Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

توصيف الخلايا البطانية لنمو الدم (BOEC) من الدم المحيطي للخنزير

Published: January 6, 2022 doi: 10.3791/63285
Automatic Translation
1, 2, 3, 4, 4, 1
1Department of Biomedical Engineering, Medical College of Wisconsin & Marquette University, 2Division of Engineering, Mayo Clinic, 3Department of Physiology & Biomedical Engineering, Mayo Clinic, 4Department of Cardiovascular Medicine, Mayo Clinic

Abstract

البطانة هي بنية ديناميكية متكاملة تلعب دورا مهما في العديد من الوظائف الفسيولوجية مثل تكوين الأوعية الدموية والإرقاء والالتهاب والاتزان الداخلي. تلعب البطانة أيضا دورا مهما في الفيزيولوجيا المرضية مثل تصلب الشرايين وارتفاع ضغط الدم والسكري. تشكل الخلايا البطانية البطانة الداخلية للدم والأوعية اللمفاوية وتظهر عدم تجانس في التركيب والوظيفة. قامت مجموعات مختلفة بتقييم وظائف الخلايا البطانية المشتقة من الدم المحيطي البشري مع التركيز على الخلايا السلفية البطانية المشتقة من الخلايا الجذعية المكونة للدم أو الخلايا البطانية الناضجة (أو الخلايا المكونة للمستعمرة البطانية). توفر هذه الخلايا موردا ذاتيا للعلاجات ونمذجة الأمراض. قد توفر الخلايا الغريبة مصدرا بديلا للعلاجات بسبب توافرها وتجانسها باستخدام متشابهة وراثيا تربى في ظروف مماثلة. ومن ثم ، تم تقديم بروتوكول قوي لعزل وتوسيع الخلايا البطانية المتكاثرة للغاية من الدم المحيطي للخنازير. يمكن استخدام هذه الخلايا في العديد من التطبيقات مثل هندسة أنسجة القلب والأوعية الدموية ، والعلاج بالخلايا ، ونمذجة الأمراض ، وفحص الأدوية ، ودراسة بيولوجيا الخلايا البطانية ، والثقافات المشتركة في المختبر للتحقيق في استجابات الالتهاب والتخثر في زراعة الأعضاء.

Introduction

البطانة هي بنية ديناميكية معقدة للغاية ومكون حيوي لجدار الأوعية الدموية. يبطن السطح الداخلي للأوعية الدموية لتوفير واجهة مادية بين الدورة الدموية والأنسجة المحيطة. من المعروف أن هذا الهيكل غير المتجانس يؤدي وظائف مختلفة مثل تكوين الأوعية ، والالتهاب ، وتنظيم الأوعية ، والإرقاء1،2،3،4. الخلايا البطانية للوريد السري البشري هي نوع من الخلايا يدرس على نطاق واسع لتقييم وظائف الخلايا البطانية. ومع ذلك ، فإن تباين الدفعة الخاصة بالمريض ، والنمط الظاهري غير المتسق ، والحد الأدنى من كفاءة الانقسام تشير إلى الحاجة إلى تحديد مصدر الخلية الذي يمكن أن يحسن كل هذه الميزات5.

يمكن أن يكون الحصول على مجموعة متجانسة من الخلايا البطانية الأولية أمرا صعبا من الناحية الفنية ، ولا تمتلك الخلايا البطانية الأولية قدرة تكاثرية عالية6. ومن ثم ، لدراسة تجديد الأوعية الدموية وتقييم العمليات الفيزيولوجية المرضية ، حاولت مجموعات مختلفة الحصول على أنواع مختلفة من الخلايا البطانية المشتقة من الدم المحيطي وتقييمها ، على سبيل المثال ، الخلايا السلفية البطانية البطانية (EPCs) أو الخلايا البطانية لنمو الدم (BOECs)6،7،8،9. تنشأ EPCs المبكرة على شكل مغزل من الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs) ولها قوة نمو محدودة وقدرة وعائية محدودة على إنتاج خلايا بطانية ناضجة. علاوة على ذلك ، فهي تشبه إلى حد كبير الخلايا الوحيدة الالتهابية. بالإضافة إلى ذلك ، لا تزال قدرتها على التمايز إلى خلايا بطانية وظيفية ومتكاثرة وناضجة قابلة للنقاش6،7،9،10. يمكن أن تؤدي الثقافة المستمرة لخلايا الدم أحادية النواة المحيطية (PBMCs) إلى ظهور مجموعة ثانوية من الخلايا تعرف باسم EPCs متأخرة النمو أو BOECs أو الخلايا المكونة للمستعمرة البطانية (ECFCs)6،7،9،10. في عام 2018 ، اعترف Medina et al. بقيود EPCs ، وغموض تسميتها ، إلى جانب الافتقار العام للتوافق مع العديد من أنواع الخلايا المتميزة التي يتم تجميعها باستمرار تحت EPCs11. في المقابل ، أصبحت BOECs معترف بها لدورها في إصلاح الأوعية الدموية ، والصحة والمرض ، والعلاج الخلوي. ستعتمد الدراسة الإضافية والاستخدام العلاجي لهذه الخلايا على بروتوكولات لاشتقاق هذه الأنواع من الخلايا باستمرار من الخلايا السلفية المنتشرة.

يمكن استخدام الخلايا الأولية مثل BOECs كبديل للحصول على خلايا بطانية ناضجة تكاثريةللغاية 6. BOECs متميزة ظاهريا عن EPCs المبكرة وتظهر ميزات بطانية نموذجية مثل مورفولوجيا الحصى والتعبير عن تقاطعات adherens و caveolae12. وجد التنميط الجيني بواسطة Hebbel et al.13،14،15 أن BOECs أو ECFCs هي الخلايا البطانية الحقيقية لأنها تعزز تكوين الأوعية الدموية الدقيقة والأوعية الكبيرة. وبالتالي ، يمكن استخدام BOECs كأداة لتقييم العمليات الفيزيولوجية المرضية والتنوع الجيني16. كما أنها تعتبر مصدرا ممتازا للخلايا للعلاج الخلوي لتجديد الأوعية الدموية17. ومن ثم ، فإن وجود بروتوكول موحد لاشتقاق هذه الخلايا شديدة التكاثر باستمرار أمر ضروري.

بينما توفر BOECs أداة قوية لدراسة التباين الفيزيولوجي المرضي والجيني البشري ، فإن مصدرا أكثر تجانسا ل BOECs قد يوفر نتائج تجريبية وعلاجية أكثر قوة وموثوقية. يمكن تحقيق التجانس الفائق باستخدام مصادر الخلايا الغريبة المستمدة من الحيوانات المتشابهة وراثيا التي تربى في ظروف مماثلة18. في حين أن مصادر الخلايا الغريبة المنشأ عرضة لإثارة استجابة مناعية للمضيف ، يتم تطوير استراتيجيات التعديل المناعي بهدف توليد ومنتجات حيوانية متوافقة مع المناعة ، بما في ذلك الخلايا. الخنازير ، على وجه الخصوص ، هي مصدر وفير للدم المحيطي وتستخدم عادة لدراسة الأجهزة الطبية والعلاجات الأخرى بسبب أوجه التشابه التشريحية والفسيولوجية مع البشر. ومن ثم ، فإن هذه الدراسة تعمل على تحسين بروتوكول عزل وتوسيع BOECs شديدة التكاثر من الدم المحيطي الخنازير. البروتوكول المفصل أدناه هو طريقة مباشرة وموثوقة للحصول على عدد كبير من BOECs من كمية صغيرة نسبيا من الدم. يمكن توسيع الثقافات من خلال عدة ممرات لتوليد ملايين الخلايا من عينة دم واحدة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الدراسات على الحيوانات من قبل اللجان المؤسسية المعنية لرعاية واستخدام الحيوان (IACUC) في كلية الطب في ويسكونسن ومايو كلينك.

ملاحظة: في هذه الدراسة ، تم استخدام الخنازير المحلية المتقاطعة يوركشاير / لاندريس / دوروك (Sus domesticus) ، ذكورا وإناثا ، 40-80 كجم ، 3-6 أشهر من العمر.

1. جمع الدم المحيطي الخنازير

  1. تحضير المواد.
    1. خفف محلول الهيبارين إلى 100 وحدة / مل في محلول ملحي معقم.
    2. أضف 3-4 مل من محلول الهيبارين إلى كل من أنبوبين مخروطيين سعة 50 مل وحقنتين سعة 60 مل.
    3. اسحب محلول الهيبارين غير المخفف (1000 وحدة / مل) في أنبوب تمديد.
    4. قم بتوصيل إبرة 19 جم بأحد طرفي أنبوب التمديد المملوء بالهيبارين ومحقنة 60 مل تحتوي على الهيبارين بالطرف الآخر.
  2. تخدير خنزير وفقا للسياسات المؤسسية
    1. تطبيق الحقن العضلي للأتروبين (0.05 ملغ/ كغ)، تيلتامين/زولازيبام (2-5 ملغ/كغ)، زيلازين (2 ملغ/كغ) للحث على التخدير.
      ملاحظة: يتم تحقيق التخدير الكافي بمجرد أن يكون الحيوان فاقدا للوعي وتكون عضلات الفك السفلي غير صلبة.
    2. ضع الحيوان في وضع الاستلقاء وضع المناشف الملفوفة على كلا الجانبين لتوفير الاستقرار.
    3. ضع مرهما للعيون على العينين لمنع الجفاف أثناء التخدير.
    4. توفير الدعم الحراري أثناء التخدير بما في ذلك البطانيات و / أو وسادات التدفئة و / أو طاولة الإجراءات الساخنة.
  3. نظف منطقة الفخذ الفخذي بمحلول فرك البيتادين.
  4. ثقب الوريد الفخذي أو الشريان بإبرة 19 G وببطء (~ 1-2 مل / ثانية) سحب 50 مل من الدم في المحقنة.
    ملاحظة: يمكن أن يؤدي الرسم بسرعة كبيرة إلى تلف الخلايا.
  5. ترك الإبرة في مكانها ، قم بثني أنبوب التمديد على الفور وافصل المحقنة سعة 60 مل
  6. انقل الدم ببطء إلى أنبوب مخروطي يحتوي على الهيبارين سعة 50 مل.
  7. قم بتغطية الأنبوب المخروطي سعة 50 مل بإحكام ، ثم قلبه برفق عدة مرات للخلط ، وضعه على الثلج.
  8. قم بتوصيل المحقنة المتبقية التي تحتوي على الهيبارين سعة 60 مل بأنبوب التمديد ، وقم بفك أنبوب التمديد ، واسحب ببطء 50 مل إضافية من الدم إلى المحقنة.
  9. قم بإزالة الإبرة على الفور من الشريان أو الوريد واسحب الدم المتبقي ببطء من أنبوب التمديد إلى المحقنة.
  10. افصل المحقنة سعة 60 مل من أنبوب التمديد وانقل الدم ببطء إلى الأنبوب المخروطي المتبقي المحتوي على الهيبارين سعة 50 مل.
  11. قم بتغطية الأنبوب المخروطي سعة 50 مل بإحكام ، ثم قلبه برفق عدة مرات للخلط ، وضعه على الثلج.
  12. تطبيق الارقاء الضغط على منطقة الفخذ الخنزير.
  13. استعادة الخنزير وفقا للسياسات المؤسسية. راقب الحيوان باستمرار حتى يستعيد وعيه الكافي للحفاظ على الاستلقاء القصي والعودة إلى منطقة السكن / تربية الكلاب العادية.

2. عزل الخلايا أحادية النواة

  1. تمييع الدم 1: 1 مع محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) في أربعة أنابيب مخروطية سعة 50 مل.
    ملاحظة: يجب إجراء هذا العمل في غطاء زراعة الخلايا باستخدام تقنية معقمة لتجنب تلويث ثقافة الخلية.
  2. أضف 25 مل من محلول تدرج الكثافة الجاهز للاستخدام بدرجة حرارة الغرفة إلى ثمانية أنابيب مخروطية سعة 50 مل.
  3. ببطء شديد ماصة 25 مل من الدم / محلول ملحي على طول الجزء الداخلي من كل محلول تدرج الكثافة يحتوي على أنبوب مخروطي سعة 50 مل عن طريق تثبيت الأنبوب بزاوية حادة على طرف الماصة.
    ملاحظة: يجب أن يوضع محلول الدم برفق فوق محلول تدرج الكثافة ويحافظ على واجهة محددة جيدا.
  4. أجهزة الطرد المركزي الأنابيب لمدة 30 دقيقة عند 560 × جم ودرجة حرارة الغرفة (RT).
    ملاحظة: للحصول على أفضل النتائج ، قم بتعطيل فرامل الطرد المركزي إن أمكن.
  5. استخدم ماصة رقيقة لجمع الطبقة المنتفخة بعناية (طبقة غائمة من الخلايا أحادية النواة فوق محلول تدرج الكثافة وأسفل البلازما الشفافة) من كل أنبوب وتوزيعها بالتساوي في أنبوبين مخروطيين جديدين سعة 50 مل. تخلص من محلول تدرج الكثافة الذي يحتوي على أنابيب.
    ملاحظة: اجمع أكبر قدر ممكن من معطف بافي مع جمع أقل قدر ممكن من محلول تدرج الكثافة والبلازما.

3. غسل وطلاء الخلايا

  1. معطف لوحة 6 بئر مع الفبرونيكتين.
    1. اصنع محلولا من الفبرونيكتين البشري في البلازما عن طريق تخفيفه إلى 1 مجم / مل في الماء المعقم. قم بتخزين القسامات في درجة حرارة -20 درجة مئوية.
    2. اصنع 3.6 مل من محلول عامل من الفبرونيكتين عن طريق تخفيف 600 ميكرولتر من محلول مخزون الفبرونيكتين في 3 مل من برنامج تلفزيوني.
    3. انقل 600 ميكرولتر من محلول عمل الفبرونيكتين إلى كل بئر من صفيحة ذات 6 آبار واهزها برفق حتى تغطى بالتساوي.
    4. انتظر 30 دقيقة حتى يقوم الفبرونيكتين بتغطية الآبار وشفط المحلول برفق من كل بئر.
  2. أثناء انتظار معطف الفبرونيكتين ، اغسل الخلايا أحادية النواة
    1. قم بتعبئة الأنابيب بما يصل إلى 45 مل من PBS
    2. جهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 560 × جم و 4 درجات مئوية مع فرامل منخفضة. نضح الطافي من كلا الأنبوبين.
    3. أعد تعليق كل خلية بيليه في 25 مل من PBS.
    4. كرر لغسل مرة ثانية.
  3. أعد تعليق كل حبيبة خلية في 5 مل من PBS وأضف 15 مل من محلول كلوريد الأمونيوم 0.8٪ إلى كل أنبوب.
    ملاحظة: هذه الخطوة هي تحلل خلايا الدم الحمراء المتبقية.
  4. احتضان على الجليد لمدة 10 دقائق.
  5. اغسل الخلايا كما كان من قبل عن طريق تعبئة الأنابيب ب PBS وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 560 × جم و 4 درجات مئوية مع فرامل منخفضة. نضح الطافي من كلا الأنبوبين.
  6. أعد تعليق كل حبيبة خلية في 25 مل من PBS وكرر الغسيل مرة ثانية.
  7. إعادة تعليق كل حبيبة خلوية في 6 مل من وسط زراعة EGM-2 المكمل بمصل بقري جنيني بنسبة 10٪ (FBS) ومحلول مضاد حيوي / مضاد حيوي يحتوي على 10000 وحدة / مل من البنسلين و 10 مجم / مل من الستربتومايسين و 25 ميكروغرام / مل من الأمفوتريسين.
    ملاحظة: يتكون وسط استزراع EGM-2 من وسط استزراع EBM-2 مكمل ب 200 ميكرولتر من الهيدروكورتيزون ، 2 مل من عامل نمو الخلايا الليفية البشرية (hFGF-B) ، 500 ميكرولتر من عامل نمو بطانة الأوعية الدموية (VEGF) ، 500 ميكرولتر من التناظرية المؤتلفة لعامل النمو الشبيه بالأنسولين (R3 IGF-1) ، 500 ميكرولتر من حمض الأسكوربيك ، 500 ميكرولتر من عامل نمو البشرة البشري (hEGF) ، 500 ميكرولتر من الجنتاميسين / الأمفوتريسين ، و 500 ميكرولتر من الهيبارين لكل 500 مل.
  8. انقل 2 مل من معلق الخلية برفق إلى كل بئر من الصفيحة ذات 6 آبار المطلية بالفبرونيكتين واهزها برفق حتى تغطى بالتساوي.
    ملاحظة: الهدف هو زرع أكبر عدد ممكن من الخلايا لزيادة عدد المستعمرات البطانية التي ستتشكل.

4. ثقافة الخلية

  1. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 ، و 100٪ رطوبة.
  2. في اليوم التالي ، أضف برفق 1 مل من وسط الاستزراع الطازج إلى كل بئر.
    ملاحظة: من المهم أن تكون لطيفا حتى لا تزعج الخلايا الملتصقة بشكل فضفاض بطلاء الفبرونيكتين.
  3. في اليوم التالي، قم بإجراء تغيير نصف وسط الاستزراع عن طريق استنشاق 1.5 مل من وسط الاستزراع برفق من كل بئر واستبداله ب 1.5 مل من وسط الاستزراع الطازج.
  4. في كل يوم من الأيام ال 5 التالية، قم بإجراء تغيير وسط استزراع كامل برفق لكل بئر (2 مل من وسط الاستزراع الطازج لكل بئر).
  5. بعد ذلك ، قم بتغيير وسط الثقافة برفق ثلاث مرات في الأسبوع.
  6. تصور بانتظام ثقافات الخلايا تحت المجهر الضوئي منخفض الطاقة (4x الهدف).
    ملاحظة: ستبدأ مستعمرات الخلايا البطانية الملتصقة بنمو الدم (BOEC) في الظهور في الآبار بعد 7-10 أيام من الطلاء. سيتم التخلص من أنواع الخلايا غير الملتصقة بتغييرات متوسطة ، وستتبدد أنواع الخلايا الملتصقة الأخرى تدريجيا مع نمو مستعمرات BOEC.
  7. قم بتمرير BOECs إلى قارورة T-75 المطلية بالفبرونيكتين عندما تكون ~ 70٪ -80٪ متقاربة واستمر في تغيير وسط الثقافة ثلاث مرات في الأسبوع.
    ملاحظة: يمكن التحكم في كثافة البذر عن طريق تمرير المستعمرات في قارورة T25 بدلا من ذلك. لا تتطلب الممرات اللاحقة طلاء الفبرونيكتين ، ويمكن تقليل التغييرات المتوسطة للثقافة إلى مرتين في الأسبوع.
  8. يمكن استخدام الخلايا من الممرات 1-3 للتجارب أو نقلها إلى وسط تجميد وتخزينها في النيتروجين السائل لاستخدامها في المستقبل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

لوحظ مورفولوجيا الخلايا المستزرعة منذ بداية المزرعة حتى لوحظت مستعمرات BOEC (الشكل 1). بدأت مجموعة أقل من الخلايا الملتصقة في الالتصاق بأطباق الاستزراع والنمو ، بينما تمت إزالة الخلايا غير الملتصقة مع تغيرات وسط الثقافة (الشكل 1 ب). ظهرت المستعمرات لأول مرة في اليوم 6 كمجموعة من الخلايا الشبيهة بالبطانة تتكاثر شعاعيا للخارج من نقطة مركزية (الشكل 1 د). مع تقدم الثقافة ، أصبحت مستعمرات الخلايا أكثر كثافة وأظهرت مورفولوجيا مرصوفة بالحصى مشابهة للخلايا البطانية الناضجة (الشكل 1F). يوفر مورفولوجيا الحصى البطانية النموذجية تحديدا أوليا سهلا ل BOECs باستخدام المجهر الضوئي.

عادة ما تكون مستعمرات الخلايا البطانية جاهزة للمرور في 10-14 يوما من الثقافة. في هذا الوقت ، ستنتج اللوحة المكونة من 6 آبار عادة ~ 1 مليون خلية بنسبة صلاحية 93٪ -98٪. خلال المقطع الأول ، ستتوسع الخلايا البطانية لتنتج ~ 6-10 ملايين خلية في قارورة T75.

لتقييم تشكل BOECs ، تم طلاء مصفوفة الغشاء القاعدي (على سبيل المثال ، Matrigel) على 15 لوحة تولد الأوعية بشكل جيد عند 10 ميكرولتر / بئر وتم تحضينها عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة للسماح بالبلمرة. تم زرع خلايا الممر 2 على ألواح مغلفة بمصفوفة الغشاء القاعدي وتم تصويرها في نقاط زمنية 14 ساعة و 24 ساعة. كانت كثافة ما يقرب من 3500 خلية لكل بئر قادرة على تشكيل شبكة وهياكل تشبه الأنبوب. لوحظ تكوين الأنبوب في غضون 14 ساعة للوسط الخالي من المصل (EGM-2 مع المكملات باستثناء FBS) وفي غضون 24 ساعة لوسط النمو الكامل (EGM-2 مع المكملات الغذائية بما في ذلك FBS). قد تكون إضافة FBS قد خففت من عوامل النمو الخاصة بالخلايا البطانية (على سبيل المثال ، VEGF) وأدخلت عوامل إشارات أخرى مما أدى إلى تأخير عملية تكوين الأنبوب. تم استخدام الفحص المجهري ثنائي التباين الطوري لتصوير تكوين الأنبوب في وسط خال من المصل (الشكل 2 أ ، ب) ووسط نمو كامل (الشكل 2 ج ، د). خضعت الخلايا في كلتا الحالتين الوسيطتين للتمايز المورفولوجي وسرعان ما تم تنظيمها في شبكات واسعة من الهياكل الشبيهة بالأنبوب الشعري. كانت هذه الهياكل تتكون من حبال خلوية منظمة تشبه الشبكات الشعرية في الجسم الحي. علاوة على ذلك ، توضح الصور المجهرية بتكبير 20x التنظيم المعقد متعدد الخلايا للخلايا البطانية وتمايزها المورفولوجي بالتفصيل. لم تكن هناك فروق مورفولوجية لوحظت بين الظروف الإعلامية. تشير الشبكة الواسعة من التراكيب الشبيهة بالأنبوب الشعري بقوة إلى تمايز الخلايا المستزرعة إلى خلايا بطانية ناضجة ووظيفية.

تميزت BOECs أيضا بالتعبير عن علامة الخلايا البطانية الناضجة CD31 أو جزيء التصاق الخلايا البطانية للصفائح الدموية -1 (PECAM1) (الشكل 3A ، B). أظهرت BOECs تعبيرا موحدا عن CD31. علاوة على ذلك ، أكد تحليل قياس التدفق الخلوي عدم وجود EPCs حيث أن الخلايا ملطخة سلبية لعلامة الوحيدات CD14 مقارنة بمجموعة التحكم الإيجابية ل PBMCs (الشكل 3C ، D).

Figure 1
الشكل 1: صور مجهرية ضوئية للنمط الظاهري. لوحظت الصور المجهرية الضوئية ل BOECs المستزرعة عند تكبير 10x في (A) اليوم 0 و (B) اليوم 2 و (C) اليوم 4 و (D) اليوم 6 و (E) اليوم 8 و (F) بعد المقطع الأول. قضبان المقياس: 200 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: التمايز المورفولوجي وتنظيم الممر 2 BOECs. لوحظ التمايز المورفولوجي وتنظيم الممر 2 BOECs في هياكل تشبه الأنبوب الشعري في مصفوفة الغشاء القاعدي في غضون 14 ساعة للوسط الخالي من المصل وخلال 24 ساعة لوسط النمو الكامل. (أ) وسط خال من المصل عند 4x ، (ب) وسط خال من المصل عند 20x ، (ج) وسط نمو كامل عند 4x ، و (د) وسط نمو كامل عند 20x. قضبان المقياس: 200 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: توصيف BOECs مع CD31 و CD14. (أ) تم تلطيخ الممر 2-3 BOECs ل PECAM1 باستخدام الجسم المضاد ل CD31-FITC الذي يظهر باللون الأخضر و (B) الصور المجهرية المقابلة لتباين الطور. كانت الخلايا ملطخة في التعليق ، وتم تصوير التعليق على شريحة مجهرية. قضبان المقياس: 200 ميكرومتر. (ج) تحليل قياس التدفق الخلوي ل BOECs مع الجسم المضاد CD14-AF700 مقارنة ب (D) خلايا الدم أحادية النواة المحيطية ذات التحكم الإيجابي (PBMCs). يظهر تلطيخ CD14 الإيجابي باللون الأزرق والخلايا غير الملوثة الموضحة باللون الأحمر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

BOECs هي أداة قوية يمكن استخدامها في مختلف الأساليب العلمية والعلاجية7،8،16. تم استخدام BOECs لتحليل التعبير الجيني EC لتوضيح العوامل الرئيسية المسؤولة عن تطور أمراض الأوعية الدموية والسرطان5،19،20،21. كما تم استخدام BOECs في التطبيقات العلاجية مثل تجديد الأوعية الدموية وتوصيل الجينات22،23،24. وقد عرفت BOECs المعدلة وراثيا لقدرتها العلاجية المضادة للورمتولد الأوعية 25,26. علاوة على ذلك ، فإن الإمكانات الوعائية ل BOECs تجعلها مرشحين ممتازين للعلاجات الخلوية التي تهدف إلى الأوعية الدموية والأوعية الدموية الجديدة17,27. على الرغم من أن العديد من الدراسات تصف كيفية الحصول على BOECs من الدم المحيطي البشري6،7،8،9 ، فإن تباين مصادر الخلايا البشرية بسبب الاختلاف الفيزيولوجي المرضي والجيني الأساسي يشير إلى وجود حاجة ماسة للحصول على BOECs من مصادر صحيةxenogenic 9،13،18.

تم تقديم بروتوكول مفصل لاشتقاق BOECs بكفاءة من خلايا الدم أحادية النواة المحيطية الخنازير. تشمل الخطوات الحاسمة معالجة عينات الدم في أسرع وقت ممكن والحصاد الفعال لطبقات معطف بافي بعد الطرد المركزي المتدرج الكثافة لزيادة عدد PBMCs القابلة للحياة التي تدخل في الثقافة. تعد كثافة الطلاء الأولية وتمرير الخلايا في الوقت المناسب من الاعتبارات المهمة للحصول على عزل ثابت لهذه الأنواع من الخلايا. يوفر حجم الدم الأولي البالغ 100 مل عددا مناسبا من PBMCs لصفيحة واحدة من ستة آبار. تجدر الإشارة إلى أن الحد الأقصى لحجم الدم الذي يمكن جمعه بأمان من الخنزير سيختلف باختلاف وزن جسم الحيوان. الحد الأقصى لحجم الدم الآمن المقترح لمرة واحدة للخنازير هو 8 مل لكل كيلوغرام من وزن الجسم. بالإضافة إلى ذلك ، يعد تمرير المستعمرات الأولية في الوقت المناسب من الممر 0 إلى الممر 1 أمرا ضروريا أيضا. تتوقف الخلايا عن التكاثر إذا كانت كثافة البذر منخفضة جدا أو إذا وصلت الخلايا إلى نقطة التقاء. عندما تصبح الخلايا متداخلة ، فإنها تبدأ في التحول إلى مورفولوجيا اللحمة المتوسطة الممدودة والنمط الظاهري. يمكن أيضا التحكم في كثافة البذر عن طريق تمرير المستعمرات إلى قارورة T25 بدلا من قارورة T75. مطلوب دراسة متأنية لعدم فقدان أنواع الخلايا الملتصقة أثناء تغيير الوسائط الأولي لأنه من الضروري جدا التقاط أكبر عدد ممكن من الخلايا الملتصقة مع التخلص من EPCs غير الملتصقة. ينتج هذا البروتوكول مستعمرات خلايا النمو في حوالي 1 أسبوع.

البروتوكول قابل للتكرار وموثوق للغاية. يتم تحقيق توسيع مستعمرات الخلايا البطانية في ما يقدر بنحو 90٪ -95٪ من الثقافات. عادة ما يكون الفشل بسبب عدم تكوين مستعمرات الخلايا البطانية ، مما يعني أنه إذا تم تشكيل مستعمرة واحدة على الأقل من الخلايا البطانية ، فسوف تستمر دائما في التوسع في الثقافة. تشمل مصادر الفشل التباين العشوائي ، والقص المفرط للخلايا أثناء جمع الدم ، وتلويث الميكروبات في المزرعة ، وفقدان كبير للخلايا أحادية النواة أثناء خطوات المعالجة. بعد ثقافة غير ناجحة ، عادة ما تكون الثقافة الثانية ناجحة ، مما يشير إلى أن التباين بين الحيوانات ليس عاملا رئيسيا. يكون البروتوكول ناجحا حتى عند جمع الدم مباشرة بعد القتل الرحيم ، مما يشير إلى أن خطوات الغسيل تقلل بكفاءة من عوامل القتل الرحيم إلى مستويات غير ضارة.

بغض النظر عن عدم التجانس في عدد خلايا الدم المنتشرة ، تم الحصول على BOECs التي تختلف تماما عن EPCs. BOECs مشتقة من مجموعة فرعية صغيرة من PBMCs الملتصقة التي تفتقر إلى تعبير CD14. تم تأكيد ذلك من خلال عدم وجود تلطيخ CD14 (الشكل 3C ، D). يمكن تفسير إزالة EPCs وحيدة الخلية من مزارع BOEC في الممرات المبكرة إما بموت الخلايا أو عدم الالتزام. يشير مورفولوجيا الحصى ل BOECs (الشكل 1E ، F) إلى نمط ظاهري بطاني واضح. بالإضافة إلى ذلك ، فإن التعبير الموحد لعلامة السطح CD31 (الشكل 3A) يعني وجود مجموعة متجانسة من الخلايا البطانية الناضجة. علاوة على ذلك ، فإن التشكل الشعري ل BOECs في كل من المصل الخالي (الشكل 2 أ ، ب) ووسائط النمو الكاملة (الشكل 2 ج ، د) يظهر قدرتها الوعائية المتأصلة 6,8. أظهر التحليل السابق ل BOECs الخنازير التي تم إنشاؤها باستخدام هذا البروتوكول أن هذه الخلايا إيجابية بالإضافة إلى تعبير عامل فون ويلبراند وربط الليكتين28.

إن وفرة PBMCs في الدم المتداول ، والتي تخرج منها BOECs ، تدعم جدوى طريقة قوية للحصول على إمدادات غير محدودة تقريبا من BOECs العلاجية من مصادر حيوانية. بمجرد إتقان هذه التقنية ، يمكن استخدام BOECs للعديد من التطبيقات ، بما في ذلك إصلاح الأوعية الدموية وتجديدها ، ونمذجة الأمراض ، وفحص الأدوية ، ودراسات بيولوجيا الخلايا البطانية. هناك حاجة إلى دراسات مستمرة لتأكيد تجانس الخنازير BOECs وتوافقها كمصدر علاجي في البشر.

أحد قيود هذا البروتوكول هو خطر فشل مستعمرات الخلايا البطانية في التوليد. يقدر معدل الفشل ب 5٪ -10٪ ، وفي هذه الحالات ، تكون المحاولة الثانية ضرورية. عندما يكون ضمان النجاح مهما ، يمكن جمع ضعف كمية الدم ، ويمكن اتباع البروتوكول بالتوازي لإنتاج ثقافتين مستقلتين. علاوة على ذلك ، تقتصر تجربتنا على الخنازير المحلية الصحية في يوركشاير / لاندريس / دوروك (Sus domesticus) ، ذكورا وإناثا ، 40-80 كجم ، 3-6 أشهر. معدلات النجاح مع السلالات الأخرى والأعمار والظروف التجريبية غير معروفة.

هناك قيد آخر للبروتوكول وهو عدم وجود علامة نهائية للنمط الظاهري BOEC. هنا وفي العملالسابق 28 ، تم تمييز BOECs الخنازير الناتجة عن هذا البروتوكول للعديد من علامات BOEC ، لكن فهم النمط الظاهري BOEC يستمر في التطور. تتميز BOECs أيضا في الممرات 2-3 والنمط الظاهري في الممرات الأعلى غير معروف. تتمثل ميزة BOECs الخنازير مقارنة بالبشر في الإمداد الجاهز لدم الخنزير ، والذي يسمح بتوليد ثقافات أكثر تكرارا وإمدادا قويا بخلايا مرور منخفضة متسقة.

أحد القيود الرئيسية لاستخدام خلايا الخنازير في الأساليب العلاجية هو الاستجابة المناعية للمضيف29. يتم التحقيق في العديد من استراتيجيات التعديل المناعي للتخفيف من مناعة الخلايا الغريبة لزراعة البشر ، مثل العوامل المضادة للالتهابات والتلاعب الجيني كريسبر / كاس30،31،32. اقترحت الدراسات الحديثة التعبير عن البروتينات التنظيمية التكميلية البشرية (hCRPs)33 وإدخال خنازير α1,3- galactosyltransferase المحذوفة (GTKO)32,34. هذه التطورات تبشر بالخير للتطبيق العلاجي للخلايا الغريبة ، بما في ذلك BOECs الخنازير.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

يرغب المؤلفون في الاعتراف بالتمويل المقدم من NIH / NHLBI R00 HL129068.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
19 G needle Covidien 1188818112
50 mL conical tubes Corning 352098
6 well plate BD Falcon 353046
60 mL syringes Covidien 8881560125
Ammonium chloride solution (0.8%) Stemcell Technologies 07850
Antibiotic/antimycotic solution (100x) Gibco 15240-062
Centrifuge Thermo Scientific 75-253-839
EGM-2 culture medium Lonza Walkersville CC-3162
Extension tube Hanna Pharmaceutical Supply Co. 03382C6227
Fetal bovine serum (FBS) Atlas Biologicals F-0500-A
Ficoll-Paque 1077 Cytiva 17144003 Density gradient solution
Heparin sodium injection (1,000 units/mL) Pfizer 00069-0058-01
Human plasma fibronectin Gibco 33016-015
Ice N/A N/A
Phosphate-buffered saline (PBS) Gibco 10010-023
Pipette set Eppendorf 2231300004
Sterile water Gibco 15230-162
Thin pipette Celltreat Scientific 229280

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Aird, W. C. Phenotypic heterogeneity of the endothelium: II. Representative vascular beds. Circulation Research. 100 (2), 174-190 (2007).
  2. Aird, W. C. Phenotypic heterogeneity of the endothelium: I. Structure, function, and mechanisms. Circulation Research. 100 (2), 158-173 (2007).
  3. Pober, J. S., Tellides, G. Participation of blood vessel cells in human adaptive immune responses. Trends in Immunology. 33 (1), 49-57 (2012).
  4. Navarro, S., et al. The endothelial cell protein C receptor: its role in thrombosis. Thrombosis Research. 128 (5), 410-416 (2011).
  5. Hasstedt, S. J., et al. Cell adhesion molecule 1: a novel risk factor for venous thrombosis. Blood. 114 (14), 3084-3091 (2009).
  6. Ormiston, M. L., et al. Generation and culture of blood outgrowth endothelial cells from human peripheral blood. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (106), e53384 (2015).
  7. Lin, Y., Weisdorf, D. J., Solovey, A., Hebbel, R. P. Origins of circulating endothelial cells and endothelial outgrowth from blood. Journal of Clinical Investigation. 105 (1), 71-77 (2000).
  8. Martin-Ramirez, J., Hofman, M., Biggelaar, M. V. D., Hebbel, R. P., Voorberg, J. Establishment of outgrowth endothelial cells from peripheral blood. Nature Protocols. 7 (9), 1709-1715 (2012).
  9. Gulati, R., et al. Diverse origin and function of cells with endothelial phenotype obtained from adult human blood. Circulation Research. 93 (11), 1023-1025 (2003).
  10. Hebbel, R. P. Blood endothelial cells: utility from ambiguity. The Journal of Clinical Investigation. 127 (5), 1613-1615 (2017).
  11. Medina, R. J., et al. Endothelial progenitors: A consensus statement on nomenclature. Stem Cells Translational Medicine. 6 (5), 1316-1320 (2018).
  12. Medina, R. J., et al. Molecular analysis of endothelial progenitor cell (EPC) subtypes reveals two distinct cell populations with different identities. BMC Medical Genomics. 3, 18 (2010).
  13. Jiang, A., Pan, W., Milbauer, L. C., Shyr, Y., Hebbel, R. P. A practical question based on cross-platform microarray data normalization: are BOEC more like large vessel or microvascular endothelial cells or neither of them. Journal of Bioinformatics and Computational Biology. 5 (4), 875-893 (2007).
  14. Pan, W., Shen, X., Jiang, A., Hebbel, R. P. Semi-supervised learning via penalized mixture model with application to microarray sample classification. Bioinformatics. 22 (19), 2388-2395 (2006).
  15. Hirschi, K. K., Ingram, D. A., Yoder, M. C. Assessing identity, phenotype, and fate of endothelial progenitor cells. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 28 (9), 1584-1595 (2008).
  16. Fernandez, L. A., et al. Blood outgrowth endothelial cells from hereditary haemorrhagic telangiectasia patients reveal abnormalities compatible with vascular lesions. Cardiovascular Research. 68 (2), 235-248 (2005).
  17. Critser, P. J., Yoder, M. C. Endothelial colony-forming cell role in neoangiogenesis and tissue repair. Current Opinion in Organ Transplantation. 15 (1), 68-72 (2010).
  18. Zhao, Y., et al. Isolation and culture of primary aortic endothelial cells from miniature pigs. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e59673 (2019).
  19. Chang Milbauer, L., et al. Genetic endothelial systems biology of sickle stroke risk. Blood. 111 (7), 3872-3879 (2008).
  20. Wei, P., et al. Differential endothelial cell gene expression by African Americans versusCaucasian Americans: a possible contribution to health disparity in vascular disease and cancer. BMC Medicine. 9 (1), 2 (2011).
  21. Hasstedt, S. J., et al. Cell adhesion molecule 1: a novel risk factor for venous thrombosis. Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 114 (14), 3084-3091 (2009).
  22. Milbauer, L. C., et al. Blood outgrowth endothelial cell migration and trapping in vivo: a window into gene therapy. Translational Research. 153 (4), 179-189 (2009).
  23. Matsui, H., et al. Ex vivo gene therapy for hemophilia A that enhances safe delivery and sustained in vivo factor VIII expression from lentivirally engineered endothelial progenitors. Stem Cells. 25 (10), 2660-2669 (2007).
  24. De Meyer, S. F., et al. Phenotypic correction of von Willebrand disease type 3 blood-derived endothelial cells with lentiviral vectors expressing von Willebrand factor. Blood. 107 (12), 4728-4736 (2006).
  25. Bodempudi, V., et al. Blood outgrowth endothelial cell-based systemic delivery of antiangiogenic gene therapy for solid tumors. Cancer Gene Therapy. 17 (12), 855-863 (2010).
  26. Dudek, A. Z., et al. Systemic inhibition of tumour angiogenesis by endothelial cell-based gene therapy. British Journal of Cancer. 97 (4), 513-522 (2007).
  27. Moubarik, C., et al. Transplanted late outgrowth endothelial progenitor cells as cell therapy product for stroke. Stem Cell Reviews and Reports. 7 (1), 208-220 (2011).
  28. Pislaru Sorin, V., et al. Magnetic forces enable rapid endothelialization of synthetic vascular grafts. Circulation. 114 (1), 314 (2006).
  29. Satyananda, V., et al. New concepts of immune modulation in xenotransplantation. Transplantation. 96 (11), 937-945 (2013).
  30. Klymiuk, N., Aigner, B., Brem, G., Wolf, E. Genetic modification of pigs as organ donors for xenotransplantation. Molecular Reproduction and Development. 77 (3), 209-221 (2010).
  31. Ryczek, N., Hryhorowicz, M., Zeyland, J., Lipiński, D., Słomski, R. CRISPR/Cas technology in pig-to-human xenotransplantation research. International Journal of Molecular Sciences. 22 (6), 3196 (2021).
  32. Cooper, D. K., Koren, E., Oriol, R. Genetically engineered pigs. Lancet. 342 (8872), 682-683 (1993).
  33. Cozzi, E., White, D. J. G. The generation of transgenic pigs as potential organ donors for humans. Nature Medicine. 1 (9), 964-966 (1995).
  34. Phelps, C. J., et al. Production of alpha 1,3-galactosyltransferase-deficient pigs. Science. 299 (5605), New York, N.Y. 411-414 (2003).

Tags

هذا الشهر في JoVE ، العدد 179 ، الخلايا البطانية لنمو الدم ، الخنازير ، الدم المحيطي ، الخلايا المكونة للمستعمرة البطانية ، الخلايا البطانية الناضجة ، زراعة الأعضاء ، مورفولوجيا الحصاة ، التشكل ، الخلايا السلفية البطانية
توصيف الخلايا البطانية لنمو الدم (BOEC) من الدم المحيطي للخنزير
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shradhanjali, A., Uthamaraj, S.,… More

Shradhanjali, A., Uthamaraj, S., Dragomir-Daescu, D., Gulati, R., Sandhu, G. S., Tefft, B. J. Characterization of Blood Outgrowth Endothelial Cells (BOEC) from Porcine Peripheral Blood. J. Vis. Exp. (179), e63285, doi:10.3791/63285 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter