Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

אפיון צמיחת דם תאי אנדותל (BOEC) מדם היקפי חזירי

Published: January 6, 2022 doi: 10.3791/63285
Automatic Translation
1, 2, 3, 4, 4, 1
1Department of Biomedical Engineering, Medical College of Wisconsin & Marquette University, 2Division of Engineering, Mayo Clinic, 3Department of Physiology & Biomedical Engineering, Mayo Clinic, 4Department of Cardiovascular Medicine, Mayo Clinic

Abstract

האנדותל הוא מבנה משולב דינמי הממלא תפקיד חשוב בתפקודים פיזיולוגיים רבים כגון אנגיוגנזה, המוסטאזיס, דלקת והומאוסטזיס. האנדותל גם ממלא תפקיד חשוב בפתופיזיולוגיות כגון טרשת עורקים, יתר לחץ דם וסוכרת. תאי אנדותל יוצרים את הרירית הפנימית של כלי הדם והלימפה ומפגינים הטרוגניות במבנה ובתפקוד. קבוצות שונות העריכו את הפונקציונליות של תאי אנדותל שמקורם בדם היקפי אנושי תוך התמקדות בתאי אב אנדותל שמקורם בתאי גזע המטופויטיים או בתאי אנדותל בוגרים (או תאים יוצרי מושבות אנדותל). תאים אלה מספקים משאב אוטולוגי לטיפולים ולמידול מחלות. תאים קסנוגניים עשויים לספק מקור חלופי לטיפולים בשל זמינותם וההומוגניות המושגת על ידי שימוש בבעלי חיים דומים גנטית שגודלו בתנאים דומים. לפיכך, הוצג פרוטוקול חזק לבידוד והרחבה של תאי אנדותל בעלי שגשוג דם גבוה מדם היקפי חזירי. תאים אלה יכולים לשמש ליישומים רבים כגון הנדסת רקמות לב וכלי דם, תרפיה תאית, מידול מחלות, בדיקת תרופות, לימוד ביולוגיה של תאי אנדותל, ותרביות מבחנה כדי לחקור תגובות דלקתיות וקרישה בהשתלת קסנו.

Introduction

האנדותל הוא מבנה מורכב ודינמי ביותר ומרכיב חיוני בדופן כלי הדם. הוא מצפה את פני השטח הפנימיים של כלי הדם כדי לספק ממשק פיזי בין מחזור הדם לבין הרקמות הסובבות אותו. מבנה הטרוגני זה ידוע לבצע פונקציות שונות כגון אנגיוגנזה, דלקת, vasoregulation, hemostasis 1,2,3,4. תאי אנדותל של וריד הטבור האנושי הם סוג תא שנחקר באופן נרחב כדי להעריך את הפונקציונליות של תאי אנדותל. עם זאת, השתנות האצווה הספציפית למטופל, פנוטיפ לא עקבי ויעילות פיצול מינימלית מצביעים על צורך לקבוע מקור תא שיכול לשפר את כל התכונות הללו5.

השגת אוכלוסייה הומוגנית של תאי אנדותל ראשוניים יכולה להיות מאתגרת מבחינה טכנית, ולתאי אנדותל ראשוניים אין יכולת שגשוג גבוהה6. לפיכך, כדי לחקור התחדשות כלי דם ולהעריך תהליכים פתופיזיולוגיים, קבוצות שונות ניסו להשיג ולהעריך סוגים שונים של תאי אנדותל שמקורם בדם היקפי, למשל, תאי אב אנדותל (EPC) או תאי אנדותל צמיחת דם (BOECs)6,7,8,9 . ה-EPCs המוקדמים בצורת ציר מקורם בתאי גזע המטופויטיים (HSC) ויש להם עוצמת גדילה מוגבלת ויכולת אנגיוגנית מוגבלת לייצר תאי אנדותל בוגרים. יתר על כן, הם דומים מאוד מונוציטים דלקתיים. בנוסף, יכולתם להמשיך ולהתמיין לתאי אנדותל מתפקדים, מתרבים ובוגרים עדיין שנויה במחלוקת 6,7,9,10. התרבית המתמשכת של תאי דם חד-גרעיניים היקפיים (PBMCs) יכולה להצמיח אוכלוסייה משנית של תאים הידועים בשם EPCs מאוחרים, BOECs או תאים יוצרי מושבות אנדותל (ECFCs)6,7,9,10. מדינה ואחרים בשנת 2018, הכירו במגבלות של EPCs, בעמימות של המינוח שלהם, יחד עם חוסר התאמה כללי עם סוגי תאים מובחנים רבים המקובצים ברציפות תחת EPCs11. לעומת זאת, BOECs הפכו מוכרים על תפקידם בתיקון כלי דם, בריאות ומחלות, וטיפול תאי. מחקר נוסף ושימוש טיפולי בתאים אלה יסתמכו על פרוטוקולים כדי להפיק באופן עקבי סוגי תאים אלה מתאי אב במחזור.

תאים ראשוניים כגון BOECs יכולים לשמש כפונדקאית להשגת תאי אנדותל בוגרים בעלי שגשוג גבוה6. BOECs נבדלים פנוטיפית מ- EPCs מוקדמים ומציגים תכונות אנדותל טיפוסיות כגון מורפולוגיה מרוצפת וביטוי של צמתים דבקים ומערות12. פרופיל גנים שנערך על ידי Hebbel et al.13,14,15 מצא כי BOECs או ECFCs הם תאי אנדותל אמיתיים כפי שהם מקדמים היווצרות כלי דם וכלי דם גדולים. לפיכך, BOECs יכולים לשמש ככלי להערכת תהליכים פתופיזיולוגיים ושונות גנטית16. הם נחשבים גם למקור תאי מצוין לטיפול תאי להתחדשות כלי הדם17. לפיכך, פרוטוקול סטנדרטי כדי לגזור באופן עקבי תאים אלה מאוד שגשוג הוא חיוני.

בעוד BOECs מספקים כלי רב עוצמה לחקר השונות הפתופיזיולוגית והגנטית האנושית, מקור הומוגני יותר של BOECs עשוי לספק תוצאות ניסוייות וטיפוליות חזקות ואמינות יותר. הומוגניות מעולה יכולה להיות מושגת על ידי שימוש במקורות תאים קסנוגניים שמקורם בבעלי חיים דומים גנטית שגדלו בתנאים דומים18. בעוד מקורות תאים קסנוגניים נוטים לעורר תגובה חיסונית של המאכסן, אסטרטגיות אימונומודולציה מפותחות במטרה לייצר בעלי חיים ומוצרים מן החי התואמים למערכת החיסון, כולל תאים. חזירים, בפרט, הם מקור שופע של דם היקפי והם משמשים בדרך כלל לחקר מכשירים רפואיים וטיפולים אחרים בשל דמיון אנטומי ופיזיולוגי לבני אדם. לפיכך, מחקר זה מזקק את הפרוטוקול לבידוד והרחבה של BOECs מתרבים מאוד מדם היקפי חזירי. הפרוטוקול המפורט להלן הוא שיטה פשוטה ואמינה להשגת מספר רב של BOECs מנפח קטן יחסית של דם. ניתן להרחיב את התרביות באמצעות מספר מעברים כדי ליצור מיליוני תאים מדגימת דם אחת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל המחקרים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדות המוסדיות לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) בהתאמה במכללה הרפואית של ויסקונסין ומאיו קליניק.

הערה: במחקר זה נעשה שימוש בחזירי בית יורקשייר/לנדרייס/דורוק (Sus domesticus), זכר ונקבה, 40-80 ק"ג, בני 3-6 חודשים.

1. איסוף דם היקפי חזירי

  1. הכינו חומרים.
    1. לדלל את תמיסת הפרין ל 100 U/mL במי מלח סטריליים.
    2. הוסף 3-4 מ"ל של תמיסת הפרין לכל אחד משני צינורות חרוטי 50 מ"ל ושני מזרקים 60 מ"ל.
    3. משוך תמיסת הפרין לא מדוללת (1,000 U/mL) לתוך צינור מאריך.
    4. חבר מחט 19 G לקצה אחד של צינור הארכה מלא הפרין ומזרק המכיל הפרין 60 מ"ל לקצה השני.
  2. להרדים חזיר בהתאם למדיניות המוסדית
    1. מתן הזרקת IM של אטרופין (0.05 מ"ג/ק"ג), טילטמין/זולאזפאם (2-5 מ"ג/ק"ג) וקסילזין (2 מ"ג/ק"ג) להשראת הרדמה.
      הערה: הרדמה מספקת מושגת ברגע שהחיה מחוסרת הכרה ושרירי הלסת אינם נוקשים.
    2. הניחו את בעל החיים במצב שכיבה והניחו מגבות מגולגלות משני הצדדים כדי לספק יציבות.
    3. יש למרוח משחה אופתלמית על העיניים כדי למנוע יובש בזמן הרדמה.
    4. לספק תמיכה תרמית במהלך ההרדמה כולל שמיכות, כריות חימום ו / או שולחן הליך מחומם.
  3. נקו את אזור המפשעה של עצם הירך עם תמיסת פילינג בטאדין.
  4. נקב את וריד הירך או עורק הירך עם מחט 19 G ולאט (~ 1-2 מ"ל / שנייה) למשוך 50 מ"ל של דם לתוך המזרק.
    הערה: ציור מהיר מדי עלול לגרום נזק לתאים.
  5. השארת המחט במקום, מיד לסובב את צינור ההארכה לנתק את מזרק 60 מ"ל
  6. מעבירים לאט את הדם לצינור חרוטי המכיל הפרין 50 מ"ל.
  7. מכסים היטב את הצינור החרוטי 50 מ"ל, הופכים בעדינות כמה פעמים כדי לערבב, ומניחים על קרח.
  8. חברו את המזרק הנותר המכיל הפרין 60 מ"ל לצינור המאריך, שחררו את הצינור המאריך ושאבו לאט לאט 50 מ"ל נוספים של דם לתוך המזרק.
  9. מיד להסיר את המחט מן העורק או הווריד ולאט לאט למשוך את הדם שנותר מן הצינור הרחבה לתוך מזרק.
  10. נתקו את מזרק 60 מ"ל מצינור ההארכה והעבירו באיטיות את הדם לצינור החרוטי הנותר המכיל הפרין 50 מ"ל.
  11. מכסים היטב את הצינור החרוטי 50 מ"ל, הופכים בעדינות כמה פעמים כדי לערבב, ומניחים על קרח.
  12. יש להפעיל המוסטאזיס לחץ על אזור המפשעה של עצם הירך של החזיר.
  13. להחזיר את החזיר על פי המדיניות המוסדית. יש להשגיח באופן רציף על בעל החיים עד שהוא חוזר להכרה מספקת כדי לשמור על עצם החזה ולחזור לאזור הדיור/כלבייה הרגיל.

2. בידוד תאים חד-גרעיניים

  1. לדלל את הדם 1: 1 עם מלוחים חוצצים פוספט (PBS) בארבעה צינורות חרוטי 50 מ"ל.
    הערה: עבודה זו צריכה להתבצע במכסה מנוע של תרבית תאים תוך שימוש בטכניקה אספטית כדי למנוע זיהום של תרבית התא.
  2. הוסף 25 מ"ל של תמיסת שיפוע צפיפות מוכנה לשימוש בטמפרטורת החדר לשמונה צינורות חרוטיים של 50 מ"ל.
  3. לאט מאוד פיפטה 25 מ"ל של תמיסת דם/מלח לאורך החלק הפנימי של כל תמיסת שיפוע צפיפות המכילה צינור חרוטי 50 מ"ל על ידי החזקת הצינור בזווית חדה לקצה הפיפטה.
    הערה: תמיסת הדם צריכה להניח בעדינות שכבה על גבי תמיסת שיפוע הצפיפות ולשמור על ממשק מוגדר היטב.
  4. צנטריפוגה את הצינורות במשך 30 דקות ב 560 x גרם ובטמפרטורת החדר (RT).
    הערה: לקבלת התוצאות הטובות ביותר, השבת את בלם הצנטריפוגה במידת האפשר.
  5. השתמש פיפטה דקה כדי לאסוף בזהירות את מעיל באפי (שכבה עכורה של תאים מונוגרעיניים מעל תמיסת שיפוע צפיפות מתחת פלזמה ברורה) מכל צינור ולהפיץ באופן שווה לתוך שני צינורות חרוטי חדשים 50 מ"ל. יש להשליך את תמיסת שיפוע הצפיפות המכילה צינורות.
    הערה: אספו כמה שיותר מהפרווה הבאפית תוך איסוף כמה שפחות מתמיסת שיפוע הצפיפות והפלזמה.

3. שטיפה וציפוי של תאים

  1. מצפים צלחת 6 בארות עם פיברונקטין .
    1. הפוך פתרון מלאי של פיברונקטין פלזמה אנושי על ידי דילול אותו ל 1 מ"ג / מ"ל במים סטריליים. אחסן את aliquots ב -20 °C.
    2. הפוך 3.6 מ"ל של פתרון עבודה של פיברונקטין על ידי דילול 600 מיקרוליטר של תמיסת מלאי פיברונקטין ב 3 מ"ל של PBS.
    3. מעבירים 600 μL של תמיסת העבודה פיברונקטין לכל באר של צלחת 6 בארות ורוקדים בעדינות עד לציפוי אחיד.
    4. המתינו 30 דקות עד שהפיברונקטין יצפה את הבארות ושאפו בעדינות את התמיסה מכל באר.
  2. בזמן ההמתנה פיברונקטין לצפות, לשטוף את התאים mononuclear
    1. מלא את הצינורות עם עד 45 מ"ל של PBS
    2. צנטריפוגה למשך 5 דקות ב 560 x גרם ו 4 ° C עם בלימה נמוכה. שאפו את הסופרנאטנט משני הצינורות.
    3. השהה מחדש כל כדור תא ב 25 מ"ל של PBS.
    4. חזרו על הפעולה כדי לשטוף פעם נוספת.
  3. השהה מחדש כל כדור תא ב -5 מ"ל של PBS והוסף 15 מ"ל של תמיסת אמוניום כלוריד 0.8% לכל צינור.
    הערה: שלב זה הוא ליזה של תאי הדם האדומים הנותרים.
  4. דוגרים על קרח במשך 10 דקות.
  5. שטפו את התאים כמו קודם על ידי מילוי צינורות עם PBS וצנטריפוגה למשך 5 דקות ב 560 x גרם ו 4 ° C עם בלימה נמוכה. שאפו את הסופרנאטנט משני הצינורות.
  6. יש להשהות מחדש כל כדור תא ב-25 מ"ל של PBS ולחזור על השטיפה פעם נוספת.
  7. יש להשהות מחדש כל כדורית ב-6 מ"ל של מדיום תרבית EGM-2 בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי (FBS) ותמיסה אנטיביוטית/אנטי-מיקוטית אחת המכילה 10,000 U/mL פניצילין, סטרפטומיצין 10 מ"ג/מ"ל ו-25 מיקרוגרם/מ"ל אמפוטריצין.
    הערה: מדיום תרבית EGM-2 מורכב ממדיום תרבית EBM-2 בתוספת 200 μL של הידרוקורטיזון, 2 מ"ל של גורם גדילה פיברובלסטי אנושי (hFGF-B), 500 μL של גורם גדילה אנדותל כלי דם (VEGF), 500 μL של אנלוגי רקומביננטי של גורם גדילה דמוי אינסולין (R3 IGF-1), 500 μL של חומצה אסקורבית, 500 μL של גורם גדילה אפידרמיס אנושי (hEGF), 500 μL של gentamicin/amphotericin, ו 500 μL של הפרין לכל 500 מ"ל.
  8. מעבירים בעדינות 2 מ"ל מתרחיף התא לכל באר של צלחת 6 בארות מצופה פיברונקטין ומנערים בעדינות עד לציפוי אחיד.
    הערה: המטרה היא לזרוע כמה שיותר תאים כדי למקסם את מספר מושבות האנדותל שייווצרו.

