Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Visualisere og kvantifisere farmasøytiske forbindelser i huden ved hjelp av sammenhengende Raman Scattering Imaging

Published: November 24, 2021 doi: 10.3791/63264
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Wellman Center for Photomedicine, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School

Summary

En sammenhengende Raman spredning avbildningsmetodikk for å visualisere og kvantifisere farmasøytiske forbindelser i huden er beskrevet. Dette dokumentet beskriver hudvevsforberedelse (menneske og mus) og aktuell formuleringsapplikasjon, bildeanskaffelse for å kvantifisere romlige konsentrasjonsprofiler og foreløpig farmakokinetisk analyse for å vurdere aktuell legemiddellevering.

Abstract

Kutan farmakokinetikk (cPK) etter aktuell formuleringsapplikasjon har vært et forskningsområde av særlig interesse for regulatoriske og narkotikautviklingsforskere for mekanistisk å forstå aktuell biotilgjengelighet (BA). Semi-invasive teknikker, for eksempel tape-stripping, dermal mikrodialyse, eller dermal åpen-flow mikroperfusjon, alle kvantifisere makroskala cPK. Selv om disse teknikkene har gitt enorm cPK-kunnskap, mangler samfunnet en mekanistisk forståelse av aktiv farmasøytisk ingrediens (API) penetrasjon og permeasjon på cellenivå.

En ikke-invasiv tilnærming for å adressere mikroskala cPK er sammenhengende Raman-spredningsavbildning (CRI), som selektivt retter seg mot iboende molekylære vibrasjoner uten behov for ekstrinsiske etiketter eller kjemisk modifikasjon. CRI har to hovedmetoder - sammenhengende anti-Stokes Raman spredning (CARS) og stimulert Raman spredning (SRS) - som muliggjør sensitiv og selektiv kvantifisering av API-er eller inaktive ingredienser. CARS brukes vanligvis til å utlede strukturell hudinformasjon eller visualisere kjemisk kontrast. I motsetning til dette brukes SRS-signalet, som er lineært med molekylær konsentrasjon, til å kvantifisere API-er eller inaktive ingredienser i hudstratifikasjoner.

Selv om musevev ofte har blitt brukt til cPK med CRI, må aktuell BA og bioequivalens (BE) til slutt vurderes i humant vev før forskriftsmessig godkjenning. Denne artikkelen presenterer en metodikk for å forberede og bilde ex vivo hud som skal brukes i kvantitative farmakokinetiske CRI-studier i evalueringen av aktuell BA og BE. Denne metodikken muliggjør pålitelig og reproduserbar API-kvantifisering innen menneske- og musehud over tid. Konsentrasjonene i lipidrike og lipidfattige rom, samt total API-konsentrasjon over tid kvantifiseres; Disse brukes til estimater av mikro- og makroskala BA og potensielt BE.

Introduction

Metoder for å vurdere cPK etter aktuell legemiddelproduktapplikasjon har utvidet seg fra klassiske in vitro permeation testing (IVPT) studier 1,2,3,4,5 og tape-stripping 6,7,8 til ytterligere metoder som åpen-flow mikroperfusjon eller dermal mikrodialyse 9,10,11, 12,13,14. Det er potensielt forskjellige lokale steder for terapeutisk virkning avhengig av sykdommen av interesse. Derfor kan det være et tilsvarende antall metoder for å vurdere hastigheten og i hvilken grad en API kommer til det tiltenkte lokale handlingsstedet. Mens hver av de nevnte metodene har sine fordeler, er den største ulempen mangelen på mikroskala cPK-informasjon (dvs. manglende evne til å visualisere hvor API-en går og hvordan den gjennomsyrer).

En ikke-invasiv metodikk av interesse for å estimere aktuell BA og BE er CRI, som kan deles inn i to bildemodaliteter: CARS og SRS mikroskopi. Disse sammenhengende Raman-metodene muliggjør kjemisk spesifikk avbildning av molekyler via ikke-lineære Raman-effekter. I CRI er to laserpulstog fokusert og skannet i en prøve; Forskjellen i energi mellom laserfrekvensene er satt til å målrette vibrasjonsmoduser som er spesifikke for de kjemiske strukturene av interesse. Siden CRI-prosesser er ikke-lineære, genereres det bare et signal ved mikroskopfokuset, noe som gir mulighet for tredimensjonal farmakokinetisk tomografisk bildebehandling av vevet. I forbindelse med cPK har CARS blitt brukt til å innhente vevsstrukturinformasjon, for eksempel plasseringen av lipidrike hudstrukturer15. I motsetning har SRS blitt brukt til å kvantifisere molekylær konsentrasjon da signalet er lineært med konsentrasjon. For ex vivo hudprøver er det fordelaktig å utføre BILER i epi-retning16 og SRS i overføringsmodus17. Derfor vil vevsprøver som er tynne tillate SRS-signaldeteksjon og kvantifisering.

Som modellvev presenterer det nakne museøret flere fordeler med mindre ulemper. En fordel er at vevet allerede er ~ 200-300 μm i tykkelse og krever ikke ytterligere prøvepreparering. I tillegg ses flere hudstratifikasjoner ved aksialt å fokusere gjennom ett synsfelt (f.eks. stratum corneum, talgkjertler (SGs), adipocytter og subkutant fett)16,18. Dette muliggjør foreløpig preklinisk estimering av kutane permeasjonsveier og aktuelle BA-estimater før du går over til menneskelige hudprøver. Imidlertid presenterer den nakne musemodellen begrensninger som vanskeligheter med ekstrapolering til in vivo-scenarier på grunn av forskjeller i hudstruktur19. Mens nakenmusøret er en utmerket modell for å oppnå foreløpige resultater, er den menneskelige hudmodellen gullstandarden. Selv om det har vært forskjellige kommentarer om egnetheten og anvendbarheten av frossen menneskelig hud for å nøyaktig rekapitulere in vivo permeation kinetikk 20,21,22, er bruk av frossen menneskelig hud en akseptert metode for evaluering av in vitro API permeation kinetikk 23,24,25 . Denne protokollen visualiserer ulike hudlag i mus og menneskelig hud mens den kvantifiserer API-konsentrasjoner i lipidrike og lipidfattige strukturer.

Mens CRI har blitt brukt på tvers av en rekke felt for å spesifikt visualisere forbindelser i vev, har det vært begrenset innsats for å undersøke cPK av topisk anvendte narkotikaprodukter. For å evaluere den aktuelle BA/BE av aktuelle produkter ved hjelp av CRI, er det nødvendig å først ha en standardisert protokoll på plass for å gjøre nøyaktige sammenligninger. Tidligere forsøk på å bruke CRI for legemiddellevering til huden har vist variasjon i dataene. Siden dette er en relativt ny anvendelse av CRI, er det viktig å etablere en protokoll for å oppnå pålitelige resultater 18,26,27. Denne tilnærmingen retter seg bare mot ett spesifikt bølgenummer i den biologiske stille regionen i Raman-spekteret. Imidlertid har de fleste API-er og inaktive ingredienser Raman-skift innenfor fingeravtrykksregionen. Dette har tidligere skapt utfordringer på grunn av det iboende signalet som oppstår fra vevet i fingeravtrykksregionen. Nylige laser- og beregningsmessige fremskritt har fjernet denne barrieren, som også kan brukes i kombinasjon med tilnærmingen som presenteres her28. Denne tilnærmingen som presenteres her tillater kvantifisering av en API, som har et Raman-skifte i det stille området (2000-2300 cm-1). Dette er ikke begrenset til stoffets fysiokjemiske egenskaper, noe som kan være tilfelle for noen tidligere nevnte cPK-overvåkingsmetoder29.

Protokollen må redusere variasjon i prøve-til-prøve-variasjon i hudtykkelsen for ulike preparater, da tykke menneskelige hudprøver vil gi minimalt signal etter påføring av legemiddelprodukter på grunn av lysspredning av den tykke prøven. Et mål med dette manuskriptet er å presentere en vevsforberedelsesmetodikk som sikrer reproduserbare bildestandarder. I tillegg er CRI-systemet satt opp som beskrevet for å redusere potensielle feilkilder samt minimere signal-til-støy. Dette dokumentet vil imidlertid ikke diskutere de veiledende prinsippene og tekniske fordelene ved CRI-mikroskopet, da dette tidligere har blitt dekket30. Til slutt utforskes den omfattende dataanalyseprosedyren for å muliggjøre tolkning av resultatene for å bestemme et eksperiments suksess eller fiasko.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bruken av naken mus ørevev ble godkjent av Massachusetts General Hospital Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC), mens bruken av menneskelig hudvev ble godkjent av Massachusetts General Hospital Institutional Review Board (IRB). I henhold til IACUC-protokoller ble ny euthanized mus hentet fra samarbeidspartnere med nakne muskolonier. Humant vev ble anskaffet fra valgfrie abdominoplastikkprosedyrer ved Massachusetts General Hospital via en godkjent protokoll. I tillegg ble spesifikke vevstyper annet enn bukhud anskaffet via en kroppsdonasjonsmyndighet, også gjennom en IRB-godkjent protokoll.

1. Fremstilling av vev

  1. Forberedelse av naken mus øre hudvev
    1. Etter å ha kjøpt nyhøste nakne musekropper, fjern ørene ved hjelp av tang og mikrokirurgisk saks. Legg det ene øret i en liten Petri-tallerken (dvs. 35 mm x 10 mm). Plasser den nakne musekroppen i en biofarepose som skal kastes i samsvar med lokale IACUC-protokoller.
    2. Skyll hvert museøre med fosfatbufret saltvann (PBS) og klapp det forsiktig tørt med en oppgavevisker. Gjenta to ganger for å fjerne eventuelt gjenværende smuss eller rusk på øret som kan påvirke bildekvaliteten (se figur 1).
    3. Hvis øret skal brukes innen 24 timer, legg det i en liten Petri-tallerken (dvs. 35 mm x 10 mm) med fersk PBS i kjøleskap (2-8 °C). Hvis øret skal brukes etter 24 timers høsting, legg det i en Petri-tallerken (35 mm x 10 mm) uten PBS, dekk parabolen med parafilm og legg den i en -20 °C fryser.
  2. Fremstilling av menneskelig hudvev
    1. Etter anskaffelsen av humant vev, plasser det i en stor Petri-tallerken (dvs. 60 mm x 15 mm) i en biologisk hette for å gi nok plass til prøvepreparering.
    2. Plasser stratum corneum-siden vendt ned slik at det subkutane fettet er tilgjengelig.
    3. Bruk tang og mikrokirurgisk saks, begynn å forsiktig fjerne det subkutane fettet. Når subkutant fett ikke lenger kan fjernes med saksen, bytt til en 10-blads engangs skalpell (eller tilsvarende) for å fjerne det gjenværende subkutane fettet. Bruk skalpellen i en 45° vinkel mot huden mens du holder huden stille med tang (se figur 1).
      MERK: For å ha SRS-bilder av høy kvalitet, må prøvene være så tynne som mulig uten å bli punktert.

Figure 1
Figur 1: Bilder av ideell tykkelse for avbildning av mus og menneskelig hud. (A) Musens ørehud holdt opp mot lys, noe som synlig kan slippe lys gjennom. (B) Ideell menneskelig hud holdt opp til lys etter tilberedning. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

  1. Del den menneskelige huden i 1 cm x 1 cm stykker.
    MERK: Frisk hud, kan brukes i opptil 24 timer uten bruk av en agarose gel seng, som beskrevet tidligere31. Frisk hud kan imidlertid brukes lenger hvis den holdes på en agarose gel seng. Hvis huden skal brukes senere, plasseres huden i en prøvetransportpose og plasseres deretter i en -20 °C fryser. Frossen hud må tines ved hjelp av prosedyren nedenfor for optimale resultater (se trinn 3.1.2).

2. Laser- og mikroskopoppsett

  1. Omtrent 30 min før bildebehandling, slå på den vidt justerbare ultraraske laseren (heretter referert til som laseren) og la den varme opp. Aktiver laservarslingsskiltet/låsesystemet for å varsle personell utenfor potensiell fare ved innkjøring.
    MERK: Riktig briller må alltid brukes når du arbeider med klasse IV-lasere. For den spesifikke laseren som brukes her, er det anbefalte riktige eyewear OD ≥ 6 for arbeidsområdet til laseren 800-1300 nm.
  2. Mens laseren varmes opp, aktiverer du gjenværende maskinvare for mikroskopkontroll, CARS-deteksjon og SRS-deteksjon.
  3. Juster mikroskopet riktig for å sikre optimal avbildning. I vinduet Image Acquisition Control i mikroskopkontrollprogramvaren (heretter MC-programvare) klikker du på overføringslampen for å la lyset komme fra mikroskopets transilluminasjonslampe.
  4. Sørg for riktig Köhler-belysning for å justere mikroskopet langs den vertikale aksen: Lukk iris ned slik at en minimumsmengde lys ses gjennom øyestykket32.
  5. Mens du ser gjennom okularet, åpner du iris for å se om polygonen berører alle sider samtidig. Juster kondensatorhøyden hvis en polygonfigur ikke kan ses før du åpner iris.
  6. Hvis polygonformen ikke berører alle sidene samtidig, justerer du blenderjusteringsposisjonen ved hjelp av justeringsknappene.
    MERK: Se Sanderson et al.33 for et dyptgående mikroskopoppsett.
  7. Plasser et mikroskop med deksler og dobbeltsidig selvklebende avstandsstykke som inneholder en oljeprøve (f.eks. olivenolje, da det er mange -CH2-bindinger i oljer) på mikroskopets trinnholder.
  8. I vinduet for anskaffelsesinnstillinger i MC-programvaren finner du rullegardinmenyen for mikroskopet og setter mikroskopmålet til 20x.
  9. Kontroller at CARS-deteksjonsfilteret (645 nm/50 nm) er i posisjon til å visualisere og måle epiCARS-signalet langs mikroskopets sideport-fotomultiplikatorrør.
    MERK: Dette spesifikke filteret er valgt for avbildning av lipider som anti-Stokes CARS-signal generert ved 652 nm for en pumpebølgelengde på 803 nm og en Stokes bølgelengde på 1040 nm (se Eq. (1)).
    Equation 1 (1)
    Hvor λ-variablene har enheter av NM; λpumpe er pumpestrålebølgelengden; og λStokes er Stokes strålebølgelengde.
  10. Se gjennom okularet for å finne kanten på oljeprøven, som vil bli brukt til å verifisere justeringen av systemet.
  11. Kontroller at kanten er i Z-fokus ved hjelp av fokusknappene på mikroskopet, og juster trinnkontrolleren for å få XY-fokus.
  12. Etter at laseren har varmet opp, sett pumpestrålen til 803 nm med motorens finjustering satt til 50,0 i laserens grafiske brukergrensesnitt. Den nøyaktige motorfinjusteringen som brukes, kan variere fra oppsett til oppsett.
    MERK: Pumpestrålen er den eneste strålen med en justerbar bølgelengde på denne laseren, da Stokes strålebølgelengde er festet til 1040 nm. Denne konfigurasjonen er rettet mot CH-vibrasjonen ved 2850 cm-1 (se Eq. (2) for å beregne pumpebølgelengden for bølgenummermålretting).
    Equation 2 (2)
    Hvor Equation 3 har enheter av relativ bølgenummer (cm−1), og λ variabler har enheter i cm.
  13. Kontroller justeringen av laseren i mikroskopet før avbildning; se figur 2 for fremstilling av laserbanen. Under det første oppsettet av mikroskopet installerer du to iriser i strålebanen som guider for riktig justering i mikroskopet. Ettersom laserens optiske bane kan drive over tid, må du sørge for at laserstrålebanene krysser midten av irisene slik at de kommer riktig inn i mikroskopet.
  14. Bruk IR-betrakteren til å lukke alle irisene helt og sørg for at strålen er sentrert på begge: først på iris nærmest laseren og til slutt ved mikroskopinngangsporten.
  15. Kontroller først pumpestrålen for å sikre at strålen går rett inn i mikroskopet. Når pumpen er justert, må du kontrollere at Stokes-strålen også går riktig inn i mikroskopet.
    1. Hvis bjelkene ikke er justert gjennom irisene, kan du gå gjennom bjelkene gjennom irisene ved hjelp av x- og y-justeringsknappene på de to speilfestene for pumpen og Stokes strålebaner.
  16. Når stråleflekkene overlapper før du går inn i mikroskopet, må du kontrollere at de passerer mikroskopet riktig.
    1. I vinduet Image Acquisition Control i MC-programvaren klikker du på TD-kanalen for overføring, ALG1 (analog kanal 1) for den sammenhengende anti-Stokes Raman-kanalen og ALG2 (analog kanal 2) for den stimulerte Raman-spredningskanalen. Bruk følgende innstillinger (som i denne protokollen): Forsterkning av 1 og en forskyvning på -1 for ALG1, forsterkning på 1,25 og forskyvning på -2 for ALG2.
      MERK: Analoge kanaler kan ha forskjellig nummerering for individuelle bildekanaler, avhengig av systemkonfigurasjonen. Hvis SRS-detektoren er på plass, vil det ikke være noe overføringssignal, da det ikke kan komme lys gjennom (dvs. man kan ikke visualisere bilder med TD og ALG2 samtidig i dette oppsettet).

Figure 2
Figur 2: Skjematisk oppsett for sammenhengende Raman-laseravbildningsbane. Bjelker er uavhengig betinget for spotstørrelse og matchet via tidsforsinkelsesstadium for å generere sammenhengende Raman-spredning i prøver for ønsket innstillingsfrekvens. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

  1. Slå på kraftmåleren, og mål pumpens kraft og Stokes-bjelker individuelt for eksperimentet ved hjelp av en kraftig termisk kraftsensor.
    MERK: I dette spesifikke eksemplet var pumpestrålekraften 80 mW, mens Stokes strålekraft var 180 mW før inngangen til mikroskopet.
  2. I vinduet Image Acquisition Control klikker du på Focus x2-knappen for å vise bildet i MC-programvaren.
  3. I vinduet Anskaffelsesinnstillinger må du kontrollere at pikselforholdet og oppholdstiden er satt til de ønskede parameterne for eksperimentet.
    MERK: Et forhold på 1 024 x 1 024 piksler og en oppholdstid på 2 μs/pixel ble brukt i denne protokollen.
  4. Bekreft laserjusteringen med hensyn til mikroskopet ved å fjerne blokkeringen av pumpestrålen og se på TD-kanalen .
    MERK: Laseren er riktig justert hvis strålen er sett sentrert i bildet med de riktige detektorinnstillingene.
  5. Ellers bruker du X- og Y-justeringsknapper på periskopet for å omplassere strålen til midten av bildet.
  6. Bekreft laser- og mikroskopjustering ved å se det samme bildet i både CARS- og SRS-kanalene.
  7. Hvis du vil hente justeringsbildet, klikker du på XY-skanneknappen i vinduet Bildeanskaffelseskontroll med riktig filtermodus angitt (f.eks .
  8. Lagre dette settet med bilder med et beskrivende filnavn for å sammenligne over tid og bekrefte systemytelsen/justeringen.

3. Lipid bildebehandling

  1. Museøre og menneskelig vev
    1. Hvis du bruker ferskt vev, hopper du over trinn 3.1.2.
    2. Fjern musens ørehud fra -20 °C fryseren og legg den i et inkubasjonskammer (32 °C) i 10 minutter. Fjern museøret fra inkubasjonskammeret.
      MERK: Se trinn 1.1.2. for forberedelse av museørehud. Grov håndtering eller skraping av vevet kan føre til mekanisk nedbrytning, ødeleggelse eller forstyrrelse av vevet, spesielt stratum corneum.
    3. Hvis du bruker et nakent museøre, plasserer du den fremre delen av øret vendt mot glassbunnen på en 35 mm, nr. Hvis du bruker menneskelig hud, plasser den med stratum corneum med forsiden ned, da dette vil tillate legemiddel kvantifisering fra de overfladiske lagene til de dypere lagene (figur 1).
      MERK: Den bakre delen av det nakne museøret er mer utsatt for ufullkommenheter fra huset. Hvis menneskelig hud ikke er plassert med stratum corneum side vendt nedover på det omvendte mikroskopet, vil man ikke kunne se forbi dermis, da det er en god del lys spredt, og stoffet som gjennomsyrer stratum corneum kan ikke ses.
    4. Når vevet er sentrert på glassbunnen, bruk en bomullsspisset applikator for å sikre at huden er flat og har fullstendig kontakt med dekslene på glassbunnsfatet.
      MERK: Dette er et trinn som kan forårsake problemer mens du forestiller huden hvis den ikke er helt flat.
    5. Plasser en skive på toppen av huden for å forhindre bevegelse under avbildning. Sørg for at vevet er synlig gjennom senterhullet på skiven for SRS-overføringsdeteksjon.
    6. Fjern glidetrinninnlegget og erstatt det med inkubasjonskammeret, som har den enkle tallerkeninnsatsen.
    7. Plasser glassbunnsfatet med hudvevet i den enkle tallerkenfestet til inkubasjonskammeret.
      MERK: Alternativt kan du bruke en 6-brønns plate for å avbilde flere hudprøver og formuleringer samtidig.
    8. Reduser pikselforholdet i vinduet Anskaffelsesinnstillinger i MC-programvaren (f.eks. fra 1 024 x 1 024 til 512 x 512) for raskere galvoskanningshastighet mens Z-dybden endres for å finne stratum corneum (se figur 3A for mus eller figur 3E for menneske).
    9. Når stratum corneum er funnet, registrer den aksiale posisjonen som nullposisjonen i vinduet Anskaffelsesinnstillinger og endre pikselforholdet for hvert enkelt eksperiment (f.eks. 1 024 x 1 024).

Figure 3
Figur 3: Eksempel på huddybder oppnådd ved hjelp av SRS. Det øverste settet med bilder er fra naken mus øre hud som viser følgende: (A) stratum corneum, (B) talgkjertler, (C) adipocytter, (D) subkutant fett. Det nederste settet med bilder er hentet fra menneskelig hud som viser følgende: (E) stratum corneum, (F) papillær dermis og (G) en talgkjertel. Skalastenger = 100 μm. Både mus og menneskelige hudbilder ble anskaffet ved hjelp av et 20x mål på 1024 piksler x 1024 piksler; den menneskelige SG ble tatt på 512 x 512 piksler. Forkortelser: SRS = stimulert Raman spredning; SG = talgkjertel. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

4. Anvendelse av aktuell formulering

  1. Pipette den forhåndsbestemte formuleringsdosen på huden (f.eks. 10 μL/cm2).
    MERK: Formuleringens viskositet vil spille en rolle i pipettevalget. Bruk av en positiv forskyvningspipette for viskøse formuleringer, for eksempel kremer eller geler, og en luftforskyvningspipette for løsninger anbefales. I dette eksperimentet var ruxolitinib modellforbindelsen i en enkel løsning av propylenglykol (propan-1,2-diol).
  2. Bruk stempelspissen fra en sprøyte, eller en hanskefinger, gni formuleringen i en bevegelse med urviseren i 30 s. Legg merke til tidspunktet da formuleringen brukes til senere cPK-analyse (se trinn 6.15-6.17 nedenfor).
    MERK: Varigheten av søknaden avhenger av eksperimentet; hver og en kan være forskjellig.
  3. Etter at den tildelte tiden for formuleringen for å gjennomsyre har gått, fjern overflødig formulering og plasser huden med formuleringssiden vendt mot glassbunnsfatet.
    MERK: Formuleringen fjernes ved hjelp av en delikat oppgavevisker eller en liten (~1 tomme) 3D-trykt squeegee i en enkelt retning (f.eks. fra nord til sør).

5. Eksperimentelt oppsett for legemiddel kvantifisering

  1. Sett pumpestrålen på 803 nm. Kontroller pumpen og Stokes strålekrefter med fotodioden for å sikre at de er de ønskede kreftene for eksperimentet. Fjern blokkeringen av hver stråle individuelt for å måle kraften og blokkere bjelkene på nytt.
    MERK: I dette spesifikke eksemplet var pumpestrålekraften 100 mW, mens Stokes bjelkekraft var 180 mW.
  2. Legg glassbunnsfatet i et inkubasjonskammer med en innsats for en glassbunnsfat. Fest parabolen med klips for å forhindre bevegelse under avbildning.
  3. Slå på overføringslampen i MC-programvaren. Når du ser gjennom okularet, justerer du aksialfokuset med justeringsknappen for å sikre at vevet er i fokus.
  4. Fjern blokkeringen av både pumpen og Stokes-bjelkene. Kontroller at ALG1- og ALG2-kanaler er aktivert, og klikk deretter Fokus x2 på MC-programvaren for å visualisere huden i CARS- og SRS-kanalene. Kontroller at SRS-fotodioden er på plass over kondensatoren.
  5. Klikk Matl (Multi Area Time Lapse) på rullegardinmenyen Enhet. Se etter en XY Stage Warning som skal vises. Når fasen beveger seg for å finne den mekaniske opprinnelsen, klikker du OK.
  6. Gå til Vis i MATL-modulen, og klikk deretter Registrert punktliste i MC-programvaren. Begynn å legge til enten 1) spesifikke dybder i huden (dvs. stratum corneum, SGs, adipocytter, subkutant fett som bestemt under levende bildebehandling med lipidjustert kontrast) eller 2) XY-posisjoner hvis hele dybdebunker skal tas. Se figur 3 for eksempler.
    1. Når stratum corneum er identifisert, bla gjennom aksialfokuset (eller z-fokus) for å identifisere spesifikke vevsstratifikasjoner nevnt ovenfor. Se figur 3 for eksempler på menneske- og musehud.
    2. Når det gjelder bildebehandling av bestemte dybder i motsetning til fullstendige Z-dybdestakker, klikker du Registrer punkt for hver hudstratifisering for å legge det til i MATL-køen. Hvis du vil ha full dybdestakker, klikker du Registrer punkt for hver XY-posisjon med dybdevalg i vinduet for anskaffelsesparametere .
    3. Når alle de ønskede XY-posisjonene (full Z-depth stacks) eller XYZ (spesifikke hudstratifikasjoner) er registrert i MATL-programvaren, endrer du filkatalogen og navnet på en måte som vil være konsistent gjennom forsøkene for bilde- og cPK-analyser (se trinn 6.15- 6.17).
  7. Sett antall gjentakelser til 1 i MATL-modulen, og klikk På klar. Vent til Spill av endres fra en grå til en svart pil, noe som indikerer at programvaren er klar. Trykk Spill av for å begynne å forestille deg den foreløpige lipidstakken (heretter Lipid-bilder).
    MERK: Dette vil bli brukt til å skille lipidrike og lipidfattige områder av individuelle vevsstratifikasjoner under analyse. Syklusen og den totale tiden er angitt nederst til høyre på listen over registrerte punkt.
  8. Når syklusen er fullført, blokker både pumpen og Stokes bjelker. Endre bølgelengden på det grafiske laserbrukergrensesnittet til ønsket bølgelengde basert på den målrettede bølgenummer- eller Raman-vibrasjonen.
    MERK: For eksempel brukes 843 nm for pumpestrålen til å målrette mot 2250 cm-1 ved hjelp av Eq. (2), og motorjusteringen endres til 50,1. Eksempelmedisinen som presenteres her, ruxolitinib, inneholder en nitril som kan målrettes mot 2250 cm-1. Bølgetallet som er rettet mot hudstruktur vil alltid være det samme (2850 cm-1); Bølgenummeret for en API kan imidlertid være et hvilket som helst bølgenummer, men må være kjent eller beregnet a priori.
  9. Juster det manuelle tidsforsinkelsesstadiet (figur 2) for å sikre overlapping i tide for den nye bølgelengden og pumpestrålekraften. Forsikre deg om at de samme kreftene brukes til både lipid- og API-avbildning, som er etablert a priori.
  10. Bruk varigheten per syklus til å beregne totalt antall repetisjoner som kreves per eksperiment. Bare del det totale ønskede tidsforløpet for eksperimentet etter syklusvarigheten.
    MERK: Syklusvarigheten er en funksjon av bildestørrelse, pikselboetid, Kalman-gjennomsnitt og antall bilder per syklus. Optimalisering av disse parametrene vil forkorte syklustiden, og dermed øke temporal oppløsning.
  11. Når det totale antallet syklus repetisjoner er valgt, fjern blokkeringen av pumpestrålen, kontroller strømmen ved hjelp av fotodioden, og sørg for at den samsvarer med den ønskede effekten. Til slutt fjerner du blokkeringen av Stokes-strålen for å tillate avbildning.
  12. Trykk Spill av for å starte automatisk bildebehandling av settpunktene.
  13. Når MATL-bildet er fullført, bytter du pumpestrålen tilbake til 803 nm og justerer strømmen tilbake til den opprinnelige lipidavbildningseffekten som ble brukt i trinn 5.1.
  14. Som i tidligere trinn, endre filnavnet slik at det er konsekvent for innleggseksperimentbilder gjennom hele studien.
  15. Sett antall gjentakelser til 1.
  16. Klikk Klar | Spill av-knappen for å skaffe deg en lipidstabel etter tidsforløpet og sikre at det ikke har vært noen vevsbevegelse under avbildning (figur 4).

Figure 4
Figur 4: Vevsbevegelse i naken museørehud demonstrert ved å visualisere talgkjertler. Eksempel på begrenset vevsbevegelse er avbildet i A og B, mens betydelig vevsbevegelse er avbildet i C og D. (A) viser talgkjertlene på tidspunktet for formuleringsapplikasjonen og (B) samme dybde på 120 min etter påføring. (C) Mus talgkjertler på tidspunktet for formulering søknad og (D) 120 min etter formulering søknad; talgkjertlene er knapt synlige, noe som er en indikasjon på at dette eksperimentet ikke målte opptaket i talgkjertlene for hele eksperimentell varighet. Skalastenger = 100 μm. Bildene er 1024 piksler x 1024 piksler. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

6. Dataanalyse

  1. Hent bilder som . OIB (eller . OIR avhengig av mikroskop og MC-programvare) filtyper med hver XYZ posisjon har en egen undermappe.
  2. Kompiler lipidbilder med API-kanalbilder ved å gi lipidbilder nytt navn med følgende slutt _lipid.oib.
  3. Utfør følgende trinn med hver hudstratifisering (demonstrert her ved hjelp av bare SG-stratifiseringen for enkelhets skyld; se figur 3B).
    1. Importer et SG lipidbilde til ImageJ (eller Fiji)34 og merk av i boksen merket Split Channels for å dele filen inn i CARS- og SRS-kanalene.
      MERK: Fiji vil dele filen inn i antall bilder som er anskaffet under eksperimentet på tvers av antall kanaler.
    2. Åpne interesseområdet (ROI) ved å klikke Analyser | Verktøy | ROI Manager.
    3. Bruk SRS-kanalen (f.eks. C = 1) til å avgrense en SG i bildet.
      MERK: Bærekraftsmålene er de lyse stedene på grunn av målrettet -CH2-vibrasjon.
    4. Legg dette til i ROI-behandling ved å klikke Legg til [t] i ROI-behandling eller trykke på t på tastaturet. Gjenta denne prosessen for hver SG i bildet.
    5. Hvis du vil maskere ut lipidrike områder, merker du hver avkastning og klikker kategorien Mer | OR (kombiner) | Legg til i ROI-behandling.
    6. Hvis du vil maskere ut lipidfattige områder, bruker du rektangelverktøyet på FIJI-menyen og tegner en firkant rundt hele bildet. Legg dette til i ROI-lederen.
    7. Klikk på den nylig tillagte firkantede avkastningen i tillegg til avkastningen som velger alle lipidrike regioner i ROI-lederen. Under Mer velger du XOR for å generere en maske av lipidfattige områder og legge den til i ROI-lederen.
  4. Last inn API-bildene i Fiji.
  5. Sett sammen bildene i numerisk rekkefølge (dvs. bilde0001, bilde0002, bilde0003 osv.) ved hjelp av følgende menysekvens: Bilde | Stabler | Verktøy | Kjede sammen.
    1. Alternativt kan du importere disse bildene ved å laste inn et av bildene i Fiji og deretter velge et alternativ som heter Gruppefiler med lignende navn på oppsettsiden .
      MERK: Dette gir muligheten til å importere alle bilder med et lignende filnavn og sette dem sammen automatisk.
  6. Mens du har det sammenkoblede bildet aktivt, går du til ROI-lederen, velger lipidrike områder (dvs. SG), klikker Mer og velger Multi-measure. Vent til Resultat-vinduet vises.
  7. Se etter Område, Gjennomsnitt, Min, Maks og Median i standardinnstillingene for måling. Hvis andre beregninger ønskes for analyse, aktiverer du disse alternativene ved å merke av i den relevante avmerkingsboksen i vinduet Angi mål (Analyser | Angi mål ...).
  8. Eksporter dataene fra resultatvinduet til et regneark, og legg til en kolonne med tittelen Region.
  9. Legg lipidrike til hver datarad for lipidrike områder. Legg lipidfattig til regioner som var utenfor lipidene.
  10. Legg til en kolonne med tittelen lag , og legg til det respektive laget som ble analysert (Tilleggstabell S1).
  11. Gjenta trinn 6.5 - 6.7 for lipidfattige områder mens riktig avkastning er valgt.
  12. Hvis du vil visualisere dataene, lagrer du regnearket og importerer det til JupyterLab (pakkematplotlib)35 eller i R (pakke ggplot2)36. Tegn inn dataene som en funksjon av bildenummeret i forhold til gjennomsnittsintensiteten for å beregne konsentrasjonstidsdataene. (Figur 5).
  13. Importer regnearket til RStudio for å utføre ikke-samsvarende analyser (NCA) for farmakokinetisk analyse av CRI-dataene.
  14. Legg til en kolonne med tittelen klokkeslett.
  15. For Image0001 beregner du varigheten mellom formuleringsprogrammet og det første bildet.
    MERK: Dette er første gang. Syklusvarigheten brukes til å beregne de gjenværende bildene (og dermed tidspoengene) som øker over tid. For eksempel, hvis tiden siden søknaden er 30 min, vil Image0001 ha et tidspunkt på 30 min, og med en syklusvarighet på 8 min, vil Image0002 ha et tidspunkt på 38 min, Image0003 vil ha et tidspunkt på 46 min og så videre.
  16. Kjør Kystverket i RStudio (ved hjelp av NonCompart-pakken)37 på intensitetstidsdataene som er importert fra regnearket, med følgende kall for ett lag/område:
    sNCA(x = tid, y = gjennomsnitt, dose = 1, timeUnit = "s", doseUnit ="mg")
    Der x refererer til tidspunkter, refererer y til intensitet, og dosen kan etterlates som en, beregnet som mM-dosen av legemidlet i formuleringen eller produktdosen.
    MERK: Kystverkets utgang vil gi parametere som Cmax og AUCalle. Men siden dette er ex vivo-hud , er disse parametrene faktisk Jmax og AUCflux-all.
  17. Sammenlign Jmax - ogAUC-flux-all-beregningene visuelt ved å plotte dem (figur 6) i tillegg til statistiske sammenligninger på tvers av eksperimentelle forhold. Se figur 6 for eksempel analyse av ex vivo CRI-studier.
    MERK: De aktuelle statistiske prøvene er betinget av hvert enkelt datasett. Det er også viktig å merke seg at alle farmakokinetiske parametere er logg-normalt distribuert, og eventuelle sammenligninger må bruke logg-transformerte (naturlig logg eller log10) data.

Figure 5
Figur 5: Intensitet kontra tidsprofiler. (A) Et eksempel på fluxprofiler som har nådd metning og dermed bare en nedgang i intensiteten ses. Hver avkastning har en annen fluxprofil for å demonstrere heterogeniteten i dataene man kan skaffe seg. (B) Et eksempel på konsentrasjoner som øker etter at avbildningen har begynt. Hver avkastning er et annet synsfelt (indikert av de forskjellige fargesporene) i samme vev i samme eksperiment. I tillegg til globale konsentrasjoner er det evnen til å belyse hvilket lokalmiljø en API / formulering foretrekker som indikert av lipidrike og lipidfattige regioner. Profilene som presenteres i A indikerer at det ikke er noen absorpsjon av stoffet i vevet, da API-en allerede har gjennomsyret og begynt å forlate vevet når avbildningen har startet. Men i B har vevet ikke nådd metning, og det er fortsatt absorpsjon av API etterfulgt av eliminering. Segmentering av bilder til lipidrike og lipidfattige vil hjelpe til med belysningen av lokaliseringen av API (eller inaktive) og permeasjonsveiene inn i huden (dvs. stratum corneum). En høyere konsentrasjon i de lipidrike regionene indikerer at API-en lokaliserer innenfor lipidstrukturen til laget som undersøkes, noe som hjelper til med målrettet informasjon om levering av narkotika. Forkortelser: AVKASTNING = interesseområde; API = aktiv farmasøytisk ingrediens. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Avbildning anses som vellykket hvis vevet ikke har beveget seg betydelig i verken aksial (<10 μm) eller lateral retning etter at eksperimentet er fullført (figur 4). Dette er en umiddelbar indikasjon hvis SRS-målingen for API av interesse ikke er representativ for den opprinnelige dybden, for hvilken kvantifisering er lagspesifikk. Dette reduseres ved å avbilde z-stabler for hver XY interesseposisjon, med avveiningen som den tidsmessige oppløsningen. Hvis frossen hud brukes i disse studiene, er penetrasjonen og permeasjonen av API-en rask sammenlignet med frisk hud, og minimal tid mellom formuleringsapplikasjon og starten av avbildning er viktig. En annen vurdering er målet som brukes for forsøkene. Hvis du bruker et 60x mål, er det relativt enkelt å velge en flat overflate innenfor et enkelt synsfelt (FOV). Men for et 20x mål er det viste feltet mye større, og dermed er et viktig skritt i vevspreparatet å sikre jevn kontakt av huden med glassbunnavbildningsfatet. En flat FOV og lignende dybde sammenlignet med den opprinnelige dybden i FOV er to nøkler til positive resultater.

Justeringen av laseren, i tillegg til det dynamiske området i bildet, må adresseres med største forsiktighet. Feiljustering av laserpulstogene inn i mikroskopet kan føre til en rekke problemer, inkludert lave signalnivåer eller ujevnt begeistrede FOVer, noe som kan gi opphav til bilder med lav kontrast. En annen vurdering er å sikre at hele det dynamiske spekteret av intensitetsverdier brukes når du anskaffer bilder; Ellers komprimeres bildedataene, og konsentrasjonsforskjeller kan være vanskelige å oppdage.

Et annet hensyn er at hud heterogenitet kan gi opphav til variasjon i de beregnede mikroskala fluxprofilene innenfor samme datasett. Intensitetene (en proxy for konsentrasjoner) begynner høyt og synker over eksperimentell varighet (figur 5A), mens andre studier indikerer en økning etterfulgt av en reduksjon i flux over eksperimentell varighet (figur 5B). For tiden kan absolutt konsentrasjons kvantifisering ikke skje umiddelbart på grunn av det eksperimentelle oppsettet. Dermed er konsentrasjoner som reduseres etter påføring muligens et resultat av metning innenfor dybden av interesse, og kvantifiseringen representerer bare API-eliminering. Hvis det dynamiske området ikke er stort nok eller huden er for tykk, vil visuell inspeksjon gjøre konsentrasjonene stillestående slik at det ikke skjer noen endring i bildebehandlingsvarigheten. Dette er en funksjon av både et suboptimalt dynamisk område og hudtykkelse, noe som vil foreslå et behov for å gjenta eksperimentet.

Konsentrasjonstidsprofilene blir deretter utsatt for Kystverket for hver profil for å estimere eksponering, maksimal flux og tid til maksimal flux. Statistisk analyse (figur 6) gjennomføres på tvers av eksperimentelle forhold for å undersøke kovariater som bidrar til potensielle forskjeller i eksponeringer. Sammenligninger av de globale cPK-parametrene vil gi innsikt i hvilken formulering som gir høyere flux eller større eksponering. Mikroskala cPK-parametrene (dvs. lipidrike og lipidfattige regioner) vil derimot gi innsikt i de lokale biodistribusjons- og permeasjonsveiene. For eksempel, når man sammenligner to formuleringer med samme API-konsentrasjon og forskjellig i de inaktive ingrediensene, kan en formulering ha en tendens til å gjennomsyre gjennom stratum corneum via lipidrik region kontra lipidfattig region. Denne observasjonen indikerer at denne spesifikke formuleringen vil "presse" permeasjonen mot lipidrike regioner for enklere penetrasjon og permeasjon.

Figure 6
Figur 6: Eksempel på NCA-analyse av konsentrasjonstidsprofil fra museørevev. (A) Et eksempel påt max (tid hvor maksimal konsentrasjon oppstår) analyse mellom to formuleringer for samme API. Denne analysen indikerer at 2-(2-ethoxyetoksy)etanol gir utvidet API-permeasjon sammenlignet med Gel-formuleringen, uavhengig av hudlaget. Det kan også ses at tmax for SC-laget er lengre enn SG, noe som tyder på at 2-(2-ethoxyetoksy)etanolformuleringen fortsetter å levere API selv når bildebehandlingsvarigheten er avsluttet. (B) Et eksempel på total eksponeringsanalyse mellom samme formulering/API-kombinasjon i A , men på dybder lenger inn i huden. Denne figuren er endret fra18. Forkortelser: SC = stratum corneum; SG = talgkjertel; AD = adipocytt; SCF = subkutant fett. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Supplerende tabell S1: Eksempeldatasett hentet fra manuell bildeanalyse. Kolonnene angir informasjonen som er innhentet fra Dataanalyse-delen av dette manuskriptet (dvs. ramme, område, gjennomsnitt, min, maks, median), mens flere kolonner er lagt til for bruk i en cPK-analyse (dvs. lag, region, time_minutes). Disse dataene kan analyseres via Kystverket og plottes for å visualisere konsentrasjonsprofilen i SG-hudlaget. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Evalueringen av aktuell BA/BE er et forskningsområde som krever en mangefasettert tilnærming, da ingen enkelt metode fullt ut kan karakterisere in vivo cPK. Denne protokollen presenterer en metodikk for evaluering av et aktuelt legemiddelprodukts BA/BE basert på sammenhengende Raman-avbildning. Et av de første punktene som kan overses er hvor tynne hudprøvene må være, spesielt for kvantitativ overføring SRS-avbildning. Hvis huden er for tykk (dvs. lys kan ikke lett passere gjennom), er det lite eller ingen signal målt av SRS-detektoren, og det vil derfor gi dårlige konsentrasjonsdata. Det må utvises forsiktighet for å forberede disse vevsprøvene riktig, da dette kan gjøre eller ødelegge et eksperiment. Når det gjelder det nakne museøret, bortsett fra å skylle med PBS og klappe det tørt for å fjerne gjenværende smuss på øret, er det nødvendig med lite forberedelse.

Museører er vanligvis av en tykkelse på flere hundre μm, noe som er optimalt for overføring av SRS. Menneskelige hudprøver er vanligvis flere mm tykke, inkludert subkutant fett, selv om tykkelsen er svært variabel avhengig av den anatomiske kilden til hudvevet og donorens alder. Dermed må så mye overflødig vev fjernes som mulig for å nøyaktig kvantifisere lipidstrukturer og API-konsentrasjoner i epidermis og dermis over tid. Hvis vevsforberedelsestrinnet blir oversett, vil de resterende trinnene i det eksperimentelle oppsettet i stor grad være uegnet, da startforholdene ikke er optimale.

Laser-/mikroskopoppsettet er neste utfordring eller potensiell snublestein. Feiljustering av laseren i strålebanen og til slutt inn i mikroskopet resulterer i dårlig kontrast og dermed dårlige bilderesultater. Det anbefales å sette opp CARS-kanalen først, da signalet er lettere å finne. Pumpe- og Stokes pulstog må overlappes både i tid og rom. Justeringen av pumpelaseren kontrolleres ved hjelp av transmisjonsdetektoren i mikroskopets MC-programvare når SRS-detektoren vendes ut av veien. Mens du ser på CARS-kanalen (ALG1) i MC-programvaren, er Stokes-strålen blokkert. Men hvis det ikke er noe signal fra oljeprøven, er det først nødvendig å justere Stokes-strålen og deretter justere tidsoverlappingen. Det kan være nødvendig å gjenta disse to justeringene til signalet er optimalisert. Den romlige overlappingen av de to bjelkene vises gjennom en IR-seer på irisene, mens tidsforsinkelsesfasen (figur 2) justeres slik at bjelkene overlapper i tide. Disse to justeringstrinnene er avgjørende for å sikre generering av CARS-signaler.

Når et signal er tydelig i CARS-kanalen, er SRS-kanalen (ALG2) den neste som er satt opp. Potensielle problemer med manglende signal er at innlåsingsfasen eller forsterkningsinnstillingene er for lave, eller at forskyvningen er satt for høyt i låseprogramvaren. I tillegg kan kondensatorposisjonen justeres for å fokusere det overførte lyset på fotodioden og dermed optimalisere SRS-signalet. Feil oppsett av laser/mikroskop vil føre til mangel på signal, og dermed redusere konsentrasjonsestimater og mangel på permeasjonsinformasjon. Laserkraften til pumpen og Stokes-bjelkene kan optimaliseres for individuelle studier. Det er imidlertid kritisk at bjelkens krefter er de samme for hvert eksperiment. Ulike laserkrefter mellom replikeringer vil gi falske forskjeller i konsentrasjon, noe som vil skyldes oppsettet i stedet for API / formulering.

Hver studie vil kreve en unik dose-varighetstid (dvs. varighet av tiden som formuleringen er igjen på huden) og må undersøkes uavhengig for å kvantifisere kutan API-penetrasjon / permeasjon, da dette er formuleringsavhengig. Et annet hensyn ved utvikling av en protokoll er formuleringsprogrammets okklusive karakter. Det er viktig å vite om formuleringen ble utformet for å administreres under okklusive eller ikke-okklusive forhold. CRI-metoden som presenteres her, bruker et invertert mikroskop; Dette betyr at hudoverflaten er med forsiden ned og under okklusive innstillinger. Et oppreist mikroskop kan gi muligheten til å ha ikke-okklusive forhold; Imidlertid kan hudoverflaten ikke være flat, noe som vil gjøre denne typen eksperimenter utfordrende.

Det må erkjennes at den okklusive karakteren av disse eksperimentene ikke er den typiske kliniske bruken; Likevel analyseres permeasjonsveier i disse studiene. CRI-metoden som presenteres her, gir muligheten til å visualisere og kvantifisere mikroskalaendringer som ellers ikke skiller seg ut med metoder som dermal mikrodialyse, dermal mikroperfusjon i åpen strømning, tape-stripping eller IVPT-studier. Den siste tidens utvikling av rask bølgenummerjustering har banet vei for samtidig kvantifisering av hudstrukturen og flere vibrasjonsbindinger utenfor den stille regionen. Imidlertid er ytterligere beregningsmetoder for å analysere bidraget fra spesifikke analytter fra huden fortsatt under utvikling28. Dette er også spesielt relevant for in vivo CRI-studier, selv om kreftene som brukes på benken i dette oppsettet (ca. 50 mW i fokus) kanskje ikke er tillatt for klinisk bruk. Potensialet i denne metodikken som skal oversettes fra en laboratoriebenk til klinikken, kan gjøre det mulig for etterforskere å kvantifisere stoffets permeasjon in vivo samt ex vivo i samme setting for å utvikle in vitro-in vivo-relasjoner som er avgjørende for fremskrittet i aktuell narkotikautvikling.

Den store mengden data som er samlet inn fra en eksperimentell kjøring, kan være alt fra 10 bilder per nettsted til 70 bilder per nettsted. Hvis det er flere steder per stykke vev, fører dette til gigabyte informasjon. Bildene i seg selv gir globale konsentrasjonstidsdata og kvantifiseres som de er, uten forhåndsbehandling. Det maksimerer imidlertid ikke nytten av CRI, da lokale biodistribusjonsdata kan trekkes ut i tillegg til permeasjonsveidata. Bildesegmenteringen er tidkrevende, men gir detaljert informasjon som ikke er mulig med andre metoder. For eksempel er det mulig å estimere den foretrukne penetrasjonsveien gjennom stratum corneum (lipidrik eller lipidfattig), noe som kan gi innsikt i hvilke inaktive ingredienser som kan bidra til en bestemt vei eller om den er stoffavhengig. Analyse av ett eksperiment kan ta flere timer til dager, avhengig av antall bilder og eksperimentell varighet. Derfor vil en automatisert tilnærming hjelpe til med dataanalyse og gi konsistent merknad av lipidrike og lipidfattige regioner på tvers av hudstratifikasjoner18.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

CLE er en oppfinner på patenter for CARS mikroskopi som er lisensiert til flere mikroskopprodusenter. Alle andre forfattere har ingen interessekonflikter å avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne vil takke Dr. Fotis Iliopoulos og Daniel Greenfield fra Evans' Group for deres diskusjon og korrekturlesing av dette manuskriptet. I tillegg ønsker forfatterne å anerkjenne støtte fra LEO Pharma. Figur 2 ble opprettet med BioRender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tissue Preparation
Autoclavable Biohazard Bags FisherBrand 22-044562 As refered to in text: biohazard bags
https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-polyethylene-biohazard-autoclave-bags-without-sterilization-indicator-8/22044562?searchHijack=true&searchTerm= 22044562&searchType=RAPID& matchedCatNo=22044562
Cell Culture Buffers: Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution 1x Corning MT21030CV As refered to in text: PBS
https://www.fishersci.com/shop/products/corning-cellgro-cell-culture-buffers-dulbecco-s-phosphate-buffered-salt-solution-1x-8/MT21030CV?searchHijack=true&searchTerm= 21-030-cv&searchType= RAPID&matchedCatNo=21-030-cv
Disposable Scalpels Exel International 14-840-00 As refered to in text: scalpel
https://www.fishersci.com/shop/products/exel-international-disposable-scalpels-3/1484000?keyword=true
High Precision 45° Angle Broad Point Tweezers/Forceps Fisherbrand 12-000-132 As refered to in text: forceps
https://www.fishersci.com/shop/products/high-precision-45-angle-broad-point-tweezers-forceps/12000132#?keyword=
Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-Ply Kimberly-Clark Professional Kimtech Science 06-666 As refered to in text: task wiper
https://www.fishersci.com/shop/products/kimberly-clark-kimtech-science-kimwipes-delicate-task-wipers-7/06666
Parafilm M Laboratory Wrapping Film Bemis 13-374-12 As refered to in text: parafilm
https://www.fishersci.com/shop/products/curwood-parafilm-m-laboratory-wrapping-film-4/1337412
Petri Dish (35 mm x 10 mm) Fisherbrand FB0875711YZ As refered to in text: small petri dish
https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-specialty-6/FB0875711YZ?keyword=true
Petri Dish (60 mm x 15 mm) Fisherbrand FB0875713A As refered to in text: large petri dish
https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/FB0875713A?keyword=true
Surgical Scissors Roboz NC9411473 As refered to in text: scissors
https://www.fishersci.com/shop/products/scissors-327/NC9411473?searchHijack=true&searchTerm= RS-5915SC&searchType=RAPID& matchedCatNo=RS-5915SC
Laser/microscope
650/60 nm BrightLine single-band bandpass filter Semrock As refered to in text: CARS filter - CH2 vibrations (645nm/60nm filter)
Control box IX2-UCB Olympus As refered to in text: Control Box
D700/30m Chroma As refered to in text: CARS filter - deuterated band
https://www.chroma.com/products/parts/d700-30m
DeepSee Insight Spectra-Physics As refered to in text: Laser
https://www.spectra-physics.com/f/insight-x3-tunable-laser
Digital Handheld Optical Power and Energy Meter Console ThorLabs PM100D As refered to in text: power meter
https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=3341
Fluoview Software Olympus As refered to in text: Microscope Control software
Frosted Microscope Slides FisherBrand As refered to in text: microscope slides
https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-frosted-microscope-slides-4/22265446
FV1000 Olympus As refered to in text: Microscope
Incubation Chamber Tokai Hit GM-800 As refered to in text: incubation chamber
Integrating Sphere Photodiode Power Sensor ThorLabs S142C As refered to in text: photodiode
https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=3341
Power supply FV31-PSU Olympus As refered to in text: Power Supply
Precision 4063, 80MHz Dual Channel Function Generator BK Precision As refered to in text: function generator
ProScan – Precision Microscope Automation Prior Scientific Instruments As refered to in text: stage controller
https://www.prior.com/microscope-automation/inverted-microscope-systems/proscan-linear-stage-highest-precision-microscope-automation
SecureSeal Imaging Spacers Grace Biolabs 654004 As refered to in text: spacer
https://gracebio.com/product/secureseal-imaging-spacers-654004/
SRS Detection Kit APE As refered to in text: SRS detector
UPLSAPO 20X NA:0.75 Olympus As refered to in text: 20X Objective
https://www.olympus-lifescience.com/en/objectives/uplsapo/
Lipid/Drug Imaging
 35 mm Dish, No. 0 Uncoated Coverslip, 14 mm Glass Diameter MatTek Corporation NC9711297 As refered to in text: Glass bottom dish
https://www.fishersci.com/shop/products/glass-bottom-mircrowell-dish/nc9711297
Cotton-tipped applicators FisherBrand As refered to in text: Cotton-tipped applicator
Distriman Postive Displacement Pipette Gilson As refered to in text: Postive Displacement Pipette
https://www.fishersci.com/shop/products/gilson-distriman-positive-displacement-repetitive-pipette/F164001G#?keyword=
Distriman Postive Displacement Pipette Tips Gilson As refered to in text: Tips for pipette
https://www.fishersci.com/shop/products/gilson-distritip-syringes-6/f164100g?keyword=true
Data Analysis
FIJI Open-source As refered to in text: FIJI/ImageJ
https://imagej.net/software/fiji/
Jupyter-Lab open-source As refered to in text: JupyterLab
https://jupyter.org/
Rstudio Open-source As refered to in text: Rstudio
https://www.rstudio.com/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Finnin, B., Walters, K. A., Franz, T. J. In vitro skin permeation methodology. In Transdermal and topical drug delivery: principles and methodology. Transdermal and topical drug delivery: principles and practice. Benson, H. E., Watkinson, A. C. , John Wiley & Sons. Hoboken NJ USA. 85-108 (2012).
  2. Shin, S. H., et al. On the road to development of an in vitro permeation test (IVPT) model to compare heat effects on transdermal delivery systems: exploratory studies with nicotine and fentanyl. Pharmaceutical Research. 34 (9), 1817-1830 (2017).
  3. Hossain, A., et al. Preparation, characterisation, and topical delivery of terbinafine. Pharmaceutics. 11 (10), 548 (2019).
  4. Santos, L. L., Swofford, N. J., Santiago, B. G. In vitro permeation test (IVPT) for pharmacokinetic assessment of topical dermatological formulations. Current Protocols in Pharmacology. 91 (1), 79 (2020).
  5. Iliopoulos, F., Caspers, P. J., Puppels, G. J., Lane, M. E. Franz cell diffusion testing andquantitative confocal Raman spectroscopy: In vitro-in vivo correlation. Pharmaceutics. 12 (9), 887 (2020).
  6. Cordery, S., et al. Topical bioavailability of diclofenac from locally-acting, dermatological formulations. International Journal of Pharmaceutics. 529 (1-2), 55-64 (2017).
  7. Pensado, A., et al. Stratum corneum sampling to assess bioequivalence between topicalacyclovir products. Pharmaceutical Research. 36 (12), 1-16 (2019).
  8. Zhang, Y., et al. Dermal delivery of niacinamide-in vivo studies. Pharmaceutics. 13 (5), 726 (2021).
  9. Bodenlenz, M., et al. Open flow microperfusion as a dermal pharmacokinetic approach to evaluate topical bioequivalence. Clinical Pharmacokinetics. 56 (1), 91-98 (2017).
  10. Eirefelt, S., et al. Evaluating dermal pharmacokinetics and pharmacodymanic effect of soft topical PDE4 inhibitors:Open flow microperfusion and skin biopsies. Pharmaceutical Research. 37 (12), 1-12 (2020).
  11. Stagni, G., O'Donnell, D., Liu, Y. J., Kellogg, J. D. L., Shepherd, A. M. Iontophoretic current and intradermal microdialysis recovery in humans. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 41 (1), 49-54 (1999).
  12. Garcia Ortiz, P., Hansen, S. H., Shah, V. P., Menne, T., Benfeldt, E. Impact of adultatopic dermatitis on topical drug penetration: assessment by cutaneous microdialysis and tape stripping. Acta Dermato-Venereologica. 89 (1), 33-38 (2009).
  13. Joshi, A., Patel, H., Joshi, A., Stagni, G. Pharmacokinetic applications of cutaneous microdialysis: Continuous+intermittent vs continuous-only sampling. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 83, 16-20 (2017).
  14. Kuzma, B. A., et al. Evaluation of local bioavailability of metronidazole from topical formulations using dermal microdialysis: Preliminary study in a Yucatan mini-pig model. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 159, 105741 (2021).
  15. Begley, R., Harvey, A., Byer, R. L.Coherent anti-Stokes Raman spectroscopy. Applied Physics Letters. 25 (7), 387-390 (1974).
  16. Evans, C. L., et al. Chemical imaging of tissue in vivo with video-rate coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (46), 16807-16812 (2005).
  17. Hill, A. H., Manifold, B., Fu, D. Tissue imaging depth limit of stimulated Raman scattering microscopy. Biomedical Optics Express. 11 (2), 762-774 (2020).
  18. Feizpour, A., Marstrand, T., Bastholm, L., Eirefelt, S., Evans, C. L. Label-free quantification of pharmacokinetics in skin with stimulated Raman scattering microscopy and deep learning. Journal of Investigative Dermatology. 141 (2), 395-403 (2021).
  19. Ghosh, B., Reddy, L. H., Kulkarni, R. V., Khanam, J. Comparison of skin permeability of drugs in mice and human cadaver skin. Indian Journal of Experimental Biology. 38 (1), 42-45 (2000).
  20. Nielsen, J. B., Plasencia, I., Sørensen, J. A., Bagatolli, L. Storage conditions of skin affect tissue structure and subsequent in vitro percutaneous penetration. Skin Pharmacology and Physiology. 24 (2), 93-102 (2011).
  21. Barbero, A. M., Frasch, H. F. Effect of frozen human epidermis storage duration and cryoprotectant on barrier function using two model compounds. Skin Pharmacology and Physiology. 29 (1), 31-40 (2016).
  22. Babu, R., et al. The influence of various methods of cold storage of skin on the permeation of melatonin and nimesulide. Journal of Controlled Release. 86 (1), 49-57 (2003).
  23. Skelly, J. P., et al. FDA and AAPS report of the workshop on principles and practices of in vitro percutaneous penetration studies: relevance to bioavailability and bioequivalence. Pharmaceutical Research. 4 (3), 265-267 (1987).
  24. OECD. Guidance document for the conduct of skin absorption studies. OECD. , (2004).
  25. OECD. Test no. 428: Skin absorption: In vitro method. OECD. , (2004).
  26. Saar, B. G., et al. Video-rate molecular imaging in vivo with stimulated Raman scattering. Science. 330 (6009), 1368-1370 (2010).
  27. Saar, B. G., Contreras-Rojas, L. R., Xie, X. S., Guy, R. H. Imaging drug delivery to skin with stimulated Raman scattering microscopy. Molecular Pharmaceutics. 8 (3), 969-975 (2011).
  28. Pence, I. J., Kuzma, B. A., Brinkmann, M., Hellwig, T., Evans, C. L. Multi-windowsparse spectral sampling stimulated Raman scattering microscopy. Biomedical Optics Express. 12 (10), 6095-6114 (2021).
  29. Herkenne, C., et al. In vivo methods for the assessment of topical drug bioavailability. Pharmaceutical Research. 25 (1), 87-103 (2008).
  30. Alfonso-Garcıa, A., Mittal, R., Lee, E. S., Potma, E. O. Biological imaging with coherent Raman scattering microscopy: a tutorial. Journal of Biomedical Optics. 19 (7), 071407 (2014).
  31. Osseiran, S., et al. Longitudinal monitoring of cancer cell subpopulations in monolayers, 3D spheroids, and xenografts using the photoconvertible dye DiR. Scientific Reports. 9 (1), 1-10 (2019).
  32. Evennett, P. Kohler illumination: a simple interpretation. Proceedings of the Royal Microscopical Society. 28 (4), 189-192 (1983).
  33. Sanderson, J. Fundamentals of microscopy. Current Protocols in Mouse Biology. 10 (2), 76 (2020).
  34. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  35. Hunter, J. D. Matplotlib: A 2D graphics environment. Computing in Science & Engineering. 9 (3), 90-95 (2007).
  36. Wickham, H. ggplot2: Elegant Graphics for Data Analysis. , Springer-Verlag. New York. (2016).
  37. Kim, H., Han, S., Cho, Y. S., Yoon, S. K., Bae, K. Development of R packages:'Non-Compart' and 'ncar' for noncompartmental analysis (NCA). Translational and Clinical Pharmacology. 26 (1), 10-15 (2018).

Tags

Medisin utgave 177 sammenhengende Raman-spredning sammenhengende anti-Stokes Raman-spredning stimulert Raman-spredning kutan farmakokinetikk biotilgjengelighet bioekvivalentitet
Visualisere og kvantifisere farmasøytiske forbindelser i huden ved hjelp av sammenhengende Raman Scattering Imaging
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kuzma, B. A., Pence, I. J., Ho, A.,… More

Kuzma, B. A., Pence, I. J., Ho, A., Evans, C. L. Visualizing and Quantifying Pharmaceutical Compounds within Skin using Coherent Raman Scattering Imaging. J. Vis. Exp. (177), e63264, doi:10.3791/63264 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter