Summary
Мониторинг внутричерепного давления у грызунов моделями нетравматического внутрижелудочкового кровоизлияния не встречается в современной литературе. Здесь мы демонстрируем технику измерения внутричерепного давления, среднего артериального давления и давления перфузии головного мозга во время внутрижелудочкового кровоизлияния на животной модели крысы.
Abstract
Выжившие после внутрижелудочкового кровоизлияния часто остаются со значительным ухудшением долговременной памяти; таким образом, исследования с использованием внутрижелудочковых кровоизлияний на животных моделях имеют важное значение. В этом исследовании мы искали способы измерения внутричерепного давления, среднего артериального давления и давления перфузии головного мозга во время нетравматического внутрижелудочкового кровоизлияния у крыс. Экспериментальный проект включал три группы Sprague Dawley: фиктивную, стандартное внутрижелудочковое кровоизлияние 200 мкл и контрольные группы транспортных средств. Путем введения внутрипаренхимального волоконно-оптического датчика давления были получены точные измерения внутричерепного давления во всех группах. Церебральные перфузионные давления рассчитывались со знанием внутричерепного давления и средних значений артериального давления. Как и ожидалось, в группе внутрижелудочкового кровоизлияния и контрольной группы транспортных средств наблюдалось повышение внутричерепного давления и последующее снижение давления перфузии головного мозга при внутрижелудочковой инъекции аутологичной крови и искусственной спинномозговой жидкости соответственно. Добавление внутрипаренхимального волоконно-оптического датчика давления полезно для мониторинга точных изменений внутричерепного давления.
Introduction
Внутрижелудочковое кровоизлияние (IVH), тип внутричерепного кровоизлияния (ICH), является разрушительным заболеванием, которое несет значительную смертность и заболеваемость. ИВГ характеризуется как накопление продуктов крови внутри внутричерепных желудочков. Изолированный ВГС встречается редко и обычно встречается у взрослых1. Это может быть связано с гипертоническим кровоизлиянием, разрывом внутричерепной аневризмы или другой сосудистой мальформацией, опухолями или травмой1. IVH приводит к вторичной черепно-мозговой травме, а также развитию гидроцефалии2. Выжившие после IVH часто остаются со значительными функциональными, запоминающими и когнитивными нарушениями после травмы. Эти долгосрочные когнитивные и запоминающие дефициты сообщаются у 44% выживших после ICH3. При субарахноидальном кровоизлиянии (SAH), другом типе ICH, хорошо известно, что примерно у половины выживших будет дефицит памяти, а у тех, у кого есть IVH в дополнение к SAH, результаты, как правило, значительно хуже 4,5,6.
Основные механизмы дисфункции памяти после IVH еще предстоит выяснить. Исследования in vivo с использованием нетравматических моделей IVH на животных с функциональной дисфункцией и дисфункцией памяти необходимы для выявления потенциальных терапевтических целей для таких пациентов. Животные модели с более тяжелой памятью и функциональной дисфункцией после IVH были бы лучшими для изучения этих изменений. Лаборатория старшего автора также исследовала роль высокого внутричерепного давления (ВЧД) в развитии дефицита памяти у крысиных моделей IVH. Поэтому важное значение для изучения имеют методы точного измерения МСП в ходе ИВГ. Здесь мы сообщаем о методах точного измерения МСП в модели крыс IVH. Хотя мониторинг ПМС ранее использовался в травматических моделях ICH, а также субарахноидальных кровоизлияний на животных моделях, мониторинг ICP в спонтанных моделях IVH грызунов не так часто сообщается в литературе 7,8. Следовательно, экспериментальный дизайн, представленный здесь, включал три группы крыс Sprague Dawley: фиктивный, стандартное внутрижелудочковое кровоизлияние 200 мкл и контроль транспортного средства. Для группы IVH использовалась аутологичная модель внутрижелудочковой инъекции крови. Для контрольных животных использовали внутрижелудочковую инъекцию стерильного раствора лактированного Рингера. ICP, среднее артериальное давление (MAPs) и церебральное перфузионное давление (CPPs) были зарегистрированы интраоперационно, и результаты представлены в настоящем документе.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все методы исследования и ухода за животными / содержания были выполнены в соответствии с институциональными руководящими принципами Калифорнийского университета в Дэвисе. Институциональный комитет по уходу за животными и их использованию (IACUC) Калифорнийского университета в Дэвисе одобрил все протоколы использования животных и экспериментальные процедуры (протокол IACUC No 21874).
1. Содержание животных
- Получить крыс Спрэга-Доули в возрасте 8-10 месяцев. Перед любой экспериментальной процедурой поместите крыс в виварий и подождите не менее 1 недели для общей адаптации в их клетках после 12-часового цикла света / темноты с пищей и водой ad libitum.
2. Анестезия и предоперационные процедуры
- Обезболить крысу 4% изофлураном в течение 4 мин. Повесьте крысу за зубы в лежачем положении на платформе интубации и интубируйте эндотрахеально с помощью эндотрахеальной канюли и ларингоскопа.
- Поместите обезболенную и интубированную крысу на вентилятор (2% изофлуран и газ-носитель O2/N2). Крыса адекватно анестезируется, если не наблюдается реакции на болезненный раздражитель, такой как защемление задней части.
- Вставьте ректальный термометр для непрерывного контроля температуры.
- Выполняйте все оперативные процедуры с использованием стерильной техники. Обрежьте волосы на голове и бедренной области и подготовьте кожу тремя чередующимися скрабами бетадина и 70% спирта перед операцией.
- Аспирировать любые накопленные дыхательные выделения путем временного удаления крысы из аппарата искусственной вентиляции легких и аспирации выделений с помощью трубки ПЭ-50, подключенной к шприцу объемом 10 мл.
- Защитите глаза крысы стерильной искусственной слезной глазной мазью.
- Вводят местный бупивакаин (~0,1 мл 0,25% раствора) в кожу и подкожные ткани перед разрезом кожи головы.
3. Протокол операции
- Установка внутрижелудочковой иглы и монитор внутричерепного давления (ВЧД)
- Поместите крысу в положение лежа в стереотаксическую рамку и перекладывайте крысу.
- Сделайте 1,5-сантиметровый разрез кожи головы вдоль средней линии с помощью скальпеля из 15 лезвий.
- Применяют мягкое давление марлей при гемостазе.
- Используя стерильный аппликатор хлопкового наконечника, отделите надкостницу от черепа до тех пор, пока не будет виден ориентир брегмы.
- Найдите и разметьте брегму с помощью стереотаксиса и разметьте расположение двух двусторонних отверстий для заусенцев, 1,4 мм сбоку и 0,9 мм сзади к брегме.
- Используя ручную дрель, создайте эти два небольших (до 2 мм) черепных отверстия в правом и левом полушариях. Орошайте любые лишние костные чипсы стерильным раствором лактированного рингера.
- В правом полушарии расположите направляющую канюлю 22-G на уровне отверстия заусенца, чтобы вставить иглу 28-G через канюлю на глубину правого бокового желудочка (4,6 мм по отношению к брегме), чтобы создать IVH.
- Подключите волоконно-оптический датчик давления к считывающему устройству. Включите считывающее устройство и убедитесь, что выбранные единицы измерения находятся в мм рт.ст. Затем загрунтуйте датчик, погружая его наконечник в небольшой стакан с помощью раствора Lactated Ringer, пока блок считывания не считывает ноль. Как только он обнуляется в растворе Lactated Ringers, все это устанавливается для вставки.
- В левом полушарии осторожно вставьте датчик давления на глубину 2-3 мм в кору для мониторинга ICP в режиме реального времени.
- Канюляция бедренной артерии и введение монитора среднего артериального давления (MAP)
- После введения монитора ICP поверните нижний ствол крысы для легкого доступа к левому бедру и паховой области.
- После стерильной подготовки и местного введения бупивакаина сделайте разрез кожи в 1,5 см над задней конечностью 15-лопастным скальпелем.
- Рассекните левую бедренную артерию сначала поверхностно гемостатом, а затем более глубокими слоями с помощью щипцов с тонкими кончиками под микроскопом. Определите глубокую синюю бедренную вену, чтобы помочь найти соседнюю артерию.
- Отвяжите дистальную бедренную артерию с помощью шелкового шва 3-0 и поместите временный металлический зажим на проксимальную часть бедренной артерии.
- Иметь второй волоконно-оптический датчик давления, подключенный к уже загрунтованному блоку считывания. Вставьте датчик давления в полиэтиленовую (ПЭ-50) трубку, которая затем вставляется в Туохи Борст, который затем закрывается. Подключите Tuohy Borst к 3-ходовому запорному крану, подключенному к шприцу объемом 1 мл на одном конце и игле 22-G с трубкой PE-50 на другом конце.
- Под микроскопом сделайте 2-миллиметровую бедренную артериотомию с помощью микроножек и канюлюцируйте ее трубкой PE-50, соединенной с остальной частью установки.
- Внутрижелудочковая инъекция
- Аспирируйте 500 мкл крови с помощью шприца 1 мл и поверните 3-полосный запорный кран, чтобы датчик давления считывал MAP.
- Праймируйте внутрижелудочковую иглу 28-G, соединенную с трубкой PE-50 с аспирированной кровью для животных IVH и Lactated Ringer's для животных управления транспортным средством. Затем вставьте эту иглу в направляющую канюлю на глубину правого бокового желудочка.
- Используя скорость 100 мкл/мин, вводят кровь или стерильный раствор Лактированного Рингера (200 мкл) в правый боковой желудочек, накачивая шприц 1 мл большим пальцем. До этого и во время внутрижелудочковой инъекции контролируйте и регистрируйте ДЦП, артериальное артериальное давление и ректальную температуру.
- Мониторинг и запись значений ICP и MAP после инъекции.
- Замыкание
- После завершения внутрижелудочковой инъекции извлеките трубку PE-50, содержащую датчик давления, который был вставлен в бедренную артерию, и приложите временный клипс к бедренной артерии для предотвращения кровотечения.
- Завяжите проксимальную часть бедренной артерии с помощью шелкового шва 3-0.
- Закройте разрез бедренной кости прерванным способом, используя шелк 3-0.
- Удалите направляющую канюлю с помощью внутрижелудочковой иглы и монитора ВЧП.
- Запечатайте отверстия заусенца костным воском.
- Закройте разрез черепа 3-0 шелковым швом в прерванном режиме.
- Нанесите местный бупивакаин на разрез и введите 0,35 мл карпрофена (5 мг/кг) после операции. Не оставляйте животных без присмотра до тех пор, пока они не придут в достаточное сознание для поддержания грудинного покоя.
- Позвольте крысам полностью восстановиться после операции под наблюдением и верните их в свои домашние клетки со свободным доступом к пище и воде после выздоровления.
4. Послеоперационное лечение
- Проверяйте всех послеоперационных животных ежедневно в течение семи послеоперационных дней, чтобы контролировать их выздоровление, неврологический статус, поведение, вес и разрезы.
- Вводят 0,35 мл карпрофена (5 мг/кг) путем подкожной инъекции во время операции и на1-й и2-й послеоперационные дни.
- Снимают швы на7-й послеоперационный день стерильным способом.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Внутричерепное, среднее артериальное и церебральное перфузионное давление
Как МСП, так и МАП контролировались интраоперационно у всех животных (рисунок 1). Крысы были в возрасте 8-10 месяцев со средним весом 495 ± 17 г. Были также собраны графики ПМС в режиме реального времени (рисунок 2). Исключая фиктивную группу, МСП значительно увеличивались во время внутрижелудочковой инъекции в IVH, а также в контрольных группах транспортных средств (рисунок 3). В группе IVH (43 мм рт.ст.) было зафиксировано большеЕ значение МСП по сравнению с системой управления транспортным средством (36,5 мм рт.ст.). Затем ICP быстро снижались и нормализовались в течение пяти минут после внутрижелудочковой инъекции в этих группах животных. Волоконно-оптический датчик успешно использовался для мониторинга ICP и MAP в режиме реального времени. Было отмечено, что MAP оставались одинаковыми на протяжении всей процедуры, тогда как CPP уменьшались во время внутрижелудочковой инъекции либо крови, либо раствора Лактированного Рингера (рисунок 3).
Рисунок 1: Экспериментальная установка. (А) Расположение отверстий для заусенцев. (B) Изображение всей экспериментальной установки. Сокращения: A-P, от передней до задней оси; M-L, медиальная к боковой оси. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Записи ПМС. Запись внутричерепного давления (ICP) в режиме реального времени у (A) фиктивных, (B) IVH и (C) животных, контролирующих транспортное средство. Стрелка обозначает начало инъекции IVH/LR. N=1 в каждой группе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Графики ICP, MAP и CPP. (A) Среднее внутричерепное давление (ICP), (B) среднее артериальное давление (MAP) и (C) среднее церебральное перфузионное давление (CPP) значения до желудочковой инъекции, во время желудочковой инъекции и после желудочковой инъекции у ЖИВОТНЫХ IVH и контроля транспортных средств. N=1 в каждой группе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом исследовании изучались механизмы измерения ICP, MAP и CPP в нетравматической модели животных для крыс IVH. Результаты были зафиксированы у следующих групп: фиктивные, VH 200 мкл и контрольные транспортные средства (искусственные внутрижелудочковые инъекции спинномозговой жидкости) животные. Этот экспериментальный проект был выбран для изучения того, как ICP можно контролировать во время инъекции IVH, поскольку мы предположили, что всплеск ICP может способствовать более значительной вторичной черепно-мозговой травме и, следовательно, дефициту памяти в моделях IVH животных. Поэтому целью этого исследования было создание модели IVH на животных с объективным мониторингом ICP, MAP и CPP после нетравматического IVH, чтобы мы могли применять это в дальнейшем в будущих экспериментах, которые будут сосредоточены на влиянии ICP, индуцированных IVH, на последующую дисфункцию памяти. Это пилотное исследование показало, что ICP и MAP можно точно контролировать с помощью датчика волоконно-оптического давления, введенного в левый боковой желудочек и бедренную артерию соответственно. ИКП значительно увеличиваются при внутрижелудочковом введении крови и искусственной спинномозговой жидкости. Кроме того, соответствующие ЦПП уменьшаются во время внутрижелудочковой инъекции.
Одна из основных задач этого исследования заключалась в том, чтобы найти способ точного мониторинга и регистрации очень небольших изменений давления (МСП и МАП). Это было сделано с помощью волоконно-оптического датчика давления. Волоконно-оптический датчик должен был быть маленьким, чтобы точно измерять минимальные изменения давления. Волоконно-оптический датчик, который использовался, изолирован в кабельной оболочке для его защиты. Наружный диаметр оболочки составляет 0,9 мм, а диаметр самого наконечника датчика – 420 мкм. Мы позаботились о том, чтобы значения ICP и MAP для крыс могли попасть в нормальный рабочий диапазон давлений для этого датчика (от -50 мм рт.ст. до +300 мм рт.ст.). Также была обеспечена точность волоконно-оптического датчика небольшой, ±1 мм рт.ст. (Opsens Solutions).
Большинство современных доклинических моделей ICH в настоящее время используют грызунов с инфузией цельной крови и коллагеназой (инъекция фермента коллагеназы с целью повреждения внеклеточного матрикса, приводящего к IVH) в качестве двух наиболее распространенных экспериментальных конструкций 9,10. Модель инфузии цельной крови включает вливание крови через трепанацию черепа или отверстие для заусенцев и была зарегистрирована не только у крыс, но и у свиней и видов приматов. Однако ни одна животная модель не идеальна, и у каждой есть свои преимущества и недостатки 9,10. Что касается исходов, поведения, отека мозга, гибели клеток и размера гематомы являются одними из наиболее распространенных конечных точек, протестированных в исследованиях ICH. Из поведенческих тестов, оценивающих когнитивную дисфункцию и дисфункцию памяти, большинство используют тест водного лабиринта Морриса10. Мы не нашли исследований, объективно измеряющих МСП в нетравматических моделях крыс IVH.
Недавний обзор MacLellan et al. обнаружил много ключевых проблем с доклинической литературой ICH9. MacLellan et al. обнаружили, что подавляющее большинство исследований сообщают только о положительных эффектах лечения. Многие исследования с отрицательными результатами публикуются в журналах более низкого уровня или не публикуются вообще, способствуя немалой предвзятости публикации. Они также обнаружили, что многие исследования не описывают методологию, такую как рандомизация, возраст и пол животных, среди прочих. Отсутствие ослепления, отсутствие отчетности о физиологических переменных, а также статистическая мощность являются дополнительными недостатками, которые были отмечены в этом обзоре. Все это делает его сложным для других, кто пытается повторить эксперимент10. Кроме того, некоторые исследования, такие как Hatman et al., показали, что дефицит обучения и памяти, как правило, острый и уменьшается уже через 8 недель после экспериментального ICH на животных моделях11. Следовательно, эти эффекты кратковременной памяти на животных моделях могут не точно отражать ту долговременную память и когнитивную дисфункцию, которая происходит после ICH у людей.
Это исследование не лишено ограничений. Основным ограничением является низкая древесина животных. Это было пилотное исследование, и будущие исследования на животных будут содержать большее количество животных, чтобы закрепить результаты, наблюдаемые здесь. Другим ограничением этого исследования является неспособность адекватно контролировать MAP в течение всей операции, поскольку бедренная артерия и система Tuohy Borst легко сворачиваются, несмотря на использование низкогепаринизированного физиологического раствора для промывки трубки.
В заключение мы сообщаем о методах точного мониторинга ICP, MAP и CPP в нетравматической модели животных для крыс IVH. Исследования, подобные этому, проложат путь к созданию более последовательной модели IVH на животных и, следовательно, к более строгим доклиническим исследованиям. Более качественные доклинические исследования на нетравматических моделях IVH на животных имеют решающее значение для выяснения потенциальных терапевтических возможностей для выживших после IVH в будущем.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Все авторы сообщают об отсутствии конфликта интересов.
Acknowledgments
Эта работа финансировалась грантом NINDS: K08NS105914
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% bupivacaine | Hospira, Inc. | 409115901 | |
| 1 mL syringe | Covetrus | 60734 | |
| 10% providine iodine solution | Aplicare | MSD093947 | |
| 20 mL syringe | Covidien | 8881520657 | |
| 22 G needles | Becton Dickinson | 305155 | |
| 28 G intraventricular needles | P technologies | 8IC313ISPCXC | C313I/SPC 28-Gneedles to fit 22-G guide cannula with 6 mm projection |
| 3-0 silk suture | Henry Schein, Inc. | SP116 | |
| 3-way-stopcock | Merti Medical Systems | M3SNC | |
| 4% paraformaldehyde | Fisher Chemical | 30525-89-4 | |
| AnyMaze software | Any-Maze behavioral tracking software | Stoelting CO, USA | |
| Artificial ointment | Covetrus | 48272 | |
| Blood collection vials with EDTA | Becton Dickinson | 367856 | |
| Bone wax | CP Medical, Inc. | CPB31A | |
| Carprofen | Zoetis, Inc. | 54771-8507-1 | |
| Centrifuge | Beckman | BE-GS6R | Model GS-6R |
| Cotton tip applicators | Covetrus | 71214 | |
| Drill | Dremel | 1600A011JA | |
| Fiberoptic pressure sensors with readout units | Opsens Medical | OPP-M200-X-80SC- 2.0PTFE-XN-100PIT-P1 and LIS-P1-N-62SC | Opp-M200 packaged pressure sensors with LifeSens system |
| Forceps | 11923-13, 11064-07 | ||
| Gauze | Covetrus | 71043 | |
| Guillotine | World Precision Instruments | 51330 | |
| Heating pad with rectal thermometer | CWE, Inc. | 08-13000 ,08-13014 | TC1000 Temperature controller |
| Hemostats | 13013-14, 13008-12 | ||
| Isoflurane | Covetrus | 29405 | |
| Lactated ringers | Baxter Healthcare Corp. | Y345583 | |
| Laryngoscope | American Diagnostic Corporation | 4080 | |
| Metal clip | Fine Scientic Tools | 18056-14 | |
| Micro scissors | Fine Scientic Tools | 15007-08 | |
| Microscope | Leica | model L2 | |
| Needle driver | 12003-15 | ||
| Polyethylene tubing | Thermo Fisher Scientific | 14-170-12B | PE-50 tubing |
| Rats | Envigo | Sprague Dawley rats 8–10 months old | |
| Scalpel | 10010-00 | ||
| Scissors | 14090-11 | ||
| Stereotaxic instrument | Kopf instruments | Model 940 with ear bars | |
| Syringe pump | KD Scientific | 780100 | Model 100 series |
| Tuohy Borst | Abbott | 23242 | |
| Ventilator | Harvard rodent ventilator | 55-0000 | Model 683 |
References
- Gates, P. C., Barnett, H. J. M., Vinters, H. V., Simonsen, R. L., Siu, K.
- Strajle, J., Garton, H. J. L., Maher, C. O., Muraszko, K., Keep, R. F., Xi, G. Mechanisms of hydrocephalus after neonatal and adult intraventricular hemorrhage. Translational Stroke Research. 3, Suppl 1 25-38 (2012).
- Murao, K., Rossi, C., Cordonnier, C. Intracerebral hemorrhage and cognitive decline. Revue Neurologique. 169, 772-778 (2013).
- Al-Khindi, T., Macdonald, R. L., Schweizer, T. A. Cognitive and functional outcome after aneurysmal subarachnoid hemorrhage. Stroke. 41, 519-536 (2010).
- Kreiter, K. T., et al. Predictors of cognitive dysfunction after subarachnoid hemorrhage. Stroke. 33, 200-208 (2002).
- Zanaty, M., et al. Intraventricular extension of an aneurysmal subarachnoid hemorrhage is an independent predictor of a worse functional outcome. Clinical Neurology and Neurosurgery. 170, 67-72 (2018).
- Gabrielian, L., Willshire, L. W., Helps, S. C., vanden Heuvel, C., Mathias, J., Vink, R. Intracranial pressure changes following traumatic brain injury in rats: lack of significant change in the absence of mass lesions or hypoxia. Journal of Neurotrauma. 28, 2103-2111 (2011).
- Kolar, M., Nohejlova, K., Duska, F., Mares, J., Pachl, J. Changes of cortical perfusion in the early phase of subarachnoid bleeding in a rat model and the role of intracranial hypertension. Physiological Research. 66, 545-551 (2017).
- Ariesen, M. J., Claus, S. P., Rinkel, G. J. E., Algra, A. Risk factors for intracerebral hemorrhage in the general population. A systematic review. Stroke. 34, 2060-2066 (2003).
- MacLellan, C. L., Paquette, R., Colbourne, F. A critical appraisal of experimental intracerebral hemorrhage research. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 32, 612-627 (2012).
- Hartman, R., Lekic, T., Rojas, H., Tang, J., Zhang, J. H. Assessing functional outcomes following intracerebral hemorrhage in rats. Brain Research. 1280, 148-157 (2009).