4. תרבית תאים

  1. לדגור על התאים בטמפרטורה של 37°C, 5%CO2 ו-100% לחות.
  2. למחרת, להוסיף בעדינות 1 מ"ל של מדיום תרבית טרי לכל באר.
    הערה: חשוב להיות עדינים כדי לא להפריע לתאים הנצמדים באופן רופף לציפוי הפיברונקטין (fibronectin).
  3. למחרת, בצע שינוי מדיום חצי תרבית על ידי שאיפה עדינה של 1.5 מ"ל של מדיום תרבות מכל באר והחלפתו ב -1.5 מ"ל של מדיום תרבות טרי.
  4. בכל אחד מ-5 הימים הבאים, בצעו בעדינות שינוי מדיום תרבית מלא לכל באר (2 מ"ל מדיום תרבית טרי לכל באר).
  5. לאחר מכן, לשנות בעדינות את המדיום התרבות שלוש פעמים בשבוע.
  6. דמיינו באופן קבוע את תרביות התאים תחת מיקרוסקופ אור בהספק נמוך (4x אובייקטיבי).
    הערה: מושבות תאי אנדותל (BOEC) יתחילו להופיע בבארות 7-10 ימים לאחר הציפוי. סוגי תאים שאינם דבקים יושלכו עם שינויים בינוניים, וסוגי תאים דבקים אחרים יתפוגגו בהדרגה ככל שמושבות BOEC יגדלו.
  7. יש להעביר את ה-BOECs לבקבוק T-75 מצופה פיברונקטין כאשר ~70%-80% מתמזגים, ולהמשיך להחליף מדיום תרבית שלוש פעמים בשבוע.
    הערה: ניתן לשלוט בצפיפות הזריעה על ידי העברת מושבות לבקבוק T25 במקום. המעברים הבאים אינם דורשים ציפוי פיברונקטין וניתן לצמצם את שינויי המדיום בתרבית לפעמיים בשבוע.
  8. תאים ממעברים 1-3 עשויים לשמש לניסויים או להיות מועברים לתווך הקפאה ומאוחסנים בחנקן נוזלי לשימוש עתידי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

המורפולוגיה של התאים בתרבית נצפתה מתחילת התרבית ועד שנצפו מושבות BOEC (איור 1). אוכלוסייה קטנה יותר של תאים דבקים החלה להיצמד לצלחות התרבית ולגדול, בעוד שתאים לא נצמדים הוסרו עם שינויים בינוניים בתרבית (איור 1B). מושבות הופיעו לראשונה ביום 6 כאוסף של תאים דמויי אנדותל המתרבים רדיאלית החוצה מנקודה מרכזית (איור 1D). ככל שהתרבית התקדמה, מושבות התאים נעשו צפופות יותר והציגו מורפולוגיה מרוצפת הדומה לתאי אנדותל בוגרים (איור 1F). המורפולוגיה הטיפוסית של אבן האנדותל מספקת זיהוי ראשוני קל של BOECs באמצעות מיקרוסקופ אור.

מושבות תאי אנדותל מוכנות בדרך כלל למעבר לאחר 10-14 ימי תרבית. בשלב זה, צלחת 6 בארות בדרך כלל יניב ~ 1 מיליון תאים עם אחוז כדאיות של 93%-98%. במהלך המעבר הראשון, תאי אנדותל יתרחבו ויניבו ~6-10 מיליון תאים בצלוחית T75.

כדי להעריך את המורפוגנזה של BOECs, מטריצת קרום המרתף (למשל, Matrigel) הייתה מצופה על 15 לוחות אנגיוגנזה באר ב 10 μL / באר והודגרה ב 37 ° C במשך 30 דקות כדי לאפשר פילמור. תאי מעבר 2 נזרעו על לוחות ממברנים מצופים מטריצה במרתף וצולמו בנקודות זמן של 14 שעות ו-24 שעות. צפיפות של כ-3,500 תאים לבאר הצליחה ליצור רשת ומבנים דמויי צינור. היווצרות צינור הבחין בתוך 14 שעות עבור מדיום ללא סרום (EGM-2 עם תוספים למעט FBS) ובתוך 24 שעות עבור מדיום צמיחה מלא (EGM-2 עם תוספי כולל FBS). הוספת FBS עשויה לדלל את גורמי הגדילה הספציפיים לתאי אנדותל (למשל, VEGF) והציגה גורמי איתות אחרים וכתוצאה מכך עיכוב בתהליך היווצרות הצינור. נעשה שימוש במיקרוסקופ דו-ממדי עם ניגודיות פאזה כדי לדמות היווצרות צינוריות בתווך נטול סרום (איור 2A,B) ובמדיום צמיחה מלא (איור 2C,D). תאים בשני תנאי המדיה עברו התמיינות מורפולוגית והתארגנו במהירות ברשתות נרחבות של מבנים דמויי צינור נימי. מבנים אלה הורכבו מכבלי תאים מאורגנים הדומים לרשתות נימים in vivo. יתר על כן, מיקרוגרפים בהגדלה של פי 20 ממחישים בפירוט את הארגון הרב-תאי המורכב של תאי אנדותל ואת התמיינותם המורפולוגית. לא נצפו הבדלים מורפולוגיים בין תנאי התקשורת. הרשת הנרחבת של מבנים דמויי צינור נימי מצביעה בבירור על התמיינות של תאים בתרבית לתאי אנדותל בוגרים ומתפקדים.

BOECs אופיינו גם על-ידי ביטוי של סמן תאי אנדותל בוגר CD31 או מולקולת הידבקות תאי אנדותל טסיות דם-1 (PECAM1) (איור 3A,B). BOECs הראו ביטוי אחיד של CD31. יתר על כן, ניתוח ציטומטריית זרימה אישר את היעדרם של EPCs מכיוון שהתאים הוכתמו שליליים עבור סמן מונוציטים CD14 בהשוואה לקבוצת הביקורת החיובית של PBMCs (איור 3C,D).

Figure 1
איור 1: תמונות במיקרוסקופ אור פנוטייפ. תמונות מיקרוסקופ האור של BOECs בתרבית שנצפו בהגדלה של פי 10 ביום (A) יום 0, (B) יום 2, (C) יום 4, (D) יום 6, (E) יום 8 ו-(F) לאחר המעבר הראשון. פסי קנה מידה: 200 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: התמיינות מורפולוגית וארגון של מעבר 2 BOECs. התמיינות מורפולוגית וארגון של מעבר 2 BOECs למבנים דמויי צינור נימי הבחינו במטריצת קרום המרתף תוך 14 שעות עבור תווך ללא סרום ותוך 24 שעות עבור מדיום צמיחה מלא. (A) מדיום ללא סרום ב-4x, (B) מדיום ללא סרום ב-20x, (C) מדיום צמיחה מלא ב-4x, ו-(D) מדיום צמיחה מלא ב-20x. פסי קנה מידה: 200 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: אפיון BOECs עם CD31 ו-CD14. (A) מעבר 2-3 BOECs הוכתמו עבור PECAM1 באמצעות נוגדן אנטי-CD31-FITC שנראה בירוק ו-(B) תמונות מיקרוסקופ תואם עם ניגודיות פאזה. התאים הוכתמו בתרחיף, והמתלה צולם בשקופית מיקרוסקופ. פסי קנה מידה: 200 מיקרומטר. (C) ניתוח ציטומטריית זרימה של BOECs עם נוגדן CD14-AF700 בהשוואה ל- (D) בקרה חיובית תאי דם חד-גרעיניים היקפיים (PBMCs). צביעת CD14 חיובית מוצגת בתאים כחולים ולא מוכתמים המוצגים באדום. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

BOECs הם כלי רב עוצמה שניתן להשתמש בו בגישות מדעיות וטיפוליות שונות 7,8,16. BOECs שימשו לניתוח ביטוי גנים EC כדי להבהיר את גורמי המפתח האחראים להתפתחות מחלות כלי דם וסרטן 5,19,20,21. BOECs שימשו גם ביישומים טיפוליים כגון התחדשות כלי דם והעברת גנים22,23,24. BOECs מהונדסים גנטית ידועים ביכולתם הטיפולית בגידול אנטי-אנגיוגני25,26. יתר על כן, הפוטנציאל האנגיוגני של BOECs הופך אותם למועמדים מצוינים לטיפולים תאיים המכוונים לכלי דם וניאו-וסקולריזציה17,27. למרות שמספר מחקרים מתארים כיצד להשיג BOECs מדם היקפי אנושי 6,7,8,9, השונות של מקורות תאים אנושיים עקב שונות פתופיזיולוגית וגנטית בסיסית מצביעה על צורך קריטי להשיג BOECs ממקורות קסנוגניים בריאים 9,13,18.

הוצג פרוטוקול מפורט לגזירה יעילה של BOECs מתאי דם חד-גרעיניים היקפיים חזיריים. צעדים קריטיים כוללים עיבוד דגימות דם בהקדם האפשרי וקציר יעיל של שכבות מעיל באפי לאחר צנטריפוגה הדרגתית צפיפות כדי למקסם את מספר PBMCs קיימא להיכנס לתרבית. צפיפות הציפוי הראשונית ומעבר בזמן של תאים הם שיקולים חשובים להשגת בידוד עקבי של סוגי תאים אלה. נפח דם התחלתי של 100 מ"ל מספק מספר מתאים של PBMCs עבור צלחת אחת שש בארות. יש לציין כי נפח הדם המרבי שניתן לאסוף בבטחה מחזיר ישתנה עם משקל הגוף של בעלי החיים. איסוף בטוח וחד פעמי של נפח הדם המרבי לחזירים הוא 8 מ"ל לכל ק"ג משקל גוף. בנוסף, מעבר בזמן של מושבות ראשוניות ממעבר 0 למעבר 1 הוא גם חיוני. התאים מפסיקים להתרבות אם צפיפות הזריעה נמוכה מאוד או אם התאים מגיעים למפגש. כאשר התאים מתמזגים, הם מתחילים להפוך למורפולוגיה ופנוטיפ מזנכימליים מוארכים. צפיפות הזריעה יכולה להיות נשלטת גם על ידי העברת מושבות לתוך בקבוק T25 ולא צלוחיות T75. נדרשת זהירות כדי לא לאבד את סוגי התאים הדבקים במהלך שינוי המדיה הראשוני מכיוון שהכרחי מאוד ללכוד כמה שיותר תאים דבקים תוך השלכת EPC שאינם דבקים. פרוטוקול זה מייצר מושבות תאים שגדלו תוך כשבוע.

הפרוטוקול ניתן לשחזור ואמין ביותר. הרחבת מושבות תאי אנדותל מושגת בכ-90%-95% מהתרביות. כישלון נובע בדרך כלל מחוסר היווצרות של מושבות תאי אנדותל, כלומר אם נוצרת לפחות מושבת תאי אנדותל אחת, הם כמעט תמיד ימשיכו להתרחב בתרבית. מקורות הכשל כוללים השתנות אקראית, גזירה מוגזמת של תאים במהלך איסוף הדם, מיקרובים מזהמים בתרבית, ואובדן גבוה של תאים חד-גרעיניים במהלך שלבי העיבוד. לאחר תרבות לא מוצלחת, תרבות שנייה בדרך כלל תצליח, מה שמצביע על כך שהשונות בין בעלי החיים אינה גורם מרכזי. הפרוטוקול מוצלח אפילו בעת איסוף דם מיד לאחר המתת חסד, מה שמצביע על כך ששלבי הכביסה מפחיתים ביעילות את סוכני המתת החסד לרמות בלתי מזיקות.

ללא קשר להטרוגניות באוכלוסיית תאי הדם במחזור, התקבלו BOECs שונים מאוד מ- EPCs. BOECs נגזרים מתת-קבוצה קטנה של PBMCs דבקים חסרי ביטוי CD14. זה אושר על-ידי היעדר צביעת CD14 (איור 3C,D). הסילוק של EPCs מונוציטיים מתרביות BOEC במעברים מוקדמים עשוי להיות מוסבר על ידי מוות תאי או אי היצמדות. המורפולוגיה המרוצפת של BOECs (איור 1E,F) מצביעה על פנוטיפ אנדותל בולט. נוסף על כך, הביטוי האחיד של סמן פני השטח CD31 (איור 3A) מרמז על אוכלוסייה הומוגנית של תאי אנדותל בוגרים. יתר על כן, המורפוגנזה הנימית של BOECs גם ללא נסיוב (איור 2A,B) וגם במצע גדילה מלא (איור 2C,D) מראה את היכולת האנגיוגנית הטבועה בהם 6,8. ניתוח קודם של BOECs חזיריים שנוצרו באמצעות פרוטוקול זה הראה תאים אלה חיוביים בנוסף עבור ביטוי גורם פון וילברנד וקשירת לקטין28.

השפע של PBMCs במחזור הדם, שממנו BOECs לצמוח, תומך בהיתכנות של שיטה חזקה כדי להשיג אספקה כמעט בלתי מוגבלת של BOECs טיפוליים ממקורות מן החי. לאחר השליטה בטכניקה, BOECs יכולים לשמש למספר יישומים, כולל תיקון והתחדשות כלי דם, מידול מחלות, בדיקות סקר לתרופות ומחקרים בביולוגיה של תאי אנדותל. יש צורך במחקרים מתמשכים כדי לאשר את ההומוגניות של BOECs חזיריים ואת התאמתם כמקור טיפולי בבני אדם.

מגבלה אחת של פרוטוקול זה היא הסיכון להרחבת מושבות תאי אנדותל שאינן מצליחות ליצור. שיעור הכישלון מוערך בכ-5%-10%, ובמקרים אלה יש צורך בניסיון נוסף. כאשר הבטחת ההצלחה חשובה, ניתן לאסוף כמות כפולה של דם, וניתן לעקוב אחר הפרוטוקול במקביל כדי להניב שתי תרביות עצמאיות. יתר על כן, הניסיון שלנו מוגבל לחזירי בית בריאים מסוג יורקשייר/לנדרייס/דורוק (Sus domesticus), זכר ונקבה, 40-80 ק"ג, בני 3-6 חודשים. שיעורי ההצלחה עם גזעים אחרים, גילאים ותנאי ניסוי אחרים אינם ידועים.

מגבלה נוספת של הפרוטוקול היא שסמן סופי לפנוטיפ BOEC אינו קיים. כאן ובעבודה קודמת28, BOECs חזיריים שנוצרו מפרוטוקול זה אופיינו עבור מספר סמני BOEC, אך ההבנה של פנוטיפ BOEC ממשיכה להתפתח. BOECs מאופיינים גם במעברים 2-3 ופנוטיפ במעברים גבוהים יותר אינו ידוע. יתרון של BOECs חזיריים בהשוואה לבני אדם הוא אספקה מוכנה של דם חזיר, המאפשר יצירת תרביות תכופות יותר ואספקה איתנה של תאים עקביים במעבר נמוך.

אחת המגבלות העיקריות של שימוש בתאים חזיריים בגישות טיפוליות היא התגובה החיסונית של המאכסן29. מספר אסטרטגיות אימונומודולציה נחקרות כדי למתן את האימונוגניות של תאים קסנוגניים להשתלה אנושית, כגון חומרים אנטי דלקתיים ומניפולציה גנטית CRISPR/Cas30,31,32. מחקרים עדכניים יותר הציעו ביטוי של חלבוני בקרה משלימים אנושיים (hCRPs)33 והכנסת α1,3- גלקטוסילטרנספראז נמחק (GTKO)32,34 חזירים. התקדמות זו טומנת בחובה הבטחה ליישום טיפולי של תאים קסנוגניים, כולל BOECs חזיריים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

המחברים מבקשים להכיר במימון מ-NIH/NHLBI R00 HL129068.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
19 G needle Covidien 1188818112
50 mL conical tubes Corning 352098
6 well plate BD Falcon 353046
60 mL syringes Covidien 8881560125
Ammonium chloride solution (0.8%) Stemcell Technologies 07850
Antibiotic/antimycotic solution (100x) Gibco 15240-062
Centrifuge Thermo Scientific 75-253-839
EGM-2 culture medium Lonza Walkersville CC-3162
Extension tube Hanna Pharmaceutical Supply Co. 03382C6227
Fetal bovine serum (FBS) Atlas Biologicals F-0500-A
Ficoll-Paque 1077 Cytiva 17144003 Density gradient solution
Heparin sodium injection (1,000 units/mL) Pfizer 00069-0058-01
Human plasma fibronectin Gibco 33016-015
Ice N/A N/A
Phosphate-buffered saline (PBS) Gibco 10010-023
Pipette set Eppendorf 2231300004
Sterile water Gibco 15230-162
Thin pipette Celltreat Scientific 229280

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Aird, W. C. Phenotypic heterogeneity of the endothelium: II. Representative vascular beds. Circulation Research. 100 (2), 174-190 (2007).
  2. Aird, W. C. Phenotypic heterogeneity of the endothelium: I. Structure, function, and mechanisms. Circulation Research. 100 (2), 158-173 (2007).
  3. Pober, J. S., Tellides, G. Participation of blood vessel cells in human adaptive immune responses. Trends in Immunology. 33 (1), 49-57 (2012).
  4. Navarro, S., et al. The endothelial cell protein C receptor: its role in thrombosis. Thrombosis Research. 128 (5), 410-416 (2011).
  5. Hasstedt, S. J., et al. Cell adhesion molecule 1: a novel risk factor for venous thrombosis. Blood. 114 (14), 3084-3091 (2009).
  6. Ormiston, M. L., et al. Generation and culture of blood outgrowth endothelial cells from human peripheral blood. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (106), e53384 (2015).
  7. Lin, Y., Weisdorf, D. J., Solovey, A., Hebbel, R. P. Origins of circulating endothelial cells and endothelial outgrowth from blood. Journal of Clinical Investigation. 105 (1), 71-77 (2000).
  8. Martin-Ramirez, J., Hofman, M., Biggelaar, M. V. D., Hebbel, R. P., Voorberg, J. Establishment of outgrowth endothelial cells from peripheral blood. Nature Protocols. 7 (9), 1709-1715 (2012).
  9. Gulati, R., et al. Diverse origin and function of cells with endothelial phenotype obtained from adult human blood. Circulation Research. 93 (11), 1023-1025 (2003).
  10. Hebbel, R. P. Blood endothelial cells: utility from ambiguity. The Journal of Clinical Investigation. 127 (5), 1613-1615 (2017).
  11. Medina, R. J., et al. Endothelial progenitors: A consensus statement on nomenclature. Stem Cells Translational Medicine. 6 (5), 1316-1320 (2018).
  12. Medina, R. J., et al. Molecular analysis of endothelial progenitor cell (EPC) subtypes reveals two distinct cell populations with different identities. BMC Medical Genomics. 3, 18 (2010).
  13. Jiang, A., Pan, W., Milbauer, L. C., Shyr, Y., Hebbel, R. P. A practical question based on cross-platform microarray data normalization: are BOEC more like large vessel or microvascular endothelial cells or neither of them. Journal of Bioinformatics and Computational Biology. 5 (4), 875-893 (2007).
  14. Pan, W., Shen, X., Jiang, A., Hebbel, R. P. Semi-supervised learning via penalized mixture model with application to microarray sample classification. Bioinformatics. 22 (19), 2388-2395 (2006).
  15. Hirschi, K. K., Ingram, D. A., Yoder, M. C. Assessing identity, phenotype, and fate of endothelial progenitor cells. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 28 (9), 1584-1595 (2008).
  16. Fernandez, L. A., et al. Blood outgrowth endothelial cells from hereditary haemorrhagic telangiectasia patients reveal abnormalities compatible with vascular lesions. Cardiovascular Research. 68 (2), 235-248 (2005).
  17. Critser, P. J., Yoder, M. C. Endothelial colony-forming cell role in neoangiogenesis and tissue repair. Current Opinion in Organ Transplantation. 15 (1), 68-72 (2010).
  18. Zhao, Y., et al. Isolation and culture of primary aortic endothelial cells from miniature pigs. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e59673 (2019).
  19. Chang Milbauer, L., et al. Genetic endothelial systems biology of sickle stroke risk. Blood. 111 (7), 3872-3879 (2008).
  20. Wei, P., et al. Differential endothelial cell gene expression by African Americans versusCaucasian Americans: a possible contribution to health disparity in vascular disease and cancer. BMC Medicine. 9 (1), 2 (2011).
  21. Hasstedt, S. J., et al. Cell adhesion molecule 1: a novel risk factor for venous thrombosis. Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 114 (14), 3084-3091 (2009).
  22. Milbauer, L. C., et al. Blood outgrowth endothelial cell migration and trapping in vivo: a window into gene therapy. Translational Research. 153 (4), 179-189 (2009).
  23. Matsui, H., et al. Ex vivo gene therapy for hemophilia A that enhances safe delivery and sustained in vivo factor VIII expression from lentivirally engineered endothelial progenitors. Stem Cells. 25 (10), 2660-2669 (2007).
  24. De Meyer, S. F., et al. Phenotypic correction of von Willebrand disease type 3 blood-derived endothelial cells with lentiviral vectors expressing von Willebrand factor. Blood. 107 (12), 4728-4736 (2006).
  25. Bodempudi, V., et al. Blood outgrowth endothelial cell-based systemic delivery of antiangiogenic gene therapy for solid tumors. Cancer Gene Therapy. 17 (12), 855-863 (2010).
  26. Dudek, A. Z., et al. Systemic inhibition of tumour angiogenesis by endothelial cell-based gene therapy. British Journal of Cancer. 97 (4), 513-522 (2007).
  27. Moubarik, C., et al. Transplanted late outgrowth endothelial progenitor cells as cell therapy product for stroke. Stem Cell Reviews and Reports. 7 (1), 208-220 (2011).
  28. Pislaru Sorin, V., et al. Magnetic forces enable rapid endothelialization of synthetic vascular grafts. Circulation. 114 (1), 314 (2006).
  29. Satyananda, V., et al. New concepts of immune modulation in xenotransplantation. Transplantation. 96 (11), 937-945 (2013).
  30. Klymiuk, N., Aigner, B., Brem, G., Wolf, E. Genetic modification of pigs as organ donors for xenotransplantation. Molecular Reproduction and Development. 77 (3), 209-221 (2010).
  31. Ryczek, N., Hryhorowicz, M., Zeyland, J., Lipiński, D., Słomski, R. CRISPR/Cas technology in pig-to-human xenotransplantation research. International Journal of Molecular Sciences. 22 (6), 3196 (2021).
  32. Cooper, D. K., Koren, E., Oriol, R. Genetically engineered pigs. Lancet. 342 (8872), 682-683 (1993).
  33. Cozzi, E., White, D. J. G. The generation of transgenic pigs as potential organ donors for humans. Nature Medicine. 1 (9), 964-966 (1995).
  34. Phelps, C. J., et al. Production of alpha 1,3-galactosyltransferase-deficient pigs. Science. 299 (5605), New York, N.Y. 411-414 (2003).

Tags

החודש ב- JoVE גיליון 179 צמיחת דם תאי אנדותל דם חזירי דם היקפי תאים יוצרי מושבות אנדותל תאי אנדותל בוגרים השתלת קסנו מורפולוגיה מרוצפת מורפוגנזה תאי אב אנדותל
אפיון צמיחת דם תאי אנדותל (BOEC) מדם היקפי חזירי
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shradhanjali, A., Uthamaraj, S.,… More

Shradhanjali, A., Uthamaraj, S., Dragomir-Daescu, D., Gulati, R., Sandhu, G. S., Tefft, B. J. Characterization of Blood Outgrowth Endothelial Cells (BOEC) from Porcine Peripheral Blood. J. Vis. Exp. (179), e63285, doi:10.3791/63285 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter