Abstract
Эндотелий представляет собой динамическую интегрированную структуру, которая играет важную роль во многих физиологических функциях, таких как ангиогенез, гемостаз, воспаление и гомеостаз. Эндотелий также играет важную роль в патофизиологии, такой как атеросклероз, гипертония и диабет. Эндотелиальные клетки образуют внутреннюю оболочку кровеносных и лимфатических сосудов и проявляют гетерогенность в структуре и функциях. Различные группы оценивали функциональность эндотелиальных клеток, полученных из периферической крови человека, уделяя особое внимание эндотелиальным клеткам-предшественникам, полученным из гемопоэтических стволовых клеток или зрелых эндотелиальных клеток крови (или эндотелиальных колониеобразующих клеток). Эти клетки обеспечивают аутологичный ресурс для терапии и моделирования заболеваний. Ксеногенные клетки могут обеспечить альтернативный источник терапевтических средств из-за их доступности и однородности, достигаемой с помощью генетически сходных животных, выращенных в аналогичных условиях. Таким образом, был представлен надежный протокол выделения и расширения эндотелиальных клеток с высоким пролиферативным ростом крови из периферической крови свиней. Эти клетки могут быть использованы для многочисленных применений, таких как сердечно-сосудистая тканевая инженерия, клеточная терапия, моделирование заболеваний, скрининг лекарств, изучение биологии эндотелиальных клеток и совместные культуры in vitro для исследования воспалительных и коагуляционных реакций при ксенотрансплантации.
Introduction
Эндотелий представляет собой очень сложную, динамичную структуру и жизненно важный компонент сосудистой стенки. Он выстилает внутреннюю поверхность кровеносных сосудов, обеспечивая физический интерфейс между циркулирующей кровью и окружающими тканями. Известно, что эта гетерогенная структура выполняет различные функции, такие как ангиогенез, воспаление, вазорегуляция и гемостаз 1,2,3,4. Эндотелиальные клетки пупочной вены человека являются широко изученным типом клеток для оценки функциональности эндотелиальных клеток. Тем не менее, вариабельность партии для конкретного пациента, непоследовательный фенотип и минимальная эффективность расщепления предполагают необходимость определения источника клеток, который мог бы улучшить все эти особенности5.
Получение однородной популяции первичных эндотелиальных клеток может быть технически сложным, а первичные эндотелиальные клетки не обладают высокой пролиферативной способностью6. Следовательно, для изучения регенерации сосудов и оценки патофизиологических процессов различные группы пытались получить и оценить различные типы эндотелиальных клеток, полученных из периферической крови, например, эндотелиальные клетки-предшественники (EPC) или эндотелиальные клетки роста крови (BOEC)6,7,8,9 . Веретенообразные ранние ЭПК происходят из гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) и имеют ограниченную потенциал роста и ограниченную ангиогенную способность продуцировать зрелые эндотелиальные клетки. Кроме того, они очень похожи на воспалительные моноциты. Кроме того, их способность к дальнейшей дифференцировке в функциональные, пролиферирующие, зрелые эндотелиальные клетки все еще остается спорной 6,7,9,10. Непрерывная культура мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC) может привести к образованию вторичной популяции клеток, известных как EPC с поздним ростом, BOEC или эндотелиальные колониеобразующие клетки (ECFC)6,7,9,10. Medina et al. в 2018 году признали ограничения EPC, неоднозначность их номенклатуры, а также общее отсутствие соответствия со многими различными типами клеток, постоянно группируемыми под EPC11. Напротив, BOEC получили признание за их роль в восстановлении сосудов, здоровье и болезни, а также клеточную терапию. Дальнейшее изучение и терапевтическое использование этих клеток будет основываться на протоколах для последовательного получения этих типов клеток из циркулирующих клеток-предшественников.
Первичные клетки, такие как BOEC, могут быть использованы в качестве суррогата для получения высокопролиферативных зрелых эндотелиальных клеток6. BOEC фенотипически отличаются от ранних EPC и демонстрируют типичные эндотелиальные особенности, такие как морфология булыжника и экспрессия прилипших соединений и кавеол12. Профилирование генов, проведенное Hebbel et al.13,14,15, показало, что BOEC или ECFC являются истинными эндотелиальными клетками, поскольку они способствуют образованию микрососудов и крупных сосудов. Таким образом, BOEC могут быть использованы в качестве инструмента для оценки патофизиологических процессов и генетической изменчивости16. Они также считаются отличным источником клеток для клеточной терапии для регенерации сосудов17. Следовательно, стандартизированный протокол для последовательного получения этих высокопролиферативных клеток имеет важное значение.
В то время как BOEC предоставляют мощный инструмент для изучения патофизиологических и генетических вариаций человека, более однородный источник BOEC может обеспечить более надежные и надежные экспериментальные и терапевтические результаты. Превосходная однородность может быть достигнута за счет использования ксеногенных клеточных источников, полученных от генетически сходных животных, выращенных в аналогичных условиях18. В то время как ксеногенные клеточные источники склонны вызывать иммунный ответ хозяина, разрабатываются стратегии иммуномодуляции с целью получения иммуносовместимых животных и продуктов животного происхождения, включая клетки. Свиньи, в частности, являются обильным источником периферической крови и обычно используются для изучения медицинских устройств и других методов лечения из-за анатомического и физиологического сходства с людьми. Следовательно, это исследование уточняет протокол выделения и распространения высокопролиферативных BOEC из периферической крови свиней. Протокол, подробно описанный ниже, является простым и надежным методом получения большого количества BOEC из относительно небольшого объема крови. Культуры могут быть расширены через несколько проходов для получения миллионов клеток из одного образца крови.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все исследования на животных были одобрены соответствующими институциональными комитетами по уходу за животными и их использованию (IACUC) в Медицинском колледже Висконсина и клинике Майо.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании использовались домашние свиньи помеси йоркшир/ландрас/дюрок (Sus domesticus), самцы и самки, 40-80 кг, в возрасте 3-6 месяцев.
1. Забор периферической крови свиней
- Подготовьте материалы.
- Раствор гепарина развести до 100 ЕД/мл в стерильном физиологическом растворе.
- Добавьте по 3-4 мл раствора гепарина в каждую из двух конических пробирок по 50 мл и двух шприцев по 60 мл.
- Наберите неразбавленный раствор гепарина (1,000 Ед / мл) в удлинительную трубку.
- Подсоедините иглу 19 г к одному концу удлинительной трубки, заполненной гепарином, и шприц, содержащий гепарин, 60 мл к другому концу.
- Анестезировать свинью в соответствии с институциональной политикой
- Введите внутримышечное введение атропина (0,05 мг / кг), тилетамина / золазепама (2-5 мг / кг) и ксилазина (2 мг / кг), чтобы вызвать анестезию.
ПРИМЕЧАНИЕ: адекватная анестезия достигается, когда животное находится без сознания, а мышцы нижней челюсти нежесткие. - Положите животное в положение лежа на спине и положите свернутые полотенца с обеих сторон, чтобы обеспечить устойчивость.
- Нанесите офтальмологическую мазь на глаза, чтобы предотвратить сухость под наркозом.
- Обеспечьте тепловую поддержку во время анестезии, включая одеяла, грелки и/или процедурный стол с подогревом.
- Введите внутримышечное введение атропина (0,05 мг / кг), тилетамина / золазепама (2-5 мг / кг) и ксилазина (2 мг / кг), чтобы вызвать анестезию.
- Очистите бедренную паховую область раствором скраба бетадина.
- Проколите бедренную вену или артерию иглой 19 G и медленно (~ 1-2 мл / с) наберите 50 мл крови в шприц.
ПРИМЕЧАНИЕ: Слишком быстрое рисование может привести к повреждению ячеек. - Оставив иглу на месте, немедленно перегните удлинительную трубку и отсоедините шприц объемом 60 мл
- Медленно переведите кровь в коническую пробирку объемом 50 мл, содержащую гепарин.
- Плотно закройте коническую пробирку объемом 50 мл, аккуратно переверните несколько раз, чтобы перемешать, и положите на лед.
- Подсоедините оставшийся шприц, содержащий гепарин, объемом 60 мл к удлинительной трубке, разверните удлинительную трубку и медленно наберите в шприц еще 50 мл крови.
- Немедленно извлеките иглу из артерии или вены и медленно наберите оставшуюся кровь из удлинительной трубки в шприц.
- Отсоедините шприц объемом 60 мл от удлинительной трубки и медленно перенесите кровь в оставшуюся коническую пробирку объемом 50 мл, содержащую гепарин.
- Плотно закройте коническую пробирку объемом 50 мл, аккуратно переверните несколько раз, чтобы перемешать, и положите на лед.
- Нанесите прижимной гемостаз на бедренную паховую область свиньи.
- Восстановите свинью в соответствии с институциональной политикой. Непрерывно наблюдайте за животным до тех пор, пока оно не придет в сознание, достаточное для поддержания лежачего положения на грудине и не вернется в обычное помещение для содержания / питомника.
2. Выделение мононуклеарных клеток
- Разбавьте кровь 1:1 фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS) в четырех конических пробирках по 50 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта работа должна быть выполнена в колпаке для клеточных культур с использованием асептической техники, чтобы избежать загрязнения клеточной культуры. - Добавьте 25 мл готового к использованию раствора с градиентом плотности при комнатной температуре в восемь конических пробирок по 50 мл.
- Очень медленно пипеткой вводят 25 мл раствора крови/физиологического раствора вдоль внутренней стороны каждого раствора с градиентом плотности, содержащего 50 мл конической трубки, держа пробирку под острым углом к наконечнику пипетки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор крови должен аккуратно наслаиваться поверх раствора градиента плотности и поддерживать четко определенную границу раздела. - Центрифугируйте пробирки в течение 30 мин при 560 x g и комнатной температуре (RT).
ПРИМЕЧАНИЕ: Для достижения наилучших результатов отключите тормоз центрифуги, если это возможно. - С помощью тонкой пипетки осторожно соберите охристую оболочку (мутный слой мононуклеарных клеток над раствором градиента плотности и ниже прозрачной плазмы) из каждой пробирки и равномерно распределите по двум новым коническим пробиркам объемом 50 мл. Откажитесь от раствора градиента плотности, содержащего трубки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Соберите как можно больше охристой шерсти, собирая при этом как можно меньше раствора градиента плотности и плазмы.
3. Промывка и обшивка ячеек
- Обмажьте 6-луночную пластину фибронектином.
- Сделайте исходный раствор фибронектина плазмы человека, разбавив его до 1 мг/мл в стерильной воде. Хранить аликвоты при температуре -20 °C.
- Сделайте 3,6 мл рабочего раствора фибронектина, разбавив 600 мкл исходного раствора фибронектина в 3 мл PBS.
- Перенесите 600 мкл рабочего раствора фибронектина в каждую лунку 6-луночной пластины и аккуратно откачайте до равномерного покрытия.
- Подождите 30 минут, пока фибронектин покроет лунки, и аккуратно аспирируйте раствор из каждой лунки.
- Ожидая, пока фибронектин покроется, промойте мононуклеарные клетки
- Долейте до 45 мл PBS в пробирки
- Центрифуга в течение 5 мин при 560 x g и 4 °C с низким тормозом. Аспирируйте надосадочную жидкость из обеих трубок.
- Ресуспендируйте каждую клеточную гранулу в 25 мл PBS.
- Повторите стирку во второй раз.
- Ресуспендируют каждую клеточную гранулу в 5 мл PBS и добавляют 15 мл 0,8% раствора хлорида аммония в каждую пробирку.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг заключается в лизиме оставшихся эритроцитов. - Инкубировать на льду 10 мин.
- Промойте ячейки, как и раньше, доливая пробирки PBS и центрифугу в течение 5 мин при 560 x g и 4 °C с низким тормозом. Аспирируйте надосадочную жидкость из обеих трубок.
- Ресуспендируйте каждую клеточную гранулу в 25 мл PBS и повторите промывку во второй раз.
- Ресуспендируют каждую клеточную гранулу в 6 мл питательной среды EGM-2 с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS) и 1x раствора антибиотика / антимикота, содержащего 10 000 ЕД / мл пенициллина, 10 мг / мл стрептомицина и 25 мкг / мл амфотерицина.
ПРИМЕЧАНИЕ: питательная среда EGM-2 состоит из питательной среды EBM-2 с добавлением 200 мкл гидрокортизона, 2 мл фактора роста фибробластов человека (hFGF-B), 500 мкл фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), 500 мкл рекомбинантного аналога инсулиноподобного фактора роста (R3 IGF-1), 500 мкл аскорбиновой кислоты, 500 мкл эпидермального фактора роста человека (hEGF), 500 мкл гентамицина/амфотерицина и 500 мкл гепарина на 500 мл. - Аккуратно перенесите 2 мл клеточной суспензии в каждую лунку 6-луночной пластины, покрытой фибронектином, и осторожно покачайте до равномерного покрытия.
ПРИМЕЧАНИЕ: Цель состоит в том, чтобы засеять как можно больше клеток, чтобы максимизировать количество эндотелиальных колоний, которые будут формироваться.
4. Клеточная культура
- Инкубируйте клетки при 37 ° C, 5% CO2 и 100% влажности.
- На следующий день аккуратно добавьте в каждую лунку по 1 мл свежей питательной среды.
ПРИМЕЧАНИЕ: важно быть осторожным, чтобы не нарушить клетки, которые слабо прилипли к фибронектиновому покрытию. - На следующий день проведите половину смены питательной среды, осторожно отсасывая по 1,5 мл питательной среды из каждой лунки и заменяя ее 1,5 мл свежей питательной среды.
- В каждый из следующих 5 дней аккуратно выполняйте полную смену питательной среды в каждую лунку (2 мл свежей питательной среды на лунку).
- После этого аккуратно меняйте культуральную среду трижды в неделю.
- Регулярно визуализируйте клеточные культуры под микроскопией с низким энергопотреблением (4-кратный объектив).
ПРИМЕЧАНИЕ: Колонии эндотелиальных клеток с прилипшим кроветворным ростом (BOEC) начнут появляться в лунках через 7-10 дней после покрытия. Неадгезивные типы клеток будут отбрасываться с изменениями среды, а другие адгезивные типы клеток будут постепенно рассеиваться по мере роста колоний BOEC. - Поместите BOEC в колбу T-75, покрытую фибронектином, когда ~ 70% -80% сливаются, и продолжайте менять питательную среду три раза в неделю.
ПРИМЕЧАНИЕ: Плотность посева можно контролировать, помещая колонии в колбу T25. Последующие пассажи не требуют покрытия фибронектином, а смену питательной среды можно сократить до двух раз в неделю. - Клетки из проходов 1-3 могут быть использованы для экспериментов или перенесены в замораживающую среду и сохранены в жидком азоте для будущего использования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Морфология культивируемых клеток наблюдалась с самого начала культивирования до наблюдения колоний BOEC (рис. 1). Меньшая популяция адгезивных клеток начала прикрепляться к чашкам для культивирования и расти, в то время как неадгезивные клетки удалялись с изменением питательной среды (рис. 1B). Колонии впервые появились на 6-й день как совокупность эндотелиальных клеток, размножающихся радиально наружу от центральной точки (рис. 1D). По мере развития культуры клеточные колонии становились более плотными и демонстрировали морфологию булыжника, похожую на зрелые эндотелиальные клетки (рис. 1F). Типичная морфология эндотелиального булыжника обеспечивает легкую предварительную идентификацию BOEC с помощью светового микроскопа.
Колонии эндотелиальных клеток обычно готовы к прохождению через 10-14 дней культивирования. В это время 6-луночная пластина обычно дает ~ 1 миллион клеток с процентом жизнеспособности 93% -98%. Во время первого прохода эндотелиальные клетки расширяются до ~ 6-10 миллионов клеток в колбе T75.
Для оценки морфогенеза BOEC матрицу базальной мембраны (например, Matrigel) наносили на 15 луночных пластин ангиогенеза при 10 мкл / лунку и инкубировали при 37 ° C в течение 30 мин, чтобы обеспечить полимеризацию. Клетки Passage 2 были засеяны на пластинах с матричным покрытием базальной мембраны и визуализированы в 14-часовом и 24-часовом временных точках. Плотность около 3 500 ячеек на скважину смогла сформировать сеть и трубчатые структуры. Образование трубки было отмечено в течение 14 ч для свободной среды сыворотки (EGM-2 с добавками, кроме FBS) и в течение 24 ч для полной питательной среды (EGM-2 с добавками, включая FBS). Добавление FBS могло разбавлять специфические для эндотелиальных клеток факторы роста (например, VEGF) и вводить другие сигнальные факторы, приводящие к задержке процесса формирования трубки. Фазово-контрастная микроскопия 2D использовалась для формирования пробирки в среде без сыворотки (рис. 2A, B) и полной питательной среде (рис. 2C, D). Клетки в обеих средах подвергались морфологической дифференцировке и быстро организовывались в обширные сети капиллярных трубчатых структур. Эти структуры состояли из организованных сотовых шнуров, напоминающих капиллярные сети in vivo. Кроме того, микрофотографии с 20-кратным увеличением подробно иллюстрируют сложную многоклеточную организацию эндотелиальных клеток и их морфологическую дифференцировку. Морфологических различий между условиями среды не наблюдалось. Разветвленная сеть капиллярных трубчатых структур убедительно свидетельствует о дифференцировке культивируемых клеток в зрелые и функциональные эндотелиальные клетки.
Кроме того, BOEC характеризовались экспрессией маркера зрелых эндотелиальных клеток CD31 или молекулы адгезии эндотелиальных клеток-1 тромбоцитов (PECAM1) (рис. 3A, B). BOEC показали равномерную экспрессию CD31. Кроме того, анализ проточной цитометрии подтвердил отсутствие EPC, поскольку клетки окрашены отрицательно на моноцитарный маркер CD14 по сравнению с положительной контрольной группой PBMC (рис. 3C, D).
Рисунок 1: Изображения фенотипической световой микроскопии. Изображения культивируемых BOEC со световой микроскопии, наблюдаемые при 10-кратном увеличении в (A) день 0, (B) день 2, (C) день 4, (D) день 6, (E) день 8 и (F) после первого прохождения. Масштабные линейки: 200 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Морфологическая дифференциация и организация прохода 2 BOEC. Морфологическая дифференциация и организация прохождения 2 BOEC в капиллярообразные трубчатые структуры отмечена в матриксе базальной мембраны в течение 14 ч для безсывороточной среды и в течение 24 ч для полной питательной среды. (A) Среда без сыворотки в 4 раза, (B) среда без сыворотки в 20 раз, (C) полная питательная среда в 4 раза и (D) полная среда для роста в 20 раз. Масштабные линейки: 200 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Характеристика BOEC с CD31 и CD14. (A) Passage 2-3 BOEC были окрашены для PECAM1 с использованием антител против CD31-FITC, видимых на зеленых и (B) соответствующих изображениях фазово-контрастной микроскопии. Клетки окрашивали в суспензии, а суспензию изображали на предметном стекле микроскопа. Масштабные линейки: 200 мкм. (C) Проточный цитометрический анализ BOEC с антителами CD14-AF700 по сравнению с (D) положительными контрольными мононуклеарными клетками периферической крови (PBMC). Положительное окрашивание CD14 показано синим цветом, а неокрашенные клетки показаны красным. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
BOEC являются мощным инструментом, который может быть использован в различных научных и терапевтических подходах 7,8,16. BOEC были использованы для анализа экспрессии гена EC для выяснения ключевых факторов, ответственных за развитие сосудистых заболеваний и рака 5,19,20,21. BOEC также использовались в терапевтических целях, таких как регенерация сосудов и доставка генов22,23,24. Генетически модифицированные BOEC известны своей антиангиогенной терапевтической способностью к опухолям25,26. Кроме того, ангиогенный потенциал BOEC делает их отличными кандидатами для клеточной терапии, направленной на васкуляризацию и неоваскуляризацию17,27. Несмотря на то, что в нескольких исследованиях описывается, как получить BOEC из периферической крови человека 6,7,8,9, вариабельность источников клеток человека из-за лежащей в основе патофизиологической и генетической изменчивости предполагает критическую необходимость получения BOEC из здоровых ксеногенных источников 9,13,18.
Был представлен подробный протокол эффективного получения BOEC из мононуклеарных клеток периферической крови свиней. Критически важные шаги включают обработку образцов крови как можно скорее и эффективный сбор слоев охристой шерсти после центрифугирования с градиентом плотности, чтобы максимизировать количество жизнеспособных PBMC, поступающих в культуру. Начальная плотность покрытия и своевременное прохождение клеток являются важными факторами для получения последовательной изоляции этих типов клеток. Начальный объем крови 100 мл обеспечивает соответствующее количество PBMC для одной шестилуночной пластины. Следует отметить, что максимальный объем крови, который можно безопасно собрать у свиньи, будет варьироваться в зависимости от массы тела животного. Рекомендуемый безопасный одноразовый максимальный объем крови для свиней составляет 8 мл на кг массы тела. Кроме того, своевременное прохождение начальных колоний из прохода 0 в проход 1 также имеет важное значение. Клетки перестают размножаться, если плотность посева очень низкая или если клетки достигают слияния. По мере того, как клетки сливаются, они начинают превращаться в удлиненную мезенхимальную морфологию и фенотип. Плотность посева также можно контролировать, пропуская колонии в колбу T25, а не в колбу T75. Требуется тщательное рассмотрение, чтобы не потерять адгезивные типы клеток во время первоначальной смены среды, поскольку очень важно захватить как можно больше адгезивных клеток, отбрасывая неадгезивные EPC. Этот протокол производит колонии разрастающихся клеток примерно за 1 неделю.
Протокол отличается высокой воспроизводимостью и надежностью. Расширение колоний эндотелиальных клеток достигается примерно в 90-95% культур. Неудача, как правило, происходит из-за отсутствия образования колоний эндотелиальных клеток, то есть, если образуется хотя бы одна колония эндотелиальных клеток, они почти всегда будут продолжать расширяться в культуре. Источники неудач включают случайную изменчивость, чрезмерный сдвиг клеток во время забора крови, загрязняющие микробы в культуре и высокую потерю мононуклеарных клеток на этапах обработки. После неудачной культуры вторая культура, как правило, будет успешной, что указывает на то, что изменчивость между животными не является основным фактором. Протокол эффективен даже при сборе крови сразу после эвтаназии, указывая на то, что этапы промывки эффективно снижают количество агентов эвтаназии до безобидного уровня.
Независимо от гетерогенности в циркулирующей популяции клеток крови, были получены BOEC, которые сильно отличаются от EPC. BOEC получены из небольшого подмножества адгезивных PBMC, у которых отсутствует экспрессия CD14. Это было подтверждено отсутствием окрашивания CD14 (рис. 3C, D). Клиренс моноцитарных ЭПК из культур BOEC в ранних пассажах может быть объяснен либо гибелью клеток, либо неприверженностью. Булыжная морфология BOEC (рис. 1E, F) предполагает выраженный эндотелиальный фенотип. Кроме того, равномерная экспрессия поверхностного маркера CD31 (рис. 3А) подразумевает однородную популяцию зрелых эндотелиальных клеток. Кроме того, капиллярный морфогенез BOEC как в сыворотке (рис. 2A, B), так и в полных питательных средах (рис. 2C, D) показывает присущую им ангиогенную способность 6,8. Предыдущий анализ BOEC свиней, сгенерированных с использованием этого протокола, показал, что эти клетки также положительны для экспрессии фактора фон Виллебранда и связывания лектина28.
Обилие PBMC в циркулирующей крови, из которой возникают BOEC, подтверждает осуществимость надежного метода получения практически безграничного запаса терапевтических BOEC из животных источников. После освоения метода BOEC можно будет использовать для нескольких применений, включая восстановление и регенерацию сосудов, моделирование заболеваний, скрининг лекарств и исследования биологии эндотелиальных клеток. Необходимы текущие исследования для подтверждения однородности BOEC свиней и их совместимости в качестве терапевтического источника у людей.
Одним из ограничений этого протокола является риск того, что колонии эндотелиальных клеток не будут генерироваться. Частота отказов оценивается в 5-10%, и в этих случаях необходима вторая попытка. Когда важна уверенность в успехе, можно собрать в два раза больше крови, и можно следовать протоколу параллельно, чтобы получить две независимые культуры. Кроме того, наш опыт ограничен здоровыми домашними свиньями кросса йоркшир/ландрас/дюрок (Sus domesticus), самцами и самками, 40-80 кг, в возрасте 3-6 месяцев. Показатели успеха с другими породами, возраст и условия эксперимента неизвестны.
Еще одним ограничением протокола является то, что окончательного маркера фенотипа BOEC не существует. Здесь и в предыдущей работе28 BOEC свиней, генерируемые с помощью этого протокола, были охарактеризованы для нескольких маркеров BOEC, но понимание фенотипа BOEC продолжает развиваться. BOEC также характерны для проходов 2-3, и фенотип для более высоких проходов неизвестен. Преимуществом BOEC свиней по сравнению с людьми является готовый запас крови свиньи, что позволяет генерировать более частые культуры и надежный запас стабильных клеток с низким пассажем.
Одним из основных ограничений использования свиных клеток в терапевтических подходах является иммунный ответ хозяина29. В настоящее время исследуется несколько стратегий иммуномодуляции для снижения иммуногенности ксеногенных клеток для трансплантации человека, таких как противовоспалительные средства и генетические манипуляции CRISPR/Cas30,31,32. В более поздних исследованиях была предложена экспрессия человеческих комплементарных регуляторных белков (hCRPs)33 и введение α1,3-галактозилтрансферазы удаленной (GTKO)32,34 свиньям. Эти достижения обещают терапевтическое применение ксеногенных клеток, в том числе свиных BOEC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам раскрывать нечего.
Acknowledgments
Авторы хотели бы выразить признательность за финансирование со стороны NIH/NHLBI R00 HL129068.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 19 G needle | Covidien | 1188818112 | |
| 50 mL conical tubes | Corning | 352098 | |
| 6 well plate | BD Falcon | 353046 | |
| 60 mL syringes | Covidien | 8881560125 | |
| Ammonium chloride solution (0.8%) | Stemcell Technologies | 07850 | |
| Antibiotic/antimycotic solution (100x) | Gibco | 15240-062 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 75-253-839 | |
| EGM-2 culture medium | Lonza Walkersville | CC-3162 | |
| Extension tube | Hanna Pharmaceutical Supply Co. | 03382C6227 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Atlas Biologicals | F-0500-A | |
| Ficoll-Paque 1077 | Cytiva | 17144003 | Density gradient solution |
| Heparin sodium injection (1,000 units/mL) | Pfizer | 00069-0058-01 | |
| Human plasma fibronectin | Gibco | 33016-015 | |
| Ice | N/A | N/A | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-023 | |
| Pipette set | Eppendorf | 2231300004 | |
| Sterile water | Gibco | 15230-162 | |
| Thin pipette | Celltreat Scientific | 229280 |
References
- Aird, W. C. Phenotypic heterogeneity of the endothelium: II. Representative vascular beds. Circulation Research. 100 (2), 174-190 (2007).
- Aird, W. C. Phenotypic heterogeneity of the endothelium: I. Structure, function, and mechanisms. Circulation Research. 100 (2), 158-173 (2007).
- Pober, J. S., Tellides, G. Participation of blood vessel cells in human adaptive immune responses. Trends in Immunology. 33 (1), 49-57 (2012).
- Navarro, S., et al. The endothelial cell protein C receptor: its role in thrombosis. Thrombosis Research. 128 (5), 410-416 (2011).
- Hasstedt, S. J., et al. Cell adhesion molecule 1: a novel risk factor for venous thrombosis. Blood. 114 (14), 3084-3091 (2009).
- Ormiston, M. L., et al. Generation and culture of blood outgrowth endothelial cells from human peripheral blood. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (106), e53384 (2015).
- Lin, Y., Weisdorf, D. J., Solovey, A., Hebbel, R. P. Origins of circulating endothelial cells and endothelial outgrowth from blood. Journal of Clinical Investigation. 105 (1), 71-77 (2000).
- Martin-Ramirez, J., Hofman, M., Biggelaar, M. V. D., Hebbel, R. P., Voorberg, J. Establishment of outgrowth endothelial cells from peripheral blood. Nature Protocols. 7 (9), 1709-1715 (2012).
- Gulati, R., et al. Diverse origin and function of cells with endothelial phenotype obtained from adult human blood. Circulation Research. 93 (11), 1023-1025 (2003).
- Hebbel, R. P. Blood endothelial cells: utility from ambiguity. The Journal of Clinical Investigation. 127 (5), 1613-1615 (2017).
- Medina, R. J., et al. Endothelial progenitors: A consensus statement on nomenclature. Stem Cells Translational Medicine. 6 (5), 1316-1320 (2018).
- Medina, R. J., et al. Molecular analysis of endothelial progenitor cell (EPC) subtypes reveals two distinct cell populations with different identities. BMC Medical Genomics. 3, 18 (2010).
- Jiang, A., Pan, W., Milbauer, L. C., Shyr, Y., Hebbel, R. P. A practical question based on cross-platform microarray data normalization: are BOEC more like large vessel or microvascular endothelial cells or neither of them. Journal of Bioinformatics and Computational Biology. 5 (4), 875-893 (2007).
- Pan, W., Shen, X., Jiang, A., Hebbel, R. P. Semi-supervised learning via penalized mixture model with application to microarray sample classification. Bioinformatics. 22 (19), 2388-2395 (2006).
- Hirschi, K. K., Ingram, D. A., Yoder, M. C. Assessing identity, phenotype, and fate of endothelial progenitor cells. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 28 (9), 1584-1595 (2008).
- Fernandez, L. A., et al. Blood outgrowth endothelial cells from hereditary haemorrhagic telangiectasia patients reveal abnormalities compatible with vascular lesions. Cardiovascular Research. 68 (2), 235-248 (2005).
- Critser, P. J., Yoder, M. C. Endothelial colony-forming cell role in neoangiogenesis and tissue repair. Current Opinion in Organ Transplantation. 15 (1), 68-72 (2010).
- Zhao, Y., et al. Isolation and culture of primary aortic endothelial cells from miniature pigs. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e59673 (2019).
- Chang Milbauer, L., et al. Genetic endothelial systems biology of sickle stroke risk. Blood. 111 (7), 3872-3879 (2008).
- Wei, P., et al. Differential endothelial cell gene expression by African Americans versusCaucasian Americans: a possible contribution to health disparity in vascular disease and cancer. BMC Medicine. 9 (1), 2 (2011).
- Hasstedt, S. J., et al. Cell adhesion molecule 1: a novel risk factor for venous thrombosis. Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 114 (14), 3084-3091 (2009).
- Milbauer, L. C., et al. Blood outgrowth endothelial cell migration and trapping in vivo: a window into gene therapy. Translational Research. 153 (4), 179-189 (2009).
- Matsui, H., et al. Ex vivo gene therapy for hemophilia A that enhances safe delivery and sustained in vivo factor VIII expression from lentivirally engineered endothelial progenitors. Stem Cells. 25 (10), 2660-2669 (2007).
- De Meyer, S. F., et al. Phenotypic correction of von Willebrand disease type 3 blood-derived endothelial cells with lentiviral vectors expressing von Willebrand factor. Blood. 107 (12), 4728-4736 (2006).
- Bodempudi, V., et al. Blood outgrowth endothelial cell-based systemic delivery of antiangiogenic gene therapy for solid tumors. Cancer Gene Therapy. 17 (12), 855-863 (2010).
- Dudek, A. Z., et al. Systemic inhibition of tumour angiogenesis by endothelial cell-based gene therapy. British Journal of Cancer. 97 (4), 513-522 (2007).
- Moubarik, C., et al. Transplanted late outgrowth endothelial progenitor cells as cell therapy product for stroke. Stem Cell Reviews and Reports. 7 (1), 208-220 (2011).
- Pislaru Sorin, V., et al. Magnetic forces enable rapid endothelialization of synthetic vascular grafts. Circulation. 114 (1), 314 (2006).
- Satyananda, V., et al. New concepts of immune modulation in xenotransplantation. Transplantation. 96 (11), 937-945 (2013).
- Klymiuk, N., Aigner, B., Brem, G., Wolf, E. Genetic modification of pigs as organ donors for xenotransplantation. Molecular Reproduction and Development. 77 (3), 209-221 (2010).
- Ryczek, N., Hryhorowicz, M., Zeyland, J., Lipiński, D., Słomski, R. CRISPR/Cas technology in pig-to-human xenotransplantation research. International Journal of Molecular Sciences. 22 (6), 3196 (2021).
- Cooper, D. K., Koren, E., Oriol, R.
- Cozzi, E., White, D. J. G. The generation of transgenic pigs as potential organ donors for humans. Nature Medicine. 1 (9), 964-966 (1995).
- Phelps, C. J., et al.
