Endotelet er en dynamisk integreret struktur, der spiller en vigtig rolle i mange fysiologiske funktioner såsom angiogenese, hæmostase, inflammation og homeostase. Endotelet spiller også en vigtig rolle i patofysiologier som aterosklerose, hypertension og diabetes. Endotelceller danner den indre foring af blod og lymfekar og viser heterogenitet i struktur og funktion. Forskellige grupper har evalueret funktionaliteten af endotelceller afledt af humant perifert blod med fokus på endotelstamceller afledt af hæmatopoietiske stamceller eller modne blodudvækstendotelceller (eller endotelkolonidannende celler). Disse celler giver en autolog ressource til terapi og sygdomsmodellering. Xenogene celler kan udgøre en alternativ kilde til behandling på grund af deres tilgængelighed og homogenitet opnået ved anvendelse af genetisk lignende dyr opdrættet under lignende forhold. Derfor er der fremlagt en robust protokol til isolering og udvidelse af stærkt proliferativ blodudvækstendotelceller fra perifert blod fra svin. Disse celler kan bruges til adskillige applikationer såsom kardiovaskulær vævsteknik, celleterapi, sygdomsmodellering, lægemiddelscreening, undersøgelse af endotelcellebiologi og in vitro-cokulturer for at undersøge inflammatoriske og koagulationsresponser i xenotransplantation.
Endotelet er en meget kompleks, dynamisk struktur og en vital bestanddel af vaskulærvæggen. Det linjer den indre overflade af blodkar for at give en fysisk grænseflade mellem cirkulerende blod og omgivende væv. Denne heterogene struktur er kendt for at udføre forskellige funktioner såsom angiogenese, inflammation, vasoregulering og hæmostase 1,2,3,4. Humane navlestrengendototelceller er en bredt undersøgt celletype for at vurdere funktionaliteten af endotelceller. Den patientspecifikke batchvariabilitet, inkonsekvente fænotype og minimale opdelingseffektivitet antyder imidlertid et behov for at bestemme en cellekilde, der kan forbedre alle disse funktioner5.
Det kan være teknisk udfordrende at opnå en homogen population af primære endotelceller, og primære endotelceller har ikke høj proliferativ kapacitet6. For at studere vaskulær regenerering og evaluere patofysiologiske processer har forskellige grupper derfor forsøgt at opnå og vurdere forskellige typer endotelceller afledt af perifert blod, fx endotelstamceller (EPC’er) eller blodudvækstendotelceller (BOEC’er)6,7,8,9 . De spindelformede tidlige EPC’er stammer fra hæmatopoietiske stamceller (HSC’er) og har begrænset vækststyrke og begrænset angiogen evne til at producere modne endotelceller. Desuden ligner de meget inflammatoriske monocytter. Derudover er deres evne til yderligere at differentiere sig til funktionelle, prolifererende, modne endotelceller stadig diskutabel 6,7,9,10. Den kontinuerlige dyrkning af mononukleære celler i perifert blod (PBMC’er) kan give anledning til en sekundær population af celler kendt som EPC’er med sen udvækst, BOEC’er eller endotelkolonidannende celler (ECFC’er)6,7,9,10. Medina et al. anerkendte i 2018 begrænsningerne ved EPC’er, tvetydigheden i deres nomenklatur sammen med en generel mangel på overensstemmelse med mange forskellige celletyper, der kontinuerligt grupperes under EPC’er11. I modsætning hertil er BOEC’er blevet anerkendt for deres rolle i vaskulær reparation, sundhed og sygdom og celleterapi. Yderligere undersøgelse og terapeutisk anvendelse af disse celler vil stole på protokoller for konsekvent at udlede disse celletyper fra cirkulerende stamceller.
Primære celler såsom BOEC’er kan bruges som surrogat for at opnå stærkt proliferative modne endotelceller6. BOEC’er adskiller sig fænotypisk fra tidlige EPC’er og udviser typiske endotelegenskaber såsom brostensmorfologi og ekspression af adhærenskryds og caveolae12. Genprofilering af Hebbel et al.13,14,15 viste, at BOEC’er eller ECFC’er er de sande endotelceller, da de fremmer mikrovaskulær og dannelse af store kar. Således kan BOEC’er bruges som et værktøj til at evaluere patofysiologiske processer og genetisk variation16. De betragtes også som en fremragende cellekilde til celleterapi til vaskulær regenerering17. Derfor er en standardiseret protokol til konsekvent at udlede disse stærkt proliferative celler afgørende.
Mens BOEC’er giver et effektivt værktøj til at studere menneskelig patofysiologisk og genetisk variation, kan en mere homogen kilde til BOEC’er give mere robuste og pålidelige eksperimentelle og terapeutiske resultater. Overlegen homogenitet kan opnås ved at anvende xenogene cellekilder fra genetisk lignende dyr, der er opdrættet under lignende forhold18. Mens xenogene cellekilder er tilbøjelige til at fremkalde et værtsimmunrespons, udvikles immunmodulationsstrategier med det formål at generere immunkompatible dyr og animalske produkter, herunder celler. Især svin er en rigelig kilde til perifert blod og bruges almindeligvis til at studere medicinsk udstyr og andre terapier på grund af anatomiske og fysiologiske ligheder med mennesker. Derfor forfiner denne undersøgelse protokollen til isolering og udvidelse af stærkt proliferative BOEC’er fra perifert blod fra svin. Protokollen beskrevet nedenfor er en ligetil og pålidelig metode til at opnå et stort antal BOEC’er fra et relativt lille volumen blod. Kulturerne kan udvides gennem flere passager for at generere millioner af celler fra en enkelt blodprøve.
BOEC’er er et kraftfuldt værktøj, der kan bruges i forskellige videnskabelige og terapeutiske tilgange 7,8,16. BOEC’er er blevet brugt til at analysere EC-genekspression for at belyse de nøglefaktorer, der er ansvarlige for udviklingen af vaskulære sygdomme og kræft 5,19,20,21. BOEC’er er også bl…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne ønsker at anerkende finansiering fra NIH / NHLBI R00 HL129068.
19 G needle | Covidien | 1188818112 | |
50 mL conical tubes | Corning | 352098 | |
6 well plate | BD Falcon | 353046 | |
60 mL syringes | Covidien | 8881560125 | |
Ammonium chloride solution (0.8%) | Stemcell Technologies | 07850 | |
Antibiotic/antimycotic solution (100x) | Gibco | 15240-062 | |
Centrifuge | Thermo Scientific | 75-253-839 | |
EGM-2 culture medium | Lonza Walkersville | CC-3162 | |
Extension tube | Hanna Pharmaceutical Supply Co. | 03382C6227 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Atlas Biologicals | F-0500-A | |
Ficoll-Paque 1077 | Cytiva | 17144003 | Density gradient solution |
Heparin sodium injection (1,000 units/mL) | Pfizer | 00069-0058-01 | |
Human plasma fibronectin | Gibco | 33016-015 | |
Ice | N/A | N/A | |
Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-023 | |
Pipette set | Eppendorf | 2231300004 | |
Sterile water | Gibco | 15230-162 | |
Thin pipette | Celltreat Scientific | 229280 |