Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Karakterisering af blodudvækstendotelceller (BOEC) fra perifert blod fra svin

Published: January 6, 2022 doi: 10.3791/63285
Automatic Translation
1, 2, 3, 4, 4, 1
1Department of Biomedical Engineering, Medical College of Wisconsin & Marquette University, 2Division of Engineering, Mayo Clinic, 3Department of Physiology & Biomedical Engineering, Mayo Clinic, 4Department of Cardiovascular Medicine, Mayo Clinic

Abstract

Endotelet er en dynamisk integreret struktur, der spiller en vigtig rolle i mange fysiologiske funktioner såsom angiogenese, hæmostase, inflammation og homeostase. Endotelet spiller også en vigtig rolle i patofysiologier som aterosklerose, hypertension og diabetes. Endotelceller danner den indre foring af blod og lymfekar og viser heterogenitet i struktur og funktion. Forskellige grupper har evalueret funktionaliteten af endotelceller afledt af humant perifert blod med fokus på endotelstamceller afledt af hæmatopoietiske stamceller eller modne blodudvækstendotelceller (eller endotelkolonidannende celler). Disse celler giver en autolog ressource til terapi og sygdomsmodellering. Xenogene celler kan udgøre en alternativ kilde til behandling på grund af deres tilgængelighed og homogenitet opnået ved anvendelse af genetisk lignende dyr opdrættet under lignende forhold. Derfor er der fremlagt en robust protokol til isolering og udvidelse af stærkt proliferativ blodudvækstendotelceller fra perifert blod fra svin. Disse celler kan bruges til adskillige applikationer såsom kardiovaskulær vævsteknik, celleterapi, sygdomsmodellering, lægemiddelscreening, undersøgelse af endotelcellebiologi og in vitro-cokulturer for at undersøge inflammatoriske og koagulationsresponser i xenotransplantation.

Introduction

Endotelet er en meget kompleks, dynamisk struktur og en vital bestanddel af vaskulærvæggen. Det linjer den indre overflade af blodkar for at give en fysisk grænseflade mellem cirkulerende blod og omgivende væv. Denne heterogene struktur er kendt for at udføre forskellige funktioner såsom angiogenese, inflammation, vasoregulering og hæmostase 1,2,3,4. Humane navlestrengendototelceller er en bredt undersøgt celletype for at vurdere funktionaliteten af endotelceller. Den patientspecifikke batchvariabilitet, inkonsekvente fænotype og minimale opdelingseffektivitet antyder imidlertid et behov for at bestemme en cellekilde, der kan forbedre alle disse funktioner5.

Det kan være teknisk udfordrende at opnå en homogen population af primære endotelceller, og primære endotelceller har ikke høj proliferativ kapacitet6. For at studere vaskulær regenerering og evaluere patofysiologiske processer har forskellige grupper derfor forsøgt at opnå og vurdere forskellige typer endotelceller afledt af perifert blod, fx endotelstamceller (EPC'er) eller blodudvækstendotelceller (BOEC'er)6,7,8,9 . De spindelformede tidlige EPC'er stammer fra hæmatopoietiske stamceller (HSC'er) og har begrænset vækststyrke og begrænset angiogen evne til at producere modne endotelceller. Desuden ligner de meget inflammatoriske monocytter. Derudover er deres evne til yderligere at differentiere sig til funktionelle, prolifererende, modne endotelceller stadig diskutabel 6,7,9,10. Den kontinuerlige dyrkning af mononukleære celler i perifert blod (PBMC'er) kan give anledning til en sekundær population af celler kendt som EPC'er med sen udvækst, BOEC'er eller endotelkolonidannende celler (ECFC'er)6,7,9,10. Medina et al. anerkendte i 2018 begrænsningerne ved EPC'er, tvetydigheden i deres nomenklatur sammen med en generel mangel på overensstemmelse med mange forskellige celletyper, der kontinuerligt grupperes under EPC'er11. I modsætning hertil er BOEC'er blevet anerkendt for deres rolle i vaskulær reparation, sundhed og sygdom og celleterapi. Yderligere undersøgelse og terapeutisk anvendelse af disse celler vil stole på protokoller for konsekvent at udlede disse celletyper fra cirkulerende stamceller.

Primære celler såsom BOEC'er kan bruges som surrogat for at opnå stærkt proliferative modne endotelceller6. BOEC'er adskiller sig fænotypisk fra tidlige EPC'er og udviser typiske endotelegenskaber såsom brostensmorfologi og ekspression af adhærenskryds og caveolae12. Genprofilering af Hebbel et al.13,14,15 viste, at BOEC'er eller ECFC'er er de sande endotelceller, da de fremmer mikrovaskulær og dannelse af store kar. Således kan BOEC'er bruges som et værktøj til at evaluere patofysiologiske processer og genetisk variation16. De betragtes også som en fremragende cellekilde til celleterapi til vaskulær regenerering17. Derfor er en standardiseret protokol til konsekvent at udlede disse stærkt proliferative celler afgørende.

Mens BOEC'er giver et effektivt værktøj til at studere menneskelig patofysiologisk og genetisk variation, kan en mere homogen kilde til BOEC'er give mere robuste og pålidelige eksperimentelle og terapeutiske resultater. Overlegen homogenitet kan opnås ved at anvende xenogene cellekilder fra genetisk lignende dyr, der er opdrættet under lignende forhold18. Mens xenogene cellekilder er tilbøjelige til at fremkalde et værtsimmunrespons, udvikles immunmodulationsstrategier med det formål at generere immunkompatible dyr og animalske produkter, herunder celler. Især svin er en rigelig kilde til perifert blod og bruges almindeligvis til at studere medicinsk udstyr og andre terapier på grund af anatomiske og fysiologiske ligheder med mennesker. Derfor forfiner denne undersøgelse protokollen til isolering og udvidelse af stærkt proliferative BOEC'er fra perifert blod fra svin. Protokollen beskrevet nedenfor er en ligetil og pålidelig metode til at opnå et stort antal BOEC'er fra et relativt lille volumen blod. Kulturerne kan udvides gennem flere passager for at generere millioner af celler fra en enkelt blodprøve.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyreforsøg blev godkendt af de respektive Institutional Animal Care and Use Committees (IACUC) ved Medical College of Wisconsin og Mayo Clinic.

BEMÆRK: I denne undersøgelse blev Yorkshire/Landrace/Duroc krydsende tamsvin (Sus domesticus), han og hun, 40-80 kg, 3-6 måneder gamle, anvendt.

1. Indsamling af perifert blod fra svin

  1. Forbered materialer.
    1. Heparinopløsningen fortyndes til 100 E/ml i sterilt saltvand.
    2. Tilsæt 3-4 ml heparinopløsning til hver af to 50 ml koniske rør og to 60 ml sprøjter.
    3. Træk ufortyndet heparinopløsning (1.000 E/ml) ind i et forlængerglas.
    4. Tilslut en 19 G kanyle til den ene ende af det heparinfyldte forlængerrør og en heparinholdig 60 ml sprøjte til den anden ende.
  2. Bedøv en gris i henhold til institutionelle politikker
    1. Administrer en IM-injektion af atropin (0,05 mg / kg), tiletamin/zolazepam (2-5 mg / kg) og xylazin (2 mg / kg) for at inducere anæstesi.
      BEMÆRK: tilstrækkelig bedøvelse opnås, når dyret er bevidstløst, og mandibulære muskler er ikke-stive.
    2. Læg dyret i liggende stilling og læg sammenrullede håndklæder på begge sider for at give stabilitet.
    3. Påfør en oftalmisk salve til øjnene for at forhindre tørhed under anæstesi.
    4. Giv termisk støtte under anæstesi, herunder tæpper, varmepuder og / eller opvarmet procedurebord.
  3. Rengør lårbenets lyskeområde med betadinskrubbeopløsning.
  4. Punktering lårbensvenen eller arterien med 19 G kanylen og træk langsomt (~1-2 ml/s) 50 ml blod ind i sprøjten.
    BEMÆRK: Hvis du tegner for hurtigt, kan det beskadige cellerne.
  5. Lad kanylen sidde på plads, knæk straks forlængerrøret og frakobl 60 ml sprøjten
  6. Overfør langsomt blodet til et heparinholdigt 50 ml konisk rør.
  7. Sæt det 50 ml koniske rør tæt på, vend forsigtigt et par gange for at blande, og læg det på is.
  8. Tilslut den resterende heparinholdige 60 ml sprøjte til forlængerrøret, løsn forlængerrøret, og træk langsomt yderligere 50 ml blod ind i sprøjten.
  9. Fjern straks nålen fra arterien eller venen og træk langsomt det resterende blod fra forlængerrøret ind i sprøjten.
  10. Afbryd 60 ml sprøjten fra forlængerrøret, og overfør langsomt blodet til det resterende heparinholdige 50 ml koniske rør.
  11. Sæt det 50 ml koniske rør tæt på, vend forsigtigt et par gange for at blande, og læg det på is.
  12. Påfør trykhæmostase på grisens lårbens lyskeområde.
  13. Gendan grisen i henhold til institutionelle politikker. Overvåg kontinuerligt dyret, indtil det genvinder tilstrækkelig bevidsthed til at opretholde brystliggepladsen og vende tilbage til det almindelige stald-/transportboksområde.

2. Isolering af mononukleære celler

  1. Fortynd blodet 1:1 med fosfatbufret saltvand (PBS) i fire 50 ml koniske rør.
    BEMÆRK: Dette arbejde skal udføres i en cellekulturhætte ved hjælp af en aseptisk teknik for at undgå kontaminering af cellekulturen.
  2. Tilsæt 25 ml stuetemperatur klar til brug densitetsgradientopløsning til otte 50 ml koniske rør.
  3. Meget langsomt pipetteres 25 ml blod/saltopløsning langs indersiden af hver densitetsgradientopløsning, der indeholder 50 ml konisk rør, ved at holde røret i en skarp vinkel i forhold til pipettespidsen.
    BEMÆRK: Blodopløsningen skal forsigtigt lag oven på densitetsgradientopløsningen og opretholde en veldefineret grænseflade.
  4. Centrifuger glassene i 30 minutter ved 560 x g og stuetemperatur (RT).
    BEMÆRK: For at opnå de bedste resultater skal centrifugebremsen deaktiveres, hvis det er muligt.
  5. Brug en tynd pipette til omhyggeligt at samle buffy coat (uklart lag af mononukleære celler over densitetsgradientopløsningen og under det klare plasma) fra hvert rør og fordel jævnt i to nye 50 ml koniske rør. Kassér densitetsgradientopløsningen, der indeholder rør.
    BEMÆRK: Opsaml så meget af buffypelsen som muligt, mens du samler så lidt af densitetsgradientopløsningen og plasmaet som muligt.

3. Vask og plettering af celler

  1. Overtræk en 6-brønds plade med fibronectin.
    1. Lav en stamopløsning af humant plasmafibronectin ved at fortynde det til 1 mg / ml i sterilt vand. De delvise prøver opbevares ved -20 °C.
    2. Lav 3,6 ml af en arbejdsløsning af fibronectin ved at fortynde 600 μL fibronectinstamopløsning i 3 ml PBS.
    3. Overfør 600 μL af fibronectin-arbejdsløsningen til hver brønd i en 6-brøndplade og rock forsigtigt, indtil den er jævnt overtrukket.
    4. Vent 30 minutter på, at fibronectin dækker brøndene og aspirer forsigtigt opløsningen ud af hver brønd.
  2. Mens du venter på, at fibronectin skal belægge, skal du vaske de mononukleære celler
    1. Fyld slangerne op med op til 45 ml PBS
    2. Centrifuger i 5 min ved 560 x g og 4 °C med lav bremse. Supernatanten suges op fra begge reagensglas.
    3. Hver cellepille resuspenderes i 25 ml PBS.
    4. Gentag for at vaske en anden gang.
  3. Resuspender hver cellepille i 5 ml PBS og tilsæt 15 ml 0,8% ammoniumchloridopløsning til hvert rør.
    BEMÆRK: Dette trin er at lyse de resterende røde blodlegemer.
  4. Inkuber på is i 10 min.
  5. Cellerne vaskes som før ved at fylde slangerne op med PBS og centrifugeres i 5 minutter ved 560 x g og 4 °C med lav bremse. Supernatanten suges op fra begge reagensglas.
  6. Resuspender hver cellepille i 25 ml PBS og gentag for at vaske en anden gang.
  7. Resuspender hver cellepellet i 6 ml EGM-2 dyrkningsmedium suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1x antibiotikum/antimykotisk opløsning indeholdende 10.000 E / ml penicillin, 10 mg / ml streptomycin og 25 μg / ml amphotericin.
    BEMÆRK: EGM-2 dyrkningsmedium består af EBM-2 dyrkningsmedium suppleret med 200 μL hydrocortison, 2 ml human fibroblastvækstfaktor (hFGF-B), 500 μL vaskulær endotelvækstfaktor (VEGF), 500 μL rekombinant analog insulinlignende vækstfaktor (R3 IGF-1), 500 μL ascorbinsyre, 500 μL human epidermal vækstfaktor (hEGF), 500 μL gentamicin / amphotericin og 500 μL heparin pr. 500 ml.
  8. Overfør forsigtigt 2 ml af cellesuspensionen til hver brønd i den fibronectinbelagte 6-brøndplade og vugge forsigtigt, indtil den er jævnt overtrukket.
    BEMÆRK: Målet er at frø så mange celler som muligt for at maksimere antallet af endotelkolonier, der dannes.

4. Cellekultur

  1. Inkuber cellerne ved 37 °C, 5% CO2 og 100% fugtighed.
  2. Den næste dag tilsættes forsigtigt 1 ml frisk kulturmedium til hver brønd.
    BEMÆRK: Det er vigtigt at være forsigtig med ikke at forstyrre celler, der er løst klæbende til fibronectinbelægningen.
  3. Den næste dag udføres en halv kulturmediumændring ved forsigtigt at aspirere 1,5 ml kulturmedium fra hver brønd og erstatte den med 1,5 ml frisk kulturmedium.
  4. På hver af de næste 5 dage udføres forsigtigt en fuld kulturmediumændring til hver brønd (2 ml frisk kulturmedium pr. Brønd).
  5. Derefter ændres kulturmediet forsigtigt tre gange om ugen.
  6. Visualiser regelmæssigt cellekulturerne under lav effekt (4x objektiv) lysmikroskopi.
    BEMÆRK: Adhærent blodudvækst endotelcelle (BOEC) kolonier begynder at dukke op i brøndene 7-10 dage efter plettering. Ikke-klæbende celletyper kasseres med mellemstore ændringer, og andre vedhængende celletyper spredes gradvist, efterhånden som BOEC-kolonierne vokser.
  7. Passage BOEC'erne i en fibronectinbelagt T-75-kolbe, når ~ 70% -80% sammenflydende, og fortsæt med at skifte kulturmedium tre gange om ugen.
    BEMÆRK: Såtætheden kan styres ved at overføre kolonier til en T25-kolbe i stedet. Efterfølgende passager kræver ikke fibronectinbelægning, og ændringer i kulturmedium kan reduceres til to gange om ugen.
  8. Celler fra passage 1-3 kan anvendes til forsøg eller overføres til et frysemedium og opbevares i flydende nitrogen til fremtidig brug.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Morfologi af de dyrkede celler blev observeret fra kulturens start, indtil BOEC-kolonier blev observeret (figur 1). En mindre population af vedhængende celler begyndte at binde sig til kulturskålene og vokse, mens ikke-klæbende celler blev fjernet med ændringer i dyrkningsmediet (figur 1B). Kolonier optrådte først på dag 6 som en samling endotellignende celler, der spredte sig radialt udad fra et centralt punkt (figur 1D). Efterhånden som kulturen skred frem, blev cellekolonierne mere tætte og viste en brostensmorfologi svarende til modne endotelceller (figur 1F). Den typiske endotelbrostensmorfologi giver en nem foreløbig identifikation af BOEC'er ved hjælp af et lysmikroskop.

Endotelcellekolonier er typisk klar til passage ved 10-14 dages dyrkning. På dette tidspunkt vil 6-brøndpladen typisk give ~ 1 million celler med procent levedygtighed på 93% -98%. Under den første passage vil endotelceller udvide sig til at give ~ 6-10 millioner celler i en T75-kolbe.

For at vurdere morfogenesen af BOEC'er blev kældermembranmatrixen (f.eks. Matrigel) belagt på 15 brøndangiogeneseplader ved 10 μL / brønd og inkuberet ved 37 ° C i 30 minutter for at muliggøre polymerisering. Passage 2-celler blev podet på kældermembranmatrixbelagte plader og afbildet ved tidspunkter på 14 timer og 24 timer. En tæthed på ca. 3.500 celler pr. brønd var i stand til at danne et netværk og rørlignende strukturer. Rørdannelse blev bemærket inden for 14 timer for serumfrit medium (EGM-2 med supplerende midler undtagen FBS) og inden for 24 timer for komplet vækstmedium (EGM-2 med kosttilskud inklusive FBS). Tilsætning af FBS kan have fortyndet de endotelcellespecifikke vækstfaktorer (f.eks. VEGF) og indført andre signalfaktorer, hvilket resulterer i forsinkelse af rørdannelsesprocessen. 2D-fasekontrastmikroskopi blev brugt til at afbilde rørdannelse i serumfrit medium (figur 2A, B) og komplet vækstmedium (figur 2C, D). Celler i begge medieforhold gennemgik morfologisk differentiering og organiserede sig hurtigt i omfattende netværk af kapillarrørlignende strukturer. Disse strukturer var sammensat af organiserede cellulære ledninger, der lignede in vivo kapillærnetværk. Desuden illustrerer mikrografier ved 20x forstørrelse den komplekse flercellede organisation af endotelceller og deres morfologiske differentiering i detaljer. Der blev ikke observeret morfologiske forskelle mellem medieforholdene. Det omfattende netværk af kapillarrørlignende strukturer tyder stærkt på differentieringen af dyrkede celler i modne og funktionelle endotelceller.

BOEC'er blev yderligere karakteriseret ved ekspression af moden endotelcellemarkør CD31 eller blodpladeendotelcelleadhæsionsmolekyle-1 (PECAM1) (figur 3A, B). BOEC'er viste ensartet udtryk for CD31. Desuden bekræftede flowcytometrianalyse fraværet af EPC'er, da cellerne farvede negativt for monocytmarkør CD14 sammenlignet med den positive kontrolgruppe af PBMC'er (figur 3C, D).

Figure 1
Figur 1: Fænotype lysmikroskopi billeder. Lysmikroskopibillederne af dyrkede BOEC'er observeret ved 10x forstørrelse på (A) dag 0, (B) dag 2, (C) dag 4, (D) dag 6, (E) dag 8 og (F) efter den første passage. Skalastænger: 200 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Morfologisk differentiering og organisering af passage 2 BOEC'er. Morfologisk differentiering og organisering af passage 2 BOEC'er i kapillarrørlignende strukturer blev bemærket i kældermembranmatrixen inden for 14 timer for serumfrit medium og inden for 24 timer for komplet vækstmedium. (A) Serumfrit medium ved 4x, (B) Serumfrit medium ved 20x, (C) Komplet vækstmedium ved 4x og (D) Komplet vækstmedium ved 20x. Skalastænger: 200 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Karakterisering af BOEC'er med CD31 og CD14. (A) Passage 2-3 BOEC'er blev farvet for PECAM1 ved hjælp af anti-CD31-FITC-antistof set i grønt og (B) tilsvarende fasekontrastmikroskopibilleder. Celler blev farvet i suspension, og suspensionen blev afbildet på et mikroskopglas. Skalastænger: 200 μm. (C) Flowcytometrianalyse af BOEC'er med CD14-AF700-antistof sammenlignet med (D) mononukleære celler i perifert blod (PBMC'er). Positiv CD14-farvning vist i blå og ubejdsede celler vist med rødt. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

BOEC'er er et kraftfuldt værktøj, der kan bruges i forskellige videnskabelige og terapeutiske tilgange 7,8,16. BOEC'er er blevet brugt til at analysere EC-genekspression for at belyse de nøglefaktorer, der er ansvarlige for udviklingen af vaskulære sygdomme og kræft 5,19,20,21. BOEC'er er også blevet anvendt i terapeutiske anvendelser såsom vaskulær regenerering og genlevering22,23,24. Genetisk modificerede BOEC'er har været kendt for deres antiangiogene tumorterapeutiske evne25,26. Endvidere gør det angiogene potentiale af BOEC'er dem fremragende kandidater til cellulære terapier, der sigter mod vaskularisering og neovaskularisering17,27. Selvom flere undersøgelser beskriver, hvordan man opnår BOEC'er fra humant perifert blod 6,7,8,9, tyder variabiliteten af humane cellekilder på grund af underliggende patofysiologisk og genetisk variation på et kritisk behov for at få BOEC'er fra sunde xenogene kilder 9,13,18.

En detaljeret protokol til effektivt at udlede BOEC'er fra mononukleære celler i perifert blod hos svin er blevet præsenteret. Kritiske trin omfatter behandling af blodprøver så hurtigt som muligt og effektiv høst af buffy coat-lag efter densitetsgradientcentrifugering for at maksimere antallet af levedygtige PBMC'er, der går ind i kulturen. Den oprindelige pletteringstæthed og rettidig passage af celler er vigtige overvejelser for at opnå konsekvent isolering af disse celletyper. Et startblodvolumen på 100 ml giver et passende antal PBMC'er til en enkelt plade med seks brønde. Det skal bemærkes, at det maksimale volumen blod, der sikkert kan indsamles fra et svin, vil variere med dyrets kropsvægt. En foreslået sikker engangs maksimal blodvolumenindsamling til svin er 8 ml pr. Kg legemsvægt. Derudover er rettidig passage af indledende kolonier fra passage 0 til passage 1 også afgørende. Cellerne ophører med at sprede sig, hvis såtætheden er meget lav, eller hvis cellerne når sammenløb. Når cellerne bliver sammenflydende, begynder de at omdanne til en langstrakt mesenkymal morfologi og fænotype. Såtætheden kan også kontrolleres ved at overføre kolonier til en T25-kolbe i stedet for en T75-kolbe. Det er nødvendigt nøje at overveje ikke at miste de vedhængende celletyper under den første medieændring, da det er meget vigtigt at fange så mange vedhængende celler som muligt, mens de ikke-klæbende EPC'er kasseres. Denne protokol producerer udvækstcellekolonier på cirka 1 uge.

Protokollen er meget reproducerbar og pålidelig. Udvidelse af endotelcellekolonier opnås i anslået 90% -95% af kulturerne. Fejl skyldes typisk manglende dannelse af endotelcellekolonier, hvilket betyder, at hvis der dannes mindst en endotelcellekoloni, vil de næsten altid fortsætte med at ekspandere i kultur. Kilder til svigt omfatter tilfældig variabilitet, overdreven klipning af celler under blodindsamling, kontaminering af mikrober i kulturen og højt tab af mononukleære celler under behandlingstrinnene. Efter en mislykket kultur vil en anden kultur typisk være vellykket, hvilket indikerer, at variation mellem dyr ikke er en vigtig faktor. Protokollen er endda vellykket, når der indsamles blod umiddelbart efter eutanasi, hvilket indikerer, at vasketrinnene effektivt reducerer eutanasimidlerne til uskadelige niveauer.

Uanset heterogeniteten i den cirkulerende blodcellepopulation blev der opnået BOEC'er, der er meget forskellige fra EPC'er. BOEC'er er afledt af en lille delmængde af klæbende PBMC'er, der mangler CD14-udtryk. Dette blev bekræftet af fraværet af CD14-farvning (figur 3C, D). Clearance af monocytiske EPC'er fra BOEC-kulturer i tidlige passager kan forklares enten ved celledød eller manglende adhærens. Brostensmorfologien af BOEC'er (figur 1E, F) antyder en udtalt endotelfænotype. Desuden indebærer den ensartede ekspression af overflademarkør CD31 (figur 3A) en homogen population af modne endotelceller. Endvidere viser kapillærmorfogenesen af BOEC'er både i serumfri (figur 2A,B) og komplette vækstmedier (figur 2C,D) deres iboende angiogene evne 6,8. Tidligere analyse af svine-BOEC'er genereret ved hjælp af denne protokol har vist, at disse celler desuden er positive for von Willebrand-faktorekspression og lektinbinding28.

Overfloden af PBMC'er i cirkulerende blod, hvorfra BOEC'er opstår, understøtter gennemførligheden af en robust metode til at opnå en praktisk talt ubegrænset forsyning af terapeutiske BOEC'er fra animalske kilder. Når teknikken er mestret, kan BOEC'er bruges til flere applikationer, herunder vaskulær reparation og regenerering, sygdomsmodellering, lægemiddelscreening og endotelcellebiologiske undersøgelser. Igangværende undersøgelser er nødvendige for at bekræfte homogeniteten af svine-BOEC'er og deres kompatibilitet som terapeutisk kilde hos mennesker.

En begrænsning af denne protokol er risikoen for, at ekspanderende endotelcellekolonier ikke genereres. Fejlprocenten anslås til at være 5%-10%, og i disse tilfælde er et andet forsøg nødvendigt. Når sikkerhed for succes er vigtig, kan dobbelt så meget blod opsamles, og protokollen kan følges parallelt for at give to uafhængige kulturer. Desuden er vores erfaring begrænset til sunde Yorkshire/Landrace/Duroc krydsende tamsvin (Sus domesticus), han og hun, 40-80 kg, 3-6 måneder gamle. Succesrater med andre racer, aldre og eksperimentelle forhold er ukendte.

En anden begrænsning af protokollen er, at der ikke findes en endelig markør for BOEC-fænotype. Her og i tidligere arbejde28 er svine-BOEC'erne genereret fra denne protokol blevet karakteriseret for flere BOEC-markører, men forståelsen af BOEC-fænotype fortsætter med at udvikle sig. BOEC'er karakteriseres også ved passager 2-3, og fænotype ved højere passager er ukendt. En fordel ved svine-BOEC'er sammenlignet med mennesker er den klare forsyning af svineblod, hvilket giver mulighed for generering af hyppigere kulturer og en robust forsyning af konsistente, lave passageceller.

En af de største begrænsninger ved at bruge svineceller i terapeutiske tilgange er værtens immunrespons29. Flere immunmodulationsstrategier undersøges for at afbøde immunogeniciteten af xenogene celler til human transplantation, såsom antiinflammatoriske midler og CRISPR / Cas genetisk manipulation30,31,32. Nyere undersøgelser har foreslået ekspression af humane komplementære regulatoriske proteiner (hCRP'er)33 og indførelse af α1,3- galactosyltransferase slettet (GTKO)32,34 svin. Disse fremskridt er lovende for terapeutisk anvendelse af xenogene celler, herunder svine-BOEC'er.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Forfatterne ønsker at anerkende finansiering fra NIH / NHLBI R00 HL129068.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
19 G needle Covidien 1188818112
50 mL conical tubes Corning 352098
6 well plate BD Falcon 353046
60 mL syringes Covidien 8881560125
Ammonium chloride solution (0.8%) Stemcell Technologies 07850
Antibiotic/antimycotic solution (100x) Gibco 15240-062
Centrifuge Thermo Scientific 75-253-839
EGM-2 culture medium Lonza Walkersville CC-3162
Extension tube Hanna Pharmaceutical Supply Co. 03382C6227
Fetal bovine serum (FBS) Atlas Biologicals F-0500-A
Ficoll-Paque 1077 Cytiva 17144003 Density gradient solution
Heparin sodium injection (1,000 units/mL) Pfizer 00069-0058-01
Human plasma fibronectin Gibco 33016-015
Ice N/A N/A
Phosphate-buffered saline (PBS) Gibco 10010-023
Pipette set Eppendorf 2231300004
Sterile water Gibco 15230-162
Thin pipette Celltreat Scientific 229280

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Aird, W. C. Phenotypic heterogeneity of the endothelium: II. Representative vascular beds. Circulation Research. 100 (2), 174-190 (2007).
  2. Aird, W. C. Phenotypic heterogeneity of the endothelium: I. Structure, function, and mechanisms. Circulation Research. 100 (2), 158-173 (2007).
  3. Pober, J. S., Tellides, G. Participation of blood vessel cells in human adaptive immune responses. Trends in Immunology. 33 (1), 49-57 (2012).
  4. Navarro, S., et al. The endothelial cell protein C receptor: its role in thrombosis. Thrombosis Research. 128 (5), 410-416 (2011).
  5. Hasstedt, S. J., et al. Cell adhesion molecule 1: a novel risk factor for venous thrombosis. Blood. 114 (14), 3084-3091 (2009).
  6. Ormiston, M. L., et al. Generation and culture of blood outgrowth endothelial cells from human peripheral blood. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (106), e53384 (2015).
  7. Lin, Y., Weisdorf, D. J., Solovey, A., Hebbel, R. P. Origins of circulating endothelial cells and endothelial outgrowth from blood. Journal of Clinical Investigation. 105 (1), 71-77 (2000).
  8. Martin-Ramirez, J., Hofman, M., Biggelaar, M. V. D., Hebbel, R. P., Voorberg, J. Establishment of outgrowth endothelial cells from peripheral blood. Nature Protocols. 7 (9), 1709-1715 (2012).
  9. Gulati, R., et al. Diverse origin and function of cells with endothelial phenotype obtained from adult human blood. Circulation Research. 93 (11), 1023-1025 (2003).
  10. Hebbel, R. P. Blood endothelial cells: utility from ambiguity. The Journal of Clinical Investigation. 127 (5), 1613-1615 (2017).
  11. Medina, R. J., et al. Endothelial progenitors: A consensus statement on nomenclature. Stem Cells Translational Medicine. 6 (5), 1316-1320 (2018).
  12. Medina, R. J., et al. Molecular analysis of endothelial progenitor cell (EPC) subtypes reveals two distinct cell populations with different identities. BMC Medical Genomics. 3, 18 (2010).
  13. Jiang, A., Pan, W., Milbauer, L. C., Shyr, Y., Hebbel, R. P. A practical question based on cross-platform microarray data normalization: are BOEC more like large vessel or microvascular endothelial cells or neither of them. Journal of Bioinformatics and Computational Biology. 5 (4), 875-893 (2007).
  14. Pan, W., Shen, X., Jiang, A., Hebbel, R. P. Semi-supervised learning via penalized mixture model with application to microarray sample classification. Bioinformatics. 22 (19), 2388-2395 (2006).
  15. Hirschi, K. K., Ingram, D. A., Yoder, M. C. Assessing identity, phenotype, and fate of endothelial progenitor cells. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 28 (9), 1584-1595 (2008).
  16. Fernandez, L. A., et al. Blood outgrowth endothelial cells from hereditary haemorrhagic telangiectasia patients reveal abnormalities compatible with vascular lesions. Cardiovascular Research. 68 (2), 235-248 (2005).
  17. Critser, P. J., Yoder, M. C. Endothelial colony-forming cell role in neoangiogenesis and tissue repair. Current Opinion in Organ Transplantation. 15 (1), 68-72 (2010).
  18. Zhao, Y., et al. Isolation and culture of primary aortic endothelial cells from miniature pigs. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e59673 (2019).
  19. Chang Milbauer, L., et al. Genetic endothelial systems biology of sickle stroke risk. Blood. 111 (7), 3872-3879 (2008).
  20. Wei, P., et al. Differential endothelial cell gene expression by African Americans versusCaucasian Americans: a possible contribution to health disparity in vascular disease and cancer. BMC Medicine. 9 (1), 2 (2011).
  21. Hasstedt, S. J., et al. Cell adhesion molecule 1: a novel risk factor for venous thrombosis. Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 114 (14), 3084-3091 (2009).
  22. Milbauer, L. C., et al. Blood outgrowth endothelial cell migration and trapping in vivo: a window into gene therapy. Translational Research. 153 (4), 179-189 (2009).
  23. Matsui, H., et al. Ex vivo gene therapy for hemophilia A that enhances safe delivery and sustained in vivo factor VIII expression from lentivirally engineered endothelial progenitors. Stem Cells. 25 (10), 2660-2669 (2007).
  24. De Meyer, S. F., et al. Phenotypic correction of von Willebrand disease type 3 blood-derived endothelial cells with lentiviral vectors expressing von Willebrand factor. Blood. 107 (12), 4728-4736 (2006).
  25. Bodempudi, V., et al. Blood outgrowth endothelial cell-based systemic delivery of antiangiogenic gene therapy for solid tumors. Cancer Gene Therapy. 17 (12), 855-863 (2010).
  26. Dudek, A. Z., et al. Systemic inhibition of tumour angiogenesis by endothelial cell-based gene therapy. British Journal of Cancer. 97 (4), 513-522 (2007).
  27. Moubarik, C., et al. Transplanted late outgrowth endothelial progenitor cells as cell therapy product for stroke. Stem Cell Reviews and Reports. 7 (1), 208-220 (2011).
  28. Pislaru Sorin, V., et al. Magnetic forces enable rapid endothelialization of synthetic vascular grafts. Circulation. 114 (1), 314 (2006).
  29. Satyananda, V., et al. New concepts of immune modulation in xenotransplantation. Transplantation. 96 (11), 937-945 (2013).
  30. Klymiuk, N., Aigner, B., Brem, G., Wolf, E. Genetic modification of pigs as organ donors for xenotransplantation. Molecular Reproduction and Development. 77 (3), 209-221 (2010).
  31. Ryczek, N., Hryhorowicz, M., Zeyland, J., Lipiński, D., Słomski, R. CRISPR/Cas technology in pig-to-human xenotransplantation research. International Journal of Molecular Sciences. 22 (6), 3196 (2021).
  32. Cooper, D. K., Koren, E., Oriol, R. Genetically engineered pigs. Lancet. 342 (8872), 682-683 (1993).
  33. Cozzi, E., White, D. J. G. The generation of transgenic pigs as potential organ donors for humans. Nature Medicine. 1 (9), 964-966 (1995).
  34. Phelps, C. J., et al. Production of alpha 1,3-galactosyltransferase-deficient pigs. Science. 299 (5605), New York, N.Y. 411-414 (2003).

Tags

Denne måned i JoVE udgave 179 blodudvækst endotelceller svin perifert blod endotelkolonidannende celler modne endotelceller xenotransplantation brostensmorfologi morfogenese endotelstamceller
Karakterisering af blodudvækstendotelceller (BOEC) fra perifert blod fra svin
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shradhanjali, A., Uthamaraj, S.,… More

Shradhanjali, A., Uthamaraj, S., Dragomir-Daescu, D., Gulati, R., Sandhu, G. S., Tefft, B. J. Characterization of Blood Outgrowth Endothelial Cells (BOEC) from Porcine Peripheral Blood. J. Vis. Exp. (179), e63285, doi:10.3791/63285 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter