ブタ末梢血からの血液伸長内皮細胞(BOEC)の特性評価
Abstract
内皮は、血管新生、止血、炎症、恒常性などの多くの生理学的機能において重要な役割を果たす動的な統合構造です。内皮は、アテローム性動脈硬化症、高血圧、糖尿病などの病態生理においても重要な役割を果たしています。内皮細胞は血管とリンパ管の内層を形成し、構造と機能の不均一性を示します。ヒト末梢血由来の内皮細胞の機能性を、造血幹細胞由来の内皮前駆細胞や成熟血液伸長内皮細胞(または内皮コロニー形成細胞)を中心に、様々なグループが評価しています。これらの細胞は、治療および疾患モデリングのための自家リソースを提供します。異種細胞は、同様の条件で飼育された遺伝的に類似した動物を使用することによって達成されるそれらの利用可能性および均質性のために、代替の治療薬源を提供し得る。したがって、ブタ末梢血からの高度に増殖性の血液伸長内皮細胞の単離および拡大のための堅牢なプロトコルが提示されている。これらの細胞は、心血管組織工学、細胞療法、疾患モデリング、薬物スクリーニング、内皮細胞生物学の研究、異種移植における炎症反応および凝固反応を調べるための in vitro 共培養など、多くの用途に使用できます。
Introduction
内皮は非常に複雑で動的な構造であり、血管壁の重要な構成要素です。血管の内面を裏打ちし、循環血液と周囲の組織との間の物理的インターフェースを提供します。この不均一な構造は、血管新生、炎症、血管調節、止血などのさまざまな機能を果たすことが知られています1、2、3、4。ヒト臍帯静脈内皮細胞は、内皮細胞の機能を評価するために広く研究されている細胞型です。しかし、患者固有のバッチ変動性、一貫性のない表現型、および最小分割効率は、これらすべての機能を改善できる細胞源を決定する必要性を示唆しています5。
初代内皮細胞の均質な集団を得ることは技術的に困難な場合があり、初代内皮細胞は高い増殖能力を持っていません6。したがって、血管再生を研究し、病態生理学的プロセスを評価するために、さまざまなグループが末梢血に由来するさまざまな種類の内皮細胞、例えば内皮前駆細胞(EPC)または血液伸長内皮細胞(BOEC)を取得して評価することを試みてきました6,7,8,9。.紡錘形の初期EPCは造血幹細胞(HSC)に由来し、成長力が限られており、成熟内皮細胞を産生する血管新生能力も限られています。さらに、それらは炎症性単球によく似ています。さらに、機能的で増殖する成熟内皮細胞にさらに分化するそれらの能力は、依然として議論の余地がある6、7、9、10である。末梢血単核細胞(PBMC)の連続培養は、後期増殖EPC、BOEC、または内皮コロニー形成細胞(ECFC)として知られる細胞の二次集団を生じさせる可能性があります6、7、9、10。Medinaらは2018年に、EPCの限界、命名法の曖昧さ、およびEPC11の下で継続的にグループ化された多くの異なる細胞型との一致の一般的な欠如を認めました。対照的に、BOECは、血管修復、健康と病気、および細胞療法におけるその役割で認識されるようになりました。これらの細胞のさらなる研究および治療的使用は、循環前駆細胞からこれらの細胞型を一貫して導出するためのプロトコルに依存するであろう。
BOECなどの初代細胞は、増殖性の高い成熟内皮細胞6を得るための代理として使用することができる。BOECは初期のEPCとは表現型的に異なり、石畳の形態や付着接合部やカベオラの発現などの典型的な内皮の特徴を示します12。Hebbelらによる遺伝子プロファイリング13,14,15は、BOECまたはECFCが微小血管および大血管形成を促進する真の内皮細胞であることを発見しました。したがって、BOECは、病態生理学的プロセスおよび遺伝的変異を評価するためのツールとして使用できます16。それらはまた、血管再生のための細胞療法のための優れた細胞源と考えられています17。したがって、これらの高度に増殖する細胞を一貫して導出するための標準化されたプロトコルが不可欠です。
BOECは、ヒトの病態生理学的および遺伝的変異を研究するための強力なツールを提供しますが、BOECのより均質な供給源は、より堅牢で信頼性の高い実験および治療結果を提供する可能性があります。優れた均質性は、同様の条件で飼育された遺伝的に類似した動物に由来する異種細胞源を使用することによって達成することができる18。異種細胞源は宿主の免疫応答を誘発する傾向がありますが、免疫調節戦略は、免疫適合性のある動物および細胞を含む動物製品を生成することを目的として開発されています。特にブタは末梢血の豊富な供給源であり、人間との解剖学的および生理学的類似性のために医療機器および他の治療法を研究するために一般的に使用されている。したがって、この研究は、ブタ末梢血からの高増殖性BOECの分離と拡大のためのプロトコルを改良します。以下に詳述するプロトコルは、比較的少量の血液から多数のBOECを取得するための簡単で信頼性の高い方法です。培養物を数回の継代で拡張して、単一の血液サンプルから数百万の細胞を生成することができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
BOECは、さまざまな科学的および治療的アプローチで使用できる強力なツールです7、8、16。BOECは、血管疾患および癌の発症に関与する重要な要因を解明するためにEC遺伝子発現を分析するために使用されています5,19,20,21。BOEC?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、NIH / NHLBI R00 HL129068からの資金提供を認めたいと考えています。
Materials
| 19 G needle | Covidien | 1188818112 | |
| 50 mL conical tubes | Corning | 352098 | |
| 6 well plate | BD Falcon | 353046 | |
| 60 mL syringes | Covidien | 8881560125 | |
| Ammonium chloride solution (0.8%) | Stemcell Technologies | 07850 | |
| Antibiotic/antimycotic solution (100x) | Gibco | 15240-062 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 75-253-839 | |
| EGM-2 culture medium | Lonza Walkersville | CC-3162 | |
| Extension tube | Hanna Pharmaceutical Supply Co. | 03382C6227 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Atlas Biologicals | F-0500-A | |
| Ficoll-Paque 1077 | Cytiva | 17144003 | Density gradient solution |
| Heparin sodium injection (1,000 units/mL) | Pfizer | 00069-0058-01 | |
| Human plasma fibronectin | Gibco | 33016-015 | |
| Ice | N/A | N/A | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-023 | |
| Pipette set | Eppendorf | 2231300004 | |
| Sterile water | Gibco | 15230-162 | |
| Thin pipette | Celltreat Scientific | 229280 |
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