Abstract
Het endotheel is een dynamische geïntegreerde structuur die een belangrijke rol speelt in veel fysiologische functies zoals angiogenese, hemostase, ontsteking en homeostase. Het endotheel speelt ook een belangrijke rol in pathofysiologieën zoals atherosclerose, hypertensie en diabetes. Endotheelcellen vormen de binnenbekleding van bloed- en lymfevaten en vertonen heterogeniteit in structuur en functie. Verschillende groepen hebben de functionaliteit van endotheelcellen afgeleid van menselijk perifeer bloed geëvalueerd met een focus op endotheelvoorlopercellen afgeleid van hematopoëtische stamcellen of volwassen bloeduitgroei endotheelcellen (of endotheelkolonievormende cellen). Deze cellen bieden een autologe bron voor therapieën en ziektemodellering. Xenogene cellen kunnen een alternatieve bron van therapieën bieden vanwege hun beschikbaarheid en homogeniteit die wordt bereikt door genetisch vergelijkbare dieren te gebruiken die in vergelijkbare omstandigheden zijn grootgebracht. Daarom is een robuust protocol gepresenteerd voor de isolatie en uitbreiding van zeer proliferatieve bloeduitgroei endotheelcellen uit perifeer bloed van varkens. Deze cellen kunnen worden gebruikt voor tal van toepassingen, zoals cardiovasculaire weefselmanipulatie, celtherapie, ziektemodellering, geneesmiddelenscreening, het bestuderen van endotheelcelbiologie en in vitro coculturen om ontstekings- en stollingsreacties bij xenotransplantatie te onderzoeken.
Introduction
Het endotheel is een zeer complexe, dynamische structuur en een essentieel onderdeel van de vaatwand. Het bekleedt het binnenoppervlak van bloedvaten om een fysieke interface te bieden tussen circulerend bloed en omliggende weefsels. Van deze heterogene structuur is bekend dat ze verschillende functies vervult, zoals angiogenese, ontsteking, vasoregulatie en hemostase 1,2,3,4. Menselijke navelstreng-endotheelcellen zijn een veel bestudeerd celtype om de functionaliteit van endotheelcellen te beoordelen. De patiëntspecifieke batchvariabiliteit, het inconsistente fenotype en de minimale splitsingsefficiëntie suggereren echter de noodzaak om een celbron te bepalen die al deze kenmerken zou kunnen verbeteren5.
Het verkrijgen van een homogene populatie van primaire endotheelcellen kan technisch een uitdaging zijn en primaire endotheelcellen bezitten geen hoge proliferatieve capaciteit6. Om vasculaire regeneratie te bestuderen en pathofysiologische processen te evalueren, hebben verschillende groepen daarom geprobeerd verschillende soorten endotheelcellen afgeleid van perifeer bloed te verkrijgen en te beoordelen, bijvoorbeeld endotheelvoorlopercellen (EPC's) of endotheelcellen met bloeduitgroei (BOECs)6,7,8,9 . De spilvormige vroege EPC's zijn afkomstig van hematopoëtische stamcellen (HSC's) en hebben een beperkte groeikracht en een beperkt angiogeen vermogen om volwassen endotheelcellen te produceren. Bovendien lijken ze sterk op inflammatoire monocyten. Bovendien is hun vermogen om verder te differentiëren in functionele, prolifererende, volwassen endotheelcellen nog steeds discutabel 6,7,9,10. De continue kweek van perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC's) kan aanleiding geven tot een secundaire populatie van cellen die bekend staat als late-outgrowth EPC's, BOEC's of endotheelkolonievormende cellen (ECFC's)6,7,9,10. Medina et al. erkenden in 2018 de beperkingen van EPC's, de ambiguïteit van hun nomenclatuur, samen met een algemeen gebrek aan overeenstemming met veel verschillende celtypen die continu zijn gegroepeerd onder EPC's11. BOEC's daarentegen zijn erkend voor hun rol in vasculair herstel, gezondheid en ziekte, en celtherapie. Verdere studie en therapeutisch gebruik van deze cellen zal afhankelijk zijn van protocollen om deze celtypen consequent af te leiden uit circulerende voorlopercellen.
Primaire cellen zoals BOEC's kunnen worden gebruikt als surrogaat om zeer proliferatieve volwassen endotheelcellente verkrijgen 6. BOEC's zijn fenotypisch verschillend van vroege EPC's en vertonen typische endotheelkenmerken zoals kasseimorfologie en expressie van adherens junctions en caveolae12. Genprofilering door Hebbel et al.13,14,15 vond dat BOECs of ECFC's de echte endotheelcellen zijn omdat ze microvasculaire en grote vatvorming bevorderen. BOEC's kunnen dus worden gebruikt als een hulpmiddel om pathofysiologische processen en genetische variatie te evalueren16. Ze worden ook beschouwd als een uitstekende celbron voor celtherapie voor vasculaire regeneratie17. Daarom is een gestandaardiseerd protocol om deze zeer proliferatieve cellen consequent af te leiden essentieel.
Hoewel BOEC's een krachtig instrument bieden voor het bestuderen van pathofysiologische en genetische variatie bij de mens, kan een meer homogene bron van BOEC's robuustere en betrouwbaardere experimentele en therapeutische resultaten opleveren. Superieure homogeniteit kan worden bereikt door gebruik te maken van xenogene celbronnen die zijn afgeleid van genetisch vergelijkbare dieren die in vergelijkbare omstandigheden zijn grootgebracht18. Terwijl xenogene celbronnen gevoelig zijn voor het opwekken van een immuunrespons van de gastheer, worden immunomodulatiestrategieën ontwikkeld met als doel immunocompatibele dieren en dierlijke producten, waaronder cellen, te genereren. Varkens, in het bijzonder, zijn een overvloedige bron van perifeer bloed en worden vaak gebruikt om medische hulpmiddelen en andere therapieën te bestuderen vanwege anatomische en fysiologische overeenkomsten met mensen. Daarom verfijnt deze studie het protocol voor de isolatie en uitbreiding van zeer proliferatieve BOEC's uit perifeer bloed van varkens. Het hieronder beschreven protocol is een eenvoudige en betrouwbare methode om een groot aantal BOEC's te verkrijgen uit een relatief klein volume bloed. De culturen kunnen via verschillende passages worden uitgebreid om miljoenen cellen uit één bloedmonster te genereren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierstudies werden goedgekeurd door de respectievelijke Institutional Animal Care and Use Committees (IACUC) aan het Medical College of Wisconsin en Mayo Clinic.
OPMERKING: In deze studie werden Yorkshire/Landrace/Duroc gedomesticeerde varkens (Sus domesticus), mannelijk en vrouwelijk, 40-80 kg, 3-6 maanden oud, gebruikt.
1. Inzameling van perifeer bloed van varkens
- Bereid materialen voor.
- Verdun heparineoplossing tot 100 E/ml in steriele zoutoplossing.
- Voeg 3-4 ml heparine-oplossing toe aan elk van de twee conische buisjes van 50 ml en twee spuiten van 60 ml.
- Zuig onverdunde heparine-oplossing (1.000 E / ml) in een verlengbuis.
- Sluit een naald van 19 G aan op het ene uiteinde van de met heparine gevulde verlengbuis en een heparinehoudende spuit van 60 ml op het andere uiteinde.
- Verdoof een varken volgens institutioneel beleid
- Dien een IM-injectie van atropine (0,05 mg / kg), tiletamine / zolazepam (2-5 mg / kg) en xylazine (2 mg / kg) toe om anesthesie te induceren.
OPMERKING: adequate anesthesie wordt bereikt zodra het dier bewusteloos is en de mandibulaire spieren niet-stijf zijn. - Leg het dier in rugligging en leg opgerolde handdoeken aan beide zijden om stabiliteit te bieden.
- Breng een oogheelkundige zalf aan op de ogen om uitdroging te voorkomen terwijl u onder narcose bent.
- Bied thermische ondersteuning tijdens anesthesie, inclusief dekens, verwarmingspads en / of verwarmde proceduretafel.
- Dien een IM-injectie van atropine (0,05 mg / kg), tiletamine / zolazepam (2-5 mg / kg) en xylazine (2 mg / kg) toe om anesthesie te induceren.
- Reinig het femorale liesgebied met betadine scruboplossing.
- Prik de dijbeenader of slagader door met de naald van 19 G en trek langzaam (~ 1-2 ml / s) 50 ml bloed in de spuit.
OPMERKING: Te snel tekenen kan de cellen beschadigen. - Laat de naald op zijn plaats, knik onmiddellijk de verlengbuis en koppel de spuit van 60 ml los
- Breng het bloed langzaam over naar een heparine-bevattende 50 ml conische buis.
- Sluit de conische buis van 50 ml stevig af, keer een paar keer voorzichtig om om te mengen en plaats op ijs.
- Sluit de resterende heparine-bevattende spuit van 60 ml aan op de verlengbuis, maak de verlengbuis los en trek langzaam nog eens 50 ml bloed in de spuit.
- Verwijder onmiddellijk de naald uit de slagader of ader en trek langzaam het resterende bloed uit de verlengbuis in de spuit.
- Koppel de spuit van 60 ml los van de verlengbuis en breng het bloed langzaam over naar de resterende heparinehoudende conische buis van 50 ml.
- Sluit de conische buis van 50 ml stevig af, keer een paar keer voorzichtig om om te mengen en plaats op ijs.
- Oefen hemostase uit op het femorale liesgebied van het varken.
- Herstel het varken volgens het institutionele beleid. Houd het dier voortdurend in de gaten totdat het weer voldoende bewustzijn heeft om sternale lighouding te behouden en terug te keren naar de reguliere huisvesting / kennel.
2. Isolatie van mononucleaire cellen
- Verdun het bloed 1:1 met fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) in vier conische buisjes van 50 ml.
OPMERKING: Dit werk moet worden uitgevoerd in een celkweekkap met behulp van een aseptische techniek om besmetting van de celcultuur te voorkomen. - Voeg 25 ml kant-en-klare dichtheidsgradiëntoplossing op kamertemperatuur toe aan acht conische buizen van 50 ml.
- Pipetteer zeer langzaam 25 ml bloed/zoutoplossing langs de binnenkant van elke dichtheidsgradiëntoplossing met een conische buis van 50 ml door de buis in een scherpe hoek ten opzichte van de pipetpunt te houden.
OPMERKING: De bloedoplossing moet voorzichtig bovenop de dichtheidsgradiëntoplossing worden gelegd en een goed gedefinieerde interface behouden. - Centrifugeer de buizen gedurende 30 minuten op 560 x g en kamertemperatuur (RT).
OPMERKING: Voor het beste resultaat schakelt u indien mogelijk de centrifugerem uit. - Gebruik een dunne pipet om de buffy coat (troebele laag mononucleaire cellen boven de dichtheidsgradiëntoplossing en onder het heldere plasma) voorzichtig uit elke buis te verzamelen en gelijkmatig te verdelen in twee nieuwe conische buizen van 50 ml. Gooi de dichtheidsgradiëntoplossing met buizen weg.
OPMERKING: Verzamel zoveel mogelijk van de buffy coat terwijl je zo min mogelijk van de dichtheidsgradiëntoplossing en het plasma verzamelt.
3. Wassen en plateren van cellen
- Bestrijk een 6-well plaat met fibronectine.
- Maak een stamoplossing van menselijk plasmafibronectine door het te verdunnen tot 1 mg / ml in steriel water. Bewaar de aliquots bij -20 °C.
- Maak 3,6 ml van een werkoplossing van fibronectine door 600 μL fibronectine-stamoplossing te verdunnen in 3 ml PBS.
- Breng 600 μL van de fibronectine-werkoplossing over in elke put van een 6-putplaat en schommel zachtjes tot een gelijkmatige laag.
- Wacht 30 minuten tot de fibronectine de putjes bedekt en zuig de oplossing voorzichtig uit elk putje.
- Terwijl u wacht tot de fibronectine is gecoacht, wast u de mononucleaire cellen
- Vul de buizen bij met maximaal 45 ml PBS
- Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 560 x g en 4 °C met lage rem. Zuig het supernatant uit beide buizen.
- Resuspendeer elke celpellet in 25 ml PBS.
- Herhaal dit om een tweede keer te wassen.
- Resuspendeer elke celpellet in 5 ml PBS en voeg 15 ml 0,8% ammoniumchlorideoplossing toe aan elke buis.
OPMERKING: Deze stap is om de resterende rode bloedcellen te lyseren. - Incubeer gedurende 10 minuten op ijs.
- Was de cellen zoals voorheen door de buizen bij te vullen met PBS en gedurende 5 minuten te centrifugeren bij 560 x g en 4 °C met lage rem. Zuig het supernatant uit beide buizen.
- Resuspendeer elke celkorrel in 25 ml PBS en herhaal om een tweede keer te wassen.
- Resuspendeer elke celpellet in 6 ml EGM-2-kweekmedium aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1x antibioticum / antimycotische oplossing met 10.000 U / ml penicilline, 10 mg / ml streptomycine en 25 μg / ml amfotericine.
OPMERKING: EGM-2 kweekmedium bestaat uit EBM-2 kweekmedium aangevuld met 200 μL hydrocortison, 2 ml humane fibroblastgroeifactor (hFGF-B), 500 μL vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF), 500 μL recombinant analoog van insuline-achtige groeifactor (R3 IGF-1), 500 μL ascorbinezuur, 500 μL humane epidermale groeifactor (hEGF), 500 μL gentamicine/amfotericine en 500 μL heparine per 500 ml. - Breng voorzichtig 2 ml van de celsuspensie over naar elk putje van de met fibronectine gecoate 6-putplaat en schommel zachtjes tot een gelijkmatige laag.
OPMERKING: Het doel is om zoveel mogelijk cellen te zaaien om het aantal endotheelkolonies dat zich zal vormen te maximaliseren.
4. Celkweek
- Incubeer de cellen bij 37 °C, 5% CO2 en 100% vochtigheid.
- Voeg de volgende dag voorzichtig 1 ml vers kweekmedium toe aan elk putje.
OPMERKING: het is belangrijk om voorzichtig te zijn om cellen die losjes aan de fibronectinecoating hechten niet te verstoren. - Voer de volgende dag een halve kweekmediumverandering uit door voorzichtig 1,5 ml kweekmedium uit elke put te zuigen en te vervangen door 1,5 ml vers kweekmedium.
- Voer op elk van de volgende 5 dagen voorzichtig een volledige verandering van het kweekmedium uit naar elke put (2 ml vers kweekmedium per put).
- Verander daarna het kweekmedium drie keer per week voorzichtig.
- Visualiseer de celculturen regelmatig onder low power (4x objectief) lichtmicroscopie.
OPMERKING: Aanhangende bloeduitgroei endotheelcel (BOEC) kolonies zullen 7-10 dagen na het plateren in de putten verschijnen. Niet-adherente celtypen zullen worden weggegooid met mediumveranderingen en andere adherente celtypen zullen geleidelijk verdwijnen naarmate de BOEC-kolonies groeien. - Passeer de BOEC's in een met fibronectine gecoate T-75-kolf wanneer ~ 70% -80% samenvloeit en blijf drie keer per week van cultuurmedium veranderen.
OPMERKING: De zaaidichtheid kan worden geregeld door kolonies in plaats daarvan in een T25-kolf te plaatsen. Volgende passages vereisen geen fibronectine-coating en veranderingen in het kweekmedium kunnen worden teruggebracht tot twee keer per week. - Cellen uit de passages 1-3 kunnen worden gebruikt voor experimenten of worden overgebracht naar een vriesmedium en worden opgeslagen in vloeibare stikstof voor toekomstig gebruik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De morfologie van de gekweekte cellen werd waargenomen vanaf het begin van de kweek totdat BOEC-kolonies werden waargenomen (figuur 1). Een kleinere populatie van aanhangende cellen begon zich aan de kweekschalen te hechten en te groeien, terwijl niet-hechtende cellen werden verwijderd met veranderingen in het kweekmedium (figuur 1B). Kolonies verschenen voor het eerst op dag 6 als een verzameling endotheelachtige cellen die zich radiaal naar buiten prolifereerden vanuit een centraal punt (figuur 1D). Naarmate de cultuur vorderde, werden celkolonies dichter en vertoonden ze een geplaveide morfologie vergelijkbaar met volwassen endotheelcellen (figuur 1F). De typische endotheelkasachtige morfologie biedt een eenvoudige voorlopige identificatie van BOEC's met behulp van een lichtmicroscoop.
Endotheelcelkolonies zijn meestal klaar om te passeren na 10-14 dagen cultuur. Op dit moment levert de 6-well plaat meestal ~ 1 miljoen cellen op met een procent levensvatbaarheid van 93% -98%. Tijdens de eerste passage zullen endotheelcellen uitzetten tot ~ 6-10 miljoen cellen in een T75-kolf.
Om de morfogenese van BOEC's te beoordelen, werd de keldermembraanmatrix (bijv. Matrigel) op 15 putangiogeneseplaten bij 10 μL/put geplateerd en gedurende 30 minuten bij 37 °C geïncubeerd om polymerisatie mogelijk te maken. Passage 2 cellen werden gezaaid op keldermembraan matrix-gecoate platen en afgebeeld op 14 uur en 24 uur tijdstippen. Een dichtheid van ongeveer 3.500 cellen per put was in staat om een netwerk en buisachtige structuren te vormen. Buisvorming werd opgemerkt binnen 14 uur voor serumvrij medium (BAVA-2 met supplementen behalve FBS) en binnen 24 uur voor volledig groeimedium (BAVA-2 met supplementen inclusief FBS). Het toevoegen van FBS kan de endotheelcelspecifieke groeifactoren (bijv. VEGF) hebben verdund en andere signaalfactoren hebben geïntroduceerd die resulteren in de vertraging van het buisvormingsproces. 2D-fasecontrastmicroscopie werd gebruikt om buisvorming in serumvrij medium (figuur 2A,B) en volledig groeimedium (figuur 2C,D) in beeld te brengen. Cellen in beide mediaomstandigheden ondergingen morfologische differentiatie en organiseerden zich snel in uitgebreide netwerken van capillaire buisachtige structuren. Deze structuren waren samengesteld uit georganiseerde cellulaire koorden die leken op in vivo capillaire netwerken. Bovendien illustreren micrografieën met een vergroting van 20x de complexe meercellige organisatie van endotheelcellen en hun morfologische differentiatie in detail. Er werden geen morfologische verschillen waargenomen tussen de mediacondities. Het uitgebreide netwerk van capillaire buisachtige structuren suggereert sterk de differentiatie van gekweekte cellen in volwassen en functionele endotheelcellen.
BOEC's werden verder gekenmerkt door de expressie van volwassen endotheelcelmarker CD31 of bloedplaatjes endotheliale celadhesiemolecuul-1 (PECAM1) (figuur 3A,B). BOEC's vertoonden een uniforme expressie van CD31. Bovendien bevestigde flowcytometrieanalyse de afwezigheid van EPC's omdat de cellen negatief gekleurd waren voor monocytenmarker CD14 in vergelijking met de positieve controlegroep van PBMC's (figuur 3C, D).
Figuur 1: Fenotype lichtmicroscopie beelden. De lichtmicroscopiebeelden van gekweekte BOEC's waargenomen bij 10x vergroting op (A) dag 0, (B) dag 2, (C) dag 4, (D) dag 6, (E) dag 8 en (F) na de eerste passage. Schaalstaven: 200 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Morfologische differentiatie en organisatie van passage 2 BOEC's. Morfologische differentiatie en organisatie van passage 2 BOEC's in capillaire buisachtige structuren werd opgemerkt in de keldermembraanmatrix binnen 14 uur voor serumvrij medium en binnen 24 uur voor volledig groeimedium. (A) Serumvrij medium bij 4x, (B) Serumvrij medium bij 20x, (C) Volledig groeimedium bij 4x en (D) Volledig groeimedium bij 20x. Schaalstaven: 200 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Karakterisering van BOEC's met CD31 en CD14. (A) Passage 2-3 BOEC's werden gekleurd voor PECAM1 met behulp van anti-CD31-FITC-antilichamen gezien in groen en (B) overeenkomstige fasecontrastmicroscopiebeelden. Cellen werden gekleurd in suspensie en de suspensie werd afgebeeld op een microscoopglaasje. Schaalstaven: 200 μm. (C) Flowcytometrie-analyse van BOEC's met CD14-AF700-antilichaam in vergelijking met (D) positieve controle perifere bloedmononucleaire cellen (PBMC's). Positieve CD14-kleuring weergegeven in blauwe en niet-gekleurde cellen weergegeven in rood. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
BOEC's zijn een krachtig instrument dat kan worden gebruikt in verschillende wetenschappelijke en therapeutische benaderingen 7,8,16. BOEC's zijn gebruikt om EC-genexpressie te analyseren om de belangrijkste factoren op te helderen die verantwoordelijk zijn voor de ontwikkeling van vaatziekten en kanker 5,19,20,21. BOEC's zijn ook gebruikt in therapeutische toepassingen zoals vasculaire regeneratie en genafgifte22,23,24. Genetisch gemodificeerde BOEC's staan bekend om hun antiangiogene tumortherapeutische vermogen25,26. Verder maakt het angiogene potentieel van BOECs ze uitstekende kandidaten voor cellulaire therapieën gericht op vascularisatie en neovascularisatie17,27. Hoewel verschillende studies beschrijven hoe BOEC's uit menselijk perifeer bloed kunnen worden verkregen 6,7,8,9, suggereert de variabiliteit van menselijke celbronnen als gevolg van onderliggende pathofysiologische en genetische variatie een kritieke noodzaak om BOEC's te verkrijgen uit gezonde xenogene bronnen 9,13,18.
Er is een gedetailleerd protocol gepresenteerd om BOEC's efficiënt af te leiden uit mononucleaire bloedcellen in perifeer bloed van varkens. Kritieke stappen omvatten het zo snel mogelijk verwerken van bloedmonsters en het efficiënt oogsten van buffy coat-lagen na dichtheidsgradiëntcentrifugatie om het aantal levensvatbare PBMC's dat in de cultuur gaat te maximaliseren. De initiële platingdichtheid en tijdige passing van cellen zijn belangrijke overwegingen voor het verkrijgen van consistente isolatie van deze celtypen. Een startbloedvolume van 100 ml levert een geschikt aantal PBMC's op voor een enkele plaat met zes putten. Opgemerkt moet worden dat het maximale bloedvolume dat veilig van een varken kan worden verzameld, zal variëren met het lichaamsgewicht van het dier. Een voorgestelde veilige eenmalige maximale bloedvolumeverzameling voor varkens is 8 ml per kg lichaamsgewicht. Daarnaast is het tijdig passeren van initiële kolonies van passage 0 naar passage 1 ook essentieel. De cellen stoppen met prolifereren als de zaaidichtheid erg laag is of als de cellen samenvloeiing bereiken. Naarmate de cellen confluent worden, beginnen ze te transformeren in een langwerpige mesenchymale morfologie en fenotype. De zaaidichtheid kan ook worden geregeld door kolonies in een T25-kolf te brengen in plaats van een T75-kolf. Zorgvuldige overweging is vereist om de aanhangende celtypen niet te verliezen tijdens de eerste mediaverandering, omdat het zeer noodzakelijk is om zoveel mogelijk aanhangende cellen vast te leggen terwijl de niet-adherente EPC's worden weggegooid. Dit protocol produceert uitgroeicelkolonies in ongeveer 1 week.
Het protocol is zeer reproduceerbaar en betrouwbaar. Uitbreiding van endotheelcelkolonies wordt bereikt in naar schatting 90% -95% van de culturen. Falen is meestal te wijten aan een gebrek aan vorming van endotheelcelkolonies, wat betekent dat als ten minste één endotheelcelkolonie wordt gevormd, ze bijna altijd zullen overgaan tot uitbreiding in cultuur. Bronnen van falen zijn willekeurige variabiliteit, overmatig scheren van cellen tijdens bloedafname, vervuilende microben in de cultuur en hoog verlies van mononucleaire cellen tijdens de verwerkingsstappen. Na een mislukte cultuur zal een tweede cultuur meestal succesvol zijn, wat aangeeft dat variabiliteit tussen dieren geen belangrijke factor is. Het protocol is zelfs succesvol bij het afnemen van bloed onmiddellijk na euthanasie, wat aangeeft dat de wasstappen de euthanasiemiddelen efficiënt tot onschadelijke niveaus reduceren.
Ongeacht de heterogeniteit in de circulerende bloedcelpopulatie werden BOEC's verkregen die sterk verschillen van EPC's. BOEC's zijn afgeleid van een kleine subset van adherente PBMC's die geen CD14-expressie hebben. Dit werd bevestigd door de afwezigheid van CD14-kleuring (figuur 3C,D). De klaring van monocytische EPC's uit BOEC-culturen in vroege passages kan worden verklaard door celdood of niet-hechting. De kasseimorfologie van BOEC's (figuur 1E,F) suggereert een uitgesproken endotheelfenotype. Bovendien impliceert de uniforme expressie van oppervlaktemarker CD31 (figuur 3A) een homogene populatie van volwassen endotheelcellen. Verder toont de capillaire morfogenese van BOEC's zowel in serumvrije (figuur 2A,B) als volledige groeimedia (figuur 2C,D) hun inherente angiogene vermogen 6,8. Eerdere analyse van varkens-BOEC's gegenereerd met behulp van dit protocol heeft aangetoond dat deze cellen bovendien positief zijn voor von Willebrand-factorexpressie en lectinebinding28.
De overvloed aan PBMC's in circulerend bloed, waaruit BOEC's voortkomen, ondersteunt de haalbaarheid van een robuuste methode om een vrijwel onbeperkte voorraad therapeutische BOEC's uit dierlijke bronnen te verkrijgen. Zodra de techniek onder de knie is, kunnen BOEC's worden gebruikt voor verschillende toepassingen, waaronder vasculair herstel en regeneratie, ziektemodellering, geneesmiddelenscreening en endotheelcelbiologiestudies. Lopende studies zijn nodig om de homogeniteit van varkens-BOEC's en hun compatibiliteit als therapeutische bron bij de mens te bevestigen.
Een beperking van dit protocol is het risico dat uitdijende endotheelcelkolonies niet genereren. Het faalpercentage wordt geschat op 5% -10% en in deze gevallen is een tweede poging noodzakelijk. Wanneer zekerheid van succes belangrijk is, kan twee keer zoveel bloed worden verzameld en kan het protocol parallel worden gevolgd om twee onafhankelijke culturen op te leveren. Verder is onze ervaring beperkt tot gezonde Yorkshire/Landrace/Duroc kruisvarkens (Sus domesticus), mannetje en vrouwtje, 40-80 kg, 3-6 maanden oud. Slagingspercentages met andere rassen, leeftijden en experimentele omstandigheden zijn onbekend.
Een andere beperking van het protocol is dat er geen definitieve marker voor het BOEC-fenotype bestaat. Hier en in eerder werk28 zijn de varkens-BOEC's die uit dit protocol zijn gegenereerd, gekarakteriseerd voor verschillende BOEC-markers, maar het begrip van het BOEC-fenotype blijft evolueren. BOEC's worden ook gekarakteriseerd bij passages 2-3 en fenotype bij hogere passages is onbekend. Een voordeel van varkens-BOEC's ten opzichte van mensen is de kant-en-klare toevoer van varkensbloed, waardoor frequentere culturen kunnen worden gegenereerd en een robuuste toevoer van consistente, laagdoorgangscellen.
Een van de belangrijkste beperkingen van het gebruik van varkenscellen in therapeutische benaderingen is de immuunrespons van de gastheer29. Verschillende immunomodulatiestrategieën worden onderzocht om de immunogeniciteit van xenogene cellen voor menselijke transplantatie te verminderen, zoals ontstekingsremmende middelen en CRISPR / Cas genetische manipulatie30,31,32. Meer recente studies hebben de expressie van humane complementaire regulerende eiwitten (hCRPs)33 en de introductie van α1,3- galactosyltransferase deleted (GTKO)32,34 varkens voorgesteld. Deze ontwikkelingen zijn veelbelovend voor de therapeutische toepassing van xenogene cellen, waaronder varkens-BOEC's.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs willen de financiering van NIH / NHLBI R00 HL129068 erkennen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 19 G needle | Covidien | 1188818112 | |
| 50 mL conical tubes | Corning | 352098 | |
| 6 well plate | BD Falcon | 353046 | |
| 60 mL syringes | Covidien | 8881560125 | |
| Ammonium chloride solution (0.8%) | Stemcell Technologies | 07850 | |
| Antibiotic/antimycotic solution (100x) | Gibco | 15240-062 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 75-253-839 | |
| EGM-2 culture medium | Lonza Walkersville | CC-3162 | |
| Extension tube | Hanna Pharmaceutical Supply Co. | 03382C6227 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Atlas Biologicals | F-0500-A | |
| Ficoll-Paque 1077 | Cytiva | 17144003 | Density gradient solution |
| Heparin sodium injection (1,000 units/mL) | Pfizer | 00069-0058-01 | |
| Human plasma fibronectin | Gibco | 33016-015 | |
| Ice | N/A | N/A | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-023 | |
| Pipette set | Eppendorf | 2231300004 | |
| Sterile water | Gibco | 15230-162 | |
| Thin pipette | Celltreat Scientific | 229280 |
References
- Aird, W. C. Phenotypic heterogeneity of the endothelium: II. Representative vascular beds. Circulation Research. 100 (2), 174-190 (2007).
- Aird, W. C. Phenotypic heterogeneity of the endothelium: I. Structure, function, and mechanisms. Circulation Research. 100 (2), 158-173 (2007).
- Pober, J. S., Tellides, G. Participation of blood vessel cells in human adaptive immune responses. Trends in Immunology. 33 (1), 49-57 (2012).
- Navarro, S., et al. The endothelial cell protein C receptor: its role in thrombosis. Thrombosis Research. 128 (5), 410-416 (2011).
- Hasstedt, S. J., et al. Cell adhesion molecule 1: a novel risk factor for venous thrombosis. Blood. 114 (14), 3084-3091 (2009).
- Ormiston, M. L., et al. Generation and culture of blood outgrowth endothelial cells from human peripheral blood. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (106), e53384 (2015).
- Lin, Y., Weisdorf, D. J., Solovey, A., Hebbel, R. P. Origins of circulating endothelial cells and endothelial outgrowth from blood. Journal of Clinical Investigation. 105 (1), 71-77 (2000).
- Martin-Ramirez, J., Hofman, M., Biggelaar, M. V. D., Hebbel, R. P., Voorberg, J. Establishment of outgrowth endothelial cells from peripheral blood. Nature Protocols. 7 (9), 1709-1715 (2012).
- Gulati, R., et al. Diverse origin and function of cells with endothelial phenotype obtained from adult human blood. Circulation Research. 93 (11), 1023-1025 (2003).
- Hebbel, R. P. Blood endothelial cells: utility from ambiguity. The Journal of Clinical Investigation. 127 (5), 1613-1615 (2017).
- Medina, R. J., et al. Endothelial progenitors: A consensus statement on nomenclature. Stem Cells Translational Medicine. 6 (5), 1316-1320 (2018).
- Medina, R. J., et al. Molecular analysis of endothelial progenitor cell (EPC) subtypes reveals two distinct cell populations with different identities. BMC Medical Genomics. 3, 18 (2010).
- Jiang, A., Pan, W., Milbauer, L. C., Shyr, Y., Hebbel, R. P. A practical question based on cross-platform microarray data normalization: are BOEC more like large vessel or microvascular endothelial cells or neither of them. Journal of Bioinformatics and Computational Biology. 5 (4), 875-893 (2007).
- Pan, W., Shen, X., Jiang, A., Hebbel, R. P. Semi-supervised learning via penalized mixture model with application to microarray sample classification. Bioinformatics. 22 (19), 2388-2395 (2006).
- Hirschi, K. K., Ingram, D. A., Yoder, M. C. Assessing identity, phenotype, and fate of endothelial progenitor cells. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 28 (9), 1584-1595 (2008).
- Fernandez, L. A., et al. Blood outgrowth endothelial cells from hereditary haemorrhagic telangiectasia patients reveal abnormalities compatible with vascular lesions. Cardiovascular Research. 68 (2), 235-248 (2005).
- Critser, P. J., Yoder, M. C. Endothelial colony-forming cell role in neoangiogenesis and tissue repair. Current Opinion in Organ Transplantation. 15 (1), 68-72 (2010).
- Zhao, Y., et al. Isolation and culture of primary aortic endothelial cells from miniature pigs. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e59673 (2019).
- Chang Milbauer, L., et al. Genetic endothelial systems biology of sickle stroke risk. Blood. 111 (7), 3872-3879 (2008).
- Wei, P., et al. Differential endothelial cell gene expression by African Americans versusCaucasian Americans: a possible contribution to health disparity in vascular disease and cancer. BMC Medicine. 9 (1), 2 (2011).
- Hasstedt, S. J., et al. Cell adhesion molecule 1: a novel risk factor for venous thrombosis. Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 114 (14), 3084-3091 (2009).
- Milbauer, L. C., et al. Blood outgrowth endothelial cell migration and trapping in vivo: a window into gene therapy. Translational Research. 153 (4), 179-189 (2009).
- Matsui, H., et al. Ex vivo gene therapy for hemophilia A that enhances safe delivery and sustained in vivo factor VIII expression from lentivirally engineered endothelial progenitors. Stem Cells. 25 (10), 2660-2669 (2007).
- De Meyer, S. F., et al. Phenotypic correction of von Willebrand disease type 3 blood-derived endothelial cells with lentiviral vectors expressing von Willebrand factor. Blood. 107 (12), 4728-4736 (2006).
- Bodempudi, V., et al. Blood outgrowth endothelial cell-based systemic delivery of antiangiogenic gene therapy for solid tumors. Cancer Gene Therapy. 17 (12), 855-863 (2010).
- Dudek, A. Z., et al. Systemic inhibition of tumour angiogenesis by endothelial cell-based gene therapy. British Journal of Cancer. 97 (4), 513-522 (2007).
- Moubarik, C., et al. Transplanted late outgrowth endothelial progenitor cells as cell therapy product for stroke. Stem Cell Reviews and Reports. 7 (1), 208-220 (2011).
- Pislaru Sorin, V., et al. Magnetic forces enable rapid endothelialization of synthetic vascular grafts. Circulation. 114 (1), 314 (2006).
- Satyananda, V., et al. New concepts of immune modulation in xenotransplantation. Transplantation. 96 (11), 937-945 (2013).
- Klymiuk, N., Aigner, B., Brem, G., Wolf, E. Genetic modification of pigs as organ donors for xenotransplantation. Molecular Reproduction and Development. 77 (3), 209-221 (2010).
- Ryczek, N., Hryhorowicz, M., Zeyland, J., Lipiński, D., Słomski, R. CRISPR/Cas technology in pig-to-human xenotransplantation research. International Journal of Molecular Sciences. 22 (6), 3196 (2021).
- Cooper, D. K., Koren, E., Oriol, R.
- Cozzi, E., White, D. J. G. The generation of transgenic pigs as potential organ donors for humans. Nature Medicine. 1 (9), 964-966 (1995).
- Phelps, C. J., et al.
