Karakterisering af blodudvækstendotelceller (BOEC) fra perifert blod fra svin

Published: January 06, 2022
doi:

Abstract

Endotelet er en dynamisk integreret struktur, der spiller en vigtig rolle i mange fysiologiske funktioner såsom angiogenese, hæmostase, inflammation og homeostase. Endotelet spiller også en vigtig rolle i patofysiologier som aterosklerose, hypertension og diabetes. Endotelceller danner den indre foring af blod og lymfekar og viser heterogenitet i struktur og funktion. Forskellige grupper har evalueret funktionaliteten af endotelceller afledt af humant perifert blod med fokus på endotelstamceller afledt af hæmatopoietiske stamceller eller modne blodudvækstendotelceller (eller endotelkolonidannende celler). Disse celler giver en autolog ressource til terapi og sygdomsmodellering. Xenogene celler kan udgøre en alternativ kilde til behandling på grund af deres tilgængelighed og homogenitet opnået ved anvendelse af genetisk lignende dyr opdrættet under lignende forhold. Derfor er der fremlagt en robust protokol til isolering og udvidelse af stærkt proliferativ blodudvækstendotelceller fra perifert blod fra svin. Disse celler kan bruges til adskillige applikationer såsom kardiovaskulær vævsteknik, celleterapi, sygdomsmodellering, lægemiddelscreening, undersøgelse af endotelcellebiologi og in vitro-cokulturer for at undersøge inflammatoriske og koagulationsresponser i xenotransplantation.

Introduction

Endotelet er en meget kompleks, dynamisk struktur og en vital bestanddel af vaskulærvæggen. Det linjer den indre overflade af blodkar for at give en fysisk grænseflade mellem cirkulerende blod og omgivende væv. Denne heterogene struktur er kendt for at udføre forskellige funktioner såsom angiogenese, inflammation, vasoregulering og hæmostase 1,2,3,4. Humane navlestrengendototelceller er en bredt undersøgt celletype for at vurdere funktionaliteten af endotelceller. Den patientspecifikke batchvariabilitet, inkonsekvente fænotype og minimale opdelingseffektivitet antyder imidlertid et behov for at bestemme en cellekilde, der kan forbedre alle disse funktioner5.

Det kan være teknisk udfordrende at opnå en homogen population af primære endotelceller, og primære endotelceller har ikke høj proliferativ kapacitet6. For at studere vaskulær regenerering og evaluere patofysiologiske processer har forskellige grupper derfor forsøgt at opnå og vurdere forskellige typer endotelceller afledt af perifert blod, fx endotelstamceller (EPC’er) eller blodudvækstendotelceller (BOEC’er)6,7,8,9 . De spindelformede tidlige EPC’er stammer fra hæmatopoietiske stamceller (HSC’er) og har begrænset vækststyrke og begrænset angiogen evne til at producere modne endotelceller. Desuden ligner de meget inflammatoriske monocytter. Derudover er deres evne til yderligere at differentiere sig til funktionelle, prolifererende, modne endotelceller stadig diskutabel 6,7,9,10. Den kontinuerlige dyrkning af mononukleære celler i perifert blod (PBMC’er) kan give anledning til en sekundær population af celler kendt som EPC’er med sen udvækst, BOEC’er eller endotelkolonidannende celler (ECFC’er)6,7,9,10. Medina et al. anerkendte i 2018 begrænsningerne ved EPC’er, tvetydigheden i deres nomenklatur sammen med en generel mangel på overensstemmelse med mange forskellige celletyper, der kontinuerligt grupperes under EPC’er11. I modsætning hertil er BOEC’er blevet anerkendt for deres rolle i vaskulær reparation, sundhed og sygdom og celleterapi. Yderligere undersøgelse og terapeutisk anvendelse af disse celler vil stole på protokoller for konsekvent at udlede disse celletyper fra cirkulerende stamceller.

Primære celler såsom BOEC’er kan bruges som surrogat for at opnå stærkt proliferative modne endotelceller6. BOEC’er adskiller sig fænotypisk fra tidlige EPC’er og udviser typiske endotelegenskaber såsom brostensmorfologi og ekspression af adhærenskryds og caveolae12. Genprofilering af Hebbel et al.13,14,15 viste, at BOEC’er eller ECFC’er er de sande endotelceller, da de fremmer mikrovaskulær og dannelse af store kar. Således kan BOEC’er bruges som et værktøj til at evaluere patofysiologiske processer og genetisk variation16. De betragtes også som en fremragende cellekilde til celleterapi til vaskulær regenerering17. Derfor er en standardiseret protokol til konsekvent at udlede disse stærkt proliferative celler afgørende.

Mens BOEC’er giver et effektivt værktøj til at studere menneskelig patofysiologisk og genetisk variation, kan en mere homogen kilde til BOEC’er give mere robuste og pålidelige eksperimentelle og terapeutiske resultater. Overlegen homogenitet kan opnås ved at anvende xenogene cellekilder fra genetisk lignende dyr, der er opdrættet under lignende forhold18. Mens xenogene cellekilder er tilbøjelige til at fremkalde et værtsimmunrespons, udvikles immunmodulationsstrategier med det formål at generere immunkompatible dyr og animalske produkter, herunder celler. Især svin er en rigelig kilde til perifert blod og bruges almindeligvis til at studere medicinsk udstyr og andre terapier på grund af anatomiske og fysiologiske ligheder med mennesker. Derfor forfiner denne undersøgelse protokollen til isolering og udvidelse af stærkt proliferative BOEC’er fra perifert blod fra svin. Protokollen beskrevet nedenfor er en ligetil og pålidelig metode til at opnå et stort antal BOEC’er fra et relativt lille volumen blod. Kulturerne kan udvides gennem flere passager for at generere millioner af celler fra en enkelt blodprøve.

Protocol

Alle dyreforsøg blev godkendt af de respektive Institutional Animal Care and Use Committees (IACUC) ved Medical College of Wisconsin og Mayo Clinic. BEMÆRK: I denne undersøgelse blev Yorkshire/Landrace/Duroc krydsende tamsvin (Sus domesticus), han og hun, 40-80 kg, 3-6 måneder gamle, anvendt. 1. Indsamling af perifert blod fra svin Forbered materialer.Heparinopløsningen fortyndes til 100 E/ml i sterilt saltvand. …

Representative Results

Morfologi af de dyrkede celler blev observeret fra kulturens start, indtil BOEC-kolonier blev observeret (figur 1). En mindre population af vedhængende celler begyndte at binde sig til kulturskålene og vokse, mens ikke-klæbende celler blev fjernet med ændringer i dyrkningsmediet (figur 1B). Kolonier optrådte først på dag 6 som en samling endotellignende celler, der spredte sig radialt udad fra et centralt punkt (figur 1D). Ef…

Discussion

BOEC’er er et kraftfuldt værktøj, der kan bruges i forskellige videnskabelige og terapeutiske tilgange 7,8,16. BOEC’er er blevet brugt til at analysere EC-genekspression for at belyse de nøglefaktorer, der er ansvarlige for udviklingen af vaskulære sygdomme og kræft 5,19,20,21. BOEC’er er også bl…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Forfatterne ønsker at anerkende finansiering fra NIH / NHLBI R00 HL129068.

Materials

19 G needle Covidien 1188818112
50 mL conical tubes Corning 352098
6 well plate BD Falcon 353046
60 mL syringes Covidien 8881560125
Ammonium chloride solution (0.8%) Stemcell Technologies 07850
Antibiotic/antimycotic solution (100x) Gibco 15240-062
Centrifuge Thermo Scientific 75-253-839
EGM-2 culture medium Lonza Walkersville CC-3162
Extension tube Hanna Pharmaceutical Supply Co. 03382C6227
Fetal bovine serum (FBS) Atlas Biologicals F-0500-A
Ficoll-Paque 1077 Cytiva 17144003 Density gradient solution
Heparin sodium injection (1,000 units/mL) Pfizer 00069-0058-01
Human plasma fibronectin Gibco 33016-015
Ice N/A N/A
Phosphate-buffered saline (PBS) Gibco 10010-023
Pipette set Eppendorf 2231300004
Sterile water Gibco 15230-162
Thin pipette Celltreat Scientific 229280

References

  1. Aird, W. C. Phenotypic heterogeneity of the endothelium: II. Representative vascular beds. Circulation Research. 100 (2), 174-190 (2007).
  2. Aird, W. C. Phenotypic heterogeneity of the endothelium: I. Structure, function, and mechanisms. Circulation Research. 100 (2), 158-173 (2007).
  3. Pober, J. S., Tellides, G. Participation of blood vessel cells in human adaptive immune responses. Trends in Immunology. 33 (1), 49-57 (2012).
  4. Navarro, S., et al. The endothelial cell protein C receptor: its role in thrombosis. Thrombosis Research. 128 (5), 410-416 (2011).
  5. Hasstedt, S. J., et al. Cell adhesion molecule 1: a novel risk factor for venous thrombosis. Blood. 114 (14), 3084-3091 (2009).
  6. Ormiston, M. L., et al. Generation and culture of blood outgrowth endothelial cells from human peripheral blood. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (106), e53384 (2015).
  7. Lin, Y., Weisdorf, D. J., Solovey, A., Hebbel, R. P. Origins of circulating endothelial cells and endothelial outgrowth from blood. Journal of Clinical Investigation. 105 (1), 71-77 (2000).
  8. Martin-Ramirez, J., Hofman, M., Biggelaar, M. V. D., Hebbel, R. P., Voorberg, J. Establishment of outgrowth endothelial cells from peripheral blood. Nature Protocols. 7 (9), 1709-1715 (2012).
  9. Gulati, R., et al. Diverse origin and function of cells with endothelial phenotype obtained from adult human blood. Circulation Research. 93 (11), 1023-1025 (2003).
  10. Hebbel, R. P. Blood endothelial cells: utility from ambiguity. The Journal of Clinical Investigation. 127 (5), 1613-1615 (2017).
  11. Medina, R. J., et al. Endothelial progenitors: A consensus statement on nomenclature. Stem Cells Translational Medicine. 6 (5), 1316-1320 (2018).
  12. Medina, R. J., et al. Molecular analysis of endothelial progenitor cell (EPC) subtypes reveals two distinct cell populations with different identities. BMC Medical Genomics. 3, 18 (2010).
  13. Jiang, A., Pan, W., Milbauer, L. C., Shyr, Y., Hebbel, R. P. A practical question based on cross-platform microarray data normalization: are BOEC more like large vessel or microvascular endothelial cells or neither of them. Journal of Bioinformatics and Computational Biology. 5 (4), 875-893 (2007).
  14. Pan, W., Shen, X., Jiang, A., Hebbel, R. P. Semi-supervised learning via penalized mixture model with application to microarray sample classification. Bioinformatics. 22 (19), 2388-2395 (2006).
  15. Hirschi, K. K., Ingram, D. A., Yoder, M. C. Assessing identity, phenotype, and fate of endothelial progenitor cells. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 28 (9), 1584-1595 (2008).
  16. Fernandez, L. A., et al. Blood outgrowth endothelial cells from hereditary haemorrhagic telangiectasia patients reveal abnormalities compatible with vascular lesions. Cardiovascular Research. 68 (2), 235-248 (2005).
  17. Critser, P. J., Yoder, M. C. Endothelial colony-forming cell role in neoangiogenesis and tissue repair. Current Opinion in Organ Transplantation. 15 (1), 68-72 (2010).
  18. Zhao, Y., et al. Isolation and culture of primary aortic endothelial cells from miniature pigs. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e59673 (2019).
  19. Chang Milbauer, L., et al. Genetic endothelial systems biology of sickle stroke risk. Blood. 111 (7), 3872-3879 (2008).
  20. Wei, P., et al. Differential endothelial cell gene expression by African Americans versusCaucasian Americans: a possible contribution to health disparity in vascular disease and cancer. BMC Medicine. 9 (1), 2 (2011).
  21. Hasstedt, S. J., et al. Cell adhesion molecule 1: a novel risk factor for venous thrombosis. Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 114 (14), 3084-3091 (2009).
  22. Milbauer, L. C., et al. Blood outgrowth endothelial cell migration and trapping in vivo: a window into gene therapy. Translational Research. 153 (4), 179-189 (2009).
  23. Matsui, H., et al. Ex vivo gene therapy for hemophilia A that enhances safe delivery and sustained in vivo factor VIII expression from lentivirally engineered endothelial progenitors. Stem Cells. 25 (10), 2660-2669 (2007).
  24. De Meyer, S. F., et al. Phenotypic correction of von Willebrand disease type 3 blood-derived endothelial cells with lentiviral vectors expressing von Willebrand factor. Blood. 107 (12), 4728-4736 (2006).
  25. Bodempudi, V., et al. Blood outgrowth endothelial cell-based systemic delivery of antiangiogenic gene therapy for solid tumors. Cancer Gene Therapy. 17 (12), 855-863 (2010).
  26. Dudek, A. Z., et al. Systemic inhibition of tumour angiogenesis by endothelial cell-based gene therapy. British Journal of Cancer. 97 (4), 513-522 (2007).
  27. Moubarik, C., et al. Transplanted late outgrowth endothelial progenitor cells as cell therapy product for stroke. Stem Cell Reviews and Reports. 7 (1), 208-220 (2011).
  28. Pislaru Sorin, V., et al. Magnetic forces enable rapid endothelialization of synthetic vascular grafts. Circulation. 114 (1), 314 (2006).
  29. Satyananda, V., et al. New concepts of immune modulation in xenotransplantation. Transplantation. 96 (11), 937-945 (2013).
  30. Klymiuk, N., Aigner, B., Brem, G., Wolf, E. Genetic modification of pigs as organ donors for xenotransplantation. Molecular Reproduction and Development. 77 (3), 209-221 (2010).
  31. Ryczek, N., Hryhorowicz, M., Zeyland, J., Lipiński, D., Słomski, R. CRISPR/Cas technology in pig-to-human xenotransplantation research. International Journal of Molecular Sciences. 22 (6), 3196 (2021).
  32. Cooper, D. K., Koren, E., Oriol, R. Genetically engineered pigs. Lancet. 342 (8872), 682-683 (1993).
  33. Cozzi, E., White, D. J. G. The generation of transgenic pigs as potential organ donors for humans. Nature Medicine. 1 (9), 964-966 (1995).
  34. Phelps, C. J., et al. Production of alpha 1,3-galactosyltransferase-deficient pigs. Science. 299 (5605), 411-414 (2003).

Play Video

Cite This Article
Shradhanjali, A., Uthamaraj, S., Dragomir-Daescu, D., Gulati, R., Sandhu, G. S., Tefft, B. J. Characterization of Blood Outgrowth Endothelial Cells (BOEC) from Porcine Peripheral Blood. J. Vis. Exp. (179), e63285, doi:10.3791/63285 (2022).

View Video