוף את רכבות הדופק של המשאבה וסטוקס גם בזמן וגם במרחב. היישור של לייזר המשאבה נבדק באמצעות גלאי השידור בתוך תוכנת המיקרוסקופ MC כאשר גלאי ה- SRS מתהפך מהדרך. בעת צפייה בערוץ CARS (ALG1) בתוכנת MC, קרן סטוקס חסומה. עם זאת, אם אין אות מדגימת השמן, יש צורך תחילה ליישר את קרן סטוקס ולאחר מכן להתאים את חפיפת הזמן. ייתכן שיהיה צורך לחזור על שתי ההתאמות הללו עד שהאות מותאם. החפיפה המרחבית של שתי הקורות נצפית דרך צופה IR על הקשתיות, בעוד ששלב השהיית הזמן (איור 2) מותאם כך שהקורות יחופפו בזמן. שני שלבי יישור אלה הם קריטיים כדי להבטיח יצירת אותות של CARS.

ברגע שאות ניכר בערוץ CARS, ערוץ SRS (ALG2) הוא הבא שיש להגדיר. בעיות פוטנציאליות להיעדר אות הן שהגדרות שלב הנעילה או הרווח נמוכות מדי, או שההיסט מוגדר גבוה מדי בתוך תוכנת הנעילה. בנוסף, ניתן לכוונן את מיקום המעבה כדי למקד את האור המועבר על הפוטודיודה ובכך לייעל את אות ה- SRS. התקנה לא נכונה של הלייזר/מיקרוסקופ תוביל להיעדר אות, ובכך תפחית את הערכות הריכוז והיעדר מידע על חדירה. כוח הלייזר של המשאבה וקרני סטוקס עשוי להיות מותאם למחקרים בודדים. עם זאת, זה קריטי כי הכוחות של הקורות זהים עבור כל ניסוי. כוחות לייזר שונים בין שכפולים יתנו הבדלים שגויים בריכוז, אשר יהיו תוצאה של ההתקנה ולא מה- API / הניסוח.

כל מחקר ידרוש זמן משך מינון ייחודי (כלומר, משך הזמן שבו הפורמולציה נשארת על העור) ויש לחקור אותו באופן עצמאי כדי לכמת חדירה/ חלחול של API עורי מכיוון שמדובר בניסוח תלוי בפורמולציה. שיקול נוסף בעת פיתוח פרוטוקול הוא האופי הסתום של יישום הניסוח. חשוב לדעת אם הפורמולציה תוכננה להינתן בתנאים חוסמים או לא בלעדיים. מתודולוגיית CRI המוצגת כאן משתמשת במיקרוסקופ הפוך; משמעות הדבר היא כי פני העור הם עם הפנים כלפי מטה ותחת הגדרות חסימה. מיקרוסקופ זקוף עשוי לספק את ההזדמנות למצבים לא בלעדיים; עם זאת, ייתכן שמשטח העור לא יהיה שטוח, מה שיהפוך ניסויים מסוג זה למאתגרים.

יש להכיר בכך שהאופי החותם של ניסויים אלה אינו השימוש הקליני הטיפוסי; עם זאת, מסלולי חלחול מנותחים בתוך מחקרים אלה. שיטת CRI המוצגת כאן מספקת את היכולת לדמיין ולכמת שינויים בקנה מידה זעיר שאחרת לא ניתן להבחין בהם באמצעות מתודולוגיות כגון מיקרודיאליזה עורית, מיקרופרפוזיה של זרימה פתוחה עורית, הפשטת סרט או מחקרי IVPT. ההתפתחויות האחרונות של כוונון מהיר של מספרי גלים סללו את הדרך לכימות בו-זמני של מבנה העור וקשרי רטט מרובים מחוץ לאזור השקט. עם זאת, שיטות חישוביות נוספות לניתוח התרומה של אנליטים ספציפיים מזה של העור עדיין נמצאות בפיתוח28. זה רלוונטי במיוחד גם למחקרי in vivo CRI, אם כי הכוחות המשמשים על הספסל במערך זה (כ-50 mW במוקד) עשויים שלא להיות מותרים לשימוש קליני. הפוטנציאל של מתודולוגיה זו להיות מתורגם מספסל מעבדה למרפאה יכול לאפשר לחוקרים לכמת את חדירת התרופה in vivo , כמו גם ex vivo באותה סביבה כדי לפתח יחסי in vitro-in vivo שהם חיוניים להתקדמות בפיתוח תרופות מקומיות.

כמות הנתונים העצומה הנרכשת מריצה ניסיונית אחת יכולה להיות בין 10 תמונות לכל אתר ל-70 תמונות בכל אתר. אם יש מספר אתרים לכל פיסת רקמה, זה מוביל לג 'יגה בייטים של מידע. התמונות עצמן מספקות נתוני זמן ריכוז גלובליים והן מכמתות כפי שהן, ללא עיבוד מקדים. עם זאת, זה לא ממקסם את התועלת של CRI מכיוון שניתן לחלץ נתוני חלוקה ביולוגית מקומיים בנוסף לנתוני מסלול חדירה. פילוח התמונה גוזל זמן רב אך מספק מידע מפורט שאינו אפשרי עם מתודולוגיות אחרות. לדוגמה, ניתן להעריך את מסלול החדירה המועדף דרך שכבת הקרנית (עשירה בשומנים או דלים בשומנים), מה שיכול לספק תובנה אילו מרכיבים לא פעילים עשויים לתרום למסלול מסוים או אם הוא תלוי בסמים. ניתוח של ניסוי אחד עשוי להימשך מספר שעות עד ימים, בהתאם למספר התמונות ולמשך הניסוי. לפיכך, גישה אוטומטית תסייע בניתוח נתונים ותספק ביאור עקבי של אזורים עשירים בשומנים ועניים בשומנים על פני ריבוד העור18.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

CLE הוא ממציא על פטנטים למיקרוסקופיה של CARS שקיבלו רישיון ליצרני מיקרוסקופים מרובים. לכל המחברים האחרים אין ניגודי עניינים לחשוף.

Acknowledgments

המחברים מבקשים להודות לד"ר פוטיס איליופולוס ולדניאל גרינפילד מקבוצת אוונס על הדיון וההגהה של כתב יד זה. בנוסף, המחברים רוצים להודות על התמיכה של LEO Pharma. איור 2 נוצר עם BioRender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tissue Preparation
Autoclavable Biohazard Bags FisherBrand 22-044562 As refered to in text: biohazard bags
https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-polyethylene-biohazard-autoclave-bags-without-sterilization-indicator-8/22044562?searchHijack=true&searchTerm= 22044562&searchType=RAPID& matchedCatNo=22044562
Cell Culture Buffers: Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution 1x Corning MT21030CV As refered to in text: PBS
https://www.fishersci.com/shop/products/corning-cellgro-cell-culture-buffers-dulbecco-s-phosphate-buffered-salt-solution-1x-8/MT21030CV?searchHijack=true&searchTerm= 21-030-cv&searchType= RAPID&matchedCatNo=21-030-cv
Disposable Scalpels Exel International 14-840-00 As refered to in text: scalpel
https://www.fishersci.com/shop/products/exel-international-disposable-scalpels-3/1484000?keyword=true
High Precision 45° Angle Broad Point Tweezers/Forceps Fisherbrand 12-000-132 As refered to in text: forceps
https://www.fishersci.com/shop/products/high-precision-45-angle-broad-point-tweezers-forceps/12000132#?keyword=
Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-Ply Kimberly-Clark Professional Kimtech Science 06-666 As refered to in text: task wiper
https://www.fishersci.com/shop/products/kimberly-clark-kimtech-science-kimwipes-delicate-task-wipers-7/06666
Parafilm M Laboratory Wrapping Film Bemis 13-374-12 As refered to in text: parafilm
https://www.fishersci.com/shop/products/curwood-parafilm-m-laboratory-wrapping-film-4/1337412
Petri Dish (35 mm x 10 mm) Fisherbrand FB0875711YZ As refered to in text: small petri dish
https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-specialty-6/FB0875711YZ?keyword=true
Petri Dish (60 mm x 15 mm) Fisherbrand FB0875713A As refered to in text: large petri dish
https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/FB0875713A?keyword=true
Surgical Scissors Roboz NC9411473 As refered to in text: scissors
https://www.fishersci.com/shop/products/scissors-327/NC9411473?searchHijack=true&searchTerm= RS-5915SC&searchType=RAPID& matchedCatNo=RS-5915SC
Laser/microscope
650/60 nm BrightLine single-band bandpass filter Semrock As refered to in text: CARS filter - CH2 vibrations (645nm/60nm filter)
Control box IX2-UCB Olympus As refered to in text: Control Box
D700/30m Chroma As refered to in text: CARS filter - deuterated band
https://www.chroma.com/products/parts/d700-30m
DeepSee Insight Spectra-Physics As refered to in text: Laser
https://www.spectra-physics.com/f/insight-x3-tunable-laser
Digital Handheld Optical Power and Energy Meter Console ThorLabs PM100D As refered to in text: power meter
https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=3341
Fluoview Software Olympus As refered to in text: Microscope Control software
Frosted Microscope Slides FisherBrand As refered to in text: microscope slides
https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-frosted-microscope-slides-4/22265446
FV1000 Olympus As refered to in text: Microscope
Incubation Chamber Tokai Hit GM-800 As refered to in text: incubation chamber
Integrating Sphere Photodiode Power Sensor ThorLabs S142C As refered to in text: photodiode
https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=3341
Power supply FV31-PSU Olympus As refered to in text: Power Supply
Precision 4063, 80MHz Dual Channel Function Generator BK Precision As refered to in text: function generator
ProScan – Precision Microscope Automation Prior Scientific Instruments As refered to in text: stage controller
https://www.prior.com/microscope-automation/inverted-microscope-systems/proscan-linear-stage-highest-precision-microscope-automation
SecureSeal Imaging Spacers Grace Biolabs 654004 As refered to in text: spacer
https://gracebio.com/product/secureseal-imaging-spacers-654004/
SRS Detection Kit APE As refered to in text: SRS detector
UPLSAPO 20X NA:0.75 Olympus As refered to in text: 20X Objective
https://www.olympus-lifescience.com/en/objectives/uplsapo/
Lipid/Drug Imaging
 35 mm Dish, No. 0 Uncoated Coverslip, 14 mm Glass Diameter MatTek Corporation NC9711297 As refered to in text: Glass bottom dish
https://www.fishersci.com/shop/products/glass-bottom-mircrowell-dish/nc9711297
Cotton-tipped applicators FisherBrand As refered to in text: Cotton-tipped applicator
Distriman Postive Displacement Pipette Gilson As refered to in text: Postive Displacement Pipette
https://www.fishersci.com/shop/products/gilson-distriman-positive-displacement-repetitive-pipette/F164001G#?keyword=
Distriman Postive Displacement Pipette Tips Gilson As refered to in text: Tips for pipette
https://www.fishersci.com/shop/products/gilson-distritip-syringes-6/f164100g?keyword=true
Data Analysis
FIJI Open-source As refered to in text: FIJI/ImageJ
https://imagej.net/software/fiji/
Jupyter-Lab open-source As refered to in text: JupyterLab
https://jupyter.org/
Rstudio Open-source As refered to in text: Rstudio
https://www.rstudio.com/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Finnin, B., Walters, K. A., Franz, T. J. In vitro skin permeation methodology. In Transdermal and topical drug delivery: principles and methodology. Transdermal and topical drug delivery: principles and practice. Benson, H. E., Watkinson, A. C. , John Wiley & Sons. Hoboken NJ USA. 85-108 (2012).
  2. Shin, S. H., et al. On the road to development of an in vitro permeation test (IVPT) model to compare heat effects on transdermal delivery systems: exploratory studies with nicotine and fentanyl. Pharmaceutical Research. 34 (9), 1817-1830 (2017).
  3. Hossain, A., et al. Preparation, characterisation, and topical delivery of terbinafine. Pharmaceutics. 11 (10), 548 (2019).
  4. Santos, L. L., Swofford, N. J., Santiago, B. G. In vitro permeation test (IVPT) for pharmacokinetic assessment of topical dermatological formulations. Current Protocols in Pharmacology. 91 (1), 79 (2020).
  5. Iliopoulos, F., Caspers, P. J., Puppels, G. J., Lane, M. E. Franz cell diffusion testing andquantitative confocal Raman spectroscopy: In vitro-in vivo correlation. Pharmaceutics. 12 (9), 887 (2020).
  6. Cordery, S., et al. Topical bioavailability of diclofenac from locally-acting, dermatological formulations. International Journal of Pharmaceutics. 529 (1-2), 55-64 (2017).
  7. Pensado, A., et al. Stratum corneum sampling to assess bioequivalence between topicalacyclovir products. Pharmaceutical Research. 36 (12), 1-16 (2019).
  8. Zhang, Y., et al. Dermal delivery of niacinamide-in vivo studies. Pharmaceutics. 13 (5), 726 (2021).
  9. Bodenlenz, M., et al. Open flow microperfusion as a dermal pharmacokinetic approach to evaluate topical bioequivalence. Clinical Pharmacokinetics. 56 (1), 91-98 (2017).
  10. Eirefelt, S., et al. Evaluating dermal pharmacokinetics and pharmacodymanic effect of soft topical PDE4 inhibitors:Open flow microperfusion and skin biopsies. Pharmaceutical Research. 37 (12), 1-12 (2020).
  11. Stagni, G., O'Donnell, D., Liu, Y. J., Kellogg, J. D. L., Shepherd, A. M. Iontophoretic current and intradermal microdialysis recovery in humans. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 41 (1), 49-54 (1999).
  12. Garcia Ortiz, P., Hansen, S. H., Shah, V. P., Menne, T., Benfeldt, E. Impact of adultatopic dermatitis on topical drug penetration: assessment by cutaneous microdialysis and tape stripping. Acta Dermato-Venereologica. 89 (1), 33-38 (2009).
  13. Joshi, A., Patel, H., Joshi, A., Stagni, G. Pharmacokinetic applications of cutaneous microdialysis: Continuous+intermittent vs continuous-only sampling. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 83, 16-20 (2017).
  14. Kuzma, B. A., et al. Evaluation of local bioavailability of metronidazole from topical formulations using dermal microdialysis: Preliminary study in a Yucatan mini-pig model. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 159, 105741 (2021).
  15. Begley, R., Harvey, A., Byer, R. L.Coherent anti-Stokes Raman spectroscopy. Applied Physics Letters. 25 (7), 387-390 (1974).
  16. Evans, C. L., et al. Chemical imaging of tissue in vivo with video-rate coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (46), 16807-16812 (2005).
  17. Hill, A. H., Manifold, B., Fu, D. Tissue imaging depth limit of stimulated Raman scattering microscopy. Biomedical Optics Express. 11 (2), 762-774 (2020).
  18. Feizpour, A., Marstrand, T., Bastholm, L., Eirefelt, S., Evans, C. L. Label-free quantification of pharmacokinetics in skin with stimulated Raman scattering microscopy and deep learning. Journal of Investigative Dermatology. 141 (2), 395-403 (2021).
  19. Ghosh, B., Reddy, L. H., Kulkarni, R. V., Khanam, J. Comparison of skin permeability of drugs in mice and human cadaver skin. Indian Journal of Experimental Biology. 38 (1), 42-45 (2000).
  20. Nielsen, J. B., Plasencia, I., Sørensen, J. A., Bagatolli, L. Storage conditions of skin affect tissue structure and subsequent in vitro percutaneous penetration. Skin Pharmacology and Physiology. 24 (2), 93-102 (2011).
  21. Barbero, A. M., Frasch, H. F. Effect of frozen human epidermis storage duration and cryoprotectant on barrier function using two model compounds. Skin Pharmacology and Physiology. 29 (1), 31-40 (2016).
  22. Babu, R., et al. The influence of various methods of cold storage of skin on the permeation of melatonin and nimesulide. Journal of Controlled Release. 86 (1), 49-57 (2003).
  23. Skelly, J. P., et al. FDA and AAPS report of the workshop on principles and practices of in vitro percutaneous penetration studies: relevance to bioavailability and bioequivalence. Pharmaceutical Research. 4 (3), 265-267 (1987).
  24. OECD. Guidance document for the conduct of skin absorption studies. OECD. , (2004).
  25. OECD. Test no. 428: Skin absorption: In vitro method. OECD. , (2004).
  26. Saar, B. G., et al. Video-rate molecular imaging in vivo with stimulated Raman scattering. Science. 330 (6009), 1368-1370 (2010).
  27. Saar, B. G., Contreras-Rojas, L. R., Xie, X. S., Guy, R. H. Imaging drug delivery to skin with stimulated Raman scattering microscopy. Molecular Pharmaceutics. 8 (3), 969-975 (2011).
  28. Pence, I. J., Kuzma, B. A., Brinkmann, M., Hellwig, T., Evans, C. L. Multi-windowsparse spectral sampling stimulated Raman scattering microscopy. Biomedical Optics Express. 12 (10), 6095-6114 (2021).
  29. Herkenne, C., et al. In vivo methods for the assessment of topical drug bioavailability. Pharmaceutical Research. 25 (1), 87-103 (2008).
  30. Alfonso-Garcıa, A., Mittal, R., Lee, E. S., Potma, E. O. Biological imaging with coherent Raman scattering microscopy: a tutorial. Journal of Biomedical Optics. 19 (7), 071407 (2014).
  31. Osseiran, S., et al. Longitudinal monitoring of cancer cell subpopulations in monolayers, 3D spheroids, and xenografts using the photoconvertible dye DiR. Scientific Reports. 9 (1), 1-10 (2019).
  32. Evennett, P. Kohler illumination: a simple interpretation. Proceedings of the Royal Microscopical Society. 28 (4), 189-192 (1983).
  33. Sanderson, J. Fundamentals of microscopy. Current Protocols in Mouse Biology. 10 (2), 76 (2020).
  34. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  35. Hunter, J. D. Matplotlib: A 2D graphics environment. Computing in Science & Engineering. 9 (3), 90-95 (2007).
  36. Wickham, H. ggplot2: Elegant Graphics for Data Analysis. , Springer-Verlag. New York. (2016).
  37. Kim, H., Han, S., Cho, Y. S., Yoon, S. K., Bae, K. Development of R packages:'Non-Compart' and 'ncar' for noncompartmental analysis (NCA). Translational and Clinical Pharmacology. 26 (1), 10-15 (2018).

Tags

רפואה גיליון 177 פיזור ראמאן קוהרנטי פיזור קוהרנטי נגד סטוקס ראמאן פיזור ראמאן מגורה עורי פרמקוקינטיקה זמינות ביולוגית שקילות ביולוגית
הדמיה וכימות של תרכובות פרמצבטיות בתוך העור באמצעות הדמיית פיזור ראמן קוהרנטית
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kuzma, B. A., Pence, I. J., Ho, A.,… More

Kuzma, B. A., Pence, I. J., Ho, A., Evans, C. L. Visualizing and Quantifying Pharmaceutical Compounds within Skin using Coherent Raman Scattering Imaging. J. Vis. Exp. (177), e63264, doi:10.3791/63264 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter