Abstract
内皮は、血管新生、止血、炎症、恒常性などの多くの生理学的機能において重要な役割を果たす動的な統合構造です。内皮は、アテローム性動脈硬化症、高血圧、糖尿病などの病態生理においても重要な役割を果たしています。内皮細胞は血管とリンパ管の内層を形成し、構造と機能の不均一性を示します。ヒト末梢血由来の内皮細胞の機能性を、造血幹細胞由来の内皮前駆細胞や成熟血液伸長内皮細胞(または内皮コロニー形成細胞)を中心に、様々なグループが評価しています。これらの細胞は、治療および疾患モデリングのための自家リソースを提供します。異種細胞は、同様の条件で飼育された遺伝的に類似した動物を使用することによって達成されるそれらの利用可能性および均質性のために、代替の治療薬源を提供し得る。したがって、ブタ末梢血からの高度に増殖性の血液伸長内皮細胞の単離および拡大のための堅牢なプロトコルが提示されている。これらの細胞は、心血管組織工学、細胞療法、疾患モデリング、薬物スクリーニング、内皮細胞生物学の研究、異種移植における炎症反応および凝固反応を調べるための in vitro 共培養など、多くの用途に使用できます。
Introduction
内皮は非常に複雑で動的な構造であり、血管壁の重要な構成要素です。血管の内面を裏打ちし、循環血液と周囲の組織との間の物理的インターフェースを提供します。この不均一な構造は、血管新生、炎症、血管調節、止血などのさまざまな機能を果たすことが知られています1、2、3、4。ヒト臍帯静脈内皮細胞は、内皮細胞の機能を評価するために広く研究されている細胞型です。しかし、患者固有のバッチ変動性、一貫性のない表現型、および最小分割効率は、これらすべての機能を改善できる細胞源を決定する必要性を示唆しています5。
初代内皮細胞の均質な集団を得ることは技術的に困難な場合があり、初代内皮細胞は高い増殖能力を持っていません6。したがって、血管再生を研究し、病態生理学的プロセスを評価するために、さまざまなグループが末梢血に由来するさまざまな種類の内皮細胞、例えば内皮前駆細胞(EPC)または血液伸長内皮細胞(BOEC)を取得して評価することを試みてきました6,7,8,9。.紡錘形の初期EPCは造血幹細胞(HSC)に由来し、成長力が限られており、成熟内皮細胞を産生する血管新生能力も限られています。さらに、それらは炎症性単球によく似ています。さらに、機能的で増殖する成熟内皮細胞にさらに分化するそれらの能力は、依然として議論の余地がある6、7、9、10である。末梢血単核細胞(PBMC)の連続培養は、後期増殖EPC、BOEC、または内皮コロニー形成細胞(ECFC)として知られる細胞の二次集団を生じさせる可能性があります6、7、9、10。Medinaらは2018年に、EPCの限界、命名法の曖昧さ、およびEPC11の下で継続的にグループ化された多くの異なる細胞型との一致の一般的な欠如を認めました。対照的に、BOECは、血管修復、健康と病気、および細胞療法におけるその役割で認識されるようになりました。これらの細胞のさらなる研究および治療的使用は、循環前駆細胞からこれらの細胞型を一貫して導出するためのプロトコルに依存するであろう。
BOECなどの初代細胞は、増殖性の高い成熟内皮細胞6を得るための代理として使用することができる。BOECは初期のEPCとは表現型的に異なり、石畳の形態や付着接合部やカベオラの発現などの典型的な内皮の特徴を示します12。Hebbelらによる遺伝子プロファイリング13,14,15は、BOECまたはECFCが微小血管および大血管形成を促進する真の内皮細胞であることを発見しました。したがって、BOECは、病態生理学的プロセスおよび遺伝的変異を評価するためのツールとして使用できます16。それらはまた、血管再生のための細胞療法のための優れた細胞源と考えられています17。したがって、これらの高度に増殖する細胞を一貫して導出するための標準化されたプロトコルが不可欠です。
BOECは、ヒトの病態生理学的および遺伝的変異を研究するための強力なツールを提供しますが、BOECのより均質な供給源は、より堅牢で信頼性の高い実験および治療結果を提供する可能性があります。優れた均質性は、同様の条件で飼育された遺伝的に類似した動物に由来する異種細胞源を使用することによって達成することができる18。異種細胞源は宿主の免疫応答を誘発する傾向がありますが、免疫調節戦略は、免疫適合性のある動物および細胞を含む動物製品を生成することを目的として開発されています。特にブタは末梢血の豊富な供給源であり、人間との解剖学的および生理学的類似性のために医療機器および他の治療法を研究するために一般的に使用されている。したがって、この研究は、ブタ末梢血からの高増殖性BOECの分離と拡大のためのプロトコルを改良します。以下に詳述するプロトコルは、比較的少量の血液から多数のBOECを取得するための簡単で信頼性の高い方法です。培養物を数回の継代で拡張して、単一の血液サンプルから数百万の細胞を生成することができます。
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Protocol
すべての動物実験は、ウィスコンシン医科大学とメイヨークリニックのそれぞれの施設動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認されました。
注:この研究では、ヨークシャー/ランドレース/デュロックのクロス家畜豚(Sus domestic us)、オスとメス、40〜80 kg、3〜6か月齢を使用しました。
1.ブタ末梢血の採取
- 材料を準備します。
- ヘパリン溶液を滅菌生理食塩水で100 U / mLに希釈します。.
- 2つの50 mLコニカルチューブと2つの60 mLシリンジのそれぞれに3〜4 mLのヘパリン溶液を追加します。
- 希釈していないヘパリン溶液(1,000 U / mL)を延長チューブに引き込みます。
- ヘパリン充填延長チューブの一方の端に19 G針を接続し、もう一方の端にヘパリン含有60 mLシリンジを接続します。
- 制度的方針に従って豚を麻酔する
- 麻酔を誘発するために、アトロピン(0.05 mg / kg)、チレタミン/ゾラゼパム(2-5 mg / kg)、およびキシラジン(2 mg / kg)のIM注射を投与します。.
注:動物が意識を失い、下顎筋が硬くなくなると、適切な麻酔が達成されます。 - 動物を仰臥位に置き、安定感を高めるために丸めたタオルを両側に置きます。
- 麻酔下での乾燥を防ぐために眼科用軟膏を目に塗ります。
- 毛布、加熱パッド、および/または加熱された手順テーブルを含む麻酔中の熱サポートを提供します。
- 麻酔を誘発するために、アトロピン(0.05 mg / kg)、チレタミン/ゾラゼパム(2-5 mg / kg)、およびキシラジン(2 mg / kg)のIM注射を投与します。.
- ベタジンスクラブ溶液で大腿鼠径部をきれいにします。
- 19 Gの針で大腿静脈または動脈に穴を開け、ゆっくりと(~1-2 mL / s)50 mLの血液をシリンジに引き込みます。
注: 描画が速すぎると、セルが損傷する可能性があります。 - 針を所定の位置に残し、すぐに延長チューブをねじり、60 mLシリンジを外します
- 血液をヘパリン含有50mLのコニカルチューブにゆっくりと移します。
- 50 mLのコニカルチューブにしっかりと蓋をし、数回静かに反転させて混合し、氷の上に置きます。
- 残りのヘパリン含有60 mLシリンジを延長チューブに接続し、延長チューブのネジを外し、さらに50 mLの血液をシリンジにゆっくりと吸引します。
- すぐに動脈または静脈から針を外し、残りの血液を延長チューブからシリンジにゆっくりと引き抜きます。
- 60 mLシリンジを延長チューブから外し、残りのヘパリン含有50 mLコニカルチューブに血液をゆっくりと移します。
- 50 mLのコニカルチューブにしっかりと蓋をし、数回静かに反転させて混合し、氷の上に置きます。
- ブタの大腿鼠径部に圧力止血を適用します。
- 制度的方針に従って豚を回復します。動物が胸骨横臥を維持し、通常の住居/犬小屋エリアに戻るのに十分な意識を取り戻すまで、動物を継続的に監視します。
2. 単核球の単離
- 4本の50 mLコニカルチューブでリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で血液を1:1に希釈します。
注:この作業は、細胞培養物の汚染を避けるために、無菌技術を使用して細胞培養フードで実行する必要があります。 - 25 mLの室温ですぐに使用できる密度勾配溶液を8本の50 mLコニカルチューブに加えます。
- 50 mLのコニカルチューブを含む各密度勾配溶液の内側に沿って、チューブをピペットチップに対して鋭角に保持することにより、25 mLの血液/生理食塩水を非常にゆっくりとピペットします。
注意: 血液溶液は、密度勾配溶液の上に穏やかに重なり、明確に定義されたインターフェースを維持する必要があります。 - チューブを560 x g および室温(RT)で30分間遠心分離します。
注意: 最良の結果を得るには、可能であれば遠心分離機ブレーキを無効にしてください。 - 薄いピペットを使用して、各チューブからバフィーコート(密度勾配溶液の上と透明な血漿の下の単核細胞の濁った層)を注意深く収集し、2つの新しい50 mLコニカルチューブに均等に分配します。チューブを含む密度勾配溶液を廃棄します。
注意: 密度勾配溶液とプラズマをできるだけ少なく収集しながら、できるだけ多くのバフィーコートを収集します。
3.細胞の洗浄とメッキ
- 6ウェルプレートをフィブロネクチンでコーティングします。
- ヒト血漿フィブロネクチンを滅菌水で1 mg / mLに希釈してストック溶液を作ります。アリコートは-20°Cで保存してください。
- 600 μLのフィブロネクチンストック溶液を3 mLのPBSで希釈して、3.6 mLのフィブロネクチンの作業溶液を作ります。
- 600 μLのフィブロネクチン作業溶液を6ウェルプレートの各ウェルに移し、均一にコーティングされるまで穏やかに揺り動かします。
- フィブロネクチンがウェルをコーティングするまで30分待ち、各ウェルから溶液を静かに吸引します。
- フィブロネクチンがコーティングするのを待っている間に、単核球を洗います
- チューブに最大45 mLのPBSを補充します
- 560 x g 、低ブレーキで4°Cで5分間遠心分離します。両方のチューブから上清を吸引します。
- 各細胞ペレットを25 mLのPBSに再懸濁します。
- 繰り返してもう一度洗います。
- 各細胞ペレットを5 mLのPBSに再懸濁し、15 mLの0.8%塩化アンモニウム溶液を各チューブに加えます。
注:このステップは、残りの赤血球を溶解することです。 - 氷上で10分間インキュベートします。
- 以前と同様に、チューブにPBSを補充し、560 x g 、低ブレーキで4°Cで5分間遠心分離して細胞を洗浄します。両方のチューブから上清を吸引します。
- 各細胞ペレットを25 mLのPBSに再懸濁し、もう一度洗浄を繰り返します。
- 各細胞ペレットを、10%ウシ胎児血清(FBS)と10,000 U/mLペニシリン、10 mg/mLストレプトマイシンおよび25 μg/mLアムホテリシンを含む1x抗生物質/抗真菌溶液を添加した6 mLのEGM-2培養液に再懸濁します。
注:EGM-2培地は、200μLのヒドロコルチゾン、2mLのヒト線維芽細胞増殖因子(hFGF-B)、500μLの血管内皮増殖因子(VEGF)、500μLのインスリン様成長因子(R3IGF-1 )の組換えアナログ、500μLのアスコルビン酸、500μLのヒト上皮成長因子(hEGF)を添加したEBM-2培養培地からなる。 500 mLあたり500 μLのゲンタマイシン/アンホテリシン、および500 μLのヘパリン。 - 2 mLの細胞懸濁液をフィブロネクチンコーティングされた6ウェルプレートの各ウェルに静かに移し、均一にコーティングされるまで穏やかに揺り動かします。
注:目標は、形成される内皮コロニーの数を最大化するために、できるだけ多くの細胞を播種することです。
4. 細胞培養
- 細胞を37°C、5%CO2、湿度100%でインキュベートします。
- 翌日、1 mLの新鮮な培養液を各ウェルに穏やかに加えます。
注:フィブロネクチンコーティングに緩く接着している細胞を乱さないように優しくすることが重要です。 - 翌日、各ウェルから1.5 mLの培養液を静かに吸引し、1.5 mLの新鮮な培地と交換して、半培養液交換を行います。
- 次の5日間のそれぞれで、各ウェルに完全培養培地交換を静かに行います(1ウェルあたり2 mLの新鮮な培地)。
- その後、週に3回培養液を静かに交換します。
- 低出力(対物レンズ4倍)光学顕微鏡下で細胞培養を定期的に可視化します。
注:付着性血液伸長内皮細胞(BOEC)コロニーは、プレーティング後7〜10日でウェルに現れ始めます。非接着細胞型は培地の変更とともに廃棄され、他の接着細胞型はBOECコロニーが成長するにつれて徐々に消散します。 - BOECをフィブロネクチンコーティングT-75フラスコに~70%-80%コンフルエントに通過させ、培養培地の交換を週に3回続けます。
注:播種密度は、代わりにコロニーをT25フラスコに継代させることで制御できます。その後の継代はフィブロネクチンコーティングを必要とせず、培地交換は週に2回に減らすことができます。 - 継代1〜3からの細胞は、実験に使用したり、凍結培地に移して将来の使用のために液体窒素中に保存したりすることができる。
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Representative Results
培養開始からBOECコロニーが観察されるまで培養細胞の形態が観察された(図1)。より小さな集団の接着細胞が培養皿に付着して増殖し始めましたが、非接着細胞は培地の変更とともに除去されました(図1B)。コロニーは、中心点から放射状に外側に増殖する内皮様細胞の集まりとして6日目に最初に現れました(図1D)。培養が進むにつれて、細胞コロニーはより密になり、成熟内皮細胞と同様の石畳の形態を示しました(図1F)。典型的な内皮石畳の形態は、光学顕微鏡を使用してBOECの簡単な予備識別を提供します。
内皮細胞コロニーは、典型的には、培養10〜14日で継代の準備ができている。この時点で、6ウェルプレートは通常、生存率が93%〜98%の~100万個の細胞を生成します。最初の継代中に、内皮細胞は増殖し、T75フラスコ内に6~1000万個の細胞を生成します。
BOECの形態形成を評価するために、基底膜マトリックス(Matrigelなど)を15ウェル血管新生プレートに10 μL/ウェルで播種し、37°Cで30分間インキュベートして重合を可能にしました。継代2細胞を基底膜マトリックスコーティングプレート上に播種し、14時間および24時間の時点で画像化した。ウェル当たり約3,500個の細胞密度で、ネットワークおよびチューブ様構造を形成することができた。チューブ形成は、無血清培地(FBSを除くサプリメントを含むEGM-2)では14時間以内、完全増殖培地(FBSを含むサプリメントを含むEGM-2)では24時間以内に認められました。FBSを添加すると、内皮細胞特異的成長因子(VEGFなど)が希釈され、他のシグナル伝達因子が導入され、チューブ形成プロセスが遅延する可能性があります。2D位相差顕微鏡を使用して、無血清培地(図2A、B)および完全増殖培地(図2C、D)でのチューブ形成を画像化しました。両方の培地条件の細胞は形態学的分化を受け、毛細管様構造の広範なネットワークに急速に組織化されました。これらの構造は、in vivo毛細血管ネットワークに似た組織化された細胞索で構成されていました。さらに、倍率20倍の顕微鏡写真は、内皮細胞の複雑な多細胞組織とその形態分化を詳細に示しています。培地条件間に形態学的差異は認められなかった。毛細管状構造の広範なネットワークは、培養細胞が成熟した機能的な内皮細胞に分化することを強く示唆しています。
BOECはさらに、成熟内皮細胞マーカーCD31または血小板内皮細胞接着分子-1(PECAM1)の発現によって特徴付けられた(図3A、B)。BOECはCD31の均一な発現を示した。さらに、フローサイトメトリー分析により、PBMCの陽性対照群と比較して、単球マーカーCD14に対して陰性に染色された細胞としてEPCが存在しないことが確認されました(図3C、D)。
図1:表現型光学顕微鏡画像。 (A)0日目、(B)2日目、(C)4日目、(D)6日目、(E)8日目、および(F)最初の継代後に10倍の倍率で観察された培養BOECの光学顕微鏡画像。スケールバー:200μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:継代2BOECの形態学的分化と組織化。 継代2 BOECの毛細管状構造への形態学的分化および組織化は、無血清培地では14時間以内、完全増殖培地では24時間以内に基底膜マトリックスで認められました。(A)4倍の無血清培地、(B)20倍の無血清培地、(C)4倍の完全増殖培地、および(D)20倍の完全増殖培地。スケールバー:200μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:CD31およびCD14によるBOECの特性評価 。 (A)継代2〜3個のBOECを、緑色で見られる抗CD31-FITC抗体および(B)対応する位相差顕微鏡画像を用いてPECAM1について染色した。細胞を懸濁液で染色し、懸濁液を顕微鏡スライド上に画像化した。スケールバー:200μm。 (C)CD14-AF700抗体を用いたBOECのフローサイトメトリー分析と(D)ポジティブコントロール末梢血単核球(PBMC)の比較。陽性CD14染色は青色で示し、非染色細胞は赤色で示す。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
BOECは、さまざまな科学的および治療的アプローチで使用できる強力なツールです7、8、16。BOECは、血管疾患および癌の発症に関与する重要な要因を解明するためにEC遺伝子発現を分析するために使用されています5,19,20,21。BOECは、血管再生や遺伝子送達などの治療用途にも使用されています22,23,24。遺伝子組み換えBOECは、抗血管新生腫瘍治療能力で知られています25,26。さらに、BOECの血管新生の可能性は、血管新生および新生血管形成を目的とした細胞療法の優れた候補になります17,27。いくつかの研究がヒト末梢血からBOECを取得する方法を説明していますが6,7,8,9、根底にある病態生理学的および遺伝的変異によるヒト細胞源の変動性は、健康な異種発生源からBOECを取得する重要な必要性を示唆しています9,13,18。
ブタ末梢血単核細胞からBOECを効率的に誘導するための詳細なプロトコルが提示されています。重要なステップには、血液サンプルをできるだけ早く処理すること、および密度勾配遠心分離後にバフィーコート層を効率的に収穫して、培養に入る生存可能なPBMCの数を最大化することが含まれます。細胞の初期めっき密度および適時継代は、これらの細胞タイプの一貫した単離を得るための重要な考慮事項である。開始血液量が100 mLの場合、1つの6ウェルプレートに適切な数のPBMCが提供されます。ブタから安全に採取できる血液の最大量は動物の体重によって異なります。豚の推奨される安全な1回限りの最大血液量収集は、体重1kgあたり8mLです。さらに、継代0から継代1への初期コロニーの適時継代も不可欠である。播種密度が非常に低い場合、または細胞がコンフルエントに達すると、細胞は増殖を停止します。細胞がコンフルエントになると、それらは細長い間葉系の形態および表現型に変化し始める。播種密度は、コロニーをT75フラスコではなくT25フラスコに継代することによっても制御することができる。非接着性EPCを廃棄しながらできるだけ多くの接着細胞を捕捉することが非常に重要であるため、最初の培地交換中に接着細胞タイプを失わないように慎重に検討する必要があります。このプロトコルは、約1週間で成長細胞コロニーを生成します。
このプロトコルは再現性と信頼性が高いです。内皮細胞コロニーの拡大は、推定90%〜95%の培養で達成される。失敗は通常、内皮細胞コロニーの形成の欠如が原因であり、少なくとも1つの内皮細胞コロニーが形成されると、ほとんどの場合、培養中に増殖します。障害の原因には、ランダムな変動性、採血中の細胞の過度のせん断、培養中の微生物の汚染、および処理ステップ中の単核細胞の高い損失が含まれます。培養に失敗した後、通常、2番目の培養が成功し、動物間の変動が主要な要因ではないことを示しています。このプロトコルは、安楽死直後に採血する場合にも成功し、洗浄ステップが安楽死剤を無害なレベルまで効率的に減らすことを示しています。
循環血球集団の不均一性に関係なく、EPCとは非常に異なるBOECが得られました。BOECは、CD14発現を欠く付着性PBMCの小さなサブセットに由来します。これは、CD14染色の非存在によって確認された(図3C、D)。初期の継代におけるBOEC培養からの単球性EPCのクリアランスは、細胞死または非接着のいずれかによって説明され得る。BOECの石畳の形態(図1E、F)は、顕著な内皮表現型を示唆しています。加えて、表面マーカーCD31の均一な発現(図3A)は、成熟内皮細胞の均質な集団を意味する。さらに、無血清(図2A、B)および完全増殖培地(図2C、D)の両方でのBOECの毛細血管形態形成は、それらの固有の血管新生能力を示しています6,8。このプロトコルを使用して生成されたブタBOECの以前の分析では、これらの細胞がフォンビルブランド因子発現およびレクチン結合に対してさらに陽性であることが示されています28。
BOECが出現する循環血中の豊富なPBMCは、動物源から治療用BOECの事実上無限の供給を得るための堅牢な方法の実現可能性を裏付けています。この技術を習得すると、BOECは血管の修復と再生、疾患モデリング、薬物スクリーニング、内皮細胞生物学研究など、いくつかのアプリケーションに使用できます。ブタのBOECの均質性とヒトの治療源としての適合性を確認するには、継続的な研究が必要です。
このプロトコルの1つの制限は、内皮細胞コロニーが生成に失敗する拡大のリスクである。失敗率は5%〜10%と推定され、このような場合は2回目の試行が必要です。成功の保証が重要な場合は、2倍の量の血液を採取し、プロトコルに並行して従って2つの独立した培養を行うことができます。さらに、私たちの経験は、健康なヨークシャー/ランドレース/デュロッククロス家畜豚(Sus domestic us)、オスとメス、40〜80 kg、3〜6か月に限定されています。他の品種、年齢、実験条件での成功率は不明です。
プロトコルの別の制限は、BOEC表現型の決定的なマーカーが存在しないことです。ここと以前の研究28では、このプロトコルから生成されたブタのBOECは、いくつかのBOECマーカーについて特徴付けられていますが、BOEC表現型の理解は進化し続けています。BOECは継代2〜3でも特徴付けられ、より高い継代での表現型は不明です。ブタのBOECがヒトと比較して優れているのは、ブタの血液をすぐに供給できることであり、これにより、より頻繁な培養物の生成と、一貫した低継代細胞の強力な供給が可能になります。
治療アプローチにおいてブタ細胞を使用することの主な制限の1つは、宿主免疫応答である29。抗炎症剤やCRISPR/Cas遺伝子操作など、ヒト移植用の異種細胞の免疫原性を軽減するために、いくつかの免疫調節戦略が研究されています30,31,32。より最近の研究では、ヒト相補的調節タンパク質(hCRP)33の発現とα1,3-ガラクトース転移酵素欠失(GTKO)の導入が提案されています32,34ブタ。これらの進歩は、ブタBOECを含む異種細胞の治療応用に有望です。
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Disclosures
著者は開示するものは何もありません。
Acknowledgments
著者らは、NIH / NHLBI R00 HL129068からの資金提供を認めたいと考えています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 19 G needle | Covidien | 1188818112 | |
| 50 mL conical tubes | Corning | 352098 | |
| 6 well plate | BD Falcon | 353046 | |
| 60 mL syringes | Covidien | 8881560125 | |
| Ammonium chloride solution (0.8%) | Stemcell Technologies | 07850 | |
| Antibiotic/antimycotic solution (100x) | Gibco | 15240-062 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 75-253-839 | |
| EGM-2 culture medium | Lonza Walkersville | CC-3162 | |
| Extension tube | Hanna Pharmaceutical Supply Co. | 03382C6227 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Atlas Biologicals | F-0500-A | |
| Ficoll-Paque 1077 | Cytiva | 17144003 | Density gradient solution |
| Heparin sodium injection (1,000 units/mL) | Pfizer | 00069-0058-01 | |
| Human plasma fibronectin | Gibco | 33016-015 | |
| Ice | N/A | N/A | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-023 | |
| Pipette set | Eppendorf | 2231300004 | |
| Sterile water | Gibco | 15230-162 | |
| Thin pipette | Celltreat Scientific | 229280 |
References
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