Abstract
El endotelio es una estructura dinámica integrada que desempeña un papel importante en muchas funciones fisiológicas como la angiogénesis, la hemostasia, la inflamación y la homeostasis. El endotelio también juega un papel importante en fisiopatologías como la aterosclerosis, la hipertensión y la diabetes. Las células endoteliales forman el revestimiento interno de los vasos sanguíneos y linfáticos y muestran heterogeneidad en estructura y función. Varios grupos han evaluado la funcionalidad de las células endoteliales derivadas de la sangre periférica humana con un enfoque en las células progenitoras endoteliales derivadas de células madre hematopoyéticas o células endoteliales maduras de crecimiento sanguíneo (o células formadoras de colonias endoteliales). Estas células proporcionan un recurso autólogo para la terapéutica y el modelado de enfermedades. Las células xenogénicas pueden proporcionar una fuente alternativa de terapéutica debido a su disponibilidad y homogeneidad logradas mediante el uso de animales genéticamente similares criados en condiciones similares. Por lo tanto, se ha presentado un protocolo robusto para el aislamiento y la expansión de células endoteliales de crecimiento sanguíneo altamente proliferativo de sangre periférica porcina. Estas células se pueden utilizar para numerosas aplicaciones, como ingeniería de tejidos cardiovasculares, terapia celular, modelado de enfermedades, detección de fármacos, estudio de la biología de las células endoteliales y cocultivos in vitro para investigar las respuestas inflamatorias y de coagulación en el xenotrasplante.
Introduction
El endotelio es una estructura altamente compleja y dinámica y un componente vital de la pared vascular. Recubre la superficie interna de los vasos sanguíneos para proporcionar una interfaz física entre la sangre circulante y los tejidos circundantes. Se sabe que esta estructura heterogénea realiza diversas funciones como angiogénesis, inflamación, vasoregulación y hemostasia 1,2,3,4. Las células endoteliales de la vena umbilical humana son un tipo de célula ampliamente estudiado para evaluar la funcionalidad de las células endoteliales. Sin embargo, la variabilidad del lote específica del paciente, el fenotipo inconsistente y la eficiencia mínima de división sugieren la necesidad de determinar una fuente celular que pueda mejorar todas estas características5.
Obtener una población homogénea de células endoteliales primarias puede ser técnicamente difícil, y las células endoteliales primarias no poseen una alta capacidad proliferativa6. Por lo tanto, para estudiar la regeneración vascular y evaluar los procesos fisiopatológicos, varios grupos han tratado de obtener y evaluar diferentes tipos de células endoteliales derivadas de sangre periférica, por ejemplo, células progenitoras endoteliales (CPE) o células endoteliales de crecimiento sanguíneo (BOEC)6,7,8,9 . Las EPC tempranas en forma de huso se originan a partir de células madre hematopoyéticas (HSC) y tienen una potencia de crecimiento limitada y una capacidad angiogénica limitada para producir células endoteliales maduras. Además, se parecen mucho a los monocitos inflamatorios. Además, su capacidad para diferenciarse aún más en células endoteliales funcionales, proliferantes y maduras sigue siendo discutible 6,7,9,10. El cultivo continuo de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) puede dar lugar a una población secundaria de células conocidas como EPC de crecimiento tardío, BOEC o células formadoras de colonias endoteliales (ECFC)6,7,9,10. Medina et al. en 2018, reconocieron las limitaciones de los EPC, la ambigüedad de su nomenclatura, junto con una falta general de concordancia con muchos tipos de células distintas agrupadas continuamente bajo EPC11. En contraste, los BOEC han sido reconocidos por su papel en la reparación vascular, la salud y la enfermedad, y la terapia celular. El estudio adicional y el uso terapéutico de estas células se basarán en protocolos para derivar consistentemente estos tipos de células a partir de células progenitoras circulantes.
Las células primarias como los BOEC pueden ser utilizadas como sustituto para obtener células endoteliales maduras altamente proliferativas6. Los BOEC son fenotípicamente distintos de los EPC tempranos y exhiben características endoteliales típicas, como la morfología de los adoquines y la expresión de uniones adherentes y caveolas12. El perfil genético de Hebbel et al.13,14,15 encontró que los BOEC o ECFC son las verdaderas células endoteliales, ya que promueven la formación de vasos microvasculares y grandes. Así, los BOEC pueden ser utilizados como herramienta para evaluar procesos fisiopatológicos y variación genética16. También se consideran una excelente fuente celular para la terapia celular para la regeneración vascular17. Por lo tanto, un protocolo estandarizado para derivar consistentemente estas células altamente proliferativas es esencial.
Mientras que los BOEC proporcionan una herramienta poderosa para estudiar la variación fisiopatológica y genética humana, una fuente más homogénea de BOEC puede proporcionar resultados experimentales y terapéuticos más sólidos y confiables. Se puede lograr una homogeneidad superior utilizando fuentes celulares xenogénicas derivadas de animales genéticamente similares criados en condiciones similares18. Si bien las fuentes de células xenogénicas son propensas a provocar una respuesta inmune del huésped, se están desarrollando estrategias de inmunomodulación con el objetivo de generar animales y productos animales inmunocompatibles, incluidas las células. Los cerdos, en particular, son una fuente abundante de sangre periférica y se usan comúnmente para estudiar dispositivos médicos y otras terapias debido a las similitudes anatómicas y fisiológicas con los humanos. Por lo tanto, este estudio refina el protocolo para el aislamiento y la expansión de BOEC altamente proliferativos de sangre periférica porcina. El protocolo detallado a continuación es un método sencillo y confiable para obtener una gran cantidad de BOEC a partir de un volumen relativamente pequeño de sangre. Los cultivos se pueden expandir a través de varios pasajes para generar millones de células a partir de una sola muestra de sangre.
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Protocol
Todos los estudios en animales fueron aprobados por los respectivos Comités Institucionales de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) en el Colegio Médico de Wisconsin y Mayo Clinic.
NOTA: En este estudio, se utilizaron cerdos domésticos cruzados Yorkshire/Landrace/Duroc (Sus domesticus), machos y hembras, 40-80 kg, 3-6 meses de edad.
1. Recolección de sangre periférica porcina
- Preparar materiales.
- Diluir la solución de heparina a 100 U/ml en solución salina estéril.
- Agregue 3-4 ml de solución de heparina a cada uno de los dos tubos cónicos de 50 ml y dos jeringas de 60 ml.
- Extraiga la solución de heparina sin diluir (1,000 U/ml) en un tubo de extensión.
- Conecte una aguja de 19 G a un extremo del tubo de extensión lleno de heparina y una jeringa de 60 ml que contenga heparina al otro extremo.
- Anestesiar a un cerdo de acuerdo con las políticas institucionales
- Administrar una inyección IM de atropina (0,05 mg/kg), tiletamina/zolazepam (2-5 mg/kg) y xilazina (2 mg/kg) para inducir la anestesia.
NOTA: la anestesia adecuada se logra una vez que el animal está inconsciente y los músculos mandibulares no son rígidos. - Coloque al animal en posición supina y coloque toallas enrolladas en ambos lados para proporcionar estabilidad.
- Aplique un ungüento oftálmico en los ojos para evitar la sequedad mientras está bajo anestesia.
- Proporcione soporte térmico durante la anestesia, incluidas mantas, almohadillas térmicas y / o mesa de procedimiento calentada.
- Administrar una inyección IM de atropina (0,05 mg/kg), tiletamina/zolazepam (2-5 mg/kg) y xilazina (2 mg/kg) para inducir la anestesia.
- Limpie el área de la ingle femoral con la solución exfoliante de betadina.
- Perfore la vena o arteria femoral con la aguja de 19 G y lentamente (~1-2 ml/s) extraiga 50 ml de sangre en la jeringa.
NOTA: Dibujar demasiado rápido puede dañar las celdas. - Dejando la aguja en su lugar, doblar inmediatamente el tubo de extensión y desconectar la jeringa de 60 ml
- Transfiera lentamente la sangre a un tubo cónico de 50 ml que contenga heparina.
- Tapa herméticamente el tubo cónico de 50 ml, invierte suavemente unas cuantas veces para mezclar y colócalo en hielo.
- Conecte la jeringa restante de 60 ml que contiene heparina al tubo de extensión, desenrosque el tubo de extensión y extraiga lentamente 50 ml adicionales de sangre en la jeringa.
- Retire inmediatamente la aguja de la arteria o vena y extraiga lentamente la sangre restante del tubo de extensión a la jeringa.
- Desconecte la jeringa de 60 ml del tubo de extensión y transfiera lentamente la sangre al tubo cónico restante de 50 ml que contiene heparina.
- Tapa herméticamente el tubo cónico de 50 ml, invierte suavemente unas cuantas veces para mezclar y colócalo en hielo.
- Aplique hemostasia de presión en el área de la ingle femoral del cerdo.
- Recuperar el cerdo de acuerdo con las políticas institucionales. Monitoree continuamente al animal hasta que recupere la conciencia suficiente para mantener la decúbito esternal y regrese al área regular de alojamiento / perrera.
2. Aislamiento de células mononucleares
- Diluir la sangre 1:1 con solución salina tamponada con fosfato (PBS) en cuatro tubos cónicos de 50 ml.
NOTA: Este trabajo debe realizarse en una campana de cultivo celular utilizando una técnica aséptica para evitar contaminar el cultivo celular. - Agregue 25 ml de solución de gradiente de densidad lista para usar a temperatura ambiente a ocho tubos cónicos de 50 ml.
- Pipetear muy lentamente 25 ml de solución sanguinológica/salina a lo largo del interior de cada solución de gradiente de densidad que contenga 50 ml de tubo cónico sosteniendo el tubo en un ángulo agudo con respecto a la punta de la pipeta.
NOTA: La solución de sangre debe colocar suavemente capas sobre la solución de gradiente de densidad y mantener una interfaz bien definida. - Centrifugar los tubos durante 30 min a 560 x g y temperatura ambiente (RT).
NOTA: Para obtener los mejores resultados, desactive el freno de la centrífuga si es posible. - Utilice una pipeta delgada para recoger cuidadosamente la capa leucocitaria (capa turbia de células mononucleares por encima de la solución de gradiente de densidad y por debajo del plasma transparente) de cada tubo y distribuir uniformemente en dos nuevos tubos cónicos de 50 ml. Deseche la solución de gradiente de densidad que contiene tubos.
NOTA: Recoja la mayor cantidad posible de la capa leucocitaria mientras recoge la menor cantidad posible de la solución de gradiente de densidad y el plasma.
3. Lavado y chapado de celdas
- Cubra un plato de 6 pocillos con fibronectina.
- Haga una solución madre de fibronectina plasmática humana diluyéndola a 1 mg/ml en agua estéril. Conservar las alícuotas a -20 °C.
- Hacer 3,6 ml de una solución de trabajo de fibronectina diluyendo 600 μL de solución madre de fibronectina en 3 ml de PBS.
- Transfiera 600 μL de la solución de trabajo de fibronectina a cada pocillo de una placa de 6 pocillos y rocíe suavemente hasta que esté uniformemente recubierto.
- Espere 30 minutos para que la fibronectina cubra los pocillos y aspire suavemente la solución de cada pocillo.
- Mientras espera a que la fibronectina se cubra, lave las células mononucleares
- Rellene los tubos con hasta 45 ml de PBS
- Centrífuga durante 5 min a 560 x g y 4 °C con freno bajo. Aspire el sobrenadante de ambos tubos.
- Resuspender cada pellet celular en 25 mL de PBS.
- Repita para lavar una segunda vez.
- Resuspenda cada pellet celular en 5 ml de PBS y agregue 15 ml de solución de cloruro de amonio al 0,8% a cada tubo.
NOTA: Este paso es lisar los glóbulos rojos restantes. - Incubar en hielo durante 10 min.
- Lavar las celdas como antes rellenando los tubos con PBS y centrífuga durante 5 min a 560 x g y 4 °C con freno bajo. Aspire el sobrenadante de ambos tubos.
- Resuspenda cada pellet celular en 25 mL de PBS y repita para lavar una segunda vez.
- Resuspender cada pellet celular en 6 ml de medio de cultivo EGM-2 suplementado con suero bovino fetal al 10% (FBS) y 1x solución antibiótica/antimicótica que contiene 10.000 U/ml de penicilina, 10 mg/ml de estreptomicina y 25 μg/ml de anfotericina.
NOTA: El medio de cultivo EGM-2 consiste en un medio de cultivo EBM-2 suplementado con 200 μL de hidrocortisona, 2 ml de factor de crecimiento de fibroblastos humanos (hFGF-B), 500 μL de factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), 500 μL de análogo recombinante del factor de crecimiento similar a la insulina (R3 IGF-1), 500 μL de ácido ascórbico, 500 μL de factor de crecimiento epidérmico humano (hEGF), 500 μL de gentamicina/anfotericina y 500 μL de heparina por 500 ml. - Transfiera suavemente 2 ml de la suspensión celular a cada pocillo de la placa de 6 pocillos recubierta de fibronectina y balancee suavemente hasta que esté uniformemente recubierta.
NOTA: El objetivo es sembrar tantas células como sea posible para maximizar el número de colonias endoteliales que se formarán.
4. Cultivo celular
- Incubar las celdas a 37 °C, 5% deCO2 y 100% de humedad.
- Al día siguiente, agregue suavemente 1 ml de medio de cultivo fresco a cada pocillo.
NOTA: es importante ser cuidadoso para no alterar las células que se adhieren libremente al recubrimiento de fibronectina. - Al día siguiente, realice un cambio de medio de cultivo aspirando suavemente 1,5 ml de medio de cultivo de cada pocillo y reemplazándolo con 1,5 ml de medio de cultivo fresco.
- En cada uno de los próximos 5 días, realice suavemente un cambio completo del medio de cultivo en cada pocillo (2 ml de medio de cultivo fresco por pocillo).
- Después de eso, cambie suavemente el medio de cultivo tres veces por semana.
- Visualice regularmente los cultivos celulares bajo microscopía de luz de baja potencia (objetivo 4x).
NOTA: Las colonias de células endoteliales de crecimiento sanguíneo adherente (BOEC) comenzarán a aparecer en los pozos 7-10 días después de la placa. Los tipos de células no adherentes se descartarán con cambios en el medio, y otros tipos de células adherentes se disiparán gradualmente a medida que crezcan las colonias BOEC. - Pasar los BOEC a un matraz T-75 recubierto de fibronectina cuando ~70%-80% confluente y continuar cambiando el medio de cultivo tres veces por semana.
NOTA: La densidad de siembra se puede controlar pasando colonias a un matraz T25. Los pasajes posteriores no requieren recubrimiento de fibronectina, y los cambios en el medio de cultivo se pueden reducir a dos veces por semana. - Las células de los pasajes 1-3 pueden usarse para experimentos o transferirse a un medio de congelación y almacenarse en nitrógeno líquido para su uso futuro.
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Representative Results
La morfología de las células cultivadas se observó desde el inicio del cultivo hasta que se observaron colonias BOEC (Figura 1). Una población más pequeña de células adherentes comenzó a adherirse a las placas de cultivo y crecer, mientras que las células no adherentes se eliminaron con cambios en el medio de cultivo (Figura 1B). Las colonias aparecieron por primera vez el día 6 como una colección de células endoteliales que proliferan radialmente hacia afuera desde un punto central (Figura 1D). A medida que avanzaba el cultivo, las colonias celulares se volvieron más densas y mostraron una morfología de adoquines similar a las células endoteliales maduras (Figura 1F). La morfología típica del adoquín endotelial proporciona una fácil identificación preliminar de los BOEC utilizando un microscopio óptico.
Las colonias de células endoteliales suelen estar listas para pasar a los 10-14 días de cultivo. En este momento, la placa de 6 pocillos generalmente producirá ~ 1 millón de células con un porcentaje de viabilidad del 93% -98%. Durante el primer paso, las células endoteliales se expandirán para producir ~ 6-10 millones de células en un matraz T75.
Para evaluar la morfogénesis de los BOEC, la matriz de la membrana basal (por ejemplo, Matrigel) se colocó en placas de angiogénesis de 15 pocillos a 10 μL/pocillo y se incubó a 37 °C durante 30 min para permitir la polimerización. Las células del pasaje 2 se sembraron en placas recubiertas de matriz de membrana basal y se obtuvieron imágenes en puntos de tiempo de 14 h y 24 h. Una densidad de aproximadamente 3.500 células por pozo fue capaz de formar una red y estructuras tubulares. La formación de tubos se observó dentro de las 14 h para el medio libre de suero (EGM-2 con suplementos excepto para FBS) y dentro de las 24 h para el medio de crecimiento completo (EGM-2 con suplementos que incluyen FBS). La adición de FBS puede haber diluido los factores de crecimiento específicos de las células endoteliales (por ejemplo, VEGF) e introducido otros factores de señalización que resultan en el retraso del proceso de formación del tubo. Se utilizó microscopía de contraste de fase 2D para obtener imágenes de la formación de tubos en medio libre de suero (Figura 2A, B) y medio de crecimiento completo (Figura 2C, D). Las células en ambas condiciones de medios experimentaron diferenciación morfológica y se organizaron rápidamente en extensas redes de estructuras en forma de tubo capilar. Estas estructuras estaban compuestas de cordones celulares organizados que se asemejaban a redes capilares in vivo. Además, las micrografías con un aumento de 20x ilustran en detalle la compleja organización multicelular de las células endoteliales y su diferenciación morfológica. No se observaron diferencias morfológicas entre las condiciones de los medios. La extensa red de estructuras en forma de tubo capilar sugiere fuertemente la diferenciación de células cultivadas en células endoteliales maduras y funcionales.
Los BOEC se caracterizaron además por la expresión del marcador de células endoteliales maduras CD31 o molécula de adhesión de células endoteliales plaquetarias-1 (PECAM1) (Figura 3A, B). Los BOEC mostraron una expresión uniforme de CD31. Además, el análisis de citometría de flujo confirmó la ausencia de EPC ya que las células se tiñeron de negativo para el marcador de monocitos CD14 en comparación con el grupo control positivo de PBMC (Figura 3C, D).
Figura 1: Imágenes de microscopía óptica fenotípica. Las imágenes de microscopía óptica de BOEC cultivadas observadas con un aumento de 10x en (A) día 0, (B) día 2, (C) día 4, (D) día 6, (E) día 8 y (F) después del primer paso. Barras de escala: 200 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Diferenciación morfológica y organización del pasaje 2 BOECs. La diferenciación morfológica y la organización del paso 2 BOEC en estructuras tubulares capilares se observó en la matriz de la membrana basal dentro de las 14 h para el medio libre de suero y dentro de las 24 h para el medio de crecimiento completo. (A) Medio libre de suero a 4x, (B) medio sin suero a 20x, (C) Medio de crecimiento completo a 4x y (D) Medio de crecimiento completo a 20x. Barras de escala: 200 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Caracterización de BOECs con CD31 y CD14. (A) Los BOEC del pasaje 2-3 se tiñeron para PECAM1 utilizando anticuerpos anti-CD31-FITC vistos en verde y (B) imágenes de microscopía de contraste de fase correspondientes. Las células se tiñeron en suspensión, y la suspensión se fotografió en un portaobjetos de microscopio. Barras de escala: 200 μm. (C) Análisis de citometría de flujo de BOEC con anticuerpos CD14-AF700 en comparación con (D) células mononucleares de sangre periférica de control positivo (PBMC). La tinción CD14 positiva se muestra en azul y las células no teñidas se muestran en rojo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Los BOEC son una poderosa herramienta que puede ser utilizada en diversos enfoques científicos y terapéuticos 7,8,16. Los BOEC se han utilizado para analizar la expresión génica de la CE para dilucidar los factores clave responsables del desarrollo de enfermedades vasculares y cáncer 5,19,20,21. Los BOEC también se han utilizado en aplicaciones terapéuticas como la regeneración vascular y la administración de genes22,23,24. Los BOEC modificados genéticamente han sido conocidos por su capacidad terapéutica antiangiogénicatumoral 25,26. Además, el potencial angiogénico de los BOEC los convierte en excelentes candidatos para terapias celulares con el objetivo de vascularización y neovascularización17,27. A pesar de que varios estudios describen cómo obtener BOEC de sangre periférica humana 6,7,8,9, la variabilidad de las fuentes de células humanas debido a la variación fisiopatológica y genética subyacente sugiere una necesidad crítica de obtener BOEC de fuentes xenogénicas sanas 9,13,18.
Se ha presentado un protocolo detallado para derivar eficientemente BOEC de células mononucleares de sangre periférica porcina. Los pasos críticos incluyen el procesamiento de muestras de sangre tan pronto como sea posible y la recolección eficiente de capas de capa leucocitaria después de la centrifugación por gradiente de densidad para maximizar el número de PBMC viables que ingresan al cultivo. La densidad de recubrimiento inicial y el paso oportuno de las células son consideraciones importantes para obtener un aislamiento consistente de estos tipos de células. Un volumen sanguíneo inicial de 100 ml proporciona un número apropiado de PBMC para una sola placa de seis pocillos. Cabe señalar que el volumen máximo de sangre que se puede recolectar de manera segura de un cerdo variará con el peso corporal del animal. Una recolección de volumen de sangre máxima segura y segura sugerida para cerdos es de 8 ml por kg de peso corporal. Además, el paso oportuno de las colonias iniciales del pasaje 0 al pasaje 1 también es esencial. Las células dejan de proliferar si la densidad de siembra es muy baja o si las células alcanzan la confluencia. A medida que las células se vuelven confluentes, comienzan a transformarse en una morfología y fenotipo mesenquimal alargados. La densidad de siembra también se puede controlar pasando colonias a un matraz T25 en lugar de un matraz T75. Se requiere una consideración cuidadosa para no perder los tipos de células adherentes durante el cambio inicial de medios, ya que es muy imperativo capturar tantas células adherentes como sea posible mientras se descartan las EPC no adherentes. Este protocolo produce colonias de células de crecimiento en aproximadamente 1 semana.
El protocolo es altamente reproducible y confiable. Las colonias de células endoteliales en expansión se logran en aproximadamente el 90% -95% de los cultivos. El fracaso se debe típicamente a la falta de formación de colonias de células endoteliales, lo que significa que si se forma al menos una colonia de células endoteliales, casi siempre procederán a expandirse en cultivo. Las fuentes de falla incluyen variabilidad aleatoria, cizallamiento excesivo de células durante la recolección de sangre, microbios contaminantes en el cultivo y alta pérdida de células mononucleares durante los pasos de procesamiento. Después de un cultivo fallido, un segundo cultivo típicamente será exitoso, lo que indica que la variabilidad entre los animales no es un factor importante. El protocolo es incluso exitoso cuando se recolecta sangre inmediatamente después de la eutanasia, lo que indica que los pasos de lavado reducen eficientemente los agentes de eutanasia a niveles inocuos.
Independientemente de la heterogeneidad en la población de células sanguíneas circulantes, se obtuvieron BOEC que son muy distintas de las EPC. Los BOEC se derivan de un pequeño subconjunto de PBMC adherentes que carecen de expresión de CD14. Esto fue confirmado por la ausencia de tinción CD14 (Figura 3C, D). El aclaramiento de EPC monocíticos de cultivos BOEC en pasajes tempranos puede explicarse por muerte celular o no adherencia. La morfología empedrada de los BOEC (Figura 1E,F) sugiere un fenotipo endotelial pronunciado. Además, la expresión uniforme del marcador de superficie CD31 (Figura 3A) implica una población homogénea de células endoteliales maduras. Además, la morfogénesis capilar de los BOEC tanto en medios libres de suero (Figura 2A,B) como en medios de crecimiento completos (Figura 2C,D) muestra su capacidad angiogénica inherente 6,8. Análisis previos de BOECs porcinos generados usando este protocolo ha demostrado que estas células son adicionalmente positivas para la expresión del factor von Willebrand y la unión a lectinas28.
La abundancia de PBMC en la sangre circulante, de la que emergen los BOEC, respalda la viabilidad de un método robusto para obtener un suministro prácticamente ilimitado de BOEC terapéuticos de origen animal. Una vez que se domina la técnica, los BOEC se pueden usar para varias aplicaciones, incluida la reparación y regeneración vascular, el modelado de enfermedades, la detección de medicamentos y los estudios de biología celular endotelial. Se necesitan estudios en curso para confirmar la homogeneidad de los BOEC porcinos y su compatibilidad como fuente terapéutica en humanos.
Una limitación de este protocolo es el riesgo de que las colonias de células endoteliales en expansión no puedan generarse. La tasa de fracaso se estima en 5% -10%, y en estos casos, es necesario un segundo intento. Cuando la garantía de éxito es importante, se puede recolectar el doble de sangre y el protocolo se puede seguir en paralelo para producir dos cultivos independientes. Además, nuestra experiencia se limita a cerdos domésticos cruzados Yorkshire / Landrace / Duroc sanos (Sus domesticus), machos y hembras, 40-80 kg, 3-6 meses de edad. Las tasas de éxito con otras razas, edades y condiciones experimentales son desconocidas.
Otra limitación del protocolo es que no existe un marcador definitivo para el fenotipo BOEC. Aquí y en trabajos anteriores28, los BOEC porcinos generados a partir de este protocolo han sido caracterizados para varios marcadores BOEC, pero la comprensión del fenotipo BOEC continúa evolucionando. Los BOEC también se caracterizan en los pasajes 2-3 y el fenotipo en los pasajes superiores es desconocido. Una ventaja de los BOEC porcinos en comparación con los humanos es el suministro inmediato de sangre de cerdo, lo que permite la generación de cultivos más frecuentes y un suministro robusto de células consistentes y de bajo paso.
Una de las principales limitaciones del uso de células porcinas en enfoques terapéuticos es la respuesta inmune del huésped29. Se están investigando varias estrategias de inmunomodulación para mitigar la inmunogenicidad de las células xenogénicas para el trasplante humano, como los agentes antiinflamatorios y la manipulación genética CRISPR/Cas30,31,32. Estudios más recientes han propuesto la expresión de proteínas reguladoras complementarias humanas (hCRPs)33 y la introducción de α1,3-galactosiltransferasa eliminada (GTKO)32,34 cerdos. Estos avances son prometedores para la aplicación terapéutica de células xenogénicas, incluidos los BOEC porcinos.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores desean reconocer la financiación de NIH / NHLBI R00 HL129068.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 19 G needle | Covidien | 1188818112 | |
| 50 mL conical tubes | Corning | 352098 | |
| 6 well plate | BD Falcon | 353046 | |
| 60 mL syringes | Covidien | 8881560125 | |
| Ammonium chloride solution (0.8%) | Stemcell Technologies | 07850 | |
| Antibiotic/antimycotic solution (100x) | Gibco | 15240-062 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 75-253-839 | |
| EGM-2 culture medium | Lonza Walkersville | CC-3162 | |
| Extension tube | Hanna Pharmaceutical Supply Co. | 03382C6227 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Atlas Biologicals | F-0500-A | |
| Ficoll-Paque 1077 | Cytiva | 17144003 | Density gradient solution |
| Heparin sodium injection (1,000 units/mL) | Pfizer | 00069-0058-01 | |
| Human plasma fibronectin | Gibco | 33016-015 | |
| Ice | N/A | N/A | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-023 | |
| Pipette set | Eppendorf | 2231300004 | |
| Sterile water | Gibco | 15230-162 | |
| Thin pipette | Celltreat Scientific | 229280 |
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