Karakterisering van bloeduitgroei endotheelcellen (BOEC) uit perifeer bloed van varkens
Abstract
Het endotheel is een dynamische geïntegreerde structuur die een belangrijke rol speelt in veel fysiologische functies zoals angiogenese, hemostase, ontsteking en homeostase. Het endotheel speelt ook een belangrijke rol in pathofysiologieën zoals atherosclerose, hypertensie en diabetes. Endotheelcellen vormen de binnenbekleding van bloed- en lymfevaten en vertonen heterogeniteit in structuur en functie. Verschillende groepen hebben de functionaliteit van endotheelcellen afgeleid van menselijk perifeer bloed geëvalueerd met een focus op endotheelvoorlopercellen afgeleid van hematopoëtische stamcellen of volwassen bloeduitgroei endotheelcellen (of endotheelkolonievormende cellen). Deze cellen bieden een autologe bron voor therapieën en ziektemodellering. Xenogene cellen kunnen een alternatieve bron van therapieën bieden vanwege hun beschikbaarheid en homogeniteit die wordt bereikt door genetisch vergelijkbare dieren te gebruiken die in vergelijkbare omstandigheden zijn grootgebracht. Daarom is een robuust protocol gepresenteerd voor de isolatie en uitbreiding van zeer proliferatieve bloeduitgroei endotheelcellen uit perifeer bloed van varkens. Deze cellen kunnen worden gebruikt voor tal van toepassingen, zoals cardiovasculaire weefselmanipulatie, celtherapie, ziektemodellering, geneesmiddelenscreening, het bestuderen van endotheelcelbiologie en in vitro coculturen om ontstekings- en stollingsreacties bij xenotransplantatie te onderzoeken.
Introduction
Het endotheel is een zeer complexe, dynamische structuur en een essentieel onderdeel van de vaatwand. Het bekleedt het binnenoppervlak van bloedvaten om een fysieke interface te bieden tussen circulerend bloed en omliggende weefsels. Van deze heterogene structuur is bekend dat ze verschillende functies vervult, zoals angiogenese, ontsteking, vasoregulatie en hemostase 1,2,3,4. Menselijke navelstreng-endotheelcellen zijn een veel bestudeerd celtype om de functionaliteit van endotheelcellen te beoordelen. De patiëntspecifieke batchvariabiliteit, het inconsistente fenotype en de minimale splitsingsefficiëntie suggereren echter de noodzaak om een celbron te bepalen die al deze kenmerken zou kunnen verbeteren5.
Het verkrijgen van een homogene populatie van primaire endotheelcellen kan technisch een uitdaging zijn en primaire endotheelcellen bezitten geen hoge proliferatieve capaciteit6. Om vasculaire regeneratie te bestuderen en pathofysiologische processen te evalueren, hebben verschillende groepen daarom geprobeerd verschillende soorten endotheelcellen afgeleid van perifeer bloed te verkrijgen en te beoordelen, bijvoorbeeld endotheelvoorlopercellen (EPC’s) of endotheelcellen met bloeduitgroei (BOECs)6,7,8,9 . De spilvormige vroege EPC’s zijn afkomstig van hematopoëtische stamcellen (HSC’s) en hebben een beperkte groeikracht en een beperkt angiogeen vermogen om volwassen endotheelcellen te produceren. Bovendien lijken ze sterk op inflammatoire monocyten. Bovendien is hun vermogen om verder te differentiëren in functionele, prolifererende, volwassen endotheelcellen nog steeds discutabel 6,7,9,10. De continue kweek van perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC’s) kan aanleiding geven tot een secundaire populatie van cellen die bekend staat als late-outgrowth EPC’s, BOEC’s of endotheelkolonievormende cellen (ECFC’s)6,7,9,10. Medina et al. erkenden in 2018 de beperkingen van EPC’s, de ambiguïteit van hun nomenclatuur, samen met een algemeen gebrek aan overeenstemming met veel verschillende celtypen die continu zijn gegroepeerd onder EPC’s11. BOEC’s daarentegen zijn erkend voor hun rol in vasculair herstel, gezondheid en ziekte, en celtherapie. Verdere studie en therapeutisch gebruik van deze cellen zal afhankelijk zijn van protocollen om deze celtypen consequent af te leiden uit circulerende voorlopercellen.
Primaire cellen zoals BOEC’s kunnen worden gebruikt als surrogaat om zeer proliferatieve volwassen endotheelcellente verkrijgen 6. BOEC’s zijn fenotypisch verschillend van vroege EPC’s en vertonen typische endotheelkenmerken zoals kasseimorfologie en expressie van adherens junctions en caveolae12. Genprofilering door Hebbel et al.13,14,15 vond dat BOECs of ECFC’s de echte endotheelcellen zijn omdat ze microvasculaire en grote vatvorming bevorderen. BOEC’s kunnen dus worden gebruikt als een hulpmiddel om pathofysiologische processen en genetische variatie te evalueren16. Ze worden ook beschouwd als een uitstekende celbron voor celtherapie voor vasculaire regeneratie17. Daarom is een gestandaardiseerd protocol om deze zeer proliferatieve cellen consequent af te leiden essentieel.
Hoewel BOEC’s een krachtig instrument bieden voor het bestuderen van pathofysiologische en genetische variatie bij de mens, kan een meer homogene bron van BOEC’s robuustere en betrouwbaardere experimentele en therapeutische resultaten opleveren. Superieure homogeniteit kan worden bereikt door gebruik te maken van xenogene celbronnen die zijn afgeleid van genetisch vergelijkbare dieren die in vergelijkbare omstandigheden zijn grootgebracht18. Terwijl xenogene celbronnen gevoelig zijn voor het opwekken van een immuunrespons van de gastheer, worden immunomodulatiestrategieën ontwikkeld met als doel immunocompatibele dieren en dierlijke producten, waaronder cellen, te genereren. Varkens, in het bijzonder, zijn een overvloedige bron van perifeer bloed en worden vaak gebruikt om medische hulpmiddelen en andere therapieën te bestuderen vanwege anatomische en fysiologische overeenkomsten met mensen. Daarom verfijnt deze studie het protocol voor de isolatie en uitbreiding van zeer proliferatieve BOEC’s uit perifeer bloed van varkens. Het hieronder beschreven protocol is een eenvoudige en betrouwbare methode om een groot aantal BOEC’s te verkrijgen uit een relatief klein volume bloed. De culturen kunnen via verschillende passages worden uitgebreid om miljoenen cellen uit één bloedmonster te genereren.
Protocol
Representative Results
Discussion
BOEC’s zijn een krachtig instrument dat kan worden gebruikt in verschillende wetenschappelijke en therapeutische benaderingen 7,8,16. BOEC’s zijn gebruikt om EC-genexpressie te analyseren om de belangrijkste factoren op te helderen die verantwoordelijk zijn voor de ontwikkeling van vaatziekten en kanker 5,19,20,21.<sup class=…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen de financiering van NIH / NHLBI R00 HL129068 erkennen.
Materials
| 19 G needle | Covidien | 1188818112 | |
| 50 mL conical tubes | Corning | 352098 | |
| 6 well plate | BD Falcon | 353046 | |
| 60 mL syringes | Covidien | 8881560125 | |
| Ammonium chloride solution (0.8%) | Stemcell Technologies | 07850 | |
| Antibiotic/antimycotic solution (100x) | Gibco | 15240-062 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 75-253-839 | |
| EGM-2 culture medium | Lonza Walkersville | CC-3162 | |
| Extension tube | Hanna Pharmaceutical Supply Co. | 03382C6227 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Atlas Biologicals | F-0500-A | |
| Ficoll-Paque 1077 | Cytiva | 17144003 | Density gradient solution |
| Heparin sodium injection (1,000 units/mL) | Pfizer | 00069-0058-01 | |
| Human plasma fibronectin | Gibco | 33016-015 | |
| Ice | N/A | N/A | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-023 | |
| Pipette set | Eppendorf | 2231300004 | |
| Sterile water | Gibco | 15230-162 | |
| Thin pipette | Celltreat Scientific | 229280 |
References
- Aird, W. C. Phenotypic heterogeneity of the endothelium: II. Representative vascular beds. Circulation Research. 100 (2), 174-190 (2007).
- Aird, W. C. Phenotypic heterogeneity of the endothelium: I. Structure, function, and mechanisms. Circulation Research. 100 (2), 158-173 (2007).
- Pober, J. S., Tellides, G. Participation of blood vessel cells in human adaptive immune responses. Trends in Immunology. 33 (1), 49-57 (2012).
- Navarro, S., et al. The endothelial cell protein C receptor: its role in thrombosis. Thrombosis Research. 128 (5), 410-416 (2011).
- Hasstedt, S. J., et al. Cell adhesion molecule 1: a novel risk factor for venous thrombosis. Blood. 114 (14), 3084-3091 (2009).
- Ormiston, M. L., et al. Generation and culture of blood outgrowth endothelial cells from human peripheral blood. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (106), e53384 (2015).
- Lin, Y., Weisdorf, D. J., Solovey, A., Hebbel, R. P. Origins of circulating endothelial cells and endothelial outgrowth from blood. Journal of Clinical Investigation. 105 (1), 71-77 (2000).
- Martin-Ramirez, J., Hofman, M., Biggelaar, M. V. D., Hebbel, R. P., Voorberg, J. Establishment of outgrowth endothelial cells from peripheral blood. Nature Protocols. 7 (9), 1709-1715 (2012).
- Gulati, R., et al. Diverse origin and function of cells with endothelial phenotype obtained from adult human blood. Circulation Research. 93 (11), 1023-1025 (2003).
- Hebbel, R. P. Blood endothelial cells: utility from ambiguity. The Journal of Clinical Investigation. 127 (5), 1613-1615 (2017).
- Medina, R. J., et al. Endothelial progenitors: A consensus statement on nomenclature. Stem Cells Translational Medicine. 6 (5), 1316-1320 (2018).
- Medina, R. J., et al. Molecular analysis of endothelial progenitor cell (EPC) subtypes reveals two distinct cell populations with different identities. BMC Medical Genomics. 3, 18 (2010).
- Jiang, A., Pan, W., Milbauer, L. C., Shyr, Y., Hebbel, R. P. A practical question based on cross-platform microarray data normalization: are BOEC more like large vessel or microvascular endothelial cells or neither of them. Journal of Bioinformatics and Computational Biology. 5 (4), 875-893 (2007).
- Pan, W., Shen, X., Jiang, A., Hebbel, R. P. Semi-supervised learning via penalized mixture model with application to microarray sample classification. Bioinformatics. 22 (19), 2388-2395 (2006).
- Hirschi, K. K., Ingram, D. A., Yoder, M. C. Assessing identity, phenotype, and fate of endothelial progenitor cells. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 28 (9), 1584-1595 (2008).
- Fernandez, L. A., et al. Blood outgrowth endothelial cells from hereditary haemorrhagic telangiectasia patients reveal abnormalities compatible with vascular lesions. Cardiovascular Research. 68 (2), 235-248 (2005).
- Critser, P. J., Yoder, M. C. Endothelial colony-forming cell role in neoangiogenesis and tissue repair. Current Opinion in Organ Transplantation. 15 (1), 68-72 (2010).
- Zhao, Y., et al. Isolation and culture of primary aortic endothelial cells from miniature pigs. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e59673 (2019).
- Chang Milbauer, L., et al. Genetic endothelial systems biology of sickle stroke risk. Blood. 111 (7), 3872-3879 (2008).
- Wei, P., et al. Differential endothelial cell gene expression by African Americans versusCaucasian Americans: a possible contribution to health disparity in vascular disease and cancer. BMC Medicine. 9 (1), 2 (2011).
- Hasstedt, S. J., et al. Cell adhesion molecule 1: a novel risk factor for venous thrombosis. Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 114 (14), 3084-3091 (2009).
- Milbauer, L. C., et al. Blood outgrowth endothelial cell migration and trapping in vivo: a window into gene therapy. Translational Research. 153 (4), 179-189 (2009).
- Matsui, H., et al. Ex vivo gene therapy for hemophilia A that enhances safe delivery and sustained in vivo factor VIII expression from lentivirally engineered endothelial progenitors. Stem Cells. 25 (10), 2660-2669 (2007).
- De Meyer, S. F., et al. Phenotypic correction of von Willebrand disease type 3 blood-derived endothelial cells with lentiviral vectors expressing von Willebrand factor. Blood. 107 (12), 4728-4736 (2006).
- Bodempudi, V., et al. Blood outgrowth endothelial cell-based systemic delivery of antiangiogenic gene therapy for solid tumors. Cancer Gene Therapy. 17 (12), 855-863 (2010).
- Dudek, A. Z., et al. Systemic inhibition of tumour angiogenesis by endothelial cell-based gene therapy. British Journal of Cancer. 97 (4), 513-522 (2007).
- Moubarik, C., et al. Transplanted late outgrowth endothelial progenitor cells as cell therapy product for stroke. Stem Cell Reviews and Reports. 7 (1), 208-220 (2011).
- Pislaru Sorin, V., et al. Magnetic forces enable rapid endothelialization of synthetic vascular grafts. Circulation. 114 (1), 314 (2006).
- Satyananda, V., et al. New concepts of immune modulation in xenotransplantation. Transplantation. 96 (11), 937-945 (2013).
- Klymiuk, N., Aigner, B., Brem, G., Wolf, E. Genetic modification of pigs as organ donors for xenotransplantation. Molecular Reproduction and Development. 77 (3), 209-221 (2010).
- Ryczek, N., Hryhorowicz, M., Zeyland, J., Lipiński, D., Słomski, R. CRISPR/Cas technology in pig-to-human xenotransplantation research. International Journal of Molecular Sciences. 22 (6), 3196 (2021).
- Cooper, D. K., Koren, E., Oriol, R. Genetically engineered pigs. Lancet. 342 (8872), 682-683 (1993).
- Cozzi, E., White, D. J. G. The generation of transgenic pigs as potential organ donors for humans. Nature Medicine. 1 (9), 964-966 (1995).
- Phelps, C. J., et al. Production of alpha 1,3-galactosyltransferase-deficient pigs. Science. 299 (5605), 411-414 (2003).
