Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Visualisering och kvantifiering av farmaceutiska föreningar i huden med hjälp av koherent Raman Scattering Imaging

Published: November 24, 2021 doi: 10.3791/63264
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Wellman Center for Photomedicine, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School

Summary

En sammanhängande Raman-spridningsmetodik för att visualisera och kvantifiera farmaceutiska föreningar i huden beskrivs. Detta dokument beskriver hudvävnadsberedning (människa och mus) och topisk formuleringsapplikation, bildförvärv för att kvantifiera spatiotemporala koncentrationsprofiler och preliminär farmakokinetisk analys för att bedöma topisk läkemedelsleverans.

Abstract

Kutan farmakokinetik (cPK) efter topikal formuleringsapplikation har varit ett forskningsområde av särskilt intresse för regulatoriska och läkemedelsutvecklingsforskare att mekaniskt förstå topikal biotillgänglighet (BA). Semi-invasiva tekniker, såsom bandstrippning, dermal mikrodialys eller dermal mikroperfusion med öppet flöde, kvantifierar alla cPK i makroskala. Medan dessa tekniker har gett stor cPK-kunskap, saknar samhället en mekanistisk förståelse för aktiv farmaceutisk ingrediens (API) penetration och permeation på cellulär nivå.

Ett icke-invasivt tillvägagångssätt för att ta itu med mikroskala cPK är koherent Raman scattering imaging (CRI), som selektivt riktar sig mot inneboende molekylära vibrationer utan behov av yttre etiketter eller kemisk modifiering. CRI har två huvudmetoder - koherent anti-Stokes Raman-spridning (CARS) och stimulerad Raman-spridning (SRS) - som möjliggör känslig och selektiv kvantifiering av API: er eller inaktiva ingredienser. CARS används vanligtvis för att härleda strukturell hudinformation eller visualisera kemisk kontrast. Däremot används SRS-signalen, som är linjär med molekylär koncentration, för att kvantifiera API: er eller inaktiva ingredienser inom hudstratifieringar.

Även om musvävnad ofta har använts för cPK med CRI, måste topikal BA och bioequivalens (BE) i slutändan bedömas i mänsklig vävnad innan myndighetsgodkännande. Detta dokument presenterar en metod för att förbereda och avbilda ex vivo-hud som ska användas i kvantitativa farmakokinetiska CRI-studier vid utvärdering av topikal BA och BE. Denna metod möjliggör tillförlitlig och reproducerbar API-kvantifiering inom människas och mushud över tid. Koncentrationerna inom lipidrika och lipidfattiga fack samt total API-koncentration över tid kvantifieras; dessa används för uppskattningar av mikro- och makroskala BA och, potentiellt, BE.

Introduction

Metoderna för att bedöma cPK efter topikal läkemedelsprodukttillämpning har utvidgats från klassiska IVPT-studier (in vitro permeation testing) 1,2,3,4,5 och bandstrippning 6,7,8 till ytterligare metoder såsom mikroperfusion med öppet flöde eller dermal mikrodialys 9,10,11. 12,13,14. Det finns potentiellt olika lokala platser för terapeutisk verkan beroende på sjukdomen av intresse. Därför kan det finnas ett motsvarande antal metoder för att bedöma hur mycket och i vilken utsträckning ett API kommer till den avsedda lokala åtgärdsplatsen. Medan var och en av de ovannämnda metoderna har sina fördelar, är den största nackdelen bristen på mikroskala cPK-information (dvs. oförmågan att visualisera var API: et går och hur det genomsyrar).

En icke-invasiv metod av intresse för att uppskatta topisk BA och BE är CRI, som kan delas upp i två bildmetoder: CARS och SRS-mikroskopi. Dessa koherenta Raman-metoder möjliggör kemiskt specifik avbildning av molekyler via icke-linjära Raman-effekter. I CRI fokuseras och skannas två laserpulståg i ett prov; skillnaden i energi mellan laserfrekvenserna är inställd på att rikta in sig på vibrationslägen som är specifika för de kemiska strukturerna av intresse. Eftersom CRI-processer är olinjära genereras en signal endast vid mikroskopfokuseringen, vilket möjliggör tredimensionell farmakokinetisk tomografisk avbildning av vävnaden. I samband med cPK har CARS använts för att erhålla vävnadsstrukturell information, såsom placeringen av lipidrika hudstrukturer15. Däremot har SRS använts för att kvantifiera molekylär koncentration eftersom dess signal är linjär med koncentration. För ex vivo-hudprover är det fördelaktigt att utföra CARS i epi-riktningen16 och SRS i överföringsläge17. Därför kommer vävnadsprover som är tunna att möjliggöra SRS-signaldetektering och kvantifiering.

Som modellvävnad presenterar det nakna musörat flera fördelar med mindre nackdelar. En fördel är att vävnaden redan är ~ 200-300 μm i tjocklek och inte kräver ytterligare provberedning. Dessutom ses flera hudstratifieringar genom att axiellt fokusera genom ett synfält (t.ex. stratum corneum, talgkörtlar (SG), adipocyter och subkutant fett)16,18. Detta möjliggör preliminär preklinisk uppskattning av kutana permeationsvägar och aktuella BA-uppskattningar innan de flyttas till mänskliga hudprover. Nakenmusmodellen presenterar dock begränsningar som svårigheter att extrapolera till in vivo-scenarier på grund av skillnader i hudstruktur19. Medan det nakna musörat är en utmärkt modell för att få preliminära resultat, är den mänskliga hudmodellen guldstandarden. Även om det har förekommit olika kommentarer om lämpligheten och tillämpligheten av frusen mänsklig hud för att exakt rekapitulera in vivo permeationskinetik 20,21,22, är användningen av frusen mänsklig hud en accepterad metod för utvärdering av in vitro API-permeationskinetik 23,24,25 . Detta protokoll visualiserar olika hudlager i mus och mänsklig hud samtidigt som API-koncentrationer inom lipidrika och lipidfattiga strukturer kvantifieras.

Medan CRI har använts inom många områden för att specifikt visualisera föreningar i vävnader, har det varit begränsade ansträngningar att undersöka cPK för topiskt applicerade läkemedelsprodukter. För att utvärdera den aktuella BA / BE för aktuella produkter med CRI är det nödvändigt att först ha ett standardiserat protokoll på plats för att göra exakta jämförelser. Tidigare försök att använda CRI för läkemedelsleverans till huden har visat variation i data. Eftersom detta är en relativt ny tillämpning av CRI är det viktigt att upprätta ett protokoll för att få tillförlitliga resultat 18,26,27. Detta tillvägagångssätt riktar sig endast till ett specifikt vågtal i den biologiska tysta regionen i Raman-spektrumet. De flesta API: er och inaktiva ingredienser har dock Raman-skift inom fingeravtrycksregionen. Detta har tidigare inneburit utmaningar på grund av den inneboende signalen som härrör från vävnaden i fingeravtrycksområdet. De senaste laser- och beräkningsframstegen har tagit bort denna barriär, som också kan användas i kombination med det tillvägagångssätt som presenteras här28. Detta tillvägagångssätt som presenteras här möjliggör kvantifiering av ett API, som har ett Raman-skift i den tysta regionen (2 000-2 300 cm-1). Detta är inte begränsat till läkemedlets fysiokemiska egenskaper, vilket kan vara fallet för vissa tidigare nämnda cPK-övervakningsmetoder29.

Protokollet måste minska variationen i hudtjocklek från prov till prov för olika preparat, eftersom tjocka mänskliga hudprover kommer att ge minimal signal efter applicering av läkemedelsprodukten på grund av ljusspridning av det tjocka provet. Ett mål med detta manuskript är att presentera en vävnadsberedningsmetodik som säkerställer reproducerbara bildstandarder. Dessutom är CRI-systemet inställt enligt beskrivningen för att minska potentiella felkällor samt minimera signal-till-brus. Detta dokument kommer dock inte att diskutera de vägledande principerna och tekniska fördelarna med CRI-mikroskopet eftersom detta tidigare har behandlats30. Slutligen undersöks det omfattande dataanalysförfarandet för att möjliggöra tolkning av resultaten för att bestämma ett experiments framgång eller misslyckande.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Användningen av naken mus öronvävnad godkändes av Massachusetts General Hospital Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC), medan användningen av mänsklig hudvävnad godkändes av Massachusetts General Hospital Institutional Review Board (IRB). Enligt IACUC-protokoll erhölls nyligen avlivade möss från samarbetspartners med nakna mösskolonier. Mänsklig vävnad anskaffades från elektiva bukplastikprocedurer vid Massachusetts General Hospital via ett godkänt protokoll. Dessutom förvärvades andra specifika vävnadstyper än bukhud via en kroppsdonationsmyndighet, även genom ett IRB-godkänt protokoll.

1. Beredning av vävnad

  1. Beredning av naken mus öronhudvävnad
    1. Efter att ha förvärvat nyskördade nakna muskroppar, ta bort öronen med pincett och mikrokirurgisk sax. Placera ett öra i en liten petriskål (dvs 35 mm x 10 mm). Placera den nakna muskroppen i en biohazard väska som ska kasseras i enlighet med lokala IACUC-protokoll.
    2. Skölj varje musöra med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och klappa det försiktigt torrt med en uppgiftstorkare. Upprepa två gånger för att ta bort eventuell kvarvarande smuts eller skräp på örat som kan påverka bildkvaliteten (se figur 1).
    3. Om örat ska användas inom 24 timmar, placera det i en liten petriskål (dvs. 35 mm x 10 mm) med färsk PBS i kylskåp (2-8 ° C). Om örat ska användas efter 24 timmars skörd, lägg det i en petriskål (35 mm x 10 mm) utan PBS, täck skålen med parafilm och lägg den i en frys på -20 °C.
  2. Framställning av mänsklig hudvävnad
    1. Efter tillvaravaratagning av mänsklig vävnad, placera den i en stor petriskål (dvs 60 mm x 15 mm) i en biologisk huva för att ge tillräckligt med utrymme för provberedning.
    2. Placera stratum corneumsidan nedåt så att det subkutana fettet är tillgängligt.
    3. Använd pincett och mikrokirurgisk sax och börja försiktigt ta bort det subkutana fettet. När subkutant fett inte längre kan avlägsnas med saxen, byt till en 10-bladig engångsskalpell (eller motsvarande) för att ta bort det återstående subkutana fettet. Använd skalpellen i 45° vinkel mot huden medan du håller huden stilla med tång (se figur 1).
      OBS: För att ha högkvalitativa överförings-SRS-bilder måste proverna vara så tunna som möjligt utan att punkteras.

Figure 1
Figur 1: Bilder av idealisk tjocklek för avbildning av mus och mänsklig hud. (A) Musöronhud hålls upp mot ljus, vilket synligt kan släppa igenom ljus. (B) Idealisk mänsklig hud som hålls upp mot ljuset efter beredningen. Klicka här för att se en större version av denna figur.

  1. Sektionera den mänskliga huden i 1 cm x 1 cm bitar.
    OBS: Färsk hud, kan användas i upp till 24 timmar utan användning av en agaros gelbädd, som beskrivits tidigare31. Frisk hud kan dock användas längre om den hålls på en agaros gelbädd. Om huden ska användas senare placeras huden i en provtransportpåse och placeras sedan i en frys på -20 °C. Fryst hud måste tinas med hjälp av proceduren nedan för optimala resultat (se steg 3.1.2).

2. Inställning av laser och mikroskop

  1. Cirka 30 minuter före avbildningen, slå på den allmänt avstämbara ultrasnabba lasern (nedan kallad lasern) och låt den värmas upp. Aktivera laservarningsskylten/låssystemet för att meddela personal utanför potentiell fara vid inresa.
    OBS: Korrekt glasögon måste alltid bäras när du arbetar med klass IV-lasrar. För den specifika lasern som används här är de rekommenderade korrekta glasögonen OD ≥ 6 för laserns arbetsområde 800-1 300 nm.
  2. Medan lasern värms upp, aktivera den återstående hårdvaran för mikroskopkontroll, CARS-detektering och SRS-detektering.
  3. Rikta in mikroskopet ordentligt för att säkerställa optimal bildbehandling. I fönstret Image Acquisition Control i mikroskopstyrningsprogramvaran (nedan kallad MC-programvara) klickar du på överföringslampan för att tillåta ljus att komma från mikroskopets transilluminationslampa.
  4. Se till att Köhler-belysningen är korrekt för att rikta in mikroskopet längs den vertikala axeln: stäng irisen så att en minimal mängd ljus ses genom ögonstycket32.
  5. När du tittar genom okularet öppnar du irisen för att se om polygonen berör alla sidor samtidigt. Justera kondensorhöjden om en polygonform inte kan ses innan du öppnar irisen.
  6. Om polygonformen inte vidrör alla sidor samtidigt justerar du bländarens justeringsposition med hjälp av justeringsknapparna.
    OBS: Se Sanderson et al.33 för en djupgående mikroskopinställning.
  7. Placera en mikroskopbild med en täckglidning och dubbelsidig självhäftande distans som innehåller ett oljeprov (t.ex. olivolja, eftersom det finns många -CH2-bindningar i oljor) på mikroskopsteghållaren.
  8. I fönstret Förvärvsinställningar i MC-programvaran hittar du rullgardinsmenyn mikroskop och ställer in mikroskopmålet till 20x.
  9. Kontrollera att CARS-detekteringsfiltret (645 nm/50 nm) är i stånd att visualisera och mäta epiCARS-signalen längs mikroskopets sidoportfotomultiplikorrör.
    OBS: Detta specifika filter väljs för avbildning av lipider som anti-Stokes CARS-signalen genererad vid 652 nm för en pumpvåglängd på 803 nm och en Stokes-våglängd på 1 040 nm (se Eq. (1)).
    Equation 1 (1)
    Där λ-variablerna har enheter av nm; λpump är pumpens strålvåglängd; och λStokes är Stokes strålvåglängd.
  10. Titta igenom okularet för att hitta kanten på oljeprovet, som kommer att användas för att verifiera systemets inriktning.
  11. Se till att kanten är i Z-fokus med hjälp av fokusknapparna på mikroskopet och justera scenregulatorn för att få XY-fokus.
  12. När lasern har värmts upp, ställ in pumpstrålen på 803 nm med motorfinjusteringen inställd på 50,0 i laserns grafiska användargränssnitt. Den exakta motorfinjusteringen som används kan skilja sig från inställning till inställning.
    OBS: Pumpstrålen är den enda strålen med en justerbar våglängd på denna laser eftersom Stokes strålvåglängd är fixerad vid 1 040 nm. Denna konfiguration riktar sig mot CH-vibrationen vid 2850 cm-1 (se Eq. (2) för att beräkna pumpens våglängd för vågtalsinriktning).
    Equation 2 (2)
    Där Equation 3 har enheter av relativt vågtal (cm−1) och λ variabler har enheter i cm.
  13. Kontrollera laserns inriktning i mikroskopet före avbildning; se figur 2 för avbildning av laserbanan. Under den första installationen av mikroskopet installerar du två iris i strålbanan som guider för korrekt inriktning i mikroskopet. Eftersom laserns optiska väg kan driva över tiden, se till att laserstrålebanorna korsar irisens centrum så att de korrekt kommer in i mikroskopet.
  14. Använd IR-betraktaren, stäng alla iris helt och se till att strålen är centrerad på båda: först på irisen närmast lasern och slutligen vid mikroskopets ingångsport.
  15. Kontrollera först pumpstrålen för att säkerställa att strålen går rakt in i mikroskopet. När pumpen är inriktad, kontrollera att Stokes-strålen också går in i mikroskopet korrekt.
    1. Om balkarna inte är inriktade genom iriserna, går iterativt strålarna genom iriserna med hjälp av x- och y-justeringsknapparna på de två spegelfästena för pumpen och Stokes strålbanor.
  16. När strålfläckarna överlappar varandra innan de går in i mikroskopet, kontrollera att de passerar mikroskopet korrekt.
    1. I fönstret Image Acquisition Control i MC-programvaran klickar du på TD-kanalen för överföring, ALG1 (analog kanal 1) för den sammanhängande anti-Stokes Raman-kanalen och ALG2 (analog kanal 2) för den stimulerade Raman-spridningskanalen. Använd följande inställningar (som i detta protokoll): förstärkning på 1 och en förskjutning på -1 för ALG1, förstärkning på 1,25 och förskjutning på -2 för ALG2.
      OBS: Beroende på systemkonfiguration kan analoga kanaler ha olika numrering för enskilda bildkanaler. Om SRS-detektorn är på plats kommer det inte att finnas någon överföringssignal eftersom inget ljus kan komma igenom (dvs man kan inte visualisera bilder med TD och ALG2 samtidigt i denna inställning).

Figure 2
Figur 2: Schematisk layout för sammanhängande Raman-laseravbildningsväg. Balkar är oberoende konditionerade för spotstorlek och matchas via tidsfördröjningssteg för att generera sammanhängande Raman-spridning i prover för önskad inställningsfrekvens. Klicka här för att se en större version av denna figur.

  1. Slå på effektmätaren och mät pumpens och Stokes-strålarnas effekt individuellt för experimentet med hjälp av en värmeeffektsensor med hög effekt.
    OBS: I detta specifika exempel var pumpstrålens effekt 80 mW, medan Stokes stråleffekt var 180 mW före ingången till mikroskopet.
  2. I fönstret Image Acquisition Control klickar du på Focus x2-knappen för att visa bilden i MC-programvaran.
  3. I fönstret Förvärvsinställningar kontrollerar du att pixelförhållandet och uppehållstiden är inställda på önskade parametrar för experimentet.
    OBS: Ett förhållande på 1 024 x 1 024 pixlar och en uppehållstid på 2 μs / pixel användes i detta protokoll.
  4. Bekräfta laserinriktningen med avseende på mikroskopet genom att avblockera pumpstrålen och titta på TD-kanalen .
    OBS: Lasern är korrekt inriktad om strålen ses centrerad i bilden med rätt detektorinställningar.
  5. Annars använder du X- och Y-justeringsknapparna på periskopet för att flytta strålen till mitten av bilden.
  6. Bekräfta laser- och mikroskopjustering genom att se samma bild i både CARS- och SRS-kanalerna.
  7. För att hämta justeringsbilden, klicka på XY-skanningsknappen i fönstret Image Acquisition Control med lämplig filterläge inställd (t.ex. Kalman Line 3).
  8. Spara den här uppsättningen bilder med ett beskrivande filnamn för att jämföra över tid och bekräfta systemets prestanda/justering.

3. Lipidavbildning

  1. Musöra och mänsklig vävnad
    1. Om du använder färsk vävnad hoppar du över steg 3.1.2.
    2. Ta bort musöronhuden från frysen -20 °C och placera den i en inkubationskammare (32 °C) i 10 min. Ta bort musörat från inkubationskammaren.
      ANMÄRKNING: Se steg 1.1.2. för förberedelse av musörathud. Grov hantering eller skrapning av vävnaden kan leda till mekanisk nedbrytning, förstörelse eller störning av vävnaden, särskilt stratum corneum.
    3. Om du använder ett nakött, placera den främre delen av örat vänd mot glasbotten på en 35 mm, nr 0 skål. Om du använder mänsklig hud, placera den med stratum corneum med framsidan nedåt eftersom detta möjliggör läkemedelskvantifiering från de ytliga skikten till de djupare skikten (Figur 1).
      OBS: Den bakre delen av det nakna musörat är mer benäget för brister från huset. Om mänsklig hud inte placeras med stratum corneum sida vänd nedåt på det inverterade mikroskopet, kommer man inte att kunna se förbi dermis eftersom det finns en hel del ljus utspridda, och läkemedlet som tränger in i stratum corneum kan inte ses.
    4. När vävnaden har centrerats på glasbotten, använd en bomullsspetsad applikator för att säkerställa att huden är platt och har fullständig kontakt med täckplattans yta på glasbotten.
      OBS: Detta är ett steg som kan orsaka svårigheter vid avbildning av huden om den inte är helt platt.
    5. Placera en bricka ovanpå huden för att förhindra rörelse under avbildning. Se till att vävnaden är synlig genom brickans mitthål för SRS-överföringsdetektering.
    6. Ta bort glidstegsinsatsen och ersätt den med inkubationskammaren, som har den enda skålinsatsen.
    7. Placera glasskålen med hudvävnaden i inkubationskammarens enda skålfäste.
      OBS: Alternativt kan du använda en 6-brunnsplatta för att avbilda flera hudprover och formuleringar samtidigt.
    8. Minska pixelförhållandet i fönstret Förvärvsinställningar i MC-programvaran (t.ex. från 1 024 x 1 024 till 512 x 512) för snabbare galvoskanningshastighet medan Z-djupet ändras för att hitta stratum corneum (se figur 3A för mus eller figur 3E för människa).
    9. När stratum corneum har hittats registrerar du den axiella positionen som nollposition i fönstret Förvärvsinställningar och ändrar pixelförhållandet för varje specifikt experiment (t.ex. 1 024 x 1 024).

Figure 3
Figur 3: Exempel på huddjup erhållna med SRS. Den översta uppsättningen bilder är från naken musöra hud som visar följande: (A) stratum corneum, (B) talgkörtlar, (C) adipocyter, (D) subkutant fett. Den nedre uppsättningen bilder erhålls från mänsklig hud som visar följande: (E) stratum corneum, (F) papillär dermis och (G) en talgkörtel. Skalstänger = 100 μm. Både mus- och mänskliga hudbilder förvärvades med ett 20x mål vid 1024 pixlar x 1024 pixlar; den mänskliga SG togs vid 512 x 512 pixlar. Förkortningar: SRS = stimulerad Raman-spridning; SG = talgkörteln. Klicka här för att se en större version av denna figur.

4. Tillämpning av topikal formulering

  1. Pipettera den förutbestämda formuleringsdosen på huden (t.ex. 10 μL/cm2).
    OBS: Formuleringens viskositet kommer att spela en roll i pipettvalet. Användning av en positiv förskjutningspipett för viskösa formuleringar, såsom krämer eller geler, och en luftförskjutningspipett för lösningar rekommenderas. I detta experiment var ruxolitinib modellföreningen i en enkel lösning av propylenglykol (propan-1,2-diol).
  2. Använd kolvspetsen från en spruta eller ett handskfinger och gnugga formuleringen medurs i en medurs rörelse i 30 s. Notera den tidpunkt då formuleringen tillämpas för senare cPK-analys (se steg 6.15–6.17 nedan).
    OBS: Varaktigheten av ansökan är beroende av experimentet; var och en kan vara annorlunda.
  3. Efter att den tilldelade tiden för formuleringen att genomtränga har gått, ta bort överskottsformuleringen och placera huden med formuleringssidan vänd mot glasskålen.
    OBS: Formuleringen avlägsnas med en känslig uppgiftstorkare eller en liten (~ 1 tum) 3D-tryckt skrapa i en enda riktning (t.ex. från norr till söder).

5. Experimentell inställning för läkemedelskvantifiering

  1. Ställ in pumpstrålen på 803 nm. Kontrollera pumpens och Stokes strålkrafter med fotodioden för att säkerställa att de är de önskade krafterna för experimentet. Avblockera varje stråle individuellt för att mäta effekten och blockera balkarna igen.
    OBS: I detta specifika exempel var pumpstrålens effekt 100 mW, medan Stokes stråleffekt var 180 mW.
  2. Placera glasskålen i en inkubationskammare med en insats för en glasbottenskål. Säkra skålen med klämmor för att förhindra rörelse under avbildning.
  3. Slå på transmissionslampan i MC-programvaran. Titta genom okularet, justera det axiella fokuset med justeringsknappen för att säkerställa att vävnaden är i fokus.
  4. Avblockera både pumpen och Stokes balkar. Se till att ALG1- och ALG2-kanalerna är aktiverade och klicka sedan på Focus x2 på MC-programvaran för att visualisera huden i CARS- och SRS-kanalerna. Se till att SRS-fotodioden är på plats ovanför kondensorn.
  5. Klicka på MULTI Area Time Lapse (MATL) i listrutan Enhet. Leta efter en XY Stage Warning som ska visas; När scenen rör sig för att hitta sitt mekaniska ursprung klickar du på OK.
  6. I MATL-modulen går du till Visa och klickar sedan på Registrerad punktlista i MC-programvaran. Börja lägga till antingen 1) specifika djup i huden (dvs . stratum corneum, SGs, adipocyter, subkutant fett som bestäms under levande avbildning med lipidinställd kontrast) eller 2) XY-positioner om hela djupstaplar ska tas. Se figur 3 för exempel.
    1. När stratum corneum har identifierats, bläddra igenom det axiella fokuset (eller z-fokus) för att identifiera specifika vävnadsstratifieringar som nämns ovan. Se figur 3 för exempel inom människo- och mushud.
    2. Vid avbildning av specifika djup i motsats till fullständiga Z-djupstackar klickar du på Register Point för varje hudstratifiering för att lägga till den i MATL-kön. För fulldjupsstackar klickar du på Registerpunkt för varje XY-position med djupval i fönstret för förvärvsparametrar .
    3. När alla önskade XY-positioner (fullständiga Z-djupstackar) eller XYZ-positioner (specifika hudstratifieringar) har registrerats i MATL-programvaran ändrar du filkatalogen och namnet på ett sätt som kommer att vara konsekvent under experimenten för bild- och cPK-analyser (se steg 6.15-6.17).
  7. Ställ in antalet upprepningar på 1 i MATL-modulen och klicka på Klar. Vänta tills Play ändras från en grå till en svart pil, vilket indikerar att programvaran är klar. Tryck på Play för att börja avbilda den preliminära lipidstacken (nedan kallade Lipid Images).
    OBS: Detta kommer att användas för att separera lipidrika och lipidfattiga regioner av enskilda vävnadsstratifieringar under analysen. Cykeln och den totala tiden anges längst ned till höger i listan över registrerade punkter.
  8. När cykeln är klar, blockera både pumpen och Stokes-balkarna. Ändra våglängden på laserns grafiska användargränssnitt till önskad våglängd baserat på det riktade vågnumret eller Raman-vibrationen.
    OBS: Till exempel används 843 nm för pumpstrålen för att rikta in sig på 2 250 cm-1 med Eq. (2), och motorns finjustering ändras till 50,1. Exempelläkemedlet som presenteras här, ruxolitinib, innehåller en nitril som kan riktas mot 2 250 cm-1. Vågnumret som är riktat mot hudstrukturen kommer alltid att vara detsamma (2 850 cm-1); Vågnumret för ett API kan dock vara vilket vågtal som helst men måste vara känt eller beräknat a priori.
  9. Justera det manuella tidsfördröjningssteget (figur 2) för att säkerställa överlappning i tid för den nya våglängden och pumpstrålens effekt. Se till att samma krafter används för både lipid- och API-avbildning, som fastställs a priori.
  10. Använd varaktigheten per cykel för att beräkna det totala antalet upprepningar som krävs per experiment. Dela helt enkelt experimentets totala önskade tidsförlopp med cykelns varaktighet.
    OBS: Cykellängden är en funktion av bildstorlek, pixeluppehållstid, Kalman-medelvärde och antalet bilder per cykel. Optimering av dessa parametrar kommer att förkorta cykeltiden, vilket ökar den tidsmässiga upplösningen.
  11. När det totala antalet cykelupprepningar har valts, avblockera pumpstrålen, kontrollera effekten med fotodioden och se till att den matchar den önskade effekten. Slutligen, avblockera Stokes-strålen för att möjliggöra avbildning.
  12. Tryck på Play för att påbörja automatisk avbildning av set-points.
  13. När MATL-avbildningen har slutförts växlar du pumpstrålen tillbaka till 803 nm och justerar tillbaka effekten till den ursprungliga lipidavbildningseffekten som användes i steg 5.1.
  14. Precis som i tidigare steg ändrar du filnamnet så att det är konsekvent för bilder efter experiment under hela studien.
  15. Ställ in antalet upprepningar på 1.
  16. Klicka på Klar | Spela-knappen för att skaffa en lipidstack efter tidskursen och se till att det inte har skett någon vävnadsrörelse under avbildningen (Figur 4).

Figure 4
Figur 4: Vävnadsrörelse i naken musöronhud demonstrerad genom att visualisera talgkörtlar. Exempel på begränsad vävnadsrörelse avbildas i A och B, medan väsentlig vävnadsrörelse avbildas i C och D. (A) visar talgkörtlarna vid appliceringen av formuleringen och (B) samma djup vid 120 minuter efter applicering. C) Talgkörtlar från mus vid tidpunkten för applicering av formuleringen och (D) 120 minuter efter applicering av formuleringen. talgkörtlarna är knappt synliga, vilket är en indikation på att detta experiment inte mätte upptaget i talgkörtlarna under hela experimenttiden. Skalstänger = 100 μm. Bilderna är 1024 pixlar x 1024 pixlar. Klicka här för att se en större version av denna figur.

6. Dataanalys

  1. Skaffa bilder som . OIB (eller . OIR beroende på mikroskop och MC-programvara) filtyper med varje XYZ-position som har en separat undermapp.
  2. Kompilera lipidbilder med API-kanalbilder genom att byta namn på lipidbilder med följande slut _lipid.oib.
  3. Utför följande steg med varje hudstratifiering (demonstreras här med endast SG-stratifieringen för enkelhetens skull; se figur 3B).
    1. Importera en SG-lipidbild till ImageJ (eller Fiji)34 och markera rutan märkt Split Channels för att dela upp filen i CARS- och SRS-kanalerna.
      OBS: Fiji kommer att dela upp filen i antalet bilder som förvärvats under experimentet över antalet kanaler.
    2. Öppna chefen för intresseområde (ROI) genom att klicka på Analysera | Verktyg | ROI Manager.
    3. Använd SRS-kanalen (t.ex. C = 1) och avgränsa en SG i bilden.
      OBS: SGs är de ljusa platserna på grund av riktad -CH2- vibration.
    4. Lägg till detta i ROI-hanteraren genom att klicka på Lägg till [t] i ROI-hanteraren eller trycka på t på tangentbordet. Upprepa den här processen för varje SG i bilden.
    5. För att maskera lipidrika regioner, välj varje ROI och klicka på fliken Mer | ELLER (Kombinera) | Lägg till i ROI Manager.
    6. För att maskera lipidfattiga regioner, använd rektangelverktyget i FIJI-menyn och rita en fyrkant runt hela bilden. Lägg till detta i ROI-hanteraren.
    7. Klicka på den nyligen tillagda kvadratiska ROI utöver ROI som väljer alla lipidrika regioner i ROI-hanteraren. Under Mer väljer du XOR för att generera en mask av de lipidfattiga regionerna och lägger till den i ROI-hanteraren.
  4. Läs in API-bilderna i Fiji.
  5. Sammanfoga bilderna i numerisk ordning (dvs. Image0001, Image0002, Image0003, etc.) med hjälp av följande menysekvens: Bild | Staplar | Verktyg | Sammanfoga.
    1. Alternativt kan du importera dessa bilder genom att läsa in en av bilderna till Fiji och sedan välja ett alternativ som heter Gruppfiler med liknande namn på installationssidan .
      OBS: Detta ger möjlighet att importera alla bilder med ett liknande filnamn och sammanfoga dem automatiskt.
  6. När du har den sammanfogade bilden aktiv går du till ROI-hanteraren, väljer de lipidrika regionerna (dvs. SG), klickar på Mer och väljer Multi-measure. Vänta tills fönstret Resultat visas.
  7. Leta efter Area, Mean, Min, Max och Median i standardmätningsinställningarna. Om andra mätvärden önskas för analys aktiverar du dessa alternativ genom att markera relevant kryssruta i fönstret Ange mått (Analysera | Ställ in mått...).
  8. Exportera data från fönstret Resultat till ett kalkylblad och lägg till en kolumn med titeln Region.
  9. Lägg till lipidrik till varje rad med data för de lipidrika regionerna. Lägg till lipidfattiga till regioner som låg utanför lipiderna.
  10. Lägg till en kolumn med titeln lager och lägg till respektive lager som analyserades (tilläggstabell S1).
  11. Upprepa steg 6.5 - 6.7 för de lipidfattiga regionerna medan lämplig avkastning väljs.
  12. Om du vill visualisera data sparar du kalkylbladet och importerar dem till antingen JupyterLab (paket matplotlib)35 eller i R (paket ggplot2)36. Rita data som en funktion av bildnumret kontra medelintensiteten för att uppskatta koncentrationstidsdata. (Figur 5).
  13. Importera kalkylbladet till RStudio för att utföra icke-partimentell analys (NCA) för farmakokinetisk analys av CRI-data.
  14. Lägg till en kolumn med titeln tid.
  15. För Image0001 beräknar du varaktigheten mellan formuleringsprogrammet och den första bilden.
    OBS: Detta är den första tidspunkten. Cykelvaraktigheten används för att beräkna de återstående bilderna (och därmed tidpunkterna) som ökar över tiden. Till exempel, om tiden sedan applikationen är 30 min, kommer Image0001 att ha en tidsperiod på 30 min och med en cykeltid på 8 min kommer Image0002 att ha en tidsperiod på 38 min, Image0003 kommer att ha en tidspunkt på 46 min och så vidare.
  16. Kör NCA i RStudio (med NonCompart-paketet)37 på intensitetstidsdata som importerats från kalkylbladet, med följande anrop för ett lager/en region:
    sNCA(x = tid, y = medelvärde, dos = 1, tidUnit = "s", dosUnit = "mg")
    Där x avser tidpunkter avser y intensitet och dos kan lämnas som en, beräknad som mM-dosen av läkemedlet i formuleringen eller produktdosen.
    OBS: NCA-utgången kommer att tillhandahålla parametrar som Cmax och AUCalla. Men eftersom detta är ex vivo-hud är dessa parametrar i själva verket Jmax och AUCflux-all.
  17. Jämför Jmax - ochAUC-flödesmått visuellt genom att plotta dem (figur 6) utöver statistiska jämförelser mellan experimentella förhållanden. Se figur 6 för ett exempel på analys av ex vivo CRI-studier .
    OBS: Lämpliga statistiska tester är beroende av varje specifik datauppsättning. Det är också viktigt att notera att alla farmakokinetiska parametrar är log-normalfördelade, och alla jämförelser måste använda log-transformerade (natural log eller log10) data.

Figure 5
Figur 5: Intensitet kontra tidsprofiler. (A) Ett exempel på flödesprofiler som har nått mättnad och därmed endast en minskning av intensiteten ses. Varje ROI har en annan flödesprofil för att visa heterogeniteten i de data som man kan förvärva. (B) Ett exempel på koncentrationer som ökar efter att avbildning har påbörjats. Varje ROI är ett annat synfält (indikerat av de olika färgspåren) inom samma vävnad i samma experiment. Förutom globala koncentrationer finns det möjlighet att belysa vilken lokal miljö en API / formulering föredrar som indikeras av lipidrika och lipidfattiga regioner. Profilerna som presenteras i A indikerar att det inte finns någon absorption av läkemedel i vävnaden eftersom API: et redan har genomsyrat och börjat lämna vävnaden när avbildningen har påbörjats. I B har vävnaden emellertid inte nått mättnad, och det finns fortfarande absorption av API följt av eliminering. Segmenteringen av bilder i lipidrika och lipidfattiga kommer att hjälpa till att belysa lokaliseringen av API (eller inaktiva) och permeationsvägarna in i huden (dvs. stratum corneum). En högre koncentration inom de lipidrika regionerna indikerar att API: et lokaliseras inom lipidstrukturen hos det undersökta skiktet, vilket hjälper till med riktad läkemedelsleveransinformation. Förkortningar: ROI = region av intresse; API = aktiv farmaceutisk ingrediens. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Avbildning anses vara framgångsrik om vävnaden inte signifikant har rört sig i axiell (<10 μm) eller lateral riktning efter experimentets slutförande (figur 4). Detta är en omedelbar indikation om SRS-mätningen för det API som är av intresse inte är representativ för det ursprungliga djupet, för vilket kvantifieringen är skiktspecifik. Detta mildras genom att avbilda z-stackar för varje XY-position av intresse, med avvägningen som den tidsmässiga upplösningen. Om frusen hud används i dessa studier är penetreringen och permeationen av API snabb jämfört med färsk hud, och minimal tid mellan formuleringsapplikation och början av avbildningen är absolut nödvändig. Ett annat övervägande är det mål som används för experimenten. Om du använder ett 60x-mål är det relativt enkelt att välja en plan yta inom ett enda synfält (FOV). För ett 20x mål är det visade fältet dock mycket större, och därmed är ett viktigt steg i vävnadsberedningen att säkerställa enhetlig kontakt med huden med glasbottens bildskål. En platt FOV och liknande djup jämfört med det ursprungliga djupet i FOV är två nycklar till positiva resultat.

Laserns inriktning, förutom bildens dynamiska omfång, måste åtgärdas med största försiktighet. Feljustering av laserpulstågen i mikroskopet kan leda till en mängd problem, inklusive låga signalnivåer eller ojämnt upphetsade FOV, vilket kan ge upphov till bilder med låg kontrast. Ett annat övervägande är att se till att hela det dynamiska intervallet av intensitetsvärden används vid anskaffning av bilder; Annars komprimeras bilddata och koncentrationsskillnader kan vara svåra att upptäcka.

Ett annat övervägande är att hudheterogenitet kan ge upphov till variation i de beräknade flödesprofilerna i mikroskala inom samma dataset. Intensiteterna (en proxy för koncentrationer) börjar högt och minskar under experimentets varaktighet (figur 5A), medan andra studier indikerar en ökning följt av en minskning av flödet under experimentets varaktighet (figur 5B). För närvarande kan absolut koncentrationskvantifiering inte ske omedelbart på grund av den experimentella inställningen. Således är koncentrationer som minskar efter applicering möjligen resultatet av en mättnad inom djupet av intresset, och kvantifieringen representerar endast API-elimineringen. Om det dynamiska omfånget inte är tillräckligt stort eller huden är för tjock, kommer visuell inspektion att göra koncentrationerna stillastående så att ingen förändring sker under avbildningstiden. Detta är en funktion av både ett suboptimalt dynamiskt omfång och hudtjocklek, vilket kommer att föreslå ett behov av att upprepa experimentet.

Koncentrationstidsprofilerna utsätts sedan för NCA för varje profil för att uppskatta exponeringen, maximalt flöde och tid till maximalt flöde. Statistisk analys (figur 6) utförs över experimentella förhållanden för att ytterligare undersöka kovariater som bidrar till potentiella skillnader i exponeringar. Jämförelser av de globala cPK-parametrarna kommer att ge insikt i vilken formulering som ger ett högre flöde eller större exponering. Däremot kommer mikroskalans cPK-parametrar (dvs . de lipidrika och lipidfattiga regionerna) att ge insikt i de lokala biodistributions- och permeationsvägarna. Till exempel, när man jämför två formuleringar med samma API-koncentration och skiljer sig åt i de inaktiva ingredienserna, kan en formulering tendera att genomtränga genom stratum corneum via den lipidrika regionen jämfört med den lipidfattiga regionen. Denna observation indikerar att denna specifika formulering kommer att "driva" permeationen mot de lipidrika regionerna för lättare penetration och permeation.

Figure 6
Figur 6: Exempel på NCA-analys av koncentrationstidsprofil från musöronvävnad. (A) Ett exempel på tmax-analys (vid vilken maximal koncentration inträffar) mellan två formuleringar för samma API. Denna analys indikerar att 2-(2-etoxietoxi)etanol ger utökad API-permeation jämfört med gelformuleringen, oavsett hudskikt. Det kan också ses att tmax för SC-skiktet är längre än SG, vilket tyder på att 2-(2-etoxietoxi)etanolformuleringen fortsätter att leverera API även när avbildningstiden har avslutats. (B) Ett exempel på total exponeringsanalys mellan samma kombination av formulering/API i A men på djup längre in i huden. Denna siffra ändras från18. Förkortningar: SC = stratum corneum; SG = talgkörteln; AD = adipocyter; SCF = subkutant fett. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Kompletterande tabell S1: Exempel på datauppsättning som hämtats från manuell bildanalys. Kolumnerna anger den information som erhållits från avsnittet Dataanalys i detta manuskript (dvs. ram, area, mean, min, max, median), medan ytterligare kolumner har lagts till för användning i en cPK-analys (dvs. lager, region time_minutes). Dessa data kan analyseras via NCA och plottas för att visualisera koncentrationsprofilen inom SG-hudskiktet. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Utvärderingen av topikal BA / BE är ett forskningsområde som kräver ett mångfacetterat tillvägagångssätt eftersom ingen enskild metod fullt ut kan karakterisera in vivo cPK. Detta protokoll presenterar en metod för utvärdering av en topikal läkemedelsprodukts BA / BE baserat på sammanhängande Raman-avbildning. En av de första punkterna som kan förbises är hur tunna hudproverna måste vara, särskilt för kvantitativ överföring SRS-avbildning. Om huden är för tjock (dvs . ljus kan inte lätt passera igenom) finns det liten eller ingen signal uppmätt av SRS-detektorn, och det kommer därför att ge dåliga koncentrationsdata. Försiktighet måste vidtas för att förbereda dessa vävnadsprover ordentligt, eftersom detta kan göra eller bryta ett experiment. När det gäller det nakna musörat, förutom att skölja med PBS och klappa det torrt för att ta bort eventuell kvarvarande smuts på örat, krävs lite förberedelse.

Musöron har vanligtvis en tjocklek av flera hundra μm, vilket är optimalt för överföring av SRS. Mänskliga hudprover är vanligtvis flera mm tjocka, inklusive subkutant fett, även om tjockleken är mycket varierande beroende på hudvävnadens anatomiska källa och givarens ålder. Således måste så mycket överflödig vävnad avlägsnas som möjligt för att exakt kvantifiera lipidstrukturer och API-koncentrationer i epidermis och dermis över tiden. Om vävnadsberedningssteget förbises, kommer de återstående stegen i den experimentella uppsättningen i stor utsträckning att vara olämpliga eftersom utgångsförhållandena inte är optimala.

Laser/mikroskopinställningen är nästa utmaning eller potentiella stötesten. Felinriktning av lasern i strålbanan och slutligen in i mikroskopet resulterar i dålig kontrast och därför dåliga bildresultat. Det rekommenderas att ställa in CARS-kanalen först, eftersom dess signal är lättare att hitta. Pumpen och Stokes pulståg måste överlappas i både tid och rum. Pumplaserns inriktning kontrolleras med hjälp av transmissionsdetektorn i mikroskopet MC-programvaran när SRS-detektorn vänds ur vägen. När du tittar på CARS-kanalen (ALG1) i MC-programvaran är Stokes-strålen avblockerad. Men om det inte finns någon signal från oljeprovet är det först nödvändigt att justera Stokes-strålen och sedan justera tidsöverlappningen. Det kan vara nödvändigt att iterera dessa två justeringar tills signalen är optimerad. Den rumsliga överlappningen av de två strålarna ses genom en IR-visare på iriserna, medan tidsfördröjningssteget (figur 2) justeras för att strålarna överlappar varandra i tid. Dessa två anpassningssteg är avgörande för att säkerställa CARS-signalgenerering.

När en signal är uppenbar i CARS-kanalen är SRS-kanalen (ALG2) nästa att ställa in. Potentiella problem på grund av brist på signal är att inlåsningsfasen eller förstärkningsinställningarna är för låga, eller att förskjutningen är inställd för högt i inlåsningsprogramvaran. Dessutom kan kondensorns position justeras för att fokusera det överförda ljuset på fotodioden och därmed optimera SRS-signalen. Felaktig inställning av lasern / mikroskopet kommer att leda till brist på signal, vilket minskar koncentrationsuppskattningarna och bristen på permeationsinformation. Laserkraften hos pumpen och Stokes-strålarna kan optimeras för enskilda studier. Det är dock viktigt att strålarnas krafter är desamma för varje experiment. Olika laserkrafter mellan replikat kommer att ge falska skillnader i koncentration, vilket kommer att bero på installationen snarare än API/ formuleringen.

Varje studie kommer att kräva en unik dos-varaktighetstid (dvs . varaktighet som formuleringen lämnas på huden) och måste undersökas oberoende för att kvantifiera kutan API-penetration / permeation eftersom detta är formuleringsberoende. Ett annat övervägande när man utvecklar ett protokoll är den ocklusiva karaktären hos formuleringsapplikationen. Det är viktigt att veta om formuleringen var utformad för att administreras under ocklusiva eller icke-exklusiva förhållanden. CRI-metoden som presenteras här använder ett inverterat mikroskop; detta innebär att hudytan är vänd nedåt och under ocklusiva inställningar. Ett upprätt mikroskop kan ge möjlighet att ha icke-exklusiva förhållanden; Hudytan kan dock inte vara platt, vilket skulle göra dessa typer av experiment utmanande.

Det måste erkännas att dessa experiments ocklusiva karaktär inte är den typiska kliniska användningen; Ändå analyseras permeationsvägar inom dessa studier. CRI-metoden som presenteras här ger möjlighet att visualisera och kvantifiera förändringar i mikroskala som annars inte kan särskiljbara med metoder som dermal mikrodialys, dermal öppen flödesmikroperfusion, bandstrippning eller IVPT-studier. Den senaste utvecklingen av snabb vågtalsinställning har banat väg för samtidig kvantifiering av hudstrukturen och flera vibrationsbindningar utanför den tysta regionen. Ytterligare beräkningsmetoder för att analysera bidraget från specifika analyter från hudens är dock fortfarande under utveckling28. Detta är också av särskild relevans för in vivo CRI-studier, även om de krafter som används på bänkskivan i denna inställning (cirka 50 mW i fokus) kanske inte är tillåtna för klinisk användning. Potentialen i denna metodik att översättas från en laboratoriebänk till kliniken kan göra det möjligt för utredare att kvantifiera läkemedlets permeation in vivo såväl som ex vivo i samma miljö för att utveckla in vitro-in vivo-relationer som är avgörande för framstegen i topikal läkemedelsutveckling.

Den stora mängden data som förvärvas från en experimentell körning kan vara allt från 10 bilder per webbplats till 70 bilder per webbplats. Om det finns flera platser per bit vävnad leder detta till gigabyte information. Bilderna i sig ger globala koncentrationstidsdata och kvantifieras som de är, utan förbehandling. Det maximerar dock inte nyttan av CRI eftersom lokala biodistributionsdata kan extraheras utöver permeationsvägsdata. Bildsegmenteringen är tidskrävande men ger detaljerad information som inte är möjlig med andra metoder. Det är till exempel möjligt att uppskatta den föredragna penetrationsvägen genom stratum corneum (lipidrik eller lipidfattig), vilket kan ge insikt i vilka inaktiva ingredienser som kan bidra till en specifik väg eller om den är läkemedelsberoende. Analys av ett experiment kan ta flera timmar till dagar, beroende på antalet bilder och experimentell varaktighet. Därför kommer ett automatiserat tillvägagångssätt att hjälpa till med dataanalys och ge konsekvent kommentar av lipidrika och lipidfattiga regioner över hudskiktningar18.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

CLE är en uppfinnare av patent för CARS-mikroskopi som har licensierats till flera mikroskoptillverkare. Alla andra författare har inga intressekonflikter att avslöja.

Acknowledgments

Författarna vill tacka Dr. Fotis Iliopoulos och Daniel Greenfield från Evans 'Group för deras diskussion och korrekturläsning av detta manuskript. Dessutom vill författarna erkänna stöd från LEO Pharma. Figur 2 skapades med BioRender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tissue Preparation
Autoclavable Biohazard Bags FisherBrand 22-044562 As refered to in text: biohazard bags
https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-polyethylene-biohazard-autoclave-bags-without-sterilization-indicator-8/22044562?searchHijack=true&searchTerm= 22044562&searchType=RAPID& matchedCatNo=22044562
Cell Culture Buffers: Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution 1x Corning MT21030CV As refered to in text: PBS
https://www.fishersci.com/shop/products/corning-cellgro-cell-culture-buffers-dulbecco-s-phosphate-buffered-salt-solution-1x-8/MT21030CV?searchHijack=true&searchTerm= 21-030-cv&searchType= RAPID&matchedCatNo=21-030-cv
Disposable Scalpels Exel International 14-840-00 As refered to in text: scalpel
https://www.fishersci.com/shop/products/exel-international-disposable-scalpels-3/1484000?keyword=true
High Precision 45° Angle Broad Point Tweezers/Forceps Fisherbrand 12-000-132 As refered to in text: forceps
https://www.fishersci.com/shop/products/high-precision-45-angle-broad-point-tweezers-forceps/12000132#?keyword=
Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-Ply Kimberly-Clark Professional Kimtech Science 06-666 As refered to in text: task wiper
https://www.fishersci.com/shop/products/kimberly-clark-kimtech-science-kimwipes-delicate-task-wipers-7/06666
Parafilm M Laboratory Wrapping Film Bemis 13-374-12 As refered to in text: parafilm
https://www.fishersci.com/shop/products/curwood-parafilm-m-laboratory-wrapping-film-4/1337412
Petri Dish (35 mm x 10 mm) Fisherbrand FB0875711YZ As refered to in text: small petri dish
https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-specialty-6/FB0875711YZ?keyword=true
Petri Dish (60 mm x 15 mm) Fisherbrand FB0875713A As refered to in text: large petri dish
https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/FB0875713A?keyword=true
Surgical Scissors Roboz NC9411473 As refered to in text: scissors
https://www.fishersci.com/shop/products/scissors-327/NC9411473?searchHijack=true&searchTerm= RS-5915SC&searchType=RAPID& matchedCatNo=RS-5915SC
Laser/microscope
650/60 nm BrightLine single-band bandpass filter Semrock As refered to in text: CARS filter - CH2 vibrations (645nm/60nm filter)
Control box IX2-UCB Olympus As refered to in text: Control Box
D700/30m Chroma As refered to in text: CARS filter - deuterated band
https://www.chroma.com/products/parts/d700-30m
DeepSee Insight Spectra-Physics As refered to in text: Laser
https://www.spectra-physics.com/f/insight-x3-tunable-laser
Digital Handheld Optical Power and Energy Meter Console ThorLabs PM100D As refered to in text: power meter
https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=3341
Fluoview Software Olympus As refered to in text: Microscope Control software
Frosted Microscope Slides FisherBrand As refered to in text: microscope slides
https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-frosted-microscope-slides-4/22265446
FV1000 Olympus As refered to in text: Microscope
Incubation Chamber Tokai Hit GM-800 As refered to in text: incubation chamber
Integrating Sphere Photodiode Power Sensor ThorLabs S142C As refered to in text: photodiode
https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=3341
Power supply FV31-PSU Olympus As refered to in text: Power Supply
Precision 4063, 80MHz Dual Channel Function Generator BK Precision As refered to in text: function generator
ProScan – Precision Microscope Automation Prior Scientific Instruments As refered to in text: stage controller
https://www.prior.com/microscope-automation/inverted-microscope-systems/proscan-linear-stage-highest-precision-microscope-automation
SecureSeal Imaging Spacers Grace Biolabs 654004 As refered to in text: spacer
https://gracebio.com/product/secureseal-imaging-spacers-654004/
SRS Detection Kit APE As refered to in text: SRS detector
UPLSAPO 20X NA:0.75 Olympus As refered to in text: 20X Objective
https://www.olympus-lifescience.com/en/objectives/uplsapo/
Lipid/Drug Imaging
 35 mm Dish, No. 0 Uncoated Coverslip, 14 mm Glass Diameter MatTek Corporation NC9711297 As refered to in text: Glass bottom dish
https://www.fishersci.com/shop/products/glass-bottom-mircrowell-dish/nc9711297
Cotton-tipped applicators FisherBrand As refered to in text: Cotton-tipped applicator
Distriman Postive Displacement Pipette Gilson As refered to in text: Postive Displacement Pipette
https://www.fishersci.com/shop/products/gilson-distriman-positive-displacement-repetitive-pipette/F164001G#?keyword=
Distriman Postive Displacement Pipette Tips Gilson As refered to in text: Tips for pipette
https://www.fishersci.com/shop/products/gilson-distritip-syringes-6/f164100g?keyword=true
Data Analysis
FIJI Open-source As refered to in text: FIJI/ImageJ
https://imagej.net/software/fiji/
Jupyter-Lab open-source As refered to in text: JupyterLab
https://jupyter.org/
Rstudio Open-source As refered to in text: Rstudio
https://www.rstudio.com/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Finnin, B., Walters, K. A., Franz, T. J. In vitro skin permeation methodology. In Transdermal and topical drug delivery: principles and methodology. Transdermal and topical drug delivery: principles and practice. Benson, H. E., Watkinson, A. C. , John Wiley & Sons. Hoboken NJ USA. 85-108 (2012).
  2. Shin, S. H., et al. On the road to development of an in vitro permeation test (IVPT) model to compare heat effects on transdermal delivery systems: exploratory studies with nicotine and fentanyl. Pharmaceutical Research. 34 (9), 1817-1830 (2017).
  3. Hossain, A., et al. Preparation, characterisation, and topical delivery of terbinafine. Pharmaceutics. 11 (10), 548 (2019).
  4. Santos, L. L., Swofford, N. J., Santiago, B. G. In vitro permeation test (IVPT) for pharmacokinetic assessment of topical dermatological formulations. Current Protocols in Pharmacology. 91 (1), 79 (2020).
  5. Iliopoulos, F., Caspers, P. J., Puppels, G. J., Lane, M. E. Franz cell diffusion testing andquantitative confocal Raman spectroscopy: In vitro-in vivo correlation. Pharmaceutics. 12 (9), 887 (2020).
  6. Cordery, S., et al. Topical bioavailability of diclofenac from locally-acting, dermatological formulations. International Journal of Pharmaceutics. 529 (1-2), 55-64 (2017).
  7. Pensado, A., et al. Stratum corneum sampling to assess bioequivalence between topicalacyclovir products. Pharmaceutical Research. 36 (12), 1-16 (2019).
  8. Zhang, Y., et al. Dermal delivery of niacinamide-in vivo studies. Pharmaceutics. 13 (5), 726 (2021).
  9. Bodenlenz, M., et al. Open flow microperfusion as a dermal pharmacokinetic approach to evaluate topical bioequivalence. Clinical Pharmacokinetics. 56 (1), 91-98 (2017).
  10. Eirefelt, S., et al. Evaluating dermal pharmacokinetics and pharmacodymanic effect of soft topical PDE4 inhibitors:Open flow microperfusion and skin biopsies. Pharmaceutical Research. 37 (12), 1-12 (2020).
  11. Stagni, G., O'Donnell, D., Liu, Y. J., Kellogg, J. D. L., Shepherd, A. M. Iontophoretic current and intradermal microdialysis recovery in humans. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 41 (1), 49-54 (1999).
  12. Garcia Ortiz, P., Hansen, S. H., Shah, V. P., Menne, T., Benfeldt, E. Impact of adultatopic dermatitis on topical drug penetration: assessment by cutaneous microdialysis and tape stripping. Acta Dermato-Venereologica. 89 (1), 33-38 (2009).
  13. Joshi, A., Patel, H., Joshi, A., Stagni, G. Pharmacokinetic applications of cutaneous microdialysis: Continuous+intermittent vs continuous-only sampling. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 83, 16-20 (2017).
  14. Kuzma, B. A., et al. Evaluation of local bioavailability of metronidazole from topical formulations using dermal microdialysis: Preliminary study in a Yucatan mini-pig model. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 159, 105741 (2021).
  15. Begley, R., Harvey, A., Byer, R. L.Coherent anti-Stokes Raman spectroscopy. Applied Physics Letters. 25 (7), 387-390 (1974).
  16. Evans, C. L., et al. Chemical imaging of tissue in vivo with video-rate coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (46), 16807-16812 (2005).
  17. Hill, A. H., Manifold, B., Fu, D. Tissue imaging depth limit of stimulated Raman scattering microscopy. Biomedical Optics Express. 11 (2), 762-774 (2020).
  18. Feizpour, A., Marstrand, T., Bastholm, L., Eirefelt, S., Evans, C. L. Label-free quantification of pharmacokinetics in skin with stimulated Raman scattering microscopy and deep learning. Journal of Investigative Dermatology. 141 (2), 395-403 (2021).
  19. Ghosh, B., Reddy, L. H., Kulkarni, R. V., Khanam, J. Comparison of skin permeability of drugs in mice and human cadaver skin. Indian Journal of Experimental Biology. 38 (1), 42-45 (2000).
  20. Nielsen, J. B., Plasencia, I., Sørensen, J. A., Bagatolli, L. Storage conditions of skin affect tissue structure and subsequent in vitro percutaneous penetration. Skin Pharmacology and Physiology. 24 (2), 93-102 (2011).
  21. Barbero, A. M., Frasch, H. F. Effect of frozen human epidermis storage duration and cryoprotectant on barrier function using two model compounds. Skin Pharmacology and Physiology. 29 (1), 31-40 (2016).
  22. Babu, R., et al. The influence of various methods of cold storage of skin on the permeation of melatonin and nimesulide. Journal of Controlled Release. 86 (1), 49-57 (2003).
  23. Skelly, J. P., et al. FDA and AAPS report of the workshop on principles and practices of in vitro percutaneous penetration studies: relevance to bioavailability and bioequivalence. Pharmaceutical Research. 4 (3), 265-267 (1987).
  24. OECD. Guidance document for the conduct of skin absorption studies. OECD. , (2004).
  25. OECD. Test no. 428: Skin absorption: In vitro method. OECD. , (2004).
  26. Saar, B. G., et al. Video-rate molecular imaging in vivo with stimulated Raman scattering. Science. 330 (6009), 1368-1370 (2010).
  27. Saar, B. G., Contreras-Rojas, L. R., Xie, X. S., Guy, R. H. Imaging drug delivery to skin with stimulated Raman scattering microscopy. Molecular Pharmaceutics. 8 (3), 969-975 (2011).
  28. Pence, I. J., Kuzma, B. A., Brinkmann, M., Hellwig, T., Evans, C. L. Multi-windowsparse spectral sampling stimulated Raman scattering microscopy. Biomedical Optics Express. 12 (10), 6095-6114 (2021).
  29. Herkenne, C., et al. In vivo methods for the assessment of topical drug bioavailability. Pharmaceutical Research. 25 (1), 87-103 (2008).
  30. Alfonso-Garcıa, A., Mittal, R., Lee, E. S., Potma, E. O. Biological imaging with coherent Raman scattering microscopy: a tutorial. Journal of Biomedical Optics. 19 (7), 071407 (2014).
  31. Osseiran, S., et al. Longitudinal monitoring of cancer cell subpopulations in monolayers, 3D spheroids, and xenografts using the photoconvertible dye DiR. Scientific Reports. 9 (1), 1-10 (2019).
  32. Evennett, P. Kohler illumination: a simple interpretation. Proceedings of the Royal Microscopical Society. 28 (4), 189-192 (1983).
  33. Sanderson, J. Fundamentals of microscopy. Current Protocols in Mouse Biology. 10 (2), 76 (2020).
  34. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  35. Hunter, J. D. Matplotlib: A 2D graphics environment. Computing in Science & Engineering. 9 (3), 90-95 (2007).
  36. Wickham, H. ggplot2: Elegant Graphics for Data Analysis. , Springer-Verlag. New York. (2016).
  37. Kim, H., Han, S., Cho, Y. S., Yoon, S. K., Bae, K. Development of R packages:'Non-Compart' and 'ncar' for noncompartmental analysis (NCA). Translational and Clinical Pharmacology. 26 (1), 10-15 (2018).

Tags

Medicin nummer 177 koherent Raman-spridning koherent anti-Stokes Raman-spridning stimulerad Raman-spridning kutan farmakokinetik biotillgänglighet bioekvivalent
Visualisering och kvantifiering av farmaceutiska föreningar i huden med hjälp av koherent Raman Scattering Imaging
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kuzma, B. A., Pence, I. J., Ho, A.,… More

Kuzma, B. A., Pence, I. J., Ho, A., Evans, C. L. Visualizing and Quantifying Pharmaceutical Compounds within Skin using Coherent Raman Scattering Imaging. J. Vis. Exp. (177), e63264, doi:10.3791/63264 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter