Abstract
Das Endothel ist eine dynamische, integrierte Struktur, die eine wichtige Rolle bei vielen physiologischen Funktionen wie Angiogenese, Hämostase, Entzündung und Homöostase spielt. Das Endothel spielt auch eine wichtige Rolle bei Pathophysiologien wie Arteriosklerose, Bluthochdruck und Diabetes. Endothelzellen bilden die innere Auskleidung von Blut- und Lymphgefäßen und weisen eine Heterogenität in Struktur und Funktion auf. Verschiedene Gruppen haben die Funktionalität von Endothelzellen aus menschlichem peripherem Blut evaluiert, wobei der Schwerpunkt auf endothelialen Vorläuferzellen liegt, die aus hämatopoetischen Stammzellen oder reifen Endothelzellen (oder endothelialen koloniebildenden Zellen) stammen. Diese Zellen stellen eine autologe Ressource für Therapeutika und die Modellierung von Krankheiten dar. Xenogene Zellen können aufgrund ihrer Verfügbarkeit und Homogenität, die durch die Verwendung genetisch ähnlicher Tiere, die unter ähnlichen Bedingungen aufgezogen wurden, erreicht werden, eine alternative Quelle für Therapeutika darstellen. Daher wurde ein robustes Protokoll für die Isolierung und Expansion von hochproliferativen Endothelzellen aus porcinem peripherem Blut vorgestellt. Diese Zellen können für zahlreiche Anwendungen verwendet werden, z. B. für das kardiovaskuläre Gewebezüchten, die Zelltherapie, die Modellierung von Krankheiten, das Screening von Medikamenten, die Untersuchung der Biologie von Endothelzellen und In-vitro-Kokulturen zur Untersuchung von Entzündungs- und Gerinnungsreaktionen bei der Xenotransplantation.
Introduction
Das Endothel ist ein hochkomplexes, dynamisches Gebilde und ein wichtiger Bestandteil der Gefäßwand. Es kleidet die innere Oberfläche der Blutgefäße aus, um eine physikalische Schnittstelle zwischen zirkulierendem Blut und dem umgebenden Gewebe zu schaffen. Es ist bekannt, dass diese heterogene Struktur verschiedene Funktionen wie Angiogenese, Entzündung, Vasoregulation und Hämostase ausübt 1,2,3,4. Humane Nabelvenen-Endothelzellen sind ein umfassend untersuchter Zelltyp, um die Funktionalität von Endothelzellen zu beurteilen. Die patientenspezifische Chargenvariabilität, der inkonsistente Phänotyp und die minimale Teilungseffizienz deuten jedoch darauf hin, dass eine Zellquelle bestimmt werden muss, die all diese Merkmale verbessern könnte5.
Eine homogene Population von primären Endothelzellen zu erhalten, kann eine technische Herausforderung darstellen, und primäre Endothelzellen besitzen keine hohe proliferative Kapazität6. Um die vaskuläre Regeneration zu untersuchen und pathophysiologische Prozesse zu bewerten, haben verschiedene Gruppen versucht, verschiedene Arten von Endothelzellen aus peripherem Blut zu erhalten und zu bewerten, z. B. Endothelvorläuferzellen (EPCs) oder Blutauswuchs-Endothelzellen (BOECs)6,7,8,9 . Die spindelförmigen frühen EPCs stammen aus hämatopoetischen Stammzellen (HSCs) und haben eine begrenzte Wachstumspotenz und eine begrenzte angiogene Fähigkeit, reife Endothelzellen zu produzieren. Darüber hinaus ähneln sie entzündlichen Monozyten sehr. Darüber hinaus ist ihre Fähigkeit, sich weiter in funktionsfähige, proliferierende, reife Endothelzellen zu differenzieren, noch umstritten 6,7,9,10. Die kontinuierliche Kultivierung von mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) kann zu einer sekundären Population von Zellen führen, die als Late-Outgrowth-EPCs, BOECs oder endotheliale koloniebildende Zellen (ECFCs) bekannt sind6,7,9,10. Medina et al. erkannten 2018 die Grenzen von EPCs, die Mehrdeutigkeit ihrer Nomenklatur sowie einen allgemeinen Mangel an Übereinstimmung mit vielen verschiedenen Zelltypen an, die kontinuierlich unter EPCs11 gruppiert werden. Im Gegensatz dazu sind BOECs für ihre Rolle bei der Gefäßreparatur, Gesundheit und Krankheit sowie der Zelltherapie anerkannt. Weitere Studien und therapeutische Anwendungen dieser Zellen werden sich auf Protokolle stützen, um diese Zelltypen konsistent aus zirkulierenden Vorläuferzellen abzuleiten.
Primärzellen wie BOECs können als Surrogat verwendet werden, um hochproliferative reife Endothelzellen zu erhalten6. BOECs unterscheiden sich phänotypisch von frühen EPCs und weisen typische endotheliale Merkmale wie die Morphologie des Kopfsteinpflasters und die Expression von Adhärenzkontakten und Caveolaeauf 12. Das Gen-Profiling von Hebbel et al.13,14,15 ergab, dass BOECs oder ECFCs die wahren Endothelzellen sind, da sie die Bildung von mikrovaskulären und großen Gefäßen fördern. Somit können BOECs als Werkzeug zur Bewertung pathophysiologischer Prozesse und genetischer Variation verwendet werden16. Sie gelten auch als hervorragende Zellquelle für die Zelltherapie zur Gefäßregeneration17. Daher ist ein standardisiertes Protokoll zur konsistenten Gewinnung dieser hochproliferativen Zellen unerlässlich.
Während BOECs ein leistungsfähiges Werkzeug für die Untersuchung der pathophysiologischen und genetischen Variation des Menschen darstellen, kann eine homogenere Quelle von BOECs robustere und zuverlässigere experimentelle und therapeutische Ergebnisse liefern. Eine überlegene Homogenität kann durch die Verwendung von xenogenen Zellquellen erreicht werden, die von genetisch ähnlichen Tieren stammen, die unter ähnlichen Bedingungen aufgezogen wurden18. Während xenogene Zellquellen dazu neigen, eine Immunantwort des Wirts hervorzurufen, werden Immunmodulationsstrategien mit dem Ziel entwickelt, immunkompatible Tiere und tierische Produkte, einschließlich Zellen, zu erzeugen. Insbesondere Schweine sind eine ergiebige Quelle für peripheres Blut und werden aufgrund anatomischer und physiologischer Ähnlichkeiten mit dem Menschen häufig zur Untersuchung von Medizinprodukten und anderen Therapien verwendet. Daher verfeinert diese Studie das Protokoll für die Isolierung und Expansion hochproliferativer BOECs aus porcinem peripherem Blut. Das unten beschriebene Protokoll ist eine einfache und zuverlässige Methode, um eine große Anzahl von BOECs aus einer relativ kleinen Blutmenge zu gewinnen. Die Kulturen können über mehrere Passagen erweitert werden, um aus einer einzigen Blutprobe Millionen von Zellen zu erzeugen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle Tierversuche wurden von den jeweiligen Institutional Animal Care and Use Committees (IACUC) am Medical College of Wisconsin und der Mayo Clinic genehmigt.
HINWEIS: In dieser Studie wurden Yorkshire/Landrace/Duroc-Kreuzungsschweine (Sus domesticus), männlich und weiblich, 40-80 kg, 3-6 Monate alt, verwendet.
1. Entnahme von peripherem Schweineblut
- Bereiten Sie Materialien vor.
- Heparinlösung in steriler Kochsalzlösung auf 100 U/ml verdünnen.
- Geben Sie jeweils 3-4 ml Heparinlösung in zwei konische 50-ml-Röhrchen und zwei 60-ml-Spritzen.
- Ziehen Sie unverdünnte Heparinlösung (1.000 U/ml) in ein Verlängerungsröhrchen.
- Verbinden Sie eine 19-G-Nadel mit einem Ende des mit Heparin gefüllten Verlängerungsröhrchens und eine Heparin-haltige 60-ml-Spritze mit dem anderen Ende.
- Betäubung eines Schweins gemäß den institutionellen Richtlinien
- Verabreichen Sie eine i.m. Injektion von Atropin (0,05 mg/kg), Tiletamin/Zolazepam (2-5 mg/kg) und Xylazin (2 mg/kg), um eine Anästhesie einzuleiten.
HINWEIS: Eine angemessene Anästhesie wird erreicht, sobald das Tier bewusstlos ist und die Unterkiefermuskulatur nicht starr ist. - Legen Sie das Tier in Rückenlage und legen Sie zusammengerollte Handtücher auf beide Seiten, um für Stabilität zu sorgen.
- Tragen Sie eine Augensalbe auf die Augen auf, um Trockenheit unter Narkose zu vermeiden.
- Bieten Sie während der Anästhesie thermische Unterstützung, einschließlich Decken, Heizkissen und/oder beheiztem Behandlungstisch.
- Verabreichen Sie eine i.m. Injektion von Atropin (0,05 mg/kg), Tiletamin/Zolazepam (2-5 mg/kg) und Xylazin (2 mg/kg), um eine Anästhesie einzuleiten.
- Reinigen Sie die Oberschenkelleiste mit Betadine-Peelinglösung.
- Punktieren Sie die Femurvene oder -arterie mit der 19-G-Nadel und ziehen Sie langsam (~1-2 ml/s) 50 ml Blut in die Spritze.
HINWEIS: Ein zu schnelles Zeichnen kann die Zellen beschädigen. - Lassen Sie die Nadel an Ort und Stelle, knicken Sie sofort den Verlängerungsschlauch und trennen Sie die 60-ml-Spritze
- Das Blut wird langsam in ein heparinhaltiges konisches 50-ml-Röhrchen überführt.
- Verschließen Sie das konische 50-ml-Röhrchen fest, drehen Sie es zum Mischen einige Male vorsichtig um und legen Sie es auf Eis.
- Schließen Sie die verbleibende 60-ml-Spritze mit Heparin an das Verlängerungsröhrchen an, knicken Sie das Verlängerungsröhrchen auf und ziehen Sie langsam weitere 50 ml Blut in die Spritze.
- Entfernen Sie sofort die Nadel aus der Arterie oder Vene und saugen Sie langsam das restliche Blut aus dem Verlängerungsschlauch in die Spritze.
- Trennen Sie die 60-ml-Spritze vom Verlängerungsschlauch und übertragen Sie das Blut langsam in den verbleibenden heparinhaltigen konischen 50-ml-Röhrchen.
- Verschließen Sie das konische 50-ml-Röhrchen fest, drehen Sie es zum Mischen einige Male vorsichtig um und legen Sie es auf Eis.
- Üben Sie eine Druckhämostase auf die Oberschenkelleistengegend des Schweins aus.
- Erholen Sie das Schwein gemäß den institutionellen Richtlinien. Überwachen Sie das Tier kontinuierlich, bis es wieder genügend Bewusstsein erlangt hat, um das Brustbein beizubehalten und in den regulären Stall-/Zwingerbereich zurückzukehren.
2. Isolierung mononukleärer Zellen
- Verdünnen Sie das Blut 1:1 mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) in vier konischen 50-ml-Röhrchen.
HINWEIS: Diese Arbeiten müssen in einer Zellkulturhaube mit einer aseptischen Technik durchgeführt werden, um eine Kontamination der Zellkultur zu vermeiden. - Geben Sie 25 ml gebrauchsfertige Dichtegradientenlösung bei Raumtemperatur in acht konische 50-ml-Röhrchen.
- Pipettieren Sie sehr langsam 25 ml Blut-/Kochsalzlösung entlang der Innenseite jeder Dichtegradientenlösung, die ein konisches 50-ml-Röhrchen enthält, indem Sie das Röhrchen in einem spitzen Winkel zur Pipettenspitze halten.
Anmerkungen: Die Blutlösung sollte sich sanft über die Dichtegradientenlösung legen und eine gut definierte Grenzfläche beibehalten. - Zentrifugieren Sie die Röhrchen 30 Minuten lang bei 560 x g und Raumtemperatur (RT).
Anmerkungen: Um optimale Ergebnisse zu erzielen, deaktivieren Sie nach Möglichkeit die Zentrifugenbremse. - Verwenden Sie eine dünne Pipette, um den Buffy-Coat (trübe Schicht mononukleärer Zellen über der Dichtegradientenlösung und unter dem klaren Plasma) vorsichtig aus jedem Röhrchen zu entnehmen und gleichmäßig in zwei neue konische 50-ml-Röhrchen zu verteilen. Verwerfen Sie die Dichtegradientenlösung, die Rohre enthält.
HINWEIS: Sammeln Sie so viel wie möglich vom Buffy-Mantel und sammeln Sie so wenig wie möglich von der Dichtegradientenlösung und dem Plasma.
3. Waschen und Beschichten der Zellen
- Eine 6-Well-Platte mit Fibronektin bestreichen.
- Stellen Sie eine Stammlösung von Fibronektin im menschlichen Plasma her, indem Sie sie in sterilem Wasser auf 1 mg/ml verdünnen. Lagern Sie die Aliquots bei -20 °C.
- Stellen Sie 3,6 ml einer Arbeitslösung von Fibronektin her, indem Sie 600 μl Fibronektin-Stammlösung in 3 ml PBS verdünnen.
- Übertragen Sie 600 μl der Fibronektin-Arbeitslösung in jede Vertiefung einer 6-Well-Platte und schütteln Sie sie vorsichtig, bis sie gleichmäßig bedeckt ist.
- Warten Sie 30 Minuten, bis das Fibronektin die Vertiefungen beschichtet hat, und saugen Sie die Lösung vorsichtig aus jeder Vertiefung ab.
- Während Sie darauf warten, dass sich das Fibronektin bedeckt, waschen Sie die mononukleären Zellen
- Füllen Sie die Röhrchen mit bis zu 45 ml PBS auf
- 5 min bei 560 x g und 4 °C mit niedriger Bremse zentrifugieren. Saugen Sie den Überstand aus beiden Röhrchen ab.
- Resuspendieren Sie jedes Zellpellet in 25 ml PBS.
- Wiederholen Sie den Vorgang, um ein zweites Mal zu waschen.
- Jedes Zellpellet wird in 5 ml PBS resuspendiert und 15 ml 0,8%ige Ammoniumchloridlösung in jedes Röhrchen gegeben.
HINWEIS: Dieser Schritt dient dazu, die verbleibenden roten Blutkörperchen zu lysieren. - 10 Minuten auf Eis inkubieren.
- Waschen Sie die Zellen wie zuvor, indem Sie die Röhrchen mit PBS auffüllen und 5 min bei 560 x g und 4 °C mit niedriger Bremse zentrifugieren. Saugen Sie den Überstand aus beiden Röhrchen ab.
- Resuspendieren Sie jedes Zellpellet in 25 ml PBS und wiederholen Sie den Vorgang zum zweiten Waschen.
- Resuspendieren Sie jedes Zellpellet in 6 ml EGM-2-Nährmedium, ergänzt mit 10 % fötalem Kälberserum (FBS) und 1x antibiotischer/antimykotischer Lösung, die 10.000 U/ml Penicillin, 10 mg/ml Streptomycin und 25 μg/ml Amphotericin enthält.
HINWEIS: EGM-2-Nährmedium besteht aus EBM-2-Nährmedium, ergänzt mit 200 μl Hydrocortison, 2 ml humanem Fibroblasten-Wachstumsfaktor (hFGF-B), 500 μl vaskulärem endothelialem Wachstumsfaktor (VEGF), 500 μl rekombinantem Analogon des insulinähnlichen Wachstumsfaktors (R3 IGF-1), 500 μl Ascorbinsäure, 500 μl humanem epidermalem Wachstumsfaktor (hEGF), 500 μl Gentamicin/Amphotericin und 500 μl Heparin pro 500 ml. - Übertragen Sie vorsichtig 2 ml der Zellsuspension in jede Vertiefung der mit Fibronektin beschichteten 6-Well-Platte und schütteln Sie sie vorsichtig, bis sie gleichmäßig bedeckt ist.
HINWEIS: Das Ziel ist es, so viele Zellen wie möglich zu besiedeln, um die Anzahl der sich bildenden Endothelkolonien zu maximieren.
4. Zellkultur
- Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C, 5 % CO2 und 100 % Luftfeuchtigkeit.
- Geben Sie am nächsten Tag vorsichtig 1 ml frisches Nährmedium in jede Vertiefung.
HINWEIS: Es ist wichtig, vorsichtig zu sein, um Zellen, die lose an der Fibronektinbeschichtung haften, nicht zu stören. - Führen Sie am nächsten Tag einen halben Nährmedienwechsel durch, indem Sie vorsichtig 1,5 ml Nährmedium aus jeder Vertiefung absaugen und durch 1,5 ml frisches Nährmedium ersetzen.
- Führen Sie an jedem der nächsten 5 Tage vorsichtig einen vollständigen Nährmedienwechsel in jeder Vertiefung durch (2 ml frisches Nährmedium pro Vertiefung).
- Wechseln Sie danach das Nährmedium dreimal pro Woche vorsichtig.
- Visualisieren Sie die Zellkulturen regelmäßig unter Lichtmikroskopie mit geringer Leistung (4x Objektiv).
HINWEIS: Adhärente Kolonien von Blutauswuchs-Endothelzellen (BOEC) beginnen 7-10 Tage nach dem Ausplattieren in den Vertiefungen zu erscheinen. Nicht adhärente Zelltypen werden mit mittleren Veränderungen verworfen, und andere adhärente Zelltypen werden sich allmählich auflösen, wenn die BOEC-Kolonien wachsen. - Wenn ~70%-80% konfluieren, werden die BOECs in einen mit Fibronektin beschichteten T-75-Kolben geleitet und das Nährmedium dreimal pro Woche gewechselt.
Anmerkungen: Die Aussaatdichte kann gesteuert werden, indem die Kolonien stattdessen in einen T25-Kolben geleitet werden. Nachfolgende Passagen erfordern keine Fibronektinbeschichtung, und der Wechsel des Nährmediums kann auf zwei Mal pro Woche reduziert werden. - Zellen aus den Gängen 1-3 können für Experimente verwendet oder in ein Gefriermedium überführt und für die zukünftige Verwendung in flüssigem Stickstoff gelagert werden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Die Morphologie der kultivierten Zellen wurde vom Beginn der Kultur bis zur Beobachtung von BOEC-Kolonien beobachtet (Abbildung 1). Eine kleinere Population adhärenter Zellen begann sich an die Kulturschalen anzuheften und zu wachsen, während nicht-adhärente Zellen mit Nährmedienwechsel entfernt wurden (Abbildung 1B). Die Kolonien erschienen erstmals an Tag 6 als eine Ansammlung von endothelialen Zellen, die von einem zentralen Punkt aus radial nach außen proliferierten (Abbildung 1D). Im Laufe der Kultur wurden die Zellkolonien dichter und wiesen eine Kopfsteinpflastermorphologie auf, die reifen Endothelzellen ähnelte (Abbildung 1F). Die typische endotheliale Kopfsteinpflastermorphologie ermöglicht eine einfache vorläufige Identifizierung von BOECs mit einem Lichtmikroskop.
Endothelzellkolonien sind in der Regel nach 10-14 Tagen Kultur bereit für die Passage. Zu diesem Zeitpunkt liefert die 6-Well-Platte in der Regel ~1 Million Zellen mit einer prozentualen Viabilität von 93 % bis 98 %. Während der ersten Passage dehnen sich Endothelzellen aus, um ~6-10 Millionen Zellen in einem T75-Kolben zu erhalten.
Um die Morphogenese von BOECs zu untersuchen, wurde die Basalmembranmatrix (z.B. Matrigel) auf 15-Well-Angiogeneseplatten bei 10 μL/Well plattiert und bei 37 °C für 30 min inkubiert, um eine Polymerisation zu ermöglichen. Die Zellen der Passage 2 wurden auf mit Basalmembranmatrix-beschichteten Platten ausgesät und zu 14 h- und 24 h-Zeitpunkten abgebildet. Eine Dichte von ca. 3.500 Zellen pro Bohrung war in der Lage, ein Netzwerk und röhrenartige Strukturen zu bilden. Die Bildung von Röhrchen wurde innerhalb von 14 h für serumfreies Medium (EGM-2 mit Supplementen außer FBS) und innerhalb von 24 h für komplettes Nährmedium (EGM-2 mit Supplementen mit FBS) festgestellt. Die Zugabe von FBS könnte die Endothelzell-spezifischen Wachstumsfaktoren (z. B. VEGF) verdünnt und andere Signalfaktoren eingeführt haben, die zu einer Verzögerung des Röhrenbildungsprozesses führen. Die 2D-Phasenkontrastmikroskopie wurde verwendet, um die Röhrenbildung in serumfreiem Medium (Abbildung 2A,B) und vollständigem Wachstumsmedium (Abbildung 2C,D) abzubilden. Zellen in beiden Medienbedingungen durchliefen eine morphologische Differenzierung und organisierten sich schnell zu ausgedehnten Netzwerken von kapillarröhrenartigen Strukturen. Diese Strukturen bestanden aus organisierten Zellsträngen, die in vivo Kapillarnetzwerken ähnelten. Des Weiteren veranschaulichen Schliffbilder mit 20-facher Vergrößerung die komplexe multizelluläre Organisation von Endothelzellen und deren morphologische Differenzierung im Detail. Es wurden keine morphologischen Unterschiede zwischen den Medienbedingungen beobachtet. Das ausgedehnte Netzwerk kapillarröhrchenartiger Strukturen deutet stark auf die Differenzierung von kultivierten Zellen in reife und funktionelle Endothelzellen hin.
BOECs wurden weiterhin durch die Expression des reifen Endothelzellmarkers CD31 oder des Thrombozyten-Endothelzelladhäsionsmoleküls-1 (PECAM1) charakterisiert (Abbildung 3A,B). BOECs zeigten eine einheitliche Expression von CD31. Darüber hinaus bestätigte die durchflusszytometrische Analyse das Fehlen von EPCs, da die Zellen im Vergleich zur Positivkontrollgruppe der PBMCs negativ für den Monozytenmarker CD14 gefärbt wurden (Abbildung 3C,D).
Abbildung 1: Phänotyp-Lichtmikroskopie-Aufnahmen. Die lichtmikroskopischen Aufnahmen von kultivierten BOECs wurden bei 10-facher Vergrößerung an (A) Tag 0, (B) Tag 2, (C) Tag 4, (D) Tag 6, (E) Tag 8 und (F) nach der ersten Passage beobachtet. Maßstabsbalken: 200 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Morphologische Differenzierung und Organisation der BOECs der Passage 2. Eine morphologische Differenzierung und Organisation der Passage 2 BOECs in kapillarrohrartige Strukturen wurde in der Basalmembranmatrix innerhalb von 14 h für serumfreies Medium und innerhalb von 24 h für vollständiges Wachstumsmedium beobachtet. (A) Serumfreies Medium bei 4x, (B) Serumfreies Medium bei 20x, (C) vollständiges Wachstumsmedium bei 4x und (D) vollständiges Wachstumsmedium bei 20x. Maßstabsbalken: 200 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Charakterisierung von BOECs mit CD31 und CD14. (A) Die BOECs der Passage 2-3 wurden auf PECAM1 mit Hilfe von Anti-CD31-FITC-Antikörpern in grünem Licht und (B) entsprechenden Phasenkontrastmikroskopiebildern gefärbt. Die Zellen wurden in Suspension gefärbt und die Suspension wurde auf einem Objektträger abgebildet. Maßstabsbalken: 200 μm. (C) Durchflusszytometrische Analyse von BOECs mit CD14-AF700-Antikörpern im Vergleich zu mononukleären Zellen (PBMCs) mit (D) Positivkontrolle. Positive CD14-Färbung in blau und ungefärbte Zellen in rot. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
BOECs sind ein leistungsfähiges Werkzeug, das in verschiedenen wissenschaftlichen und therapeutischen Ansätzen eingesetzt werden kann 7,8,16. BOECs wurden verwendet, um die EC-Genexpression zu analysieren, um die Schlüsselfaktoren aufzuklären, die für die Entwicklung von Gefäßerkrankungen und Krebs verantwortlich sind 5,19,20,21. BOECs wurden auch in therapeutischen Anwendungen wie der Gefäßregeneration und dem Gentransfer eingesetzt22,23,24. Gentechnisch modifizierte BOECs sind für ihre antiangiogene tumortherapeutische Wirkung bekannt25,26. Darüber hinaus macht das angiogene Potenzial von BOECs sie zu hervorragenden Kandidaten für zelluläre Therapien, die auf Vaskularisierung und Neovaskularisation abzielen17,27. Auch wenn mehrere Studien beschreiben, wie man BOECs aus menschlichem peripherem Blut gewinnt 6,7,8,9, deutet die Variabilität menschlicher Zellquellen aufgrund der zugrunde liegenden pathophysiologischen und genetischen Variation auf eine dringende Notwendigkeit hin, BOECs aus gesunden xenogenen Quellen zu beziehen 9,13,18.
Ein detailliertes Protokoll zur effizienten Gewinnung von BOECs aus mononukleären Zellen des peripheren Blutes von Schweinen wurde vorgestellt. Zu den kritischen Schritten gehören die schnellstmögliche Verarbeitung von Blutproben und die effiziente Entnahme von Buffy-Coat-Schichten nach der Dichtegradientenzentrifugation, um die Anzahl der lebensfähigen PBMCs zu maximieren, die in die Kultur gelangen. Die anfängliche Beschichtungsdichte und die rechtzeitige Passage der Zellen sind wichtige Überlegungen, um eine konsistente Isolierung dieser Zelltypen zu erreichen. Ein Ausgangsblutvolumen von 100 ml liefert eine angemessene Anzahl von PBMCs für eine einzelne Sechs-Well-Platte. Es ist zu beachten, dass die maximale Blutmenge, die sicher von einem Schwein entnommen werden kann, mit dem Körpergewicht des Tieres variiert. Eine empfohlene sichere einmalige Entnahme des maximalen Blutvolumens für Schweine beträgt 8 ml pro kg Körpergewicht. Darüber hinaus ist auch der rechtzeitige Übergang der ersten Kolonien von Passage 0 zu Passage 1 von entscheidender Bedeutung. Die Zellen hören auf zu vermehren, wenn die Samendichte sehr gering ist oder wenn die Zellen eine Konfluenz erreichen. Wenn die Zellen zusammenfließen, beginnen sie, sich in eine längliche mesenchymale Morphologie und einen Phänotyp umzuwandeln. Die Aussaatdichte kann auch gesteuert werden, indem Kolonien in einen T25-Kolben anstelle eines T75-Kolbens geleitet werden. Es ist eine sorgfältige Abwägung erforderlich, um die adhärenten Zelltypen während des anfänglichen Medienwechsels nicht zu verlieren, da es sehr wichtig ist, so viele adhärente Zellen wie möglich einzufangen und gleichzeitig die nicht adhärenten EPCs zu verwerfen. Dieses Protokoll erzeugt in etwa 1 Woche ausgewachsene Zellkolonien.
Das Protokoll ist hochgradig reproduzierbar und zuverlässig. Expandierende Endothelzellkolonien werden in schätzungsweise 90%-95% der Kulturen erreicht. Das Versagen ist in der Regel auf die mangelnde Bildung von Endothelzellkolonien zurückzuführen, d. h. wenn mindestens eine Endothelzellkolonie gebildet wird, werden sie sich fast immer in Kultur ausdehnen. Zu den Fehlerquellen gehören zufällige Variabilität, übermäßiges Scheren von Zellen während der Blutentnahme, Kontamination von Mikroben in der Kultur und hoher Verlust von mononukleären Zellen während der Verarbeitungsschritte. Nach einer erfolglosen Kultur ist in der Regel eine zweite Kultur erfolgreich, was darauf hindeutet, dass die Variabilität zwischen den Tieren kein wichtiger Faktor ist. Das Protokoll ist sogar bei der Blutentnahme unmittelbar nach der Euthanasie erfolgreich, was darauf hinweist, dass die Waschschritte die Euthanasiemittel effizient auf ein harmloses Niveau reduzieren.
Unabhängig von der Heterogenität in der zirkulierenden Blutzellpopulation wurden BOECs erhalten, die sich stark von EPCs unterscheiden. BOECs werden von einer kleinen Untergruppe adhärenter PBMCs abgeleitet, denen die CD14-Expression fehlt. Dies wurde durch das Fehlen einer CD14-Färbung bestätigt (Abbildung 3C,D). Die Clearance von monozytären EPCs aus BOEC-Kulturen in frühen Passagen kann entweder durch Zelltod oder Nichtadhärenz erklärt werden. Die Kopfsteinpflastermorphologie der BOECs (Abbildung 1E,F) deutet auf einen ausgeprägten endothelialen Phänotyp hin. Darüber hinaus impliziert die einheitliche Expression des Oberflächenmarkers CD31 (Abbildung 3A) eine homogene Population reifer Endothelzellen. Darüber hinaus zeigt die kapillare Morphogenese von BOECs sowohl in serumfreien (Abbildung 2A,B) als auch in vollständigen Nährmedien (Abbildung 2C,D) ihre inhärente angiogene Fähigkeit 6,8. Frühere Analysen von porcinen BOECs, die mit diesem Protokoll generiert wurden, haben gezeigt, dass diese Zellen zusätzlich positiv für die Expression des von-Willebrand-Faktors und die Lektinbindung sind28.
Die Fülle von PBMCs im zirkulierenden Blut, aus denen BOECs hervorgehen, unterstützt die Machbarkeit einer robusten Methode, um eine praktisch unbegrenzte Versorgung mit therapeutischen BOECs aus tierischen Quellen zu erhalten. Sobald die Technik beherrscht wird, können BOECs für verschiedene Anwendungen verwendet werden, darunter Gefäßreparatur und -regeneration, Krankheitsmodellierung, Arzneimittelscreening und Studien zur Biologie von Endothelzellen. Laufende Studien sind erforderlich, um die Homogenität von BOECs im Schwein und ihre Verträglichkeit als therapeutische Quelle beim Menschen zu bestätigen.
Eine Einschränkung dieses Protokolls ist das Risiko, dass sich ausdehnende Endothelzellkolonien nicht bilden. Die Fehlerrate wird auf 5%-10% geschätzt, und in diesen Fällen ist ein zweiter Versuch erforderlich. Wenn die Sicherheit des Erfolgs wichtig ist, kann die doppelte Menge Blut entnommen werden, und das Protokoll kann parallel befolgt werden, um zwei unabhängige Kulturen zu erhalten. Darüber hinaus beschränkt sich unsere Erfahrung auf gesunde Yorkshire/Landrace/Duroc-Kreuzungsschweine (Sus domesticus), männlich und weiblich, 40-80 kg, 3-6 Monate alt. Erfolgsquoten bei anderen Rassen, Alter und Versuchsbedingungen sind nicht bekannt.
Eine weitere Einschränkung des Protokolls besteht darin, dass es keinen definitiven Marker für den BOEC-Phänotyp gibt. Hier und in früheren Arbeiten28 wurden die aus diesem Protokoll generierten porcinen BOECs für mehrere BOEC-Marker charakterisiert, aber das Verständnis des BOEC-Phänotyps entwickelt sich weiter. BOECs werden auch an den Passagen 2-3 charakterisiert und der Phänotyp an höheren Passagen ist unbekannt. Ein Vorteil von porcinen BOECs im Vergleich zum Menschen ist die schnelle Versorgung mit Schweineblut, was die Erzeugung häufigerer Kulturen und eine robuste Versorgung mit konsistenten Zellen mit geringer Passage ermöglicht.
Eine der größten Einschränkungen bei der Verwendung von Schweinezellen in therapeutischen Ansätzen ist die Immunantwort des Wirts29. Es werden verschiedene Immunmodulationsstrategien untersucht, um die Immunogenität von xenogenen Zellen für die menschliche Transplantation zu verringern, wie z. B. entzündungshemmende Wirkstoffe und CRISPR/Cas-Genmanipulation30,31,32. Neuere Studien haben die Expression von humanen komplementären regulatorischen Proteinen (hCRPs)33 und die Einführung von α1,3-Galactosyltransferase-Deleted (GTKO)32,34 Schweinen vorgeschlagen. Diese Fortschritte sind vielversprechend für die therapeutische Anwendung von xenogenen Zellen, einschließlich porciner BOECs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Die Autoren bedanken sich bei der Finanzierung durch NIH/NHLBI R00 HL129068.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 19 G needle | Covidien | 1188818112 | |
| 50 mL conical tubes | Corning | 352098 | |
| 6 well plate | BD Falcon | 353046 | |
| 60 mL syringes | Covidien | 8881560125 | |
| Ammonium chloride solution (0.8%) | Stemcell Technologies | 07850 | |
| Antibiotic/antimycotic solution (100x) | Gibco | 15240-062 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 75-253-839 | |
| EGM-2 culture medium | Lonza Walkersville | CC-3162 | |
| Extension tube | Hanna Pharmaceutical Supply Co. | 03382C6227 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Atlas Biologicals | F-0500-A | |
| Ficoll-Paque 1077 | Cytiva | 17144003 | Density gradient solution |
| Heparin sodium injection (1,000 units/mL) | Pfizer | 00069-0058-01 | |
| Human plasma fibronectin | Gibco | 33016-015 | |
| Ice | N/A | N/A | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-023 | |
| Pipette set | Eppendorf | 2231300004 | |
| Sterile water | Gibco | 15230-162 | |
| Thin pipette | Celltreat Scientific | 229280 |
References
- Aird, W. C. Phenotypic heterogeneity of the endothelium: II. Representative vascular beds. Circulation Research. 100 (2), 174-190 (2007).
- Aird, W. C. Phenotypic heterogeneity of the endothelium: I. Structure, function, and mechanisms. Circulation Research. 100 (2), 158-173 (2007).
- Pober, J. S., Tellides, G. Participation of blood vessel cells in human adaptive immune responses. Trends in Immunology. 33 (1), 49-57 (2012).
- Navarro, S., et al. The endothelial cell protein C receptor: its role in thrombosis. Thrombosis Research. 128 (5), 410-416 (2011).
- Hasstedt, S. J., et al. Cell adhesion molecule 1: a novel risk factor for venous thrombosis. Blood. 114 (14), 3084-3091 (2009).
- Ormiston, M. L., et al. Generation and culture of blood outgrowth endothelial cells from human peripheral blood. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (106), e53384 (2015).
- Lin, Y., Weisdorf, D. J., Solovey, A., Hebbel, R. P. Origins of circulating endothelial cells and endothelial outgrowth from blood. Journal of Clinical Investigation. 105 (1), 71-77 (2000).
- Martin-Ramirez, J., Hofman, M., Biggelaar, M. V. D., Hebbel, R. P., Voorberg, J. Establishment of outgrowth endothelial cells from peripheral blood. Nature Protocols. 7 (9), 1709-1715 (2012).
- Gulati, R., et al. Diverse origin and function of cells with endothelial phenotype obtained from adult human blood. Circulation Research. 93 (11), 1023-1025 (2003).
- Hebbel, R. P. Blood endothelial cells: utility from ambiguity. The Journal of Clinical Investigation. 127 (5), 1613-1615 (2017).
- Medina, R. J., et al. Endothelial progenitors: A consensus statement on nomenclature. Stem Cells Translational Medicine. 6 (5), 1316-1320 (2018).
- Medina, R. J., et al. Molecular analysis of endothelial progenitor cell (EPC) subtypes reveals two distinct cell populations with different identities. BMC Medical Genomics. 3, 18 (2010).
- Jiang, A., Pan, W., Milbauer, L. C., Shyr, Y., Hebbel, R. P. A practical question based on cross-platform microarray data normalization: are BOEC more like large vessel or microvascular endothelial cells or neither of them. Journal of Bioinformatics and Computational Biology. 5 (4), 875-893 (2007).
- Pan, W., Shen, X., Jiang, A., Hebbel, R. P. Semi-supervised learning via penalized mixture model with application to microarray sample classification. Bioinformatics. 22 (19), 2388-2395 (2006).
- Hirschi, K. K., Ingram, D. A., Yoder, M. C. Assessing identity, phenotype, and fate of endothelial progenitor cells. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 28 (9), 1584-1595 (2008).
- Fernandez, L. A., et al. Blood outgrowth endothelial cells from hereditary haemorrhagic telangiectasia patients reveal abnormalities compatible with vascular lesions. Cardiovascular Research. 68 (2), 235-248 (2005).
- Critser, P. J., Yoder, M. C. Endothelial colony-forming cell role in neoangiogenesis and tissue repair. Current Opinion in Organ Transplantation. 15 (1), 68-72 (2010).
- Zhao, Y., et al. Isolation and culture of primary aortic endothelial cells from miniature pigs. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e59673 (2019).
- Chang Milbauer, L., et al. Genetic endothelial systems biology of sickle stroke risk. Blood. 111 (7), 3872-3879 (2008).
- Wei, P., et al. Differential endothelial cell gene expression by African Americans versusCaucasian Americans: a possible contribution to health disparity in vascular disease and cancer. BMC Medicine. 9 (1), 2 (2011).
- Hasstedt, S. J., et al. Cell adhesion molecule 1: a novel risk factor for venous thrombosis. Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 114 (14), 3084-3091 (2009).
- Milbauer, L. C., et al. Blood outgrowth endothelial cell migration and trapping in vivo: a window into gene therapy. Translational Research. 153 (4), 179-189 (2009).
- Matsui, H., et al. Ex vivo gene therapy for hemophilia A that enhances safe delivery and sustained in vivo factor VIII expression from lentivirally engineered endothelial progenitors. Stem Cells. 25 (10), 2660-2669 (2007).
- De Meyer, S. F., et al. Phenotypic correction of von Willebrand disease type 3 blood-derived endothelial cells with lentiviral vectors expressing von Willebrand factor. Blood. 107 (12), 4728-4736 (2006).
- Bodempudi, V., et al. Blood outgrowth endothelial cell-based systemic delivery of antiangiogenic gene therapy for solid tumors. Cancer Gene Therapy. 17 (12), 855-863 (2010).
- Dudek, A. Z., et al. Systemic inhibition of tumour angiogenesis by endothelial cell-based gene therapy. British Journal of Cancer. 97 (4), 513-522 (2007).
- Moubarik, C., et al. Transplanted late outgrowth endothelial progenitor cells as cell therapy product for stroke. Stem Cell Reviews and Reports. 7 (1), 208-220 (2011).
- Pislaru Sorin, V., et al. Magnetic forces enable rapid endothelialization of synthetic vascular grafts. Circulation. 114 (1), 314 (2006).
- Satyananda, V., et al. New concepts of immune modulation in xenotransplantation. Transplantation. 96 (11), 937-945 (2013).
- Klymiuk, N., Aigner, B., Brem, G., Wolf, E. Genetic modification of pigs as organ donors for xenotransplantation. Molecular Reproduction and Development. 77 (3), 209-221 (2010).
- Ryczek, N., Hryhorowicz, M., Zeyland, J., Lipiński, D., Słomski, R. CRISPR/Cas technology in pig-to-human xenotransplantation research. International Journal of Molecular Sciences. 22 (6), 3196 (2021).
- Cooper, D. K., Koren, E., Oriol, R.
- Cozzi, E., White, D. J. G. The generation of transgenic pigs as potential organ donors for humans. Nature Medicine. 1 (9), 964-966 (1995).
- Phelps, C. J., et al.
