Summary
I denne protokol beskrives en tarmmikrobiota-antigenspecifik T-celleadoptel overførsel colitis-model. CD4+ T-celler isoleres fra CBir1 TCR-transgene mus. Disse er specifikke for et immundominerende tarmmikrobiota-antigen CBir1 flagellin, som overføres til modtager Rag1-/- mus, hvilket fører til tarmbetændelse.
Abstract
Med stigningen i forekomsten pålægger inflammatoriske tarmsygdomme (IBD), som er kroniske sygdomme, der påvirker mave-tarmkanalen, en betydelig sundhedsmæssig og økonomisk byrde for enkeltpersoner og samfund. Derfor er det afgørende at undersøge de mekanismer, der ligger til grund for patogenesen og udviklingen af IBD. Her beskrives en tarmmikrobiota-antigenspecifik T-celleoverførselskolitismodel. CBir1 flagellin er blevet anerkendt som det immundominerende tarmbakterieantigen i eksperimentel colitis og patienter med Crohns sygdom. CBir1 TCR transgene naϊve CD4 + T-celler, der er specifikke for CBir1 flagellin, kan fremkalde kronisk colitis efter adoptiv overførsel til immunmangelfulde Rag1-/- mus. Sygdommens sværhedsgrad vurderes af histopatologi. CD4 + T-cellefænotyperne i colonic lamina propria bestemmes også. Denne model ligner meget udviklingen af IBD, som giver en ideel murinmodel til undersøgelse af de mekanismer, der driver patogenesen af IBD og tester de potentielle lægemidler til behandling af IBD.
Introduction
Inflammatoriske tarmsygdomme (IBD), hovedsageligt herunder Crohns sygdom (CD) og ulcerøs colitis (UC), er karakteriseret ved kronisk, recidiverende-remitterende betændelse i mave-tarmkanalen, der påvirker millioner over hele verden1. Flere faktorer har været impliceret i udviklingen og patogenesen af IBD, herunder genetisk modtagelighed, tarmmikrobiota, immunresponser, kost og livsstil2. Den nøjagtige mekanisme for IBD er dog stadig ikke helt forstået.
En af de særlige interesser er samspillet mellem tarmmikrobiota og værtsimmunresponser i reguleringen af tarmbetændelse3. Tarmmikrobiota tilvejebringer en række immunstimulerende molekyler og antigener, som kan aktivere immunresponser4. Mens balancen mellem effektor T-celler og regulatoriske T-celler (Tregs) er kritisk for at opretholde intestinal homeostase, bidrager det overdrevne tarmslimhinde-CD4 + T-cellerespons på tarmmikrobiotaantigener til tarmbetændelse5,6,7. Som et immundominerende tarmmikrobiotaantigen har CBir1 flagellin været relateret til patogenesen af human CD8,9. Desuden inducerer overførsel af CBir1 TCR transgene (Tg) T-celler tarmbetændelse hos immunmangelfulde mus6, der ligner den humane IBD, hvilket indikerer, at denne T-celleoverførselsmodel hjælper med at undersøge mekanismerne for human IBD.
Dette arbejde beskriver den detaljerede protokol for inducering af colitis hos Rag1-/- mus ved adoptivoverførsel af CBir1 TCR Tg naϊve CD4+ T-celler og vurdering af sygdommens sværhedsgrad. Desuden vises de forventede resultater, og de kritiske trin i proceduren og fejlfinding diskuteres, hvilket vil hjælpe forskere med at undersøge mekanismerne for patogenese af tarmbetændelse og teste de potentielle lægemidler til behandling af IBD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg blev udført i henhold til University of Texas Medical Branch's Committee on the Use and Care of the Animals. CBir1 TCR Tg mus blev leveret af Dr. Charles Elson fra University of Alabama i Birmingham. CBir1 TCR Tg mus kan være hun- eller hanmus, men bør være på 8-12 uger. Rag1-/- mus på C57BL/6-baggrunden blev opnået fra Jackson Laboratory10. Rag1-/- mus skal være køns- og aldersmatchede, og enten han eller hun kan bruges, men skal være efter 8-12 uger. Hele protokollen er opsummeret i figur 1.
1. Forberedelse af modtagermusene
- Forbered Rag1-/- mus på C57BL/6-baggrunden, opdrættet i det samme specifikke patogenfrie dyreanlæg. Beregn antallet af mus pr. gruppe ved effektanalyse11.
BEMÆRK: Rag1-/- mus har ikke modne T-celler og B-celler10. - Marker musene med øreslag.
- Vej musene samme dag som T-celleoverførsel.
2. Fremstilling af reagenser og opløsninger
BEMÆRK: De anvendte reagenser er giftige eller biofarer, og deres håndtering kræver forholdsregler og sikkerhedsforanstaltninger.
- Forbered vaskebuffer: Tilsæt 5 ml 100x Penicillin-Streptomycin i 500 ml RPMI 1640 medium. Bland det grundigt og opbevar det ved 4 °C.
- Forbered Tris-NH4Cl Lysis Buffer.
- Opløsning del A. Opløs 2,06 g Tris-base i 100 ml dobbeltdestilleret vand (ddH2O), og pH-værdien justeres til 7,2 med HCL.
- Forbered opløsning Del B. Opløs 7,47 g NH4Cl i 800 ml ddH2O.
- Bland A og B grundigt. Mål pH og juster den til 7,2, hvis ikke.
- Juster den samlede lydstyrke til 1000 ml. Autoklave og opbevar den derefter ved 4 °C.
- Forbered isolationsbufferen.
- Der tilsættes 2,5 g BSA og 500 μL EDTA (0,5 M, pH 8,0) i 500 ml 1x PBS. Bland det grundigt.
- Opløsningen filtreres gennem et vakuumdrevet engangsflaskefilter på 0,22 μm (se Materialetabel). Opbevar den ved 4 °C.
- Forbered FACS-buffer. Der tilsættes 1 ml FBS og 50 μL EDTA (0,5 M, pH 8,0) i 50 ml vaskebuffer (fremstillet i trin 2.1). Bland grundigt og opbevar det ved 4 °C.
- Forbered komplet medium. Tilsæt 5 ml FBS i 45 ml vaskebuffer. Bland grundigt og opbevar det ved 4 °C.
- Forbered EDTA-PBS-buffer.
- Beregn volumenet af den nødvendige EDTA-PBS-buffer. Volumen (ml) = musenummer x 20.
- Tilføj passende volumen FBS, EDTA og HEPES i PBS (2% FBS, 0,5 mM EDTA, 10 mM HEPES i PBS) (se materialetabel).
- Bland det grundigt og forvarm i et 37 °C vandbad.
- Forbered fordøjelsesbufferen.
- Beregn volumenet af den nødvendige fordøjelsesbuffer. Volumen (ml) = musenummer x 10.
- Tilsæt passende volumen FBS, Collagenase IV og DNase I i vaskebuffer (2 % FBS, 0,5 mg/ml kollagenase IV og 10 U/ml DNase I i vaskebuffer) (se materialetabel).
- Bland det grundigt og forvarm i et 37 °C vandbad.
- Forbered Percoll-opløsning.
- Forbered 100% Percoll. Tilsæt 5 ml 10x PBS i 45 ml original Percoll (se materialetabel).
- Forbered 2% FBS i vaskebuffer. Tilsæt 1 ml FBS i 49 ml vaskebuffer.
- Caulkululere volumenet af 40 % Percoll-opløsning og 75 % Percoll-opløsning. Volumen på 40% Percoll-opløsning (ml) = musenummer x 4; Volumen på 75% Percoll-opløsning (ml) = musenummer x 2.
BEMÆRK: De reagenser/opløsninger, der fremstilles i trin 2.1-2.5, vil blive anvendt i trin 3-4, og de reagenser, der er fremstillet i trin 2.6-2.8, vil blive anvendt i trin 9. Alle reagenser/opløsninger, der anvendes i trin 9, skal være frisklavede. Det anbefales at lave 5 % ekstra buffer til alle trin.
3. Isolering af milt CBir1 TCR Tg CD4 + T-celler
- Afliv CBir1 TCR Tg mus / mus ved en cervikal dislokation med CO2 eutanasi (30% -70% gas-luft forskydningshastighed). Våd musene med 70% ethanol.
- Udfør et ~ 1 cm venstre mavesnit, træk huden væk fra abdominal muskelvæv, lav et ~ 3 cm snit i abdominal muskelvæv, og fjern milten med steril saks og tang. Milten anbringes i en kulturskål, der indeholder 5 ml forkold vaskebuffer (tilberedt i trin 2.1).
- Slib milten med den ru overflade af to sterile glasrutschebaner. Overfør cellesuspensionen til et 50 ml centrifugerør ved at passere gennem en 100 μm cellesil (se materialetabel). Skyl glasrutsjebanerne og kulturfadet med 5 ml forkold vaskebuffer, og overfør vaskebufferen til røret.
- Centrifugering af cellesuspensionen ved 350 x g i 8 minutter ved 4 °C. Kassér supernatanten, og genophæng cellerne med 5 ml forvarmet Tris-NH4Cl Lysis Buffer (fremstillet i trin 2.2) pr. milt. Inkuber i 10 minutter ved stuetemperatur. Tilsæt 10 ml forkølet vaskebuffer til røret.
- Centrifugering af cellesuspensionen ved 350 x g i 8 minutter ved 4 °C. Kassér supernatanten, og resuspend cellerne med 10 ml forkølet isolationsbuffer (fremstillet i trin 2.3).
- Tæl cellerne. Bland 10 μL cellesuspension med 10 μL trypanblå grundigt. Læg 10 μL af blandingen på et dias, indsæt glideren i den automatiserede celletæller (se tabel over materialer) og få det levedygtige cellenummer12.
BEMÆRK: Ca. 1 x 108 celler kan fås fra en donormus i dette trin. - Centrifugering af den resterende cellesuspension fra trin 3,6 ved 350 x g i 8 minutter ved 4 °C. Kassér alle supernatanterne.
- Vortex anti-mus CD4 magnetiske partikler grundigt (se tabel over materialer), direkte tilføje 50 μL af partiklerne pr. 107 celler og bland med cellepiller grundigt. Inkuber i 30 minutter ved 4 °C.
BEMÆRK: Ethvert andet kommercielt CD4 + T-celleberigelsessæt kan bruges her. - Overfør cellepartikelsuspensionen til et sterilt opsamlingsrør. Tilsæt 3,5 ml forkølet isolationsbuffer i røret.
- Anbring røret på celleseparationsmagneten (se materialetabellen) i 8 minutter ved stuetemperatur. Aspirer forsigtigt supernatanten af ved hjælp af en 3 ml overførselspipette.
- Fjern røret fra celleseparationsmagneten (se materialetabel), resuspend cellerne med 3,5 ml forkold isoleringsbuffer, og anbring røret til magneten i 4 minutter ved stuetemperatur. Aspirer forsigtigt supernatanten af ved hjælp af en 3 ml overførselspipette.
- Gentag trin 3.11.
- Resuspend cellerne med 1 ml forkold FACS-buffer (fremstillet i trin 2.4).
4. Oprensning af CBir1 TCR Tg naϊve CD4+ T-celler
- Tæl cellerne efter trin 3.6.
- Hvis cellekoncentrationen er >107 / ml, skal du tilføje et volumen FACS-buffer for at sikre, at cellekoncentrationen er ≤ 107 / ml.
BEMÆRK: ~ 1 × 107 celler kan fås fra en donormus i dette trin. - Pletter overflademarkørerne med 10 μL anti-mus CD4-APC, 10 μL anti-mus CD25-Percp/ Cy5.5 og 10 μL anti-mus CD62L-PE13,14 (se tabel over materialer). Bland forsigtigt og inkuber i 30 minutter ved 4 °C i mørke.
- Vask cellerne med 2 ml forkold FACS-buffer. Centrifugering af cellesuspensionen ved 350 x g i 8 minutter ved 4 °C. Aspirer alle supernatanter ved at bruge en 3 ml overførselspipette.
- Gentag trin 4.4.
- Resuspendér cellerne til koncentrationen på 40 x 106/ml i forkold FACS-buffer.
BEMÆRK: For at forhindre, at sorteringsenheden tilstoppes, skal du føre cellerne gennem en 70 μm sil. - Tilsæt 0,1 μg/ml DAPI.
BEMÆRK: DAPI bruges til at udelukke de døde celler. - 15 ml centrifugerør indeholdende 4 ml komplet medium (fremstillet i trin 2.5) forberedes til opsamling af de sorterede celler.
- Læg cellerne på sorteringsenheden. Sorter enkelte levedygtige naϊve CD4+ T-celler (DAPI- CD4+ CD25- CD62L+ celler) i renhedstilstand (Dysestørrelse: 70 μm; Tryk: 70 PSI; Hændelsesrate: 8000-12000 begivenheder / s; Effektivitet: højere end 90%) (figur 2).
BEMÆRK: Naϊve CD4+ T-celler udtrykker høj ekspression af CD62L og mangler aktiveringsmarkøren CD2513,14. - Centrifugering af cellesuspensionen ved 350 x g i 8 minutter ved 4 °C. Aspirer alle supernatanterne ved hjælp af en 3 ml overførselspipette.
- Resuspend cellerne i 500 μL af 1x PBS.
- Tæl celler efter trin 3.6
BEMÆRK: ~ 5 × 106 celler kan fås fra en donormus i dette trin.
5. Celleoverførsel til modtagermusene
- Resuspend CBir1 TCR Tg naϊve CD4+ T-cellerne til 5 x 106/ml-koncentrationen ved at tilføje 1x PBS.
- Varm rag-/- musene op under en varmelampe (se materialetabel) i 4 min., og hold musene tilbage ved hjælp af en musebegrænsning.
- Intravenøst overfører 200 μL af cellesuspensionen til halevenen hos Rag-/- mus ved hjælp af en 1 ml insulinsprøjte (27 G) (se materialetabellen).
BEMÆRK: Celler fra en donormus er nok til at overføre til omkring fem modtagermus.
6. Overvågning af kliniske tegn under colitis progression
- Vej musene hver uge og øg observationen til to gange om ugen, når musene begynder at tabe >5% af de oprindelige vægte.
- Observer musens respons/bevægelse, når de forsigtigt stimuleres.
- Overhold andre kliniske abnormiteter. dvs. kropsholdning og afføring konsistens.
7. Kolonsamling og histopatologisk scoring
- Ofre modtagermusene ved en cervikal dislokation med CO2 på et tidspunkt for vægttabet >20% af den oprindelige vægt eller 6 uger efter celleoverførsel. Våd musene med 70% ethanol.
- Udfør et ~ 1 cm ventralt midterlinjehudsnit, træk huden væk fra abdominal muskelvæv, lav et ~ 3 cm snit i abdominal muskelvæv, identificer cecum og fjern hele tyktarmen med steril saks og tang. Våd tyktarmen med forkold PBS i en kulturskål.
- Skyl tyktarmen i længderetningen og skyl den med forkold PBS. Skær 1/3 af tyktarmen i længderetningen.
- Placer kolonstrimlen i et papirhåndklæde med den lysende side opad. Udfør schweizisk rulning ved hjælp af et tandstikker15.
- Anbring tyktarmen Swiss i en kassette, og sæt kassetten i 10% bufret formalin i 24 h16, efterfulgt af dehydrering ved hjælp af en automatiseret processor (se tabel over materialer) og paraffinindlejring.
- Skær 5 μm vævssektioner på et mikrotome, monteret på dias, og udfør Hematoxylin og eosin (H & E) plet17 (se Tabel over materialer).
- Bestem de histopatologiske scorer ved at kombinere scorerne for hver af de seks parametre for maksimalt 12. Lamina propria inflammation (normal, 0; mild, 1; moderat, 2; svær, 3); bægercelletab (normalt, 0; mildt, 1; moderat, 2; alvorligt, 3); unormal krypt (normal, 0; hyperplastisk, 1; desorganisering, 2; krypttab, 3); kryptabscesser (fraværende, 0; til stede, 1); slimhinde erosion og sårdannelse (normal, 0; mild, 1; moderat, 2; svær, 3); og submukosal ændring (ingen, 0; submucosa, 1; transmural, 2)18.
8. Isolering og farvning af intestinale lamina propria celler
- Efter trin 7.3 skæres yderligere 2/3 af tyktarmen i stykker på 0,5-1 cm og vaskes med forkold PBS.
- Overfør kolonsegmenterne til 20 ml forvarmet EDTA-PBS-buffer i et 50 ml centrifugerør. Inkuber ved 37 °C med 250 o/min rystelser i 30 min.
- Vortex røret, kassér supernatanterne ved at føre det gennem en steril sigte (diameter: 0,01 tommer) og resuspend kolonsegmenterne i 20 ml forkold PBS i 50 ml-røret.
- Gentag trin 8.3 to gange.
- Anbring kolonsegmenterne i et C-rør (se Materialetabel), der indeholder 10 ml forvarmet fordøjelsesbuffer.
- Anbring røret på en dissociatormaskine (se materialetabel) og inkuber under programmet "37C_m_LPDK_1" i 25 minutter.
BEMÆRK: "37C_m_LPDK_1" er et standard forudindstillet program i dissociatormaskinen, der anvendes til omrøring af prøverne og opbevaring af dem ved 37 °C. - Kontroller, om væv fordøjes fuldstændigt, hvilket betyder, at der ikke er noget stykke væv i fordøjelsesbufferen. Hvis ikke, gentag programmet for "37C_m_LPDK_1".
- Saml supernatanten ved at passere gennem en metalsigte og 100 μL sil. Skyl med 10 ml forkold PBS.
- Centrifugering af cellesuspensionen ved 350 x g i 8 minutter ved 4 °C. Aspirer alle supernatanterne.
- Resuspend cellerne i 4 ml 40% Percoll-opløsning og bland det grundigt (fremstillet i trin 2.8).
- Overfør de resuspenderede celler til 2 ml 75% Percoll-opløsning i et 15 ml centrifugerør.
- Centrifugering af celleophænget ved 850 x g i 20 minutter ved 20 °C (Accelerationsrampe: 0; Bremserampe: 0).
- Fjern forsigtigt fedt på det øverste lag ved hjælp af en 3 ml overførselspipette, og overfør cellelaget til 20 ml vaskebuffer i et 50 ml rør.
- Centrifugering af cellesuspensionen ved 350 x g i 8 minutter ved 4 °C. Kassér alle supernatanter og resuspend celler i 1 ml afsluttet medium.
- Tæl cellerne efter trin 3.6.
- Frø cellerne i en plade med 24 brønde, aktiver dem med 50 ng/ml Phorbol-12-myristat 13-acetat og 750 ng/ml ionomycin i 2 timer efterfulgt af inkubation med 5 μg/ml Brefeldin A i 3 timer (se materialetabel).
BEMÆRK: De anvendte reagenser er giftige, og deres håndtering kræver forholdsregler og sikkerhedsforanstaltninger. - Overfør cellerne til et FACS-rør, tilsæt 2 ml FACS-buffer, og centrifuger cellerne ved 350 x g i 8 minutter ved 4 °C. Kassér supernatanten.
- Inkuber cellerne med 12,5 μg/ml anti-mus CD16/3219 i (se tabel over materialer) FACS-buffer for at blokere Fc-receptorer i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Plet til levende/døde og overflademarkør.
- Cellerne vaskes med 2 ml FACS-buffer og centrifugeres ved 350 x g i 8 minutter ved 4 °C. Kassér supernatanten.
- Pletter cellerne med levende farvestof- og overflademarkører (dvs. CD3- og antimus-CD4-antistoffer)20 (se materialetabel) i FACS-buffer ved den optimerede koncentration i 30 minutter ved 4 °C i mørke.
BEMÆRK: De anvendte reagenser er giftige, og deres håndtering kræver forholdsregler og sikkerhedsforanstaltninger.
- Udfør den cellulære og nukleare farvning.
- Der tilsættes 2 ml FACS-buffer, og cellesuspensionen centrifugeres op ved 350 x g i 8 minutter ved 4 °C. Kassér supernatanten.
- Permeabilisere og fiksere cellerne ved at genbruge cellerne med 200 μL transkriptionsfaktor Fix arbejdsløsning (se tabel over materialer) i 40 minutter ved stuetemperatur.
- Der tilsættes 2 ml Permbuffer, og cellesuspensionen centrifugeres ad 350 x g i 8 minutter ved 4 °C. Kassér supernatanten.
- Inkuber cellerne med cellulære og nukleare markører (dvs. anti-mus IFNγ, anti-mus IL-17A og anti-mus Foxp3 antistoffer)20 i Perm buffer (se tabel over materialer) i 30 min-1 time ved stuetemperatur.
- Der tilsættes 2 ml Permbuffer, og cellesuspensionen centrifugeres ad 350 x g i 8 minutter ved 4 °C. Kassér supernatanten.
- Der tilsættes 1 ml FACS-buffer, og cellesuspensionen centrifugeres ad 350 x g i 8 minutter ved 4 °C. Kassér supernatanten.
- Resuspend celler med 200 μL FACS-buffer og kør prøverne på et flowcytometer (se tabel over materialer).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ca. 5 x 106 CBir1 TCR Tg naϊve CD4+ T-celler pr. milt blev isoleret fra en voksen CBir1 TCR Tg-mus. Overførsel af CBir1 TCR Tg naϊve CD4+ T-celler induceret kronisk colitis hos modtager Rag1-/- mus. Efter celleoverførsel blev kliniske tegn overvåget for at evaluere progressionen af tarmbetændelse, herunder vægttab, afføringskonsistens og bøjet kropsholdning. Som forventet begyndte mus at tabe sig omkring tre uger efter celleoverførsel, og vægten nåede omkring 80% -85% af den oprindelige vægt seks uger efter celleoverførsel (figur 3). Derudover viste mus diarré omkring 3-4 uger efter celleoverførsel og demonstrerede bøjet kropsholdning, da de udviklede alvorlig colitis. Grov morfologi af tyktarmen blev vist, og colitis sværhedsgraden blev vurderet af den histopatologiske score, når mus blev ofret. Mus, der modtog CBir1 TCR Tg naϊve CD4 + T-celler, viste kort kolonlængde 6 uger efter celleoverførsel (figur 4A). Modtagermusene demonstrerede mere celleinfiltration i tarmlamina propria 4 uger efter celleoverførsel (figur 4C), bægercelletab og tarmepitelcellehyperplasi 5 uger efter celleoverførsel (figur 4D) og slimhindeerosion og inflammatorisk celleinfiltration i submucosa i tyktarmen 6 uger efter celleoverførsel (figur 4F). Samtidig var der ingen betændelse hos Rag1-/- mus, der fik PBS alene (figur 4B). Desuden er der ingen betændelse i tyndtarmen, men cecum har betændelse. Derudover blev CD4 + T-cellefænotyper i colon lamina propria bestemt ved flowcytometri. Gating-strategien er vist (figur 5A-E). CBir1 TCR Tg naϊve CD4+ T-celler udviklede sig til IFNγ+ Th1-celler, IL-17A+ Th17-celler, IFNγ+ IL-17+ CD4+ T-celler (figur 5F) og Foxp3+ Treg-celler i tarmlaminaproprier hos Rag1-/- modtagere (figur 5G).
Figur 1: Proceduren for induktion colitis og vurdering af sygdommens sværhedsgrad. Splenic CD4 + T-celler blev isoleret fra CBir1 TCR transgene mus ved hjælp af magnetiske perler, og derefter blev naϊve T-celler renset ved sortering. CBir1 TCR transgene naϊve T-celler blev derefter intravenøst overført til modtager Rag1-/- mus. Da musene blev ofret omkring seks uger efter celleoverførsel, blev colitis sværhedsgrad vurderet ved histopatologiske scorer. CD4 + T-cellefænotyperne i colon lamina propria blev bestemt ved flowcytometri. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Gating-strategien til sortering af CBir1 TCR transgene naϊve T-celler. Levedygtige enkelt CBir1 TCR transgene naϊve T-celler blev oprenset ved at udelukke snavs (A), ikke-enkeltceller (B-C), døde celler (D) og aktiverede celler (E-F). Delpopulationen blev vist i (G). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Vægtændringerne af Rag1-/- mus efter T-celleoverførsel. 1 x 106 CBir1 TCR transgene naϊve T-celler blev overført til Rag1-/- mus, og Rag1-/- mus, der fik PBS, blev anvendt som kontroller. Musens vægte blev registreret hver uge. Data blev præsenteret i gennemsnit ± SD; Elevens t-test; s<0.001. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Den grove morfologi og hæmatoxylin og eosinfarvning af tyktarmen fra Rag1-/- mus, der modtog CBir1 TCR-transgene naϊve T-celler. (A) Modtagermusene blev ofret seks uger efter celleoverførsel, og tyktarmens grove morfologi blev vist. (B-E) Modtagermusene blev ofret på forskellige tidspunkter, og Rag1-/- mus modtog PBS som kontroller. Tyktarmen blev behandlet til hæmatoxylin og eosinfarvning. Repræsentative billeder af hæmatoxylin og eosinfarvning af tyktarmen vises. Skalabjælke = 200 μm. (F) Histopatologiske scorer blev bestemt. Data blev præsenteret i gennemsnit ± SD. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: CD4 + T-cellefænotyperne i colon lamina propria af Rag-/- mus, der modtager CBir1 TCR transgene naϊve T-celler. Når modtagermusene blev ofret 6 uger efter celleoverførsel, blev colon lamina propria-celler isoleret til farvning af CD4 + T-cellefænotyper. (A-E) Gating-strategien til analyse af T-cellefænotyper. (F-G) (F) IL-17A + CD4 + T-celler, IFNγ + CD4 + T-celler, IL-17 + IFNγ + CD4 + T-celler og (G) Foxp3 + Tregs blev bestemt ved flowcytometri. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Selvom hvert trin er afgørende for reproducerbarheden af denne colitis-model, er der flere kritiske trin. Modtageren Rag-/- mus skal modtage tilstrækkelig levedygtige naϊve CD4 + T-celler til at fremkalde tarmbetændelse. Vi brugte milt til isolering af naive CD4 + T-celler i stedet for MLN'er. Fordi udbyttet af naive CD4 + T-celler i MLN'er er meget lavere end i milt. CD62L udtrykkes stærkt i naive T-celler, og CD44 og CD25 er aktiveringsmarkørerne for T-celler13,14. I denne undersøgelse brugte vi først anti-CD4 magnetiske perler til at isolere CD4 + T-celler fra milt. Derefter brugte vi kombinationen af anti-CD4, anti-CD62L og anti-CD25 antistoffer til isolering af naive CD4 + T-celler13,14. Forskere kunne bruge andre markører til sortering af de naive CD4 + T-celler. CD45RBhi er også markør for naive T-celler. CD45RBhi CD25- CD4 + T-celler anvendes almindeligvis som naive T-celler af vildtype ikke-TCR transgene T-celler23. Derfor er teknikkerne til sortering af celler og intravenøs injektion af T-cellerne i modtagermusene afgørende. Opsætning af gating-protokollen som en skabelon er nyttig til at fremskynde eksperimenterne med færre fejl. For at undgå celledød skal celler altid opbevares på is. Desuden anbefales farvning af celler med DAPI stærkt til udelukkelse af døde celler, fordi DAPI ikke kan transitere over intakte cellemembraner, hvilket gør det til en fremragende dødcellesonde24. Opvarmning af musene for at stimulere udvidelse af halevenerne giver bedre venesigtbarhed til intravenøs injektion. Alle procedurer anbefales at blive udført af uddannede forskere.
Mange faktorer kan påvirke resultatet af colitis-modellerne, som skal være opmærksomme på. For det første skal modtageren Rag1-/- mus være alders- og kønsmatchet. I CD45RBhi T-celleoverførselsmodellen kan T-celler fra mandlige og kvindelige donorer overføres til mandlige Rag-/- modtagere, mens kun kvindelige donorer kan anvendes ved brug af kvindelige modtagere23. Vi ser dog ikke en signifikant forskel mellem mandlige og kvindelige modtagere. Modtagermusene kan enten være hunner eller hanner, og T-celler fra mandlige donorer kan også fremkalde colitis hos kvindelige modtagere. Da vægtændring er en værdifuld indikator for colitis progression, anbefales det at bruge modtagermusene mellem 8-12 uger til at præsentere en stabil vægtlinje. Disse recipientmus bør opdrættes og opbevares i samme rum på dyreanlægget, fordi mikrobiota er afgørende for reguleringen af colitisudvikling25. Tiden til at udvikle colitis varierer ved overførsel af forskellige antal CBir1 TCR Tg naive CD4 T-celler. Som forventet kræver færre celler længere tid til induktion af colitis, og et højere antal celler kræver kortere tid til induktion af colitis. Det anbefales at bruge 1 x 106 celler pr. recipientmus, da modtagermusene viser kliniske tegn på colitis ~2-3 uger efter celleoverførsel og udvikler relativt alvorlig colitis ~6 uger efter celleoverførsel. Sammenlignet med intraperitoneal injektion inducerer intravenøs injektion af celler i halevenen desuden mere konsistent colitis. Til isolering af colon lamina propria celler må tyktarmsvævene ikke blive tørre; Ellers ville det reducere cellernes udbytte og levedygtighed. En af de særlige bekymringer er, at colitisens varighed vil blive ændret, hvis modtagermusene overføres med genetisk modificerede CBir1 TCR Tg T-celler eller behandles med lægemidler26. Derudover inducerer CBir1 TCR Tg T-celler også tarmbetændelse hos andre immunmangelfulde mus, såsom TCRβ/δ-/- mus, som mangler T-celler27.
Da akkumulerende beviser indikerer en afgørende rolle for tarmbakterielle antigenspecifikke reaktive T-celler i patogenesen af IBD, vil anvendelse af T-celler, der er specifikke for et defineret tarmbakterielt antigen, give indsigt i, hvordan tarmbakterielt antigen inducerer T-celleresponser for at inducere colitis. Tarmmikrobiotaantigen CBir1 flagellin er rigeligt i mave-tarmkanalen, hvilket er relateret til patogenesen af IBD8,9. Denne colitis model ligner flere kritiske egenskaber ved IBD, herunder diarré, vægttab, histopatologisk fund og unormale intestinale immunresponser. Derfor er denne colitismodel nyttig til at studere mekanismerne i human IBD og giver et værktøj til at evaluere behandlingerne for IBD. Interessant nok viste det nylige arbejde af Chiaranunt et al., at T-celles specificitet til mikrobiota CBir 1-antigenet alene muligvis ikke er tilstrækkelig til at inducere T-celleaktivering og colitis. Dette fremgår af vildtype CBir1 TCR Tg T-celler induceret colitis hos Rag-/- modtagere, mens Rag-/- CBir1 T-celler ikke inducerede colitis i deres dyreanlæg, hvilket tyder på, at tarm-T-celler, der reagerer på specifikt tarmbakterieantigen, kan kræve andre indbyrdes forbundne kommensale bakterier, for eksempel Helicobacter spp, for at fungere som en adjuvans28 . Et spændende aspekt af denne model er, at forskellige T-celleundergrupper, nemlig Th1-, Th17- og Treg-celler, er til stede i lamina propria af colitiske modtagermus, hvilket giver en unik mulighed for at undersøge rollerne for ikke kun effektor-T-celler, men også Tregs i patogenesen af colitis29.
Men da denne colitismodel medieres af tarmmikrobiota-specifikke T-celler, er en begrænsning for denne colitis-model, at varigheden af induktion af colitis kan variere i forskellige dyrefaciliteter afhængigt af tarmmikrobiota.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen forfattere har modstridende økonomiske, faglige eller personlige interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev delvist støttet af National Institutes of Health-tilskud DK125011, AI150210 og DK124132, University of Texas System STARs-prisen (Y.C.) og James W. McLaughlin Fellowship Fund fra University of Texas Medical Branch i Galveston (W.Y.). Figur 1 blev oprettet med BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm vacuum-driven disposable bottle top filter | MilliporeSigma | SCGPS05RE | |
| 100x Penicillin-Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| 100-µm strainer | BD Biosciences | 352360 | |
| 3-mL Transfer Pipette | Fisherbrand | 13-711-9CM | |
| Anti-Mouse CD16/32 | Biolegend | 101302 | |
| Anti-Mouse CD25-Percp/Cy5.5 | Biolegend | 102030 | |
| Anti-mouse CD3-Percp/Cy5.5 | Biolegend | 100327 | |
| Anti-Mouse CD4 APC | Biolegend | 100516 | |
| Anti-Mouse CD4 Magnetic Particles | BD Biosciences | 551539 | |
| Anti-Mouse CD4-BV421 | Biolegend | 100544 | |
| Anti-Mouse CD62L-PE | Biolegend | 104408 | |
| Anti-Mouse Foxp3-PE | ThermoFisher | 12-5773-82 | |
| Anti-Mouse IFNγ-FITC | Biolegend | 505806 | |
| Anti-Mouse IL-17A-PE/Cy7 | Biolegend | 506922 | |
| Automated Cell Counter | Bio-rad | TC20 | |
| Brefeldin A | BD Biosciences | 555029 | |
| BSA | Fisher Bioreagents | BP1600-1 | |
| C tube | Miltenyi | 130-093-237 | |
| Cell Separation Magnet | BD Biosciences | 552311 | |
| Collagenase IV | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Dissociator Machine | Miltenyi | 130-096-427 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | ||
| EDTA | Corning | 46-034-CI | |
| EDTA (0.5 M, PH 8.0) | Corning | 46-034-CI | |
| FBS | R&D Systems | S11550 | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | LSD Fortessa | |
| Heat Lamp | CoverShield | BR40 | |
| Hematoxylin and Eosin (H&E) Stain Kit | Abcam | ab245880 | |
| Insulin Syringes | BD Biosciences | 329412 | |
| Ionomycin | ThermoFisher | I24222 | |
| Live/dead Fixable Near-IR Dead Cell Stain kit | ThermoFisher | L10119 | |
| MaxQ 6000 Incubated/Refrigerated Stackable Shakers | ThermoFisher | SHKE6000 | |
| NH4Cl | Thermo Scientific | A687-500 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Phorbol-12-myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich | P8139 | |
| RPMI 1640 Medium | Cytiva HyClone | SH3002702 | |
| Sorter | BD Biosciences | Arial Fusion | |
| Tissue Automatic Processor | ThermoFisher | STP120 | |
| Tissue Embedding/Processing Cassette | Fisher Healthcare | 22048142 | |
| Tris Base | Thermo Scientific | BP154-1 | |
| True-Nuclear Transcription Factor Buffer Set (including Perm Buffer) | Biolegend | 424401 |
References
- Kaplan, G. G. The global burden of IBD: From 2015 to 2025. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 12 (12), 720-727 (2015).
- Ananthakrishnan, A. N. Epidemiology and risk factors for IBD. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 12 (4), 205-217 (2015).
- Yang, W., Cong, Y. Gut microbiota-derived metabolites in the regulation of host immune responses and immune-related inflammatory diseases. Cellular & Molecular Immunology. 18 (4), 866-877 (2021).
- Pickard, J. M., Zeng, M. Y., Caruso, R., Núñez, G. Gut microbiota: Role in pathogen colonization, immune responses, and inflammatory disease. 279 (1), 70-89 (2017).
- Russler-Germain, E. V., Rengarajan, S., Hsieh, C. S. Antigen-specific regulatory T-cell responses to intestinal microbiota. Mucosal Immunology. 10 (6), 1375-1386 (2017).
- Chen, L., et al. Microbiota metabolite butyrate differentially regulates Th1 and Th17 cells' differentiation and function in induction of colitis. Inflammatory Bowel Diseases. 25 (9), 1450-1461 (2019).
- Cong, Y., Weaver, C. T., Lazenby, A., Elson, C. O. Bacterial-reactive T regulatory cells inhibit pathogenic immune responses to the enteric flora. Journal of Immunology. 169 (11), 6112-6119 (2002).
- Lodes, M. J., et al. Bacterial flagellin is a dominant antigen in Crohn disease. Journal of Clinical Investigation. 113 (9), 1296-1306 (2004).
- Targan, S. R., et al. Antibodies to CBir1 flagellin define a unique response that is associated independently with complicated Crohn's disease. Gastroenterology. 128 (7), 2020-2028 (2005).
- Mombaerts, P., et al. RAG-1-deficient mice have no mature B and T lymphocytes. Cell. 68 (5), 869-877 (1992).
- Charan, J., Kantharia, N. D. How to calculate sample size in animal studies. Journal of Pharmacology & Pharmacotherapeutics. 4 (4), 303-306 (2013).
- Kwizera, R., et al. Evaluation of trypan blue stain in the TC20 automated cell counter as a point-of-care for the enumeration of viable cryptococcal cells in cerebrospinal fluid. Medical Mycology. 56 (5), 559-564 (2018).
- Boyman, O., Létourneau, S., Krieg, C., Sprent, J. Homeostatic proliferation and survival of naïve and memory T cells. European Journal of Immunology. 39 (8), 2088-2094 (2009).
- Chai, J. G., et al. Regulatory T cells, derived from naïve CD4+CD25- T cells by in vitro Foxp3 gene transfer, can induce transplantation tolerance. Transplantation. 79 (10), 1310-1316 (2005).
- Bialkowska, A. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. Improved Swiss-rolling technique for intestinal tissue preparation for immunohistochemical and immunofluorescent analyses. Journal of Visualized Experiments. (113), e54161 (2016).
- Bialkowska, A. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. Improved Swiss-rolling technique for intestinal tissue preparation for immunohistochemical and immunofluorescent analyses. Journal of Visualized Experiments. (113), e54161 (2016).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. Cold Spring Harbor Protocols. 2008, (2008).
- Erben, U., et al. A guide to histomorphological evaluation of intestinal inflammation in mouse models. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 7 (8), 4557-4576 (2014).
- Tuijnman, W. B., Van Wichen, D. F., Schuurman, H. J. Tissue distribution of human IgG Fc receptors CD16, CD32 and CD64: An immunohistochemical study. APMIS. 101 (4), 319-329 (1993).
- Yang, W., et al. Intestinal microbiota-derived short-chain fatty acids regulation of immune cell IL-22 production and gut immunity. 11 (1), 4457 (2020).
- Reinoso Webb, C., et al. Differential susceptibility to t cell-induced colitis in mice. Role of the Intestinal Microbiota. Inflammatory Bowel Disease. 24 (2), 361-379 (2018).
- Bamias, G., et al. Down-regulation of intestinal lymphocyte activation and Th1 cytokine production by antibiotic therapy in a murine model of Crohn's disease. Journal of Immunology. 169 (9), 5308-5314 (2002).
- Steinbach, E. C., Gipson, G. R., Sheikh, S. Z. Induction of murine intestinal inflammation by adoptive transfer of effector CD4+ CD45RB high T cells into immunodeficient mice. Journal of Visualized Experiments. (98), e52533 (2015).
- Atale, N., Gupta, S., Yadav, U. C., Rani, V. Cell-death assessment by fluorescent and nonfluorescent cytosolic and nuclear staining techniques. Journal of Microscopy. 255 (1), 7-19 (2014).
- Manichanh, C., Borruel, N., Casellas, F., Guarner, F.
- Sun, M., et al. Microbiota-derived short-chain fatty acids promote Th1 cell IL-10 production to maintain intestinal homeostasis. Nature Communications. 9 (1), 3555 (2018).
- Feng, T., et al. Th17 cells induce colitis and promote Th1 cell responses through IL-17 induction of innate IL-12 and IL-23 production. Journal of Immunology. 186 (11), 6313-6318 (2011).
- Chiaranunt, P., Tometich, J. T., Ji, J. T Cell Proliferation and Colitis Are Initiated by Defined Intestinal Microbes. 201 (1), 243-250 (2018).
- Feng, T., Cao, A. T., Weaver, C. T., Elson, C. O., Cong, Y. Interleukin-12 converts Foxp3+ regulatory T cells to interferon-γ-producing Foxp3+ T cells that inhibit colitis. Gastroenterology. 140 (7), 2031-2043 (2011).
