Abstract
Endotelet er en dynamisk integrert struktur som spiller en viktig rolle i mange fysiologiske funksjoner som angiogenese, hemostase, betennelse og homeostase. Endotelet spiller også en viktig rolle i patofysiologier som aterosklerose, hypertensjon og diabetes. Endotelceller danner den indre foringen av blod og lymfekar og viser heterogenitet i struktur og funksjon. Ulike grupper har evaluert funksjonaliteten til endotelceller avledet fra humant perifert blod med fokus på endoteliale stamceller avledet fra hematopoietiske stamceller eller modne endotelceller fra blodutvekst (eller endotelkolonidannende celler). Disse cellene gir en autolog ressurs for terapeutikk og sykdomsmodellering. Xenogene celler kan gi en alternativ kilde til terapi på grunn av deres tilgjengelighet og homogenitet oppnådd ved bruk av genetisk lignende dyr oppdratt under lignende forhold. Derfor har en robust protokoll for isolering og utvidelse av svært proliferative endotelceller fra svinekjøtt perifert blod blitt presentert. Disse cellene kan brukes til mange applikasjoner som kardiovaskulær vevsteknikk, celleterapi, sykdomsmodellering, legemiddelscreening, studier av endotelcellebiologi og in vitro-kokulturer for å undersøke inflammatoriske og koagulasjonsresponser ved xenotransplantasjon.
Introduction
Endotelet er en svært kompleks, dynamisk struktur og en viktig komponent i vaskulærveggen. Den linjer den indre overflaten av blodkar for å gi et fysisk grensesnitt mellom sirkulerende blod og omkringliggende vev. Denne heterogene strukturen er kjent for å utføre forskjellige funksjoner som angiogenese, betennelse, vasoregulering og hemostase 1,2,3,4. Humane endotelceller i navlestrengen er en mye studert celletype for å vurdere funksjonaliteten til endotelceller. Imidlertid antyder den pasientspesifikke batchvariabiliteten, inkonsekvent fenotype og minimal splittingseffektivitet et behov for å bestemme en cellekilde som kan forbedre alle disse funksjonene5.
Å oppnå en homogen populasjon av primære endotelceller kan være teknisk utfordrende, og primære endotelceller har ikke høy proliferativ kapasitet6. Derfor, for å studere vaskulær regenerering og evaluere patofysiologiske prosesser, har ulike grupper forsøkt å skaffe og vurdere forskjellige typer endotelceller avledet fra perifert blod, for eksempel endoteliale stamceller (EPC) eller endotelceller fra blodutvekst (BOECs)6,7,8,9 . De spindelformede tidlige EPC-ene stammer fra hematopoietiske stamceller (HSC) og har begrenset vekststyrke og begrenset angiogen evne til å produsere modne endotelceller. Videre ligner de på inflammatoriske monocytter. I tillegg er deres evne til ytterligere å differensiere til funksjonelle, prolifererende, modne endotelceller fortsatt diskutabel 6,7,9,10. Den kontinuerlige kulturen av mononukleære celler i perifert blod (PBMC) kan gi opphav til en sekundær populasjon av celler kjent som EPC med sen utvekst, BOEC eller endotelkolonidannende celler (ECFC)6,7,9,10. Medina et al. i 2018, anerkjente begrensningene til EPC, tvetydigheten i deres nomenklatur, sammen med en generell mangel på samsvar med mange forskjellige celletyper kontinuerlig gruppert under EPC11. I motsetning til dette har BOECs blitt anerkjent for sin rolle i vaskulær reparasjon, helse og sykdom og celleterapi. Videre studier og terapeutisk bruk av disse cellene vil stole på protokoller for konsekvent å utlede disse celletyper fra sirkulerende stamceller.
Primære celler som BOEC kan brukes som surrogat for å oppnå svært proliferative modne endotelceller6. BOEC er fenotypisk forskjellig fra tidlige EPC-er og viser typiske endoteltrekk som brosteinsmorfologi og uttrykk for adherenskryss og caveolae12. Genprofilering av Hebbel et al.13,14,15 fant at BOEC eller ECFC er de sanne endotelceller da de fremmer mikrovaskulær og dannelse av store fartøy. Dermed kan BOEC brukes som et verktøy for å evaluere patofysiologiske prosesser og genetisk variasjon16. De regnes også som en utmerket cellekilde for celleterapi for vaskulær regenerering17. Derfor er en standardisert protokoll for konsekvent å utlede disse svært proliferative cellene avgjørende.
Mens BOECs gir et kraftig verktøy for å studere menneskelig patofysiologisk og genetisk variasjon, kan en mer homogen kilde til BOECs gi mer robuste og pålitelige eksperimentelle og terapeutiske resultater. Overlegen homogenitet kan oppnås ved å bruke xenogene cellekilder avledet fra genetisk like dyr oppdratt under lignende forhold18. Mens xenogene cellekilder er tilbøyelige til å fremkalle en vertsimmunrespons, utvikles immunmoduleringsstrategier med sikte på å generere immunkompatible dyr og animalske produkter, inkludert celler. Spesielt griser er en rikelig kilde til perifert blod og brukes ofte til å studere medisinsk utstyr og andre terapier på grunn av anatomiske og fysiologiske likheter med mennesker. Derfor foredler denne studien protokollen for isolering og utvidelse av svært proliferative BOEC fra perifert blod fra svin. Protokollen beskrevet nedenfor er en enkel og pålitelig metode for å oppnå et stort antall BOEC fra et relativt lite volum blod. Kulturene kan utvides gjennom flere passasjer for å generere millioner av celler fra en enkelt blodprøve.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøk ble godkjent av de respektive Institutional Animal Care and Use Committees (IACUC) ved Medical College of Wisconsin og Mayo Clinic.
MERK: I denne studien ble Yorkshire/Landrace/Duroc kryssgriser (Sus domesticus), hann og hunn, 40-80 kg, 3-6 måneder gamle, brukt.
1. Innsamling av perifert blod fra svin
- Forbered materialer.
- Fortynn heparinoppløsning til 100 E/ml i steril saltvann.
- Tilsett 3-4 ml heparinoppløsning til hver av to 50 ml koniske rør og to 60 ml sprøyter.
- Trekk ufortynnet heparinoppløsning (1000 E/ml) inn i et forlengelsesrør.
- Koble en 19 G kanyle til den ene enden av det heparinfylte forlengelsesrøret og en heparinholdig 60 ml sprøyte til den andre enden.
- Bedøv en gris i henhold til institusjonelle retningslinjer
- Administrer en IM-injeksjon av atropin (0,05 mg / kg), tiletamin / zolazepam (2-5 mg / kg) og xylazin (2 mg / kg) for å indusere anestesi.
MERK: tilstrekkelig anestesi oppnås når dyret er bevisstløs og mandibulære muskler er ikke-stive. - Legg dyret i liggende stilling og legg sammenrullede håndklær på begge sider for å gi stabilitet.
- Påfør en oftalmisk salve på øynene for å forhindre tørrhet under anestesi.
- Gi termisk støtte under anestesi, inkludert tepper, varmeputer og / eller oppvarmet prosedyrebord.
- Administrer en IM-injeksjon av atropin (0,05 mg / kg), tiletamin / zolazepam (2-5 mg / kg) og xylazin (2 mg / kg) for å indusere anestesi.
- Rengjør lårbenets lyskeområde med betadinskrubbeoppløsning.
- Punkter vena femoralis eller arterie med 19 G nålen og trekk sakte opp (~1-2 ml/s) 50 ml blod i sprøyten.
MERK: Hvis du tegner for fort, kan det skade cellene. - La kanylen være på plass, knekk umiddelbart forlengelsesslangen og koble fra sprøyten på 60 ml
- Overfør blodet sakte til et heparinholdig 50 ml konisk rør.
- Sett lokket på det 50 ml kjegleformede røret, snu forsiktig opp ned noen ganger for å blande, og legg det på is.
- Koble den gjenværende heparinholdige 60 ml sprøyten til forlengelsesrøret, løsne forlengelsesrøret og trekk sakte ytterligere 50 ml blod inn i sprøyten.
- Fjern umiddelbart nålen fra arterien eller venen og trekk sakte det gjenværende blodet fra forlengelsesrøret inn i sprøyten.
- Koble sprøyten på 60 ml fra forlengelsesrøret og overfør blodet langsomt til den gjenværende heparinholdige 50 ml koniske sonen.
- Sett lokket på det 50 ml kjegleformede røret, snu forsiktig opp ned noen ganger for å blande, og legg det på is.
- Påfør trykkhemostase på grisens lårbenske lyskeområde.
- Gjenopprett grisen i henhold til institusjonelle retningslinjer. Overvåk dyret kontinuerlig til det gjenvinner tilstrekkelig bevissthet til å opprettholde sternal hvile og gå tilbake til det vanlige huset / kennelområdet.
2. Isolering av mononukleære celler
- Fortynn blodet 1: 1 med fosfatbufret saltvann (PBS) i fire 50 ml koniske rør.
MERK: Dette arbeidet må utføres i en cellekulturhette ved hjelp av en aseptisk teknikk for å unngå forurensning av cellekulturen. - Tilsett 25 ml romtemperatur klar til bruk tetthetsgradientløsning til åtte 50 ml koniske rør.
- Pipetter svært langsomt 25 ml blod/saltoppløsning langs innsiden av hver tetthetsgradientoppløsning inneholdende 50 ml konisk rør ved å holde røret i skarp vinkel mot pipettespissen.
MERK: Blodoppløsningen skal forsiktig legges oppå tetthetsgradientløsningen og opprettholde et veldefinert grensesnitt. - Sentrifuger rørene i 30 minutter ved 560 x g og romtemperatur (RT).
MERK: For best resultat, deaktiver sentrifugebremsen hvis mulig. - Bruk en tynn pipette til forsiktig å samle det myke laget (uklart lag av mononukleære celler over tetthetsgradientløsningen og under det klare plasmaet) fra hvert rør og fordel jevnt over i to nye 50 ml koniske rør. Kast tetthetsgradientoppløsningen som inneholder rør.
MERK: Samle så mye av den myke pelsen som mulig mens du samler så lite av tetthetsgradientløsningen og plasmaet som mulig.
3. Vasking og plating av celler
- Belegg en 6-brønns plate med fibronektin.
- Lag en stamløsning av humant plasmafibronektin ved å fortynne det til 1 mg / ml i sterilt vann. Oppbevar alikotene ved -20 °C.
- Lag 3,6 ml av en arbeidsløsning av fibronektin ved å fortynne 600 μL fibronektinoppløsning i 3 ml PBS.
- Overfør 600 μL av fibronektinarbeidsløsningen til hver brønn på en 6-brønnsplate og gyng forsiktig til den er jevnt belagt.
- Vent 30 minutter for fibronektin å belegge brønnene og forsiktig aspirere løsningen ut av hver brønn.
- Mens du venter på at fibronektin skal belegge, vask de mononukleære cellene
- Fyll på rørene med opptil 45 ml PBS
- Sentrifuge i 5 min ved 560 x g og 4 °C med lav brems. Aspirer supernatanten fra begge rørene.
- Resuspender hver cellepellet i 25 ml PBS.
- Gjenta for å vaske en gang til.
- Resuspender hver cellepellet i 5 ml PBS og tilsett 15 ml 0,8% ammoniumkloridoppløsning til hvert rør.
MERK: Dette trinnet er å lyse de resterende røde blodcellene. - Inkuber på is i 10 min.
- Vask cellene som før ved å fylle på rør med PBS og sentrifuge i 5 min ved 560 x g og 4 °C med lav brems. Aspirer supernatanten fra begge rørene.
- Hør hver cellepellet på nytt i 25 ml PBS og gjenta for å vaske en gang til.
- Resuspender hver cellepellet i 6 ml EGM-2 kulturmedium supplert med 10% føtal bovint serum (FBS) og 1x antibiotika / antimykotisk oppløsning inneholdende 10.000 U / ml penicillin, 10 mg / ml streptomycin og 25 μg / ml amfotericin.
MERK: EGM-2 kulturmedium består av EBM-2 kulturmedium supplert med 200 μL hydrokortison, 2 ml human fibroblastvekstfaktor (hFGF-B), 500 μL vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF), 500 μL rekombinant analog av insulinlignende vekstfaktor (R3 IGF-1), 500 μL askorbinsyre, 500 μL human epidermal vekstfaktor (hEGF), 500 mikrol gentamicin/amfotericin og 500 mikrol heparin per 500 ml. - Overfør forsiktig 2 ml av cellesuspensjonen til hver brønn i den fibronektinbelagte 6-brønnsplaten og gyng forsiktig til den er jevnt belagt.
MERK: Målet er å frø så mange celler som mulig for å maksimere antall endotelkolonier som vil dannes.
4. Cellekultur
- Inkuber cellene ved 37 °C, 5% CO2 og 100% fuktighet.
- Neste dag tilsettes forsiktig 1 ml friskt kulturmedium til hver brønn.
MERK: Det er viktig å være forsiktig så du ikke forstyrrer celler som er løst festet til fibronektinbelegget. - Neste dag, utfør en halv kultur medium endring ved forsiktig aspirere 1,5 ml kultur medium fra hver brønn og erstatte den med 1,5 ml frisk kultur medium.
- På hver av de neste 5 dagene, utfør forsiktig en full kultur medium endring til hver brønn (2 ml frisk kultur medium per brønn).
- Deretter endrer du forsiktig kulturmediet tre ganger i uken.
- Visualiser regelmessig cellekulturer under lav effekt (4x objektiv) lysmikroskopi.
MERK: Adherent blood outgrowth endotelcelle (BOEC) kolonier vil begynne å vises i brønnene 7-10 dager etter plating. Ikke-adherente celletyper vil bli kassert med middels endringer, og andre adherente celletyper vil gradvis forsvinne etter hvert som BOEC-koloniene vokser. - Passasje BOECs inn i en fibronektinbelagt T-75 kolbe når ~ 70% -80% sammenflytende og fortsette å endre kultur medium tre ganger per uke.
MERK: Såtetthet kan kontrolleres ved å passere kolonier i en T25-kolbe i stedet. Etterfølgende passasjer krever ikke fibronektinbelegg, og kulturmediumendringer kan reduseres til to ganger per uke. - Celler fra passasjer 1-3 kan brukes til eksperimenter eller overføres til et frysemedium og lagres i flytende nitrogen for fremtidig bruk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Morfologi av dyrkede celler ble observert fra starten av kulturen til BOEC-kolonier ble observert (figur 1). En mindre populasjon av adherente celler begynte å feste seg til kulturskålene og vokse, mens ikke-adherente celler ble fjernet med kulturmediumendringer (figur 1B). Kolonier dukket først opp på dag 6 som en samling endotellignende celler som prolifererte radialt utover fra et sentralt punkt (figur 1D). Etter hvert som kulturen utviklet seg, ble cellekoloniene tettere og viste en brosteinsmorfologi som ligner modne endotelceller (figur 1F). Den typiske endotelformede brosteinsmorfologien gir en enkel foreløpig identifisering av BOEC ved hjelp av et lysmikroskop.
Endotelcellekolonier er vanligvis klare for passering på 10-14 dager med kultur. På dette tidspunktet vil 6-brønnplaten typisk gi ~ 1 million celler med prosent levedyktighet på 93% -98%. I løpet av den første passasjen vil endotelceller ekspandere for å gi ~ 6-10 millioner celler i en T75-kolbe.
For å vurdere morfogenesen til BOEC ble membranmatrisen i kjelleren (f.eks. Matrigel) belagt på 15 brønnangiogeneseplater ved 10 μL/brønn og inkubert ved 37 °C i 30 minutter for å tillate polymerisering. Passasje 2-celler ble sådd på kjellermembranmatrisebelagte plater og avbildet ved 14 timer og 24 timer. En tetthet på ca. 3 500 celler per brønn var i stand til å danne et nettverk og rørlignende strukturer. Rørdannelse ble lagt merke til innen 14 timer for serumfritt medium (EGM-2 med tilskudd unntatt FBS) og innen 24 timer for komplett vekstmedium (EGM-2 med kosttilskudd inkludert FBS). Tilsetning av FBS kan ha fortynnet endotelcellespesifikke vekstfaktorer (f.eks. VEGF) og introdusert andre signalfaktorer som resulterer i forsinkelsen av rørdannelsesprosessen. 2D-fasekontrastmikroskopi ble brukt til å avbilde rørdannelse i serumfritt medium (figur 2A,B) og komplett vekstmedium (figur 2C,D). Celler i begge medieforhold gjennomgikk morfologisk differensiering og organiserte seg raskt i omfattende nettverk av kapillærrørlignende strukturer. Disse strukturene var sammensatt av organiserte cellulære ledninger som ligner in vivo kapillære nettverk. Videre illustrerer mikrografer ved 20x forstørrelse den komplekse multicellulære organisasjonen av endotelceller og deres morfologiske differensiering i detalj. Det ble ikke observert morfologiske forskjeller mellom mediebetingelsene. Det omfattende nettverket av kapillærrørlignende strukturer antyder sterkt differensiering av dyrkede celler i modne og funksjonelle endotelceller.
BOEC ble videre karakterisert ved ekspresjon av moden endotelcellemarkør CD31 eller blodplateendotelcelleadhesjonsmolekyl-1 (PECAM1) (figur 3A,B). BOEC viste ensartet uttrykk for CD31. Videre bekreftet flowcytometrianalyse fravær av EPC da cellene farget negativt for monocyttmarkør CD14 sammenlignet med den positive kontrollgruppen av PBMC (figur 3C,D).
Figur 1: Fenotype lysmikroskopibilder. Lysmikroskopibildene av dyrkede BOECer observert ved 10x forstørrelse på (A) dag 0, (B) dag 2, (C) dag 4, (D) dag 6, (E) dag 8 og (F) etter første passasje. Skala barer: 200 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Morfologisk differensiering og organisering av passasje 2 BOECs. Morfologisk differensiering og organisering av passasje 2 BOEC i kapillærrørlignende strukturer ble lagt merke til i kjellermembranmatrisen innen 14 timer for serumfritt medium og innen 24 timer for komplett vekstmedium. (A) Serumfritt medium ved 4x, (B) Serumfritt medium ved 20x, (C) Komplett vekstmedium ved 4x, og (D) Komplett vekstmedium ved 20x. Skala barer: 200 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Karakterisering av BOEC med CD31 og CD14. (A) Passasje 2-3 BOEC ble farget for PECAM1 ved bruk av anti-CD31-FITC antistoff sett i grønt og (B) tilsvarende fasekontrastmikroskopibilder. Cellene ble farget i suspensjon, og suspensjonen ble avbildet på et mikroskoplysbilde. Skalastenger: 200 μm. (C) Flowcytometrianalyse av BOEC med CD14-AF700 antistoff sammenlignet med (D) positive kontroll perifere mononukleære blodceller (PBMC). Positiv CD14-farging vist i blå og ufargede celler vist i rødt. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
BOEC er et kraftig verktøy som kan brukes i ulike vitenskapelige og terapeutiske tilnærminger 7,8,16. BOEC har blitt brukt til å analysere EC-genuttrykk for å belyse nøkkelfaktorene som er ansvarlige for utviklingen av vaskulære sykdommer og kreft 5,19,20,21. BOEC har også blitt brukt i terapeutiske applikasjoner som vaskulær regenerering og genlevering22,23,24. Genmodifiserte BOEC har vært kjent for sin antiangiogene tumorterapeutiske evne25,26. Videre gjør det angiogene potensialet til BOECs dem gode kandidater for cellulære terapier med sikte på vaskularisering og neovaskularisering17,27. Selv om flere studier beskriver hvordan man oppnår BOEC fra humant perifert blod 6,7,8,9, antyder variasjonen av humane cellekilder på grunn av underliggende patofysiologisk og genetisk variasjon et kritisk behov for å skaffe BOEC fra sunne xenogene kilder 9,13,18.
En detaljert protokoll for effektivt å utlede BOEC fra mononukleære celler fra perifert blod fra svin har blitt presentert. Kritiske trinn inkluderer behandling av blodprøver så snart som mulig og effektiv høsting av buffy pelslag etter sentrifugering av tetthetsgradient for å maksimere antall levedyktige PBMCer som går inn i kulturen. Den initielle pletteringstettheten og rettidig passering av celler er viktige hensyn for å oppnå konsistent isolering av disse celletypene. Et startblodvolum på 100 ml gir et passende antall PBMC for en enkelt seksbrønnsplate. Det skal bemerkes at det maksimale volumet av blod som trygt kan samles fra en gris, vil variere med dyrs kroppsvekt. En foreslått sikker engangs maksimal blodvolumsamling for griser er 8 ml per kg kroppsvekt. I tillegg er rettidig passering av innledende kolonier fra passasje 0 til passasje 1 også avgjørende. Cellene slutter å spre seg hvis såtettheten er svært lav eller hvis cellene når samløp. Når cellene blir sammenflytende, begynner de å transformere seg til en langstrakt mesenkymal morfologi og fenotype. Såtetthet kan også kontrolleres ved å passere kolonier inn i en T25-kolbe i stedet for en T75-kolbe. Nøye vurdering er nødvendig for ikke å miste de adherente celletypene under første medieendring, da det er svært viktig å fange så mange adherente celler som mulig mens du kasserer de ikke-adherente EPC-ene. Denne protokollen produserer utvekstcellekolonier på ca. 1 uke.
Protokollen er svært reproduserbar og pålitelig. Ekspanderende endotelcellekolonier oppnås i anslagsvis 90% -95% av kulturer. Svikt skyldes vanligvis mangel på dannelse av endotelcellekolonier, noe som betyr at hvis minst en endotelcellekoloni dannes, vil de nesten alltid fortsette å ekspandere i kultur. Kilder til svikt inkluderer tilfeldig variabilitet, overdreven skjæring av celler under blodinnsamling, forurensning av mikrober i kulturen og høyt tap av mononukleære celler under behandlingstrinnene. Etter en mislykket kultur vil en annen kultur vanligvis være vellykket, noe som indikerer at variasjon mellom dyr ikke er en viktig faktor. Protokollen er til og med vellykket når man samler blod umiddelbart etter eutanasi, noe som indikerer at vasketrinnene effektivt reduserer eutanasimidlene til uskadelige nivåer.
Uavhengig av heterogeniteten i den sirkulerende blodcellepopulasjonen, ble BOEC som er svært forskjellige fra EPC oppnådd. BOEC er avledet fra en liten delmengde av adherente PBMCer som mangler CD14-uttrykk. Dette ble bekreftet ved fravær av CD14-farging (figur 3C,D). Clearance av monocyttiske EPC fra BOEC-kulturer i tidlige passasjer kan forklares enten ved celledød eller ikke-adherens. Brosteinsmorfologien til BOECs (figur 1E,F) antyder en uttalt endotelial fenotype. I tillegg innebærer det ensartede uttrykket av overflatemarkør CD31 (figur 3A) en homogen populasjon av modne endotelceller. Videre viser kapillær morfogenese av BOEC både i serumfritt (figur 2A,B) og komplette vekstmedier (figur 2C,D) deres iboende angiogene evne 6,8. Tidligere analyser av svine-BOEC generert ved hjelp av denne protokollen har vist at disse cellene i tillegg er positive for von Willebrands faktoruttrykk og lektinbinding28.
Overfloden av PBMC i sirkulerende blod, hvorfra BOEC oppstår, støtter muligheten for en robust metode for å oppnå en nesten ubegrenset tilførsel av terapeutiske BOEC fra animalske kilder. Når teknikken er mestret, kan BOECs brukes til flere applikasjoner, inkludert vaskulær reparasjon og regenerering, sykdomsmodellering, narkotikascreening og endotelcellebiologistudier. Pågående studier er nødvendig for å bekrefte homogeniteten av svine-BOEC og deres kompatibilitet som terapeutisk kilde hos mennesker.
En begrensning av denne protokollen er risikoen for at ekspanderende endotelcellekolonier ikke klarer å generere. Feilraten er estimert til å være 5% -10%, og i disse tilfellene er det nødvendig med et nytt forsøk. Når forsikring om suksess er viktig, kan dobbelt så mye blod samles inn, og protokollen kan følges parallelt for å gi to uavhengige kulturer. Videre er vår erfaring begrenset til friske Yorkshire/Landrace/Duroc kryssgriser (Sus domesticus), hann og hunn, 40-80 kg, 3-6 måneder gamle. Suksessrater med andre raser, aldre og eksperimentelle forhold er ukjente.
En annen begrensning ved protokollen er at en definitiv markør for BOEC-fenotype ikke eksisterer. Her og i tidligere arbeid28 har SVINE-BOECene generert fra denne protokollen blitt karakterisert for flere BOEC-markører, men forståelsen av BOEC-fenotypen fortsetter å utvikle seg. BOEC karakteriseres også ved passasje 2-3 og fenotype ved høyere passasjer er ukjent. En fordel med svine-BOEC sammenlignet med mennesker er den klare tilførselen av grisblod, noe som muliggjør generering av hyppigere kulturer og en robust tilførsel av konsistente celler med lav passasje.
En av de største begrensningene ved å bruke svineceller i terapeutiske tilnærminger er vertsimmunresponsen29. Flere immunmoduleringsstrategier blir undersøkt for å redusere immunogeniteten til xenogene celler for human transplantasjon, for eksempel antiinflammatoriske midler og CRISPR / Cas genetisk manipulasjon30,31,32. Nyere studier har foreslått ekspresjon av humane komplementære regulatoriske proteiner (hCRPs)33 og innføring av α1,3- galaktosyltransferase slettet (GTKO) 32,34 griser. Disse fremskrittene holder løfte om terapeutisk anvendelse av xenogene celler, inkludert svin BOECs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å anerkjenne finansiering fra NIH/NHLBI R00 HL129068.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 19 G needle | Covidien | 1188818112 | |
| 50 mL conical tubes | Corning | 352098 | |
| 6 well plate | BD Falcon | 353046 | |
| 60 mL syringes | Covidien | 8881560125 | |
| Ammonium chloride solution (0.8%) | Stemcell Technologies | 07850 | |
| Antibiotic/antimycotic solution (100x) | Gibco | 15240-062 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 75-253-839 | |
| EGM-2 culture medium | Lonza Walkersville | CC-3162 | |
| Extension tube | Hanna Pharmaceutical Supply Co. | 03382C6227 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Atlas Biologicals | F-0500-A | |
| Ficoll-Paque 1077 | Cytiva | 17144003 | Density gradient solution |
| Heparin sodium injection (1,000 units/mL) | Pfizer | 00069-0058-01 | |
| Human plasma fibronectin | Gibco | 33016-015 | |
| Ice | N/A | N/A | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-023 | |
| Pipette set | Eppendorf | 2231300004 | |
| Sterile water | Gibco | 15230-162 | |
| Thin pipette | Celltreat Scientific | 229280 |
References
- Aird, W. C. Phenotypic heterogeneity of the endothelium: II. Representative vascular beds. Circulation Research. 100 (2), 174-190 (2007).
- Aird, W. C. Phenotypic heterogeneity of the endothelium: I. Structure, function, and mechanisms. Circulation Research. 100 (2), 158-173 (2007).
- Pober, J. S., Tellides, G. Participation of blood vessel cells in human adaptive immune responses. Trends in Immunology. 33 (1), 49-57 (2012).
- Navarro, S., et al. The endothelial cell protein C receptor: its role in thrombosis. Thrombosis Research. 128 (5), 410-416 (2011).
- Hasstedt, S. J., et al. Cell adhesion molecule 1: a novel risk factor for venous thrombosis. Blood. 114 (14), 3084-3091 (2009).
- Ormiston, M. L., et al. Generation and culture of blood outgrowth endothelial cells from human peripheral blood. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (106), e53384 (2015).
- Lin, Y., Weisdorf, D. J., Solovey, A., Hebbel, R. P. Origins of circulating endothelial cells and endothelial outgrowth from blood. Journal of Clinical Investigation. 105 (1), 71-77 (2000).
- Martin-Ramirez, J., Hofman, M., Biggelaar, M. V. D., Hebbel, R. P., Voorberg, J. Establishment of outgrowth endothelial cells from peripheral blood. Nature Protocols. 7 (9), 1709-1715 (2012).
- Gulati, R., et al. Diverse origin and function of cells with endothelial phenotype obtained from adult human blood. Circulation Research. 93 (11), 1023-1025 (2003).
- Hebbel, R. P. Blood endothelial cells: utility from ambiguity. The Journal of Clinical Investigation. 127 (5), 1613-1615 (2017).
- Medina, R. J., et al. Endothelial progenitors: A consensus statement on nomenclature. Stem Cells Translational Medicine. 6 (5), 1316-1320 (2018).
- Medina, R. J., et al. Molecular analysis of endothelial progenitor cell (EPC) subtypes reveals two distinct cell populations with different identities. BMC Medical Genomics. 3, 18 (2010).
- Jiang, A., Pan, W., Milbauer, L. C., Shyr, Y., Hebbel, R. P. A practical question based on cross-platform microarray data normalization: are BOEC more like large vessel or microvascular endothelial cells or neither of them. Journal of Bioinformatics and Computational Biology. 5 (4), 875-893 (2007).
- Pan, W., Shen, X., Jiang, A., Hebbel, R. P. Semi-supervised learning via penalized mixture model with application to microarray sample classification. Bioinformatics. 22 (19), 2388-2395 (2006).
- Hirschi, K. K., Ingram, D. A., Yoder, M. C. Assessing identity, phenotype, and fate of endothelial progenitor cells. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 28 (9), 1584-1595 (2008).
- Fernandez, L. A., et al. Blood outgrowth endothelial cells from hereditary haemorrhagic telangiectasia patients reveal abnormalities compatible with vascular lesions. Cardiovascular Research. 68 (2), 235-248 (2005).
- Critser, P. J., Yoder, M. C. Endothelial colony-forming cell role in neoangiogenesis and tissue repair. Current Opinion in Organ Transplantation. 15 (1), 68-72 (2010).
- Zhao, Y., et al. Isolation and culture of primary aortic endothelial cells from miniature pigs. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e59673 (2019).
- Chang Milbauer, L., et al. Genetic endothelial systems biology of sickle stroke risk. Blood. 111 (7), 3872-3879 (2008).
- Wei, P., et al. Differential endothelial cell gene expression by African Americans versusCaucasian Americans: a possible contribution to health disparity in vascular disease and cancer. BMC Medicine. 9 (1), 2 (2011).
- Hasstedt, S. J., et al. Cell adhesion molecule 1: a novel risk factor for venous thrombosis. Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 114 (14), 3084-3091 (2009).
- Milbauer, L. C., et al. Blood outgrowth endothelial cell migration and trapping in vivo: a window into gene therapy. Translational Research. 153 (4), 179-189 (2009).
- Matsui, H., et al. Ex vivo gene therapy for hemophilia A that enhances safe delivery and sustained in vivo factor VIII expression from lentivirally engineered endothelial progenitors. Stem Cells. 25 (10), 2660-2669 (2007).
- De Meyer, S. F., et al. Phenotypic correction of von Willebrand disease type 3 blood-derived endothelial cells with lentiviral vectors expressing von Willebrand factor. Blood. 107 (12), 4728-4736 (2006).
- Bodempudi, V., et al. Blood outgrowth endothelial cell-based systemic delivery of antiangiogenic gene therapy for solid tumors. Cancer Gene Therapy. 17 (12), 855-863 (2010).
- Dudek, A. Z., et al. Systemic inhibition of tumour angiogenesis by endothelial cell-based gene therapy. British Journal of Cancer. 97 (4), 513-522 (2007).
- Moubarik, C., et al. Transplanted late outgrowth endothelial progenitor cells as cell therapy product for stroke. Stem Cell Reviews and Reports. 7 (1), 208-220 (2011).
- Pislaru Sorin, V., et al. Magnetic forces enable rapid endothelialization of synthetic vascular grafts. Circulation. 114 (1), 314 (2006).
- Satyananda, V., et al. New concepts of immune modulation in xenotransplantation. Transplantation. 96 (11), 937-945 (2013).
- Klymiuk, N., Aigner, B., Brem, G., Wolf, E. Genetic modification of pigs as organ donors for xenotransplantation. Molecular Reproduction and Development. 77 (3), 209-221 (2010).
- Ryczek, N., Hryhorowicz, M., Zeyland, J., Lipiński, D., Słomski, R. CRISPR/Cas technology in pig-to-human xenotransplantation research. International Journal of Molecular Sciences. 22 (6), 3196 (2021).
- Cooper, D. K., Koren, E., Oriol, R.
- Cozzi, E., White, D. J. G. The generation of transgenic pigs as potential organ donors for humans. Nature Medicine. 1 (9), 964-966 (1995).
- Phelps, C. J., et al.
