Summary
Cilt içindeki farmasötik bileşikleri görselleştirmek ve ölçmek için tutarlı bir Raman saçılma görüntüleme metodolojisi açıklanmaktadır. Bu yazıda deri dokusu hazırlığı (insan ve fare) ve topikal formülasyon uygulaması, uzaysal zamansal konsantrasyon profillerini ölçmek için görüntü elde etme ve topikal ilaç dağıtımını değerlendirmek için ön farmakokinetik analiz açıklanmaktadır.
Abstract
Topikal formülasyon uygulamasından sonra kutanöz farmakokinetiği (cPK), düzenleyici ve ilaç geliştirme bilim adamlarının topikal biyoyararlanımı (BA) mekanik olarak anlamaları için özel bir ilgi alanı olmuştur. Bant sıyırma, dermal mikrodiyaliz veya dermal açık akışlı mikroperfüzyon gibi yarı invaziv tekniklerin tümü makro ölçekli cPK'yi ölçer. Bu teknikler geniş cPK bilgisi sağlamış olsa da, topluluk aktif farmasötik bileşen (API) penetrasyonu ve hücresel düzeyde geçirgenlik konusunda mekanik bir anlayıştan yoksundur.
Mikro ölçekli cPK'yi ele almak için invaziv olmayan bir yaklaşım, dışsal etiketlere veya kimyasal modifikasyona gerek kalmadan içsel moleküler titreşimleri seçici olarak hedefleyen tutarlı Raman saçılma görüntülemesidir (CRI). CRI, API'lerin veya aktif olmayan bileşenlerin hassas ve seçici bir şekilde ölçülmesini sağlayan iki ana yönteme sahiptir - tutarlı anti-Stokes Raman saçılması (CARS) ve uyarılmış Raman saçılması (SRS). CARS tipik olarak yapısal cilt bilgilerini türetmek veya kimyasal kontrastı görselleştirmek için kullanılır. Buna karşılık, moleküler konsantrasyonla doğrusal olan SRS sinyali, cilt tabakalaşmalarındaki API'leri veya aktif olmayan bileşenleri ölçmek için kullanılır.
CRI ile cPK için fare dokusu yaygın olarak kullanılmasına rağmen, topikal BA ve biyoeşdeğerlik (BE), düzenleyici onaydan önce insan dokusunda değerlendirilmelidir. Bu yazıda topikal BA ve BE'nin değerlendirilmesinde kantitatif farmakokinetik KRİ çalışmalarında kullanılacak ex vivo deri hazırlama ve görüntüleme metodolojisi sunulmaktadır. Bu metodoloji, zaman içinde insan ve fare derisinde güvenilir ve tekrarlanabilir API ölçümü sağlar. Lipid bakımından zengin ve lipid bakımından fakir bölmelerdeki konsantrasyonlar ve zaman içindeki toplam API konsantrasyonu ölçülür; bunlar mikro ve makro ölçekli BA ve potansiyel olarak BE tahminleri için kullanılır.
Introduction
Topikal ilaç ürünü uygulamasından sonra cPK'yi değerlendirmek için kullanılan metodolojiler, klasik in vitro permeasyon testi (IVPT) çalışmaları 1,2,3,4,5 ve bant sıyırma 6,7,8'den açık akışlı mikroperfüzyon veya dermal mikrodiyaliz 9,10,11 gibi ek metodolojilere genişlemiştir. 12,13,14. İlgilenilen hastalığa bağlı olarak potansiyel olarak çeşitli lokal terapötik etki bölgeleri vardır. Bu nedenle, bir API'nin amaçlanan yerel eylem alanına ulaşma oranını ve kapsamını değerlendirmek için karşılık gelen sayıda metodoloji olabilir. Yukarıda belirtilen metodolojilerin her birinin avantajları olsa da, en büyük dezavantaj mikro ölçekli cPK bilgisinin eksikliğidir (yani, API'nin nereye gittiğini ve nasıl yayıldığını görselleştirememe).
Topikal BA ve BE'yi tahmin etmek için ilgi çekici bir noninvaziv metodoloji, iki görüntüleme yöntemine ayrılabilen CRI'dır: CARS ve SRS mikroskopisi. Bu tutarlı Raman yöntemleri, doğrusal olmayan Raman etkileri yoluyla moleküllerin kimyasal olarak spesifik görüntülenmesini sağlar. CRI'da, iki lazer darbe treni bir numune içinde odaklanır ve taranır; lazer frekansları arasındaki enerji farkı, ilgilenilen kimyasal yapılara özgü titreşim modlarını hedeflemek üzere ayarlanmıştır. CRI süreçleri doğrusal olmadığından, sadece mikroskop odağında bir sinyal üretilir ve dokunun üç boyutlu farmakokinetik tomografik görüntülenmesine izin verir. cPK bağlamında, CARS, lipit bakımından zengin cilt yapılarının yeri gibi doku yapısal bilgilerini elde etmek için kullanılmıştır15. Buna karşılık, SRS, sinyali konsantrasyonla doğrusal olduğu için moleküler konsantrasyonu ölçmek için kullanılmıştır. Ex vivo cilt örnekleri için, CARS'ı epi-yön16'da ve SRS'yi şanzıman modu17'de gerçekleştirmek avantajlıdır. Bu nedenle, ince doku örnekleri SRS sinyalinin algılanmasına ve miktarının belirlenmesine izin verecektir.
Bir model doku olarak, çıplak fare kulağı, küçük dezavantajları olan çeşitli avantajlar sunar. Bir avantajı, dokunun zaten ~ 200-300 μm kalınlığında olması ve daha fazla numune hazırlığı gerektirmemesidir. Ek olarak, bir görüş alanına eksenel olarak odaklanarak çeşitli cilt tabakalaşmaları görülür (örneğin, stratum korneum, yağ bezleri (SG'ler), adipositler ve deri altı yağ)16,18. Bu, insan derisi örneklerine geçmeden önce kutanöz permeasyon yollarının ve topikal BA tahminlerinin klinik öncesi ön tahminine izin verir. Bununla birlikte, çıplak fare modeli, cilt yapısındaki farklılıklar nedeniyle in vivo senaryolara ekstrapolasyonda zorluk gibi sınırlamalar sunar19. Çıplak fare kulağı ön sonuçlar elde etmek için mükemmel bir model olsa da, insan derisi modeli altın standarttır. Donmuş insan derisinin in vivo geçirgenlik kinetiği 20,21,22'yi doğru bir şekilde özetlemeye uygunluğu ve uygulanabilirliği hakkında çeşitli yorumlar yapılmış olmasına rağmen, donmuş insan derisinin kullanımı in vitro API geçirgenlik kinetiğinin değerlendirilmesi için kabul edilmiş bir yöntemdir23,24,25 . Bu protokol, fare ve insan derisindeki çeşitli cilt katmanlarını görselleştirirken, lipit bakımından zengin ve lipit bakımından fakir yapılardaki API konsantrasyonlarını ölçer.
CRI, dokulardaki bileşikleri spesifik olarak görselleştirmek için çok sayıda alanda kullanılmış olsa da, topikal olarak uygulanan ilaç ürünlerinin cPK'sini araştıran sınırlı çabalar olmuştur. CRI kullanarak topikal ürünlerin topikal BA / BE'sini değerlendirmek için, önce doğru karşılaştırmalar yapmak için standartlaştırılmış bir protokole sahip olmak gerekir. Cilde ilaç dağıtımı için CRI kullanan önceki çabalar, veriler içinde değişkenlik göstermiştir. Bu nispeten yeni bir CRI uygulaması olduğundan, bir protokol oluşturmak güvenilir sonuçlar elde etmek için kritik öneme sahiptir 18,26,27. Bu yaklaşım, Raman spektrumunun biyolojik sessiz bölgesinde yalnızca belirli bir dalga sayısını hedefler. Ancak, çoğu API ve etkin olmayan bileşenlerin parmak izi bölgesinde Raman kaymaları vardır. Bu daha önce parmak izi bölgesindeki dokudan kaynaklanan doğal sinyal nedeniyle zorluklar yaratmıştı. Son lazer ve hesaplamalı gelişmeler, burada sunulan yaklaşımla birlikte de kullanılabilen bu engeli ortadan kaldırmıştır28. Burada sunulan bu yaklaşım, sessiz bölgede (2.000-2.300 cm-1) Raman kayması olan bir API'nin nicelleştirilmesine izin verir. Bu, ilacın fizyokimyasal özellikleri ile sınırlı değildir, bu da daha önce bahsedilen bazı cPK izleme metodolojileri için geçerli olabilir29.
Protokol, çeşitli preparatlar için cilt kalınlığındaki numuneden numuneye değişkenliği azaltmalıdır, çünkü kalın insan derisi örnekleri, kalın numune tarafından ışık saçılması nedeniyle ilaç ürünü uygulamasından sonra minimum sinyal üretecektir. Bu makalenin amacı, tekrarlanabilir görüntüleme standartlarını sağlayan bir doku hazırlama metodolojisi sunmaktır. Ek olarak, CRI sistemi, potansiyel hata kaynaklarını azaltmak ve sinyal-gürültü sinyalini en aza indirmek için açıklandığı gibi kurulur. Bununla birlikte, bu makale CRI mikroskobunun yol gösterici ilkelerini ve teknik değerlerini tartışmayacaktır, çünkü bu daha önce30 ele alınmıştır. Son olarak, bir deneyin başarısını veya başarısızlığını belirlemek için sonuçların yorumlanmasına izin vermek için kapsamlı veri analizi prosedürü araştırılmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Çıplak fare kulak dokusunun kullanımı Massachusetts Genel Hastanesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanırken, insan derisi dokusunun kullanımı Massachusetts Genel Hastanesi Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB) tarafından onaylanmıştır. IACUC protokollerine göre, taze ötenazi fareleri, çıplak fare kolonileri olan işbirlikçilerden elde edildi. İnsan dokusu, onaylanmış bir protokol aracılığıyla Massachusetts Genel Hastanesi'ndeki elektif abdominoplasti prosedürlerinden temin edildi. Ek olarak, karın derisi dışındaki spesifik doku tipleri, IRB onaylı bir protokol aracılığıyla bir vücut bağış otoritesi aracılığıyla edinildi.
1. Dokunun hazırlanması
- Çıplak fare kulağı cilt dokusunun hazırlanması
- Taze hasat edilmiş çıplak fare gövdelerini edindikten sonra, forseps ve mikrocerrahi makas kullanarak kulakları çıkarın. Bir kulağı küçük bir Petri kabına yerleştirin (yani, 35 mm x 10 mm). Çıplak fare gövdesini, yerel IACUC protokollerine uygun olarak atılmak üzere biyolojik tehlike torbasına yerleştirin.
- Her fare kulağını fosfat tamponlu salin (PBS) ile durulayın ve bir görev sileceği ile hafifçe kurulayın. Kulakta görüntüleme kalitesini etkileyebilecek kalıntı kir veya kalıntıları temizlemek için iki kez tekrarlayın (bkz. Şekil 1).
- Kulak 24 saat içinde kullanılacaksa, buzdolabında (2-8 ° C) taze PBS ile küçük bir Petri kabına (yani 35 mm x 10 mm) yerleştirin. Kulak 24 saatlik hasattan sonra kullanılacaksa, PBS'siz bir Petri kabına (35 mm x 10 mm) yerleştirin, kabı parafilmle örtün ve -20 ° C'lik bir dondurucuya koyun.
- İnsan cilt dokusunun hazırlanması
- İnsan dokusunun tedarikinden sonra, numune hazırlama için yeterli alana izin vermek için biyolojik bir davlumbazda büyük bir Petri kabına (yani 60 mm x 15 mm) yerleştirin.
- Stratum korneum tarafını aşağıya bakacak şekilde deri altı yağa erişilebilecek şekilde yerleştirin.
- Forseps ve mikrocerrahi makas kullanarak, deri altı yağını dikkatlice çıkarmaya başlayın. Subkutan yağ artık makasla çıkarılamadığında, kalan deri altı yağını çıkarmak için 10 bıçaklı tek kullanımlık bir neştere (veya eşdeğeri) geçin. Neşteri cilde 45° açıyla verirken cildi forseps ile sabit tutun (bkz. Şekil 1).
NOT: Yüksek kaliteli iletim SRS görüntülerine sahip olmak için, numunelerin delinmeden mümkün olduğunca ince olması gerekir.
Şekil 1: Fare ve insan derisini görüntülemek için ideal kalınlıktaki görüntüler . (A) Fare kulağı derisi ışığa kadar tutulur ve ışığın gözle görülür şekilde geçmesine izin verebilir. (B) İdeal insan derisi hazırlandıktan sonra ışığa tutulur. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
- İnsan derisini 1 cm x 1 cm parçalara ayırın.
NOT: Taze cilt, daha önce tarif edildiği gibi agaroz jel yatağı kullanılmadan 24 saate kadar kullanılabilir31. Bununla birlikte, taze cilt, agaroz jel yatağında tutulursa daha uzun süre kullanılabilir. Cilt daha sonra kullanılacaksa, cilt bir numune taşıma torbasına yerleştirilir ve daha sonra -20 ° C'lik bir dondurucuya yerleştirilir. Donmuş cildin optimal sonuçlar için aşağıdaki prosedür kullanılarak çözülmesi gerekir (bkz. adım 3.1.2).
2. Lazer ve mikroskop kurulumu
- Görüntülemeden yaklaşık 30 dakika önce, geniş çapta ayarlanabilir ultra hızlı lazeri (bundan böyle lazer olarak anılacaktır) açın ve ısınmasına izin verin. Girişte potansiyel tehlike dışındaki personeli bilgilendirmek için Lazer Uyarı işareti/kilit sistemini etkinleştirin.
NOT: Sınıf IV lazerlerle çalışırken her zaman uygun gözlükler giyilmelidir. Burada kullanılan spesifik lazer için, önerilen uygun gözlük, lazerin 800-1.300 nm çalışma aralığı için OD ≥ 6'dır. - Lazer ısınırken, mikroskop kontrolü, CARS algılama ve SRS algılama için kalan donanımı etkinleştirin.
- Optimum görüntülemeyi sağlamak için mikroskobu düzgün bir şekilde hizalayın. Mikroskop kontrol yazılımındaki Görüntü Yakalama Kontrolü penceresinde (bundan böyle MC yazılımı olarak anılacaktır), ışığın mikroskobun transillüminasyon lambasından gelmesine izin vermek için iletim lambasına tıklayın.
- Mikroskopu dikey eksen boyunca hizalamak için doğru Köhler aydınlatmasını sağlayın: irisi aşağı doğru kapatın, böylece göz merceğinden minimum miktarda ışık görülür32.
- Göz merceğinden bakarken, çokgenin aynı anda her tarafa dokunup dokunmadığını görmek için irisi açın. İrisi açmadan önce çokgen şekli görülemiyorsa kondenser yüksekliğini ayarlayın.
- Çokgen şekli aynı anda tüm taraflara dokunmuyorsa, ayar düğmelerini kullanarak diyafram hizalama konumunu ayarlayın.
NOT: Derinlemesine mikroskop kurulumu için Sanderson ve ark.33'e bakınız. - Mikroskop sahne tutucusuna bir yağ örneği (örneğin, yağlar içinde birçok -CH2- bağı olduğu için zeytinyağı) içeren bir kapak kapağı ve çift taraflı yapışkan ara parça içeren bir mikroskop slaytı yerleştirin.
- MC Software'in Edinme ayarları penceresinde, mikroskop açılır menüsünü bulun ve mikroskop hedefini 20x olarak ayarlayın.
- CARS algılama filtresinin (645 nm/50 nm) mikroskop yan portu fotoçarpan tüpü boyunca epiCARS sinyalini görselleştirmek ve ölçmek için konumda olduğunu doğrulayın.
NOT: Bu özel filtre, lipitleri görüntülemek için, 803 nm pompa dalga boyu ve 1.040 nm Stokes dalga boyu için 652 nm'de üretilen anti-Stokes CARS sinyali olarak seçilmiştir (bkz.
(1)
λ değişkenlerinin nm birimlerine sahip olduğu yerlerde; λ pompa,pompa ışını dalga boyudur; ve λ Stokes,Stokes ışın dalga boyudur. - Sistemin hizalamasını doğrulamak için kullanılacak yağ numunesinin kenarını bulmak için göz merceğinden bakın.
- Mikroskop üzerindeki odak düğmelerini kullanarak kenarın Z netlemede olduğundan emin olun ve XY odağı elde etmek için sahne alanı denetleyicisini ayarlayın.
- Lazer ısındıktan sonra, pompa ışınını 803 nm'ye ayarlayın ve motor ince ayarı lazerin grafik kullanıcı arayüzünde 50.0'a ayarlandı. Kullanılan tam motor ince ayarı kurulumdan kuruluma farklılık gösterebilir.
NOT: Pompa ışını, Stokes ışını dalga boyu 1.040 nm'de sabitlendiği için bu lazer üzerinde ayarlanabilir dalga boyuna sahip tek ışındır. Bu konfigürasyon, CH titreşimini 2850 cm-1'de hedefler (dalga sayısı hedeflemesi için pompa dalga boyunu hesaplamak için bkz.
(2)
Burada
bağıl dalga sayısı birimleri (cm−1) vardır ve λ değişkenleri cm cinsinden birimlere sahiptir. - Görüntülemeden önce lazerin mikroskopa hizalamasını kontrol edin; lazer yolunun tasviri için Şekil 2'ye bakınız. Mikroskobun ilk kurulumu sırasında, mikroskopa doğru hizalama için kılavuz olarak ışın yoluna iki süsen yerleştirin. Lazerin optik yolu zamanla sürüklenebileceğinden, lazer ışını yollarının süsen merkezinden geçtiğinden emin olun, böylece mikroskopa doğru şekilde girerler.
- IR görüntüleyiciyi kullanarak, tüm süsenleri tamamen kapatın ve ışının her ikisine de odaklandığından emin olun: önce lazere en yakın iriste ve son olarak mikroskop giriş portunda.
- İlk olarak, ışının mikroskopa düz bir şekilde girdiğinden emin olmak için pompa kirişini kontrol edin. Pompa hizalandıktan sonra, Stokes ışınının da mikroskopa doğru şekilde girdiğinden emin olun.
- Kirişler süsen boyunca hizalanmazsa, pompa ve Stokes ışın yolları için iki ayna bağlantısının x ve y ayar düğmelerini kullanarak kirişleri süsen boyunca yinelemeli olarak yürüyün.
- Işın lekeleri mikroskopa girmeden önce üst üste bindiğinde, mikroskoptan doğru şekilde geçtiklerinden emin olmak için kontrol edin.
- MC yazılımının Görüntü Yakalama Kontrolü penceresinde, iletim için TD kanalına, tutarlı anti-Stokes Raman kanalı için ALG1'e (analog kanal 1) ve uyarılan Raman saçılma kanalı için ALG2'ye (analog kanal 2) tıklayın. Aşağıdaki ayarları kullanın (bu protokolde olduğu gibi): ALG1 için 1 kazanç ve -1 ofset, ALG2 için 1.25 kazanç ve -2 ofset.
NOT: Sistem yapılandırmasına bağlı olarak, analog kanallar tek tek görüntüleme kanalları için farklı numaralandırmalara sahip olabilir. SRS dedektörü yerindeyse, hiçbir ışık geçemediği için iletim sinyali olmayacaktır (yani, bu kurulumda TD ve ALG2 ile görüntüleri aynı anda görselleştiremez).
- MC yazılımının Görüntü Yakalama Kontrolü penceresinde, iletim için TD kanalına, tutarlı anti-Stokes Raman kanalı için ALG1'e (analog kanal 1) ve uyarılan Raman saçılma kanalı için ALG2'ye (analog kanal 2) tıklayın. Aşağıdaki ayarları kullanın (bu protokolde olduğu gibi): ALG1 için 1 kazanç ve -1 ofset, ALG2 için 1.25 kazanç ve -2 ofset.
(1)
(2)
bağıl dalga sayısı birimleri (cm−1) vardır ve λ değişkenleri cm cinsinden birimlere sahiptir.
Resim 2: Tutarlı Raman lazer görüntüleme yolu için şematik düzen. Kirişler, spot boyutu için bağımsız olarak şartlandırılır ve istenen ayar frekansı için numunelerde tutarlı Raman saçılması oluşturmak üzere zaman gecikme aşaması ile eşleştirilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
- Güç ölçeri açın ve yüksek güçlü bir termal güç sensörü kullanarak, pompanın ve Stokes ışınlarının gücünü deney için ayrı ayrı ölçün.
NOT: Bu özel örnekte, pompa ışını gücü 80 mW iken, Stokes ışın gücü mikroskop girişinden önce 180 mW idi. - Görüntü Alma Kontrolü penceresinde, görüntüyü MC Yazılımında görüntülemek için Focus x2 düğmesine tıklayın.
- Edinme ayarları penceresinde, piksel oranının ve bekleme süresinin deneme için istenen parametrelere ayarlandığından emin olun.
NOT: Bu protokolde 1.024 x 1.024 piksel oranı ve 2 μs/piksel bekleme süresi kullanılmıştır. - Pompa ışınının blokajını kaldırarak ve TD kanalına bakarak mikroskopla ilgili lazer hizalamasını onaylayın.
NOT: Işın görüntüde doğru dedektör ayarlarıyla ortalanmış olarak görülüyorsa lazer düzgün bir şekilde hizalanır. - Aksi takdirde, kirişi görüntünün merkezine yeniden konumlandırmak için periskop üzerindeki X ve Y ayar düğmelerini kullanın.
- Aynı görüntüyü hem CARS hem de SRS kanallarında görerek lazer ve mikroskop hizalamasını onaylayın.
- Hizalama görüntüsünü elde etmek için, Görüntü Alma Kontrolü penceresindeki XY tarama düğmesini uygun Filtre Modu ayarıyla (örneğin, Kalman Satır 3) tıklatın.
- Zaman içinde karşılaştırmak ve sistem performansını/hizalamasını onaylamak için bu görüntü kümesini açıklayıcı bir dosya adıyla kaydedin.
3. Lipid görüntüleme
- Fare kulağı ve insan dokusu
- Taze doku kullanıyorsanız, adım 3.1.2'yi atlayın.
- Fare kulak derisini -20 °C dondurucudan çıkarın ve 10 dakika boyunca bir kuluçka odasına (32 °C) yerleştirin. Fare kulağını kuluçka odasından çıkarın.
NOT: Adım 1.1.2'ye bakın. fare kulağı cilt hazırlığı için. Dokunun kabaca taşınması veya kazınması, dokunun, özellikle stratum korneumun mekanik olarak bozulmasına, tahrip olmasına veya bozulmasına neden olabilir. - Çıplak bir fare kulağı kullanıyorsanız, kulağın ön kısmını 35 mm, No. 0 tabağın cam tabanına doğru bakacak şekilde yerleştirin. İnsan derisi kullanıyorsanız, yüzeysel katmanlardan daha derin katmanlara ilaç miktarının belirlenmesine izin vereceğinden, stratum korneum yüzü aşağı bakacak şekilde yerleştirin (Şekil 1).
NOT: Çıplak fare kulağının arka kısmı, muhafazadan kaynaklanan kusurlara daha yatkındır. Eğer insan derisi ters çevrilmiş mikroskopta stratum korneum tarafı aşağıya bakacak şekilde yerleştirilmezse, dağılmış oldukça fazla miktarda ışık olduğu için dermisin ötesini göremez, stratum korneuma nüfuz eden ilaç görülemez. - Doku cam tabana ortalandıktan sonra, cildin düz olduğundan ve cam tabanlı kabın kapak kayması yüzeyiyle tam temas ettiğinden emin olmak için pamuk uçlu bir aplikatör kullanın.
NOT: Bu, tamamen düz değilse cildi görüntülerken zorluğa neden olabilecek bir adımdır. - Görüntüleme sırasında herhangi bir hareketi önlemek için cildin üstüne bir yıkayıcı yerleştirin. SRS iletim algılaması için dokunun yıkayıcının orta deliğinden görülebildiğinden emin olun.
- Slayt aşaması ekini çıkarın ve tek çanak ekine sahip inkübasyon odasıyla değiştirin.
- Cam tabanlı kabı cilt dokusu ile birlikte kuluçka odasının tek tabak tutturucuna yerleştirin.
NOT: Alternatif olarak, aynı anda birden fazla cilt örneğini ve formülasyonunu görüntülemek için 6 delikli bir plaka kullanın. - Daha hızlı galvo tarama hızı için MC yazılımının Edinme Ayarları penceresindeki piksel oranını azaltın (ör. 1.024 x 1.024'ten 512 x 512'ye) ve Z-derinliği stratum korneumu bulmak için değiştirilir (bkz. fare için Şekil 3A veya insan için Şekil 3E ).
- Stratum korneum bulunduktan sonra, Edinme Ayarları penceresinde bu eksenel konumu sıfır konumu olarak kaydedin ve her bir belirli deney için piksel oranını değiştirin (ör. 1.024 x 1.024).
Şekil 3: SRS kullanılarak elde edilen örnek cilt derinlikleri. Üst görüntü seti aşağıdakileri gösteren çıplak fare kulak derisinden alınmıştır: (A) stratum korneum, (B) yağ bezleri, (C) adipositler, (D) deri altı yağ. Alt görüntü kümesi aşağıdakileri gösteren insan derisinden elde edilir: (E) stratum korneum, (F) papiller dermis ve (G) yağ bezi. Ölçek çubukları = 100 μm. Hem fare hem de insan derisi görüntüleri, 1024 piksel x 1024 pikselde 20x hedefi kullanılarak elde edildi; insan SG 512 x 512 pikselde çekildi. Kısaltmalar: SRS = uyarılmış Raman saçılması; SG = yağ bezi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
4. Topikal formülasyonun uygulanması
- Önceden belirlenmiş formülasyon dozunu cilde pipetleyin (örneğin, 10 μL/cm2).
NOT: Formülasyonun viskozitesi pipet seçiminde rol oynayacaktır. Kremler veya jeller gibi viskoz formülasyonlar için pozitif yer değiştirmeli pipet ve çözeltiler için hava yer değiştirmeli pipet kullanılması önerilir. Bu deneyde, ruxolitinib basit bir propilen glikol çözeltisindeki (propan-1,2-diol) model bileşikti. - Bir şırıngadan veya eldivenli bir parmaktan piston ucunu kullanarak, formülü 30 saniye boyunca saat yönünde bir hareketle ovalayın. Formülasyonun daha sonraki cPK analizi için uygulandığı zamana dikkat edin (aşağıdaki 6.15-6.17 numaralı adımlara bakın).
NOT: Uygulama süresi deneye bağlıdır; her biri farklı olabilir. - Formülasyonun nüfuz etmesi için ayrılan süre geçtikten sonra, fazla formülasyonu çıkarın ve cildi, formülasyon tarafı cam tabanlı kaba bakacak şekilde yerleştirin.
NOT: Formülasyon, hassas bir görev sileceği veya tek bir yönde (örneğin, kuzeyden güneye) küçük (~1 inç) 3D baskılı silecek kullanılarak çıkarılır.
5. İlaç niceliği için deney düzeni
- Pompa kirişini 803 nm olarak ayarlayın. Deney için istenen güçler olduklarından emin olmak için pompayı ve Stokes ışın güçlerini fotodiyot ile kontrol edin. Gücü ölçmek ve kirişleri yeniden engellemek için her bir kirişin engelini ayrı ayrı kaldırın.
NOT: Bu özel örnekte, pompa ışını gücü 100 mW iken, Stokes ışın gücü 180 mW idi. - Cam tabanlı kabı, bir cam tabanlı tabak için bir ek parçaya sahip bir kuluçka odasına yerleştirin. Görüntüleme sırasında hareketi önlemek için çanağı klipslerle sabitleyin.
- MC Yazılımındaki şanzıman lambasını açın. Göz merceğinden bakarak, dokunun odak içinde olduğundan emin olmak için ayar düğmesiyle eksenel odağı ayarlayın.
- Hem pompanın hem de Stokes kirişlerinin blokajını kaldırın. ALG1 ve ALG2 kanallarının etkinleştirildiğinden emin olun ve ardından CARS ve SRS kanallarındaki kaplamayı görselleştirmek için MC yazılımında Focus x2'ye tıklayın. SRS fotodiyotunun kondenserin üzerinde konumda olduğundan emin olun.
- Aygıt açılır menüsünde, Çok Alanlı Zaman Atlamalı (MATL) seçeneğini tıklatın. XY Sahne Alanı Uyarısı'nın görünüp görünmediğine bakın; sahne alanı mekanik kaynağını bulmak için hareket ettiğinde, Tamam'ı tıklatın.
- MATL modülünde, Görünüm'e gidin ve MC yazılımı içinde Kayıtlı Nokta Listesi'ni tıklatın. 1) cilt içindeki spesifik derinlikleri (yani, stratum korneum, SG'ler, adipositler, lipid ayarlı kontrastla canlı görüntüleme sırasında belirlenen deri altı yağ) veya 2) Tüm derinlik yığınları alınacaksa XY pozisyonlarını eklemeye başlayın. Örnekler için Şekil 3'e bakın.
- Stratum korneum tanımlandıktan sonra, yukarıda belirtilen spesifik doku tabakalaşmalarını tanımlamak için eksenel odak (veya z-odağı) arasında kaydırın. İnsan ve fare derisindeki örnekler için Şekil 3'e bakın.
- Tam Z derinliği yığınlarının aksine belirli derinliklerin görüntülenmesi durumunda, her cilt tabakalaşması için, MATL kuyruğuna eklemek üzere Kayıt Noktası'nı tıklatın. Tam derinlikli yığınlar için, alma parametreleri penceresinde derinlik seçimi olan her XY pozisyonu için Kayıt Noktası'nı tıklatın.
- İstenilen tüm XY (tam Z-derinliği yığınları) veya XYZ (belirli cilt tabakalaşmaları) konumları MATL yazılımına kaydedildikten sonra, dosya dizinini ve adını, görüntü ve cPK analizleri için deneyler boyunca tutarlı olacak şekilde değiştirin (bkz. adım 6.15-6.17).
- MATL modülünde yineleme sayısını 1 olarak ayarlayın ve Hazır'ı tıklatın. Yazılımın hazır olduğunu belirten Play tuşunun griden siyah oka geçmesini bekleyin. Ön lipit yığınını görüntülemeye başlamak için Play (bundan böyle Lipid Görüntüleri) tuşuna basın.
NOT: Bu, analiz sırasında bireysel doku tabakalaşmalarının lipit bakımından zengin ve lipit bakımından fakir bölgelerini ayırmak için kullanılacaktır. Döngü ve toplam süre, kayıtlı puan listesinin sağ alt köşesinde belirtilmiştir. - Döngü tamamlandıktan sonra, hem pompayı hem de Stokes kirişlerini bloke edin. Lazer grafik kullanıcı arayüzündeki dalga boyunu, hedeflenen dalga sayısına veya Raman titreşimine bağlı olarak istenen dalga boyuna değiştirin.
NOT: Örneğin, pompa ışını için 843 nm, Eq (2) kullanılarak 2.250 cm-1'i hedeflemek için kullanılır ve motor ince ayarı 50,1 olarak değiştirilir. Burada sunulan örnek ilaç, ruxolitinib, 2.250 cm-1'de hedeflenebilen bir nitril içerir. Cilt yapısı için hedeflenen dalga sayısı her zaman aynı olacaktır (2.850 cm-1); ancak, bir API için dalga numarası herhangi bir dalga numarası olabilir, ancak a priori olarak bilinmeli veya hesaplanmalıdır. - Yeni dalga boyu ve pompa ışını gücü için zaman içinde çakışmayı sağlamak üzere manuel zaman gecikme aşamasını (Şekil 2) ayarlayın. A priori olarak belirlenen lipit ve API görüntüleme için aynı güçlerin kullanıldığından emin olun.
- Deneme başına gereken toplam tekrar sayısını hesaplamak için döngü başına süreyi kullanın. Deneyin toplam istenen zaman seyrini, döngü süresine bölmeniz yeterlidir.
NOT: Döngü süresi, görüntü boyutunun, piksel bekleme süresinin, Kalman'ın ortalamasının ve döngü başına görüntü sayısının bir işlevidir. Bu parametrelerin optimizasyonu döngü süresini kısaltacak ve böylece zamansal çözünürlüğü artıracaktır. - Toplam döngü tekrarı sayısı seçildikten sonra, pompa kirişinin blokajını kaldırın, fotodiyotu kullanarak gücü kontrol edin ve istenen güçle eşleştiğinden emin olun. Son olarak, görüntülemeye izin vermek için Stokes ışınının engelini kaldırın.
- Ayar noktalarının otomatik olarak görüntülenmesine başlamak için Oynat'a basın.
- MATL görüntüleme tamamlandıktan sonra, pompa ışınını 803 nm'ye geri döndürün ve gücü adım 5.1'de kullanılan orijinal lipit görüntüleme gücüne geri ayarlayın.
- Önceki adımlarda olduğu gibi, dosya adını etüt boyunca deneme sonrası görüntüler için tutarlı olacak şekilde değiştirin.
- Yineleme sayısını 1 olarak ayarlayın.
- Hazır |'e tıklayın Zaman sonrası bir lipit yığını elde etmek ve görüntüleme sırasında doku hareketi olmadığından emin olmak için oynat düğmesi (Şekil 4).
Şekil 4: Çıplak fare kulak derisindeki doku hareketi, yağ bezlerinin görselleştirilmesiyle gösterilmiştir. Sınırlı doku hareketi örneği A ve B'de, önemli doku hareketi ise C ve D'de tasvir edilmiştir. (A) formülasyon uygulaması sırasında yağ bezlerini gösterir ve (B) uygulamadan 120 dakika sonra aynı derinliği gösterir. (C) Formülasyon uygulaması sırasında fare yağ bezleri ve (D) formülasyon uygulamasından 120 dakika sonra; yağ bezleri zar zor görülebilir, bu da bu deneyin tüm deney süresi boyunca yağ bezlerine alımı ölçmediğinin bir göstergesidir. Ölçek çubukları = 100 μm. Görüntüler 1024 piksel x 1024 pikseldir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
6. Veri analizi
- Görüntüleri şu şekilde alın : . OIB (veya . Mikroskop ve MC yazılımına bağlı olarak OIR) her XYZ pozisyonunun ayrı bir alt klasöre sahip olduğu dosya türleri.
- Aşağıdaki _lipid.oib bitişiyle lipid görüntülerini yeniden adlandırarak lipid görüntülerini API kanal görüntüleriyle derleyin.
- Her cilt tabakalaşmasında aşağıdaki adımları uygulayın (burada basitlik uğruna yalnızca SG tabakalaması kullanılarak gösterilmiştir; bkz. Şekil 3B).
- Bir SG lipit görüntüsünü ImageJ (veya Fiji)34'e içe aktarın ve dosyayı CARS ve SRS kanallarına bölmek için Bölünmüş Kanallar etiketli kutuyu işaretleyin.
NOT: Fiji, dosyayı deney sırasında elde edilen görüntü sayısına kanal sayısı arasında böler. - Analiz Et'e tıklayarak ilgi alanı (YG) yöneticisini | Araçlar | Yatırım Getirisi Yöneticisi.
- SRS kanalını kullanarak (örneğin, C = 1), görüntüde bir SG sınırlayın.
NOT: SG'ler, hedeflenen -CH2- titreşimi nedeniyle parlak yerlerdir. - YG yöneticisinde [t] Ekle'yi tıklayarak veya klavyede t tuşuna basarak bunu YG yöneticisine ekleyin. Görüntüdeki her SG için bu işlemi tekrarlayın.
- Lipid açısından zengin bölgeleri maskelemek için her bir YG'yi seçin ve Diğer sekmesini tıklatın | VEYA (Birleştirme) | YG yöneticisine ekleyin.
- Lipid açısından zayıf bölgeleri maskelemek için FIJI menüsündeki dikdörtgen aracını kullanın ve tüm görüntünün etrafına bir kare çizin. Bunu YG yöneticisine ekleyin.
- YG yöneticisinde lipit bakımından zengin tüm bölgeleri seçen YG'ye ek olarak yeni eklenen kare YG'ye tıklayın. Daha Fazlası altında, lipit açısından zayıf bölgelerin maskesini oluşturmak ve YG yöneticisine eklemek için XOR'u seçin.
- Bir SG lipit görüntüsünü ImageJ (veya Fiji)34'e içe aktarın ve dosyayı CARS ve SRS kanallarına bölmek için Bölünmüş Kanallar etiketli kutuyu işaretleyin.
- API görüntülerini Fiji'ye yükleyin.
- Aşağıdaki menü sırasını kullanarak görüntüleri sayısal sırayla (örneğin, Image0001, Image0002, Image0003, vb.) birleştirin: Image | Yığınlar | Araçlar | Birleştirin.
- Alternatif olarak, görüntülerden birini Fiji'ye yükleyerek ve ardından kurulum sayfasında Benzer adlara sahip Grup dosyaları adlı bir seçenek belirleyerek bu görüntüleri içe aktarın.
NOT: Bu, benzer bir dosya adına sahip tüm görüntüleri içe aktarma ve bunları otomatik olarak birleştirme olanağı sağlar.
- Alternatif olarak, görüntülerden birini Fiji'ye yükleyerek ve ardından kurulum sayfasında Benzer adlara sahip Grup dosyaları adlı bir seçenek belirleyerek bu görüntüleri içe aktarın.
- Birleştirilmiş görüntüyü etkin hale getirirken YG yöneticisine gidin, lipit açısından zengin bölgeleri (yani SG'yi) seçin, Diğer'i tıklatın ve Çoklu ölçüm'ü seçin. Sonuçlar penceresinin görünmesini bekleyin.
- Varsayılan ölçüm ayarlarında Alan, Ortalama, Min, Maks ve Medyan'ı arayın. Analiz için başka metrikler isteniyorsa, Ölçümleri Ayarla penceresindeki ilgili onay kutusunu işaretleyerek bu seçenekleri etkinleştirin (Analiz Et | Ölçümleri Ayarla...).
- Verileri Sonuçlar penceresinden bir elektronik tabloya aktarın ve Bölge başlıklı bir sütun ekleyin.
- Lipid bakımından zengin bölgeler için her veri satırına lipit bakımından zengin ekleyin. Lipitlerin dışındaki bölgelere lipit bakımından fakir ekleyin.
- Katman başlıklı bir sütun ekleyin ve analiz edilen ilgili katmanı ekleyin (Ek Tablo S1).
- Uygun yatırım getirisi seçiliyken lipid açısından zayıf bölgeler için 6,5 - 6,7 arasındaki adımları yineleyin.
- Verileri görselleştirmek için elektronik tabloyu kaydedin ve JupyterLab (package matplotlib)35 veya R (package ggplot2)36 içine aktarın. Konsantrasyon-zaman verilerini tahmin etmek için verileri görüntü numarasının bir fonksiyonu ve ortalama yoğunluk olarak çizin. (Şekil 5).
- CRI verilerinin farmakokinetik analizi için kompartımansız analiz (NCA) gerçekleştirmek üzere elektronik tabloyu RStudio'ya alın.
- Saat başlıklı bir sütun ekleyin.
- Image0001 için, formülasyon uygulaması ile ilk görüntü arasındaki süreyi hesaplayın.
NOT: Bu ilk zaman noktasıdır. Döngü süresi, zaman içinde artan kalan görüntüleri (ve dolayısıyla zaman noktalarını) hesaplamak için kullanılır. Örneğin, uygulamadan bu yana geçen süre 30 dakika ise, Image0001 30 dakikalık bir zaman noktasına ve 8 dakikalık bir döngü süresine sahip olacaksa, Image0002 38 dakikalık bir zaman noktasına sahip olacak, Image0003 46 dakikalık bir zaman noktasına sahip olacaktır vb. - Elektronik tablodan içe aktarılan yoğunluk-zaman verilerinde RStudio'da NCA'yı çalıştırın (NonCompart paketini kullanarak)37 ve bir katman/bölge için aşağıdaki çağrıyı yapın:
sNCA(x = zaman, y = ortalama, doz = 1, timeUnit = "s", doseUnit ="mg")
X'in zaman noktalarını ifade ettiği yerde, y yoğunluğu ifade eder ve doz, formülasyonda veya ürün dozunda ilacın mM dozu olarak hesaplanan bir olarak bırakılabilir.
NOT: NCA çıkışı Cmax ve AUCall gibi parametreleri sağlayacaktır. Bununla birlikte, bu ex vivo cilt olduğu için, bu parametreler aslında Jmax ve AUCakısıdır. - Jmax ve AUCakı-tüm metrikleri, deneysel koşullar arasındaki istatistiksel karşılaştırmalara ek olarak, bunları çizerek görsel olarak karşılaştırın (Şekil 6). Ex vivo CRI çalışmalarının analizine bir örnek için Şekil 6'ya bakınız.
NOT: Uygun istatistiksel test(ler) her bir özel veri kümesine bağlıdır. Ayrıca, tüm farmakokinetik parametrelerin log normal olarak dağıtıldığını ve herhangi bir karşılaştırmanın log-dönüştürülmüş (doğal log veya log10) verileri kullanması gerektiğini belirtmek de önemlidir.
Şekil 5: Yoğunluk ve zaman profilleri. (A) Doygunluğa ulaşmış akı profillerine bir örnek ve bu nedenle sadece yoğunlukta bir azalma görülür. Her yatırım getirisi, elde edilebilecek verilerdeki heterojenliği göstermek için farklı bir akı profiline sahiptir. (B) Görüntüleme başladıktan sonra artan konsantrasyonlara bir örnek. Her yatırım getirisi, aynı deneyin aynı dokusu içinde farklı bir görüş alanıdır (farklı renk izleriyle gösterilir). Küresel konsantrasyonlara ek olarak, bir API / formülasyonun lipit bakımından zengin ve lipit bakımından fakir bölgeler tarafından belirtildiği gibi hangi yerel ortamı tercih ettiğini aydınlatma yeteneği vardır. A'da sunulan profiller, API'nin zaten nüfuz ettiği ve görüntüleme başladıktan sonra dokuyu terk etmeye başladığı için ilacın dokuya emilmediğini göstermektedir. Bununla birlikte, B'de, doku doygunluğa ulaşmamıştır ve hala API'nin emilimi ve ardından eliminasyon vardır. Görüntülerin lipit bakımından zengin ve lipid bakımından fakir olarak bölümlendirilmesi, API'nin (veya inaktiflerin) lokalizasyonunun ve cilde (yani stratum korneum) nüfuz yollarının aydınlatılmasına yardımcı olacaktır. Lipid bakımından zengin bölgeler içindeki daha yüksek bir konsantrasyon, API'nin incelenen tabakanın lipit yapısı içinde lokalize olduğunu gösterir ve bu da hedeflenen ilaç dağıtım bilgilerine yardımcı olur. Kısaltmalar: ROI = ilgilenilen bölge; API = aktif farmasötik bileşen. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Deneyin tamamlanmasından sonra doku eksenel (<10 μm) veya lateral yönde anlamlı bir şekilde hareket etmemişse görüntüleme başarılı kabul edilir (Şekil 4). Bu, ilgilenilen API için SRS ölçümünün, nicelemenin katmana özgü olduğu başlangıç derinliğini temsil etmediğinin hemen bir göstergesidir. Bu, ilgilenilen her XY pozisyonu için z-yığınlarının görüntülenmesiyle hafifletilir ve takas zamansal çözünürlüktür. Bu çalışmalarda donmuş cilt kullanılıyorsa, API'nin penetrasyonu ve geçirgenliği taze cilde kıyasla hızlıdır ve formülasyon uygulaması ile görüntülemenin başlaması arasında minimum süre zorunludur. Diğer bir husus, deneyler için kullanılan amaçtır. 60x hedefi kullanıyorsanız, tek bir görüş alanı (FOV) içinde düz bir yüzey seçmek nispeten kolaydır; Bununla birlikte, 20x'lik bir hedef için, görüntülenen alan çok daha büyüktür ve bu nedenle, doku hazırlığındaki önemli bir adım, cildin cam tabanlı görüntüleme kabı ile eşit temasını sağlamaktır. Düz bir FOV ve FOV içindeki orijinal derinliğe kıyasla benzer derinlik, olumlu sonuçların iki anahtarıdır.
Lazerin hizalaması, görüntünün dinamik aralığına ek olarak, azami özenle ele alınmalıdır. Lazer darbe trenlerinin mikroskopa yanlış hizalanması, düşük sinyal seviyeleri veya eşit olmayan şekilde uyarılmış FOV'lar da dahil olmak üzere düşük kontrastlı görüntülere yol açabilecek bir dizi soruna yol açabilir. Diğer bir husus, görüntüleri elde ederken yoğunluk değerlerinin tüm dinamik aralığının kullanılmasını sağlamaktır; aksi takdirde, görüntüleme verileri sıkıştırılır ve konsantrasyon farklılıklarının tespit edilmesi zor olabilir.
Diğer bir husus, cilt heterojenliğinin, aynı veri kümesi içindeki hesaplanan mikro ölçekli akı profillerinde çeşitliliğe yol açabileceğidir. Yoğunluklar (konsantrasyonlar için bir vekil) deney süresi boyunca yüksek başlar ve azalır (Şekil 5A), diğer çalışmalar ise deney süresi boyunca akıda bir azalma ile bir artış olduğunu gösterir (Şekil 5B). Şu anda, mutlak konsantrasyon nicelleştirmesi, deney düzeneği nedeniyle anında gerçekleşememektedir. Bu nedenle, uygulamadan sonra azalan konsantrasyonlar muhtemelen ilgi derinliği içindeki bir doygunluğun sonucudur ve niceleme yalnızca API eliminasyonunu temsil eder. Dinamik aralık yeterince büyük değilse veya cilt çok kalınsa, görsel inceleme konsantrasyonların durgun görünmesini sağlar, böylece görüntüleme süresi boyunca herhangi bir değişiklik olmaz. Bu, hem optimal olmayan bir dinamik aralığın hem de cilt kalınlığının bir fonksiyonudur ve bu da deneyi tekrarlama ihtiyacını ortaya koyacaktır.
Konsantrasyon-zaman profilleri daha sonra maruziyeti, maksimum akıyı ve maksimum akı süresini tahmin etmek için her profilin NCA'sına tabi tutulur. İstatistiksel analiz (Şekil 6), maruziyetlerdeki potansiyel farklılıklara katkıda bulunan eşdeğişkenleri daha fazla araştırmak için deneysel koşullar boyunca gerçekleştirilir. Global cPK parametrelerinin karşılaştırılması, hangi formülasyonun daha yüksek bir akı veya daha fazla maruz kalma sağladığı konusunda fikir verecektir. Buna karşılık, mikro ölçekli cPK parametreleri (yani, lipit bakımından zengin ve lipit bakımından fakir bölgeler) yerel biyodağılım ve geçirgenlik yolları hakkında fikir verecektir. Örneğin, aynı API konsantrasyonuna sahip iki formülasyonu karşılaştırırken ve inaktif bileşenlerde farklılık gösterirken, bir formülasyon, lipit bakımından zengin bölge yoluyla stratum korneumdan lipit-fakir bölgeninkine karşı nüfuz etme eğiliminde olabilir. Bu gözlem, bu spesifik formülasyonun, daha kolay penetrasyon ve geçirgenlik için nüfuzu lipit bakımından zengin bölgelere doğru "iteceğini" göstermektedir.
Şekil 6: Fare kulak dokusundan konsantrasyon-zaman profilinin örnek NCA analizi. (A) Aynı API için iki formülasyon arasındaki tmax (maksimum konsantrasyonun oluştuğu zaman) analizine bir örnek. Bu analiz, 2-(2-etoksietoksi) etanolün, cilt tabakasından bağımsız olarak, Jel formülasyonuna kıyasla genişletilmiş API geçirgenliği sağladığını göstermektedir. SC tabakası için tmax'ın SG'den daha uzun olduğu da görülebilir, bu da 2-(2-etoksietoksi) etanol formülasyonunun görüntüleme süresi sona erdiğinde bile API vermeye devam ettiğini düşündürmektedir. (B) A'daki aynı formülasyon/API kombinasyonu arasında, ancak cildin daha derinlerinde toplam maruz kalma analizine bir örnek. Bu rakam18'den değiştirilmiştir. Kısaltmalar: SC = stratum corneum; SG = yağ bezi; AD = adiposit; SCF = deri altı yağ. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Tablo S1: El ile görüntü analizinden alınan örnek veri kümesi. Sütunlar, bu makalenin Veri Analizi bölümünden elde edilen bilgileri (yani, çerçeve, alan, ortalama, min, maksimum, medyan) gösterirken, cPK analizinde kullanılmak üzere ek sütunlar eklenmiştir (örneğin, katman, bölge, time_minutes). Bu veriler NCA aracılığıyla analiz edilebilir ve SG cilt tabakası içindeki konsantrasyon profilini görselleştirmek için çizilebilir. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Topikal BA / BE'nin değerlendirilmesi, tek bir yöntemin in vivo cPK'yi tam olarak karakterize edemeyeceği için çok yönlü bir yaklaşım gerektiren bir araştırma alanıdır. Bu protokol, tutarlı Raman görüntülemesine dayanan topikal bir ilaç ürününün BA / BE'sinin değerlendirilmesi için bir metodoloji sunmaktadır. Göz ardı edilebilecek ilk noktalardan biri, özellikle kantitatif iletim SRS görüntüleme için cilt örneklerinin ne kadar ince olması gerektiğidir. Cilt çok kalınsa (yani, ışık kolayca geçemiyorsa), SRS dedektörü tarafından ölçülen sinyal çok azdır veya hiç yoktur ve bu nedenle zayıf konsantrasyon verileri sağlayacaktır. Bu doku örneklerini düzgün bir şekilde hazırlamak için özen gösterilmelidir, çünkü bu bir deney yapabilir veya bozabilir. Çıplak fare kulağı açısından, PBS ile durulamak ve kulaktaki artık kirleri temizlemek için kurutmak dışında, çok az hazırlık yapılması gerekir.
Fare kulakları tipik olarak SRS iletimi için en uygun olan birkaç yüz μm kalınlığındadır. İnsan derisi örnekleri tipik olarak deri altı yağ da dahil olmak üzere birkaç mm kalınlığındadır, ancak kalınlık cilt dokusunun anatomik kaynağına ve donörün yaşına bağlı olarak oldukça değişkendir. Bu nedenle, zaman içinde epidermis ve dermisteki lipit yapılarını ve API konsantrasyonlarını doğru bir şekilde ölçmek için mümkün olduğunca fazla doku çıkarılmalıdır. Doku hazırlama adımı göz ardı edilirse, başlangıç koşulları optimal olmadığı için deney düzeneğinin kalan adımları büyük ölçüde uygun olmayacaktır.
Lazer/mikroskop kurulumu bir sonraki zorluk veya potansiyel tökezleyen bloktur. Lazerin ışın yolunda ve nihayetinde mikroskopta yanlış hizalanması, zayıf kontrasta ve dolayısıyla zayıf görüntüleme sonuçlarına neden olur. Sinyalinin bulunması daha kolay olduğu için önce CARS kanalının kurulması önerilir. Pompa ve Stokes darbe trenleri hem zaman hem de uzayda üst üste binmelidir. SRS dedektörü yoldan çekildiğinde, pompa lazerinin hizalaması, mikroskop MC yazılımı içindeki iletim dedektörü kullanılarak kontrol edilir. MC yazılımında CARS kanalını (ALG1) görüntülerken, Stokes ışınının engeli kaldırılır. Bununla birlikte, yağ numunesinden sinyal yoksa, önce Stokes ışınını hizalamak ve ardından zaman çakışmasını ayarlamak gerekir. Sinyal optimize edilene kadar bu iki ayarlamayı yinelemek gerekebilir. İki ışının uzamsal örtüşmesi, süsen üzerindeki bir IR görüntüleyici aracılığıyla görüntülenirken, zaman gecikme aşaması (Şekil 2), ışınların zaman içinde üst üste binmesi için ayarlanır. Bu iki hizalama adımı, CARS sinyal üretimini sağlamak için kritik öneme sahiptir.
CARS kanalında bir sinyal belirginleştiğinde, SRS kanalı (ALG2) kurulacak bir sonraki kanaldır. Sinyal eksikliğinden kaynaklanan olası sorunlar, kilitleme aşamasının veya kazanç ayarlarının çok düşük olması veya kilitleme yazılımı içinde ofsetin çok yükseğe ayarlanmış olmasıdır. Ek olarak, kondenser konumu, iletilen ışığı fotodiyota odaklamak ve böylece SRS sinyalini optimize etmek için ayarlanabilir. Lazer/mikroskobun yanlış ayarlanması sinyal eksikliğine yol açacak, böylece konsantrasyon tahminleri azalacak ve geçirgenlik bilgisi eksikliği olacaktır. Pompanın ve Stokes ışınlarının lazer gücü, bireysel çalışmalar için optimize edilebilir. Bununla birlikte, kirişlerin güçlerinin her deney için aynı olması çok önemlidir. Replikalar arasındaki farklı lazer güçleri, konsantrasyonda yanlış farklılıklar verecektir, bu da API / formülasyondan ziyade kurulumdan kaynaklanacaktır.
Her çalışma benzersiz bir doz-süre (yani, formülasyonun ciltte bırakıldığı süre) gerektirecektir ve formülasyona bağlı olduğu için kutanöz API penetrasyonunu / permeasyonunu ölçmek için bağımsız olarak araştırılmalıdır. Bir protokol geliştirirken göz önünde bulundurulması gereken bir diğer husus, formülasyon uygulamasının tıkayıcı doğasıdır. Formülasyonun tıkayıcı veya tıkayıcı olmayan koşullar altında uygulanmak üzere tasarlanıp tasarlanmadığını bilmek önemlidir. Burada sunulan CRI metodolojisi ters çevrilmiş bir mikroskop kullanır; bu, cilt yüzeyinin yüzü aşağı dönük ve tıkayıcı ayarlar altında olduğu anlamına gelir. Dik bir mikroskop, tıkayıcı olmayan koşullara sahip olma fırsatı sağlayabilir; Bununla birlikte, cilt yüzeyi düz olmayabilir, bu da bu tür deneyleri zorlaştırır.
Bu deneylerin tıkayıcı doğasının tipik klinik kullanım olmadığı kabul edilmelidir; Bununla birlikte, bu çalışmalarda geçirgenlik yolları ayrıştırılmıştır. Burada sunulan CRI yöntemi, dermal mikrodiyaliz, dermal açık akışlı mikroperfüzyon, bant sıyırma veya IVPT çalışmaları gibi metodolojilerle ayırt edilemeyen mikro ölçekli değişiklikleri görselleştirme ve ölçme yeteneği sağlar. Hızlı dalga sayısı ayarlamasındaki son gelişmeler, cilt yapısının ve sessiz bölgenin dışındaki çoklu titreşim bağlarının eşzamanlı olarak ölçülmesinin yolunu açmıştır. Bununla birlikte, spesifik analitlerin katkısını cildinkinden ayrıştırmak için daha fazla hesaplama yöntemi hala geliştirilme aşamasındadır28. Bu aynı zamanda in vivo CRI çalışmaları için de özellikle önemlidir, ancak bu kurulumda tezgah üstünde kullanılan güçlere (odakta yaklaşık 50 mW) klinik kullanım için izin verilmeyebilir. Bu metodolojinin bir laboratuar tezgahından kliniğe çevrilme potansiyeli, araştırmacıların topikal ilaç geliştirmedeki ilerleme için çok önemli olan in vitro-in vivo ilişkileri geliştirmek için ilacın in vivo ve ex vivo geçirgenliğini aynı ortamda ölçmelerini sağlayabilir.
Bir deneysel çalışmadan elde edilen çok miktarda veri, site başına 10 görüntüden site başına 70 görüntüye kadar herhangi bir yerde olabilir. Doku parçası başına birden fazla bölge varsa, bu gigabaytlarca bilgiye yol açar. Görüntülerin kendileri küresel konsantrasyon-zaman verileri sağlar ve ön işleme tabi tutulmadan oldukları gibi ölçülür. Bununla birlikte, bu, geçirgenlik yolu verilerine ek olarak yerel biyodağıtım verileri çıkarılabildiğinden, CRI'nın faydasını en üst düzeye çıkarmaz. Görüntü segmentasyonu zaman alıcıdır, ancak diğer metodolojilerle mümkün olmayan ayrıntılı bilgi sağlar. Örneğin, stratum korneum (lipit bakımından zengin veya lipid bakımından fakir) boyunca tercih edilen penetrasyon yolunu tahmin etmek mümkündür, bu da hangi inaktif bileşenlerin belirli bir yola katkıda bulunabileceği veya ilaca bağımlı olup olmadığı konusunda fikir verebilir. Bir deneyin analizi, görüntü sayısına ve deneme süresine bağlı olarak birkaç saatten günlere kadar sürebilir. Bu nedenle, otomatik bir yaklaşım veri analizine yardımcı olacak ve cilt tabakalaşmaları arasında lipit bakımından zengin ve lipitten fakir bölgelerin tutarlı bir şekilde ek açıklamasını sağlayacaktır18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
CLE, birden fazla mikroskop üreticisine lisanslanmış olan CARS mikroskopisi için patentler üzerinde bir mucittir. Diğer tüm yazarların açıklanacak çıkar çatışmaları yoktur.
Acknowledgments
Yazarlar, Evans Grubu'ndan Dr. Fotis Iliopoulos ve Daniel Greenfield'a bu makaleyi tartışmaları ve düzeltmeleri için teşekkür eder. Buna ek olarak, yazarlar LEO Pharma'nın desteğini kabul etmek istiyor. Şekil 2 , BioRender.com ile oluşturulmuştur.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue Preparation | |||
| Autoclavable Biohazard Bags | FisherBrand | 22-044562 | As refered to in text: biohazard bags https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-polyethylene-biohazard-autoclave-bags-without-sterilization-indicator-8/22044562?searchHijack=true&searchTerm= 22044562&searchType=RAPID& matchedCatNo=22044562 |
| Cell Culture Buffers: Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution 1x | Corning | MT21030CV | As refered to in text: PBS https://www.fishersci.com/shop/products/corning-cellgro-cell-culture-buffers-dulbecco-s-phosphate-buffered-salt-solution-1x-8/MT21030CV?searchHijack=true&searchTerm= 21-030-cv&searchType= RAPID&matchedCatNo=21-030-cv |
| Disposable Scalpels | Exel International | 14-840-00 | As refered to in text: scalpel https://www.fishersci.com/shop/products/exel-international-disposable-scalpels-3/1484000?keyword=true |
| High Precision 45° Angle Broad Point Tweezers/Forceps | Fisherbrand | 12-000-132 | As refered to in text: forceps https://www.fishersci.com/shop/products/high-precision-45-angle-broad-point-tweezers-forceps/12000132#?keyword= |
| Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-Ply | Kimberly-Clark Professional Kimtech Science | 06-666 | As refered to in text: task wiper https://www.fishersci.com/shop/products/kimberly-clark-kimtech-science-kimwipes-delicate-task-wipers-7/06666 |
| Parafilm M Laboratory Wrapping Film | Bemis | 13-374-12 | As refered to in text: parafilm https://www.fishersci.com/shop/products/curwood-parafilm-m-laboratory-wrapping-film-4/1337412 |
| Petri Dish (35 mm x 10 mm) | Fisherbrand | FB0875711YZ | As refered to in text: small petri dish https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-specialty-6/FB0875711YZ?keyword=true |
| Petri Dish (60 mm x 15 mm) | Fisherbrand | FB0875713A | As refered to in text: large petri dish https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/FB0875713A?keyword=true |
| Surgical Scissors | Roboz | NC9411473 | As refered to in text: scissors https://www.fishersci.com/shop/products/scissors-327/NC9411473?searchHijack=true&searchTerm= RS-5915SC&searchType=RAPID& matchedCatNo=RS-5915SC |
| Laser/microscope | |||
| 650/60 nm BrightLine single-band bandpass filter | Semrock | As refered to in text: CARS filter - CH2 vibrations (645nm/60nm filter) | |
| Control box IX2-UCB | Olympus | As refered to in text: Control Box | |
| D700/30m | Chroma | As refered to in text: CARS filter - deuterated band https://www.chroma.com/products/parts/d700-30m |
|
| DeepSee Insight | Spectra-Physics | As refered to in text: Laser https://www.spectra-physics.com/f/insight-x3-tunable-laser |
|
| Digital Handheld Optical Power and Energy Meter Console | ThorLabs | PM100D | As refered to in text: power meter https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=3341 |
| Fluoview Software | Olympus | As refered to in text: Microscope Control software | |
| Frosted Microscope Slides | FisherBrand | As refered to in text: microscope slides https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-frosted-microscope-slides-4/22265446 |
|
| FV1000 | Olympus | As refered to in text: Microscope | |
| Incubation Chamber | Tokai Hit | GM-800 | As refered to in text: incubation chamber |
| Integrating Sphere Photodiode Power Sensor | ThorLabs | S142C | As refered to in text: photodiode https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=3341 |
| Power supply FV31-PSU | Olympus | As refered to in text: Power Supply | |
| Precision 4063, 80MHz Dual Channel Function Generator | BK Precision | As refered to in text: function generator | |
| ProScan – Precision Microscope Automation | Prior Scientific Instruments | As refered to in text: stage controller https://www.prior.com/microscope-automation/inverted-microscope-systems/proscan-linear-stage-highest-precision-microscope-automation |
|
| SecureSeal Imaging Spacers | Grace Biolabs | 654004 | As refered to in text: spacer https://gracebio.com/product/secureseal-imaging-spacers-654004/ |
| SRS Detection Kit | APE | As refered to in text: SRS detector | |
| UPLSAPO 20X NA:0.75 | Olympus | As refered to in text: 20X Objective https://www.olympus-lifescience.com/en/objectives/uplsapo/ |
|
| Lipid/Drug Imaging | |||
| 35 mm Dish, No. 0 Uncoated Coverslip, 14 mm Glass Diameter | MatTek Corporation | NC9711297 | As refered to in text: Glass bottom dish https://www.fishersci.com/shop/products/glass-bottom-mircrowell-dish/nc9711297 |
| Cotton-tipped applicators | FisherBrand | As refered to in text: Cotton-tipped applicator | |
| Distriman Postive Displacement Pipette | Gilson | As refered to in text: Postive Displacement Pipette https://www.fishersci.com/shop/products/gilson-distriman-positive-displacement-repetitive-pipette/F164001G#?keyword= |
|
| Distriman Postive Displacement Pipette Tips | Gilson | As refered to in text: Tips for pipette https://www.fishersci.com/shop/products/gilson-distritip-syringes-6/f164100g?keyword=true |
|
| Data Analysis | |||
| FIJI | Open-source | As refered to in text: FIJI/ImageJ https://imagej.net/software/fiji/ |
|
| Jupyter-Lab | open-source | As refered to in text: JupyterLab https://jupyter.org/ |
|
| Rstudio | Open-source | As refered to in text: Rstudio https://www.rstudio.com/ |
References
- Finnin, B., Walters, K. A., Franz, T. J. In vitro skin permeation methodology. In Transdermal and topical drug delivery: principles and methodology. Transdermal and topical drug delivery: principles and practice. Benson, H. E., Watkinson, A. C. , John Wiley & Sons. Hoboken NJ USA. 85-108 (2012).
- Shin, S. H., et al. On the road to development of an in vitro permeation test (IVPT) model to compare heat effects on transdermal delivery systems: exploratory studies with nicotine and fentanyl. Pharmaceutical Research. 34 (9), 1817-1830 (2017).
- Hossain, A., et al. Preparation, characterisation, and topical delivery of terbinafine. Pharmaceutics. 11 (10), 548 (2019).
- Santos, L. L., Swofford, N. J., Santiago, B. G. In vitro permeation test (IVPT) for pharmacokinetic assessment of topical dermatological formulations. Current Protocols in Pharmacology. 91 (1), 79 (2020).
- Iliopoulos, F., Caspers, P. J., Puppels, G. J., Lane, M. E. Franz cell diffusion testing andquantitative confocal Raman spectroscopy: In vitro-in vivo correlation. Pharmaceutics. 12 (9), 887 (2020).
- Cordery, S., et al. Topical bioavailability of diclofenac from locally-acting, dermatological formulations. International Journal of Pharmaceutics. 529 (1-2), 55-64 (2017).
- Pensado, A., et al. Stratum corneum sampling to assess bioequivalence between topicalacyclovir products. Pharmaceutical Research. 36 (12), 1-16 (2019).
- Zhang, Y., et al.
- Bodenlenz, M., et al. Open flow microperfusion as a dermal pharmacokinetic approach to evaluate topical bioequivalence. Clinical Pharmacokinetics. 56 (1), 91-98 (2017).
- Eirefelt, S., et al. Evaluating dermal pharmacokinetics and pharmacodymanic effect of soft topical PDE4 inhibitors:Open flow microperfusion and skin biopsies. Pharmaceutical Research. 37 (12), 1-12 (2020).
- Stagni, G., O'Donnell, D., Liu, Y. J., Kellogg, J. D. L., Shepherd, A. M. Iontophoretic current and intradermal microdialysis recovery in humans. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 41 (1), 49-54 (1999).
- Garcia Ortiz, P., Hansen, S. H., Shah, V. P., Menne, T., Benfeldt, E. Impact of adultatopic dermatitis on topical drug penetration: assessment by cutaneous microdialysis and tape stripping. Acta Dermato-Venereologica. 89 (1), 33-38 (2009).
- Joshi, A., Patel, H., Joshi, A., Stagni, G. Pharmacokinetic applications of cutaneous microdialysis: Continuous+intermittent vs continuous-only sampling. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 83, 16-20 (2017).
- Kuzma, B. A., et al. Evaluation of local bioavailability of metronidazole from topical formulations using dermal microdialysis: Preliminary study in a Yucatan mini-pig model. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 159, 105741 (2021).
- Begley, R., Harvey, A., Byer, R.
- Evans, C. L., et al. Chemical imaging of tissue in vivo with video-rate coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (46), 16807-16812 (2005).
- Hill, A. H., Manifold, B., Fu, D. Tissue imaging depth limit of stimulated Raman scattering microscopy. Biomedical Optics Express. 11 (2), 762-774 (2020).
- Feizpour, A., Marstrand, T., Bastholm, L., Eirefelt, S., Evans, C. L. Label-free quantification of pharmacokinetics in skin with stimulated Raman scattering microscopy and deep learning. Journal of Investigative Dermatology. 141 (2), 395-403 (2021).
- Ghosh, B., Reddy, L. H., Kulkarni, R. V., Khanam, J. Comparison of skin permeability of drugs in mice and human cadaver skin. Indian Journal of Experimental Biology. 38 (1), 42-45 (2000).
- Nielsen, J. B., Plasencia, I., Sørensen, J. A., Bagatolli, L. Storage conditions of skin affect tissue structure and subsequent in vitro percutaneous penetration. Skin Pharmacology and Physiology. 24 (2), 93-102 (2011).
- Barbero, A. M., Frasch, H. F. Effect of frozen human epidermis storage duration and cryoprotectant on barrier function using two model compounds. Skin Pharmacology and Physiology. 29 (1), 31-40 (2016).
- Babu, R., et al. The influence of various methods of cold storage of skin on the permeation of melatonin and nimesulide. Journal of Controlled Release. 86 (1), 49-57 (2003).
- Skelly, J. P., et al. FDA and AAPS report of the workshop on principles and practices of in vitro percutaneous penetration studies: relevance to bioavailability and bioequivalence. Pharmaceutical Research. 4 (3), 265-267 (1987).
- OECD. Guidance document for the conduct of skin absorption studies. OECD. , (2004).
- OECD. Test no. 428: Skin absorption: In vitro method. OECD. , (2004).
- Saar, B. G., et al. Video-rate molecular imaging in vivo with stimulated Raman scattering. Science. 330 (6009), 1368-1370 (2010).
- Saar, B. G., Contreras-Rojas, L. R., Xie, X. S., Guy, R. H. Imaging drug delivery to skin with stimulated Raman scattering microscopy. Molecular Pharmaceutics. 8 (3), 969-975 (2011).
- Pence, I. J., Kuzma, B. A., Brinkmann, M., Hellwig, T., Evans, C. L. Multi-windowsparse spectral sampling stimulated Raman scattering microscopy. Biomedical Optics Express. 12 (10), 6095-6114 (2021).
- Herkenne, C., et al. In vivo methods for the assessment of topical drug bioavailability. Pharmaceutical Research. 25 (1), 87-103 (2008).
- Alfonso-Garcıa, A., Mittal, R., Lee, E. S., Potma, E. O. Biological imaging with coherent Raman scattering microscopy: a tutorial. Journal of Biomedical Optics. 19 (7), 071407 (2014).
- Osseiran, S., et al. Longitudinal monitoring of cancer cell subpopulations in monolayers, 3D spheroids, and xenografts using the photoconvertible dye DiR. Scientific Reports. 9 (1), 1-10 (2019).
- Evennett, P. Kohler illumination: a simple interpretation. Proceedings of the Royal Microscopical Society. 28 (4), 189-192 (1983).
- Sanderson, J.
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Hunter, J. D. Matplotlib: A 2D graphics environment. Computing in Science & Engineering. 9 (3), 90-95 (2007).
- Wickham, H. ggplot2: Elegant Graphics for Data Analysis. , Springer-Verlag. New York. (2016).
- Kim, H., Han, S., Cho, Y. S., Yoon, S. K., Bae, K. Development of R packages:'Non-Compart' and 'ncar' for noncompartmental analysis (NCA). Translational and Clinical Pharmacology. 26 (1), 10-15 (2018).
