Summary
La monitorización de la presión intracraneal en modelos roedores de hemorragia intraventricular no traumática no es común en la literatura actual. En este documento, demostramos una técnica para medir la presión intracraneal, la presión arterial media y la presión de perfusión cerebral durante la hemorragia intraventricular en un modelo animal de rata.
Abstract
Los sobrevivientes de hemorragia intraventricular a menudo quedan con un deterioro significativo de la memoria a largo plazo; Por lo tanto, la investigación que utiliza modelos animales de hemorragia intraventricular es esencial. En este estudio, buscamos formas de medir la presión intracraneal, la presión arterial media y la presión de perfusión cerebral durante la hemorragia intraventricular no traumática en ratas. El diseño experimental incluyó tres grupos de Sprague Dawley: simulado, hemorragia intraventricular estándar de 200 μl y grupos de control de vehículos. Mediante la introducción de un sensor de presión de fibra óptica intraparenquimatoso, se obtuvieron mediciones precisas de la presión intracraneal en todos los grupos. Las presiones de perfusión cerebral se calcularon con el conocimiento de la presión intracraneal y los valores medios de presión arterial. Como era de esperar, los grupos de hemorragia intraventricular y control vehicular experimentaron un aumento en la presión intracraneal y una disminución posterior en la presión de perfusión cerebral durante la inyección intraventricular de sangre autóloga y líquido cefalorraquídeo artificial, respectivamente. La adición de un sensor de presión de fibra óptica intraparenquimatoso es beneficiosa para monitorear cambios precisos de presión intracraneal.
Introduction
La hemorragia intraventricular (hemorragia intraventricular), un tipo de hemorragia intracraneal (HIC), es una enfermedad devastadora que conlleva una mortalidad y morbilidad significativas. La hemorragia intraventricular se caracteriza por la acumulación de productos sanguíneos dentro de los ventrículos intracraneales. La Hiv aislada es poco frecuente y ocurre típicamente en adultos1. Puede estar asociado con hemorragia hipertensiva, rotura de aneurisma intracraneal u otra malformación vascular, tumores o traumatismo1. La hemorragia intraventricular conduce a una lesión cerebral secundaria, así como al desarrollo de hidrocefalia2. Los sobrevivientes de hemorragia intraventricular a menudo quedan con deficiencias funcionales, de memoria y cognitivas significativas después de su lesión. Estos déficits cognitivos y de memoria a largo plazo se reportan en hasta el 44% de los sobrevivientes de ICH3. En la hemorragia subaracnoidea (HAS), otro tipo de HIC, es bien sabido que aproximadamente la mitad de los sobrevivientes tendrán déficits de memoria, y para aquellos que tienen Hiv además de HSA, los resultados tienden a ser significativamente peores 4,5,6.
Los mecanismos subyacentes de la disfunción de la memoria después de la hemorragia intraventricular aún no se han dilucidado. La investigación in vivo utilizando modelos animales de HVI no traumática con disfunción funcional y de memoria es esencial para descubrir posibles objetivos terapéuticos para dichos pacientes. Los modelos animales con memoria más severa y disfunción funcional después de la hemorragia intraventricular serían los mejores para estudiar estos cambios. El laboratorio del autor principal también ha estado investigando específicamente el papel de la alta presión intracraneal (PIC) en el desarrollo de déficits de memoria en modelos de ratas IVH. Por lo tanto, fue importante investigar los métodos para medir con precisión los PIC durante la hemorragia intraventricular. Aquí, informamos sobre los métodos para medir con precisión los PIC en un modelo de rata IVH. Aunque la monitorización de la PIC ha sido utilizada previamente en modelos animales de hemorragia traumática y subaracnoidea, la monitorización de la PIC en modelos de roedores con Hiv espontánea no es tan comúnmente reportada en la literatura 7,8. Por lo tanto, el diseño experimental presentado aquí incluyó tres grupos de ratas Sprague Dawley: simulada, hemorragia intraventricular estándar de 200 μl y control del vehículo. Para el grupo de Hiv, se utilizó un modelo de inyección de sangre intraventricular autóloga. Para los animales control del vehículo, se utilizó la inyección intraventricular de solución estéril de Ringer lactato. Las PIC, las presiones arteriales medias (PAM) y las presiones de perfusión cerebral (PPC) se registraron intraoperatoriamente, y los resultados se informan aquí.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Todos los métodos de investigación y cuidado / mantenimiento de animales se realizaron de acuerdo con las pautas institucionales de la Universidad de California, Davis. El Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de California, Davis, aprobó todos los protocolos de uso de animales y procedimientos experimentales (protocolo IACUC # 21874).
1. Alojamiento de animales
- Obtenga ratas Sprague-Dawley de 8-10 meses de edad. Antes de cualquier procedimiento experimental, aloje a las ratas en un vivero y permita al menos 1 semana para la adaptación general en sus jaulas después de un ciclo de luz / oscuridad de 12 h con comida y agua ad libitum.
2. Anestesia y procedimientos preoperatorios
- Anestesiar a la rata con isoflurano al 4% durante 4 min. Cuelgue a la rata por los dientes en posición supina en una plataforma de intubación e intubar endotraquealmente usando una cánula endotraqueal y un laringoscopio.
- Coloque la rata anestesiada e intubada en un ventilador (isoflurano al 2% y gas portador O2/N2). La rata se anestesia adecuadamente si no se observa respuesta a un estímulo doloroso, como un pellizco en la pata trasera.
- Inserte un termómetro rectal para controlar continuamente la temperatura.
- Realizar todos los procedimientos quirúrgicos utilizando la técnica estéril. Corta el vello de la cabeza y la región femoral y prepara la piel con tres exfoliantes alternos de Betadine y alcohol al 70% antes de la cirugía.
- Aspire cualquier secreción respiratoria acumulada retirando temporalmente a la rata del ventilador y aspirando las secreciones con un tubo PE-50 conectado a una jeringa de 10 ml.
- Proteja los ojos de la rata con ungüento estéril para lágrimas artificiales.
- Inyecte bupivacaína local (~0.1 ml de solución al 0.25%) en la piel y los tejidos subcutáneos antes de la incisión del cuero cabelludo.
3. Protocolo quirúrgico
- Colocación de aguja intraventricular y monitor de presión intracraneal (PIC)
- Coloque a la rata en una posición prona en un marco estereotáctico y oreja a la rata.
- Haga una incisión de cuero cabelludo de 1,5 cm a lo largo de la línea media con un bisturí de 15 hojas.
- Aplique una presión suave con una gasa para la hemostasia.
- Usando un aplicador de punta de algodón estéril, separe el periostio del cráneo hasta que el punto de referencia bregma sea visible.
- Localice y marque el bregma usando estereotaxis y marque la ubicación de dos orificios de rebabas bilaterales, 1,4 mm laterales y 0,9 mm posteriores al bregma.
- Usando un taladro de mano, cree estos dos orificios craneales pequeños (hasta 2 mm) en los hemisferios derecho e izquierdo. Irrige cualquier exceso de astillas óseas con una solución estéril de Ringer lactato.
- En el hemisferio derecho, coloque una cánula guía de 22 G al nivel del orificio de rebabas para insertar la aguja de 28 G a través de la cánula hasta la profundidad del ventrículo lateral derecho (4,6 mm en relación con el bregma) para crear Hiv.
- Conecte el sensor de presión de fibra óptica a la unidad de lectura. Encienda la unidad de lectura y asegúrese de que las unidades seleccionadas estén en mmHg. Luego prepare el sensor sumergiendo su punta en un pequeño vaso de precipitados con la solución de Ringer lactato hasta que la unidad de lectura lea cero. Una vez que se pone a cero en la solución de Lactated Ringers, todo está listo para ser insertado.
- En el hemisferio izquierdo, inserte suavemente el sensor de presión a una profundidad de 2-3 mm en la corteza para la monitorización de ICP en tiempo real.
- Canulación de la arteria femoral e inserción de un monitor de presión arterial media (PAM)
- Después de insertar el monitor ICP, gire la parte inferior del tronco de la rata para facilitar el acceso al muslo izquierdo y al área de la ingle.
- Después de la preparación estéril y la administración local de bupivacaína, haga una incisión cutánea de 1,5 cm sobre la extremidad posterior con un bisturí de 15 hojas.
- Diseccionar la arteria femoral izquierda primero superficialmente con un hemostático y luego capas más profundas usando fórceps con puntas finas bajo un microscopio. Identifique la vena femoral azul profundo para ayudar a localizar la arteria adyacente.
- Ate la arteria femoral distal con una sutura de seda 3-0 y coloque un clip de metal temporal en la porción proximal de la arteria femoral.
- Tenga un segundo sensor de presión de fibra óptica conectado a la unidad de lectura ya cebada. Inserte el sensor de presión en el tubo de polietileno (PE-50), que se inserta en un Tuohy Borst que luego se cierra. Conecte el Tuohy Borst a una llave de paso de 3 vías conectada a una jeringa de 1 ml en un extremo y una aguja de 22 G con tubo PE-50 en el otro extremo.
- Bajo el microscopio, haga una arteriotomía femoral de 2 mm con microtijeras y cannula con un tubo PE-50 conectado al resto de la configuración.
- Inyección intraventricular
- Aspire 500 μL de sangre con una jeringa de 1 ml y gire la llave de paso de 3 vías para que el sensor de presión lea MAP.
- Prepare la aguja intraventricular 28-G conectada al tubo PE-50 con la sangre aspirada para animales de HVI y Ringer lactato para los animales de control del vehículo. Luego inserte esta aguja en la cánula guía hasta la profundidad del ventrículo lateral derecho.
- Con una velocidad de 100 μL/min, inyecte la sangre o la solución estéril de Ringer lactato (200 μL) en el ventrículo lateral derecho bombeando la jeringa de 1 ml con el pulgar. Antes de esto y durante la inyección intraventricular, monitoree y registre la PIC, la presión arterial y la temperatura rectal.
- Supervise y registre los valores ICP y MAP posteriores a la inyección.
- Clausura
- Después de completar la inyección intraventricular, retire el tubo PE-50 que contiene el sensor de presión que se insertó en la arteria femoral y aplique el clip temporal a la arteria femoral para prevenir el sangrado.
- Ate la porción proximal de la arteria femoral usando la sutura de seda 3-0.
- Cierre la incisión femoral de manera interrumpida con seda 3-0.
- Retire la cánula guía con la aguja intraventricular y el monitor ICP.
- Selle los orificios de rebabas con cera ósea.
- Cierre la incisión craneal con una sutura de seda 3-0 de manera interrumpida.
- Aplique bupivacaína tópica en la incisión e inyecte 0,35 ml de carprofeno (5 mg/kg) después de la operación. No deje a los animales desatendidos hasta que hayan recuperado la conciencia suficiente para mantener la decúbito esternal.
- Permita que las ratas se recuperen completamente después de la cirugía bajo supervisión y devuélvalas a sus jaulas domésticas con acceso gratuito a alimentos y agua después de la recuperación.
4. Manejo postoperatorio
- Revise todos los animales postoperatorios diariamente durante siete días postoperatorios para controlar su recuperación, estado neurológico, comportamiento, peso e incisiones.
- Administrar 0,35 mL de carprofeno (5 mg/kg) por inyección subcutánea en el momento de la cirugía y en el 1º y2º día postoperatorio.
- Retirar las suturas el7º día postoperatorio de forma estéril.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Presiones intracraneales, arteriales medias y de perfusión cerebral
Tanto los PIC como los PAM se monitorizaron intraoperatoriamente en todos los animales (Figura 1). Las ratas tenían entre 8 y 10 meses de edad con un peso medio de 495 ± 17 g. También se recogieron gráficos ICP en tiempo real (Figura 2). Excluyendo el grupo simulado, los PIC aumentaron significativamente durante la inyección intraventricular en la Hiv, así como en los grupos control del vehículo (Figura 3). Los PIC alcanzaron su punto máximo en el grupo de Hiv (43 mmHg) en comparación con el control del vehículo (36,5 mmHg). Luego, los PIC disminuyeron rápidamente y se normalizaron dentro de los cinco minutos posteriores a la inyección intraventricular en esos grupos de animales. El sensor de fibra óptica se utilizó con éxito para monitorear ICP y MAP en tiempo real. Se observó que las PAM se mantuvieron similares durante todo el procedimiento, mientras que las PPC disminuyeron durante la inyección intraventricular de sangre o solución de Ringer lactato (Figura 3).
Figura 1: Configuración experimental . (A) Ubicación de los orificios de rebabas. (B) Representación de toda la configuración experimental. Abreviaturas: A-P, eje anterior a posterior; M-L: eje medial a lateral. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Grabaciones ICP. Registros de presión intracraneal (PIC) en tiempo real en (A) animales simulados, (B) IV y (C) animales de control del vehículo. La flecha indica el inicio de la inyección de IVH/LR. N=1 en cada grupo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Gráficos ICP, MAP y CPP . (A) presión intracraneal media (PIC), (B) presión arterial media (PAM) y (C) valores medios de presión de perfusión cerebral (PPC) antes de la inyección ventricular, durante la inyección ventricular y post inyección ventricular en animales control de HVI y vehículos. N=1 en cada grupo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Este estudio investigó los mecanismos para medir los PIC, PAM y CPP en un modelo animal de rata con Hiv no traumática. Los resultados se registraron en los siguientes grupos: animales simulados, VH 200 μL y control del vehículo (inyección intraventricular de líquido cefalorraquídeo artificial). Este diseño experimental se eligió para investigar cómo se pueden monitorear los PIC durante la inyección de Hiv, ya que planteamos la hipótesis de que el aumento en los PIC puede contribuir a la lesión cerebral secundaria más significativa y, por lo tanto, al déficit de memoria en modelos animales de Hiv. Por lo tanto, los objetivos de este estudio fueron establecer un modelo animal de HVI con monitoreo objetivo de PIC, PAM y CPP después de la Hiv no traumática para que podamos aplicar esto más en futuros experimentos que se centrarán en los efectos de los PIC inducidos por la Hiv en la disfunción posterior de la memoria. Este estudio piloto encontró que los PIC y los PAM pueden monitorizarse con precisión utilizando un sensor de presión de fibra óptica introducido en el ventrículo lateral izquierdo y la arteria femoral, respectivamente. Las PIC aumentan significativamente durante la inyección intraventricular de sangre y líquido cefalorraquídeo artificial. Además, los CPP correspondientes disminuyen durante la inyección intraventricular.
Una de las principales preocupaciones de este estudio fue encontrar una manera de monitorear y registrar con precisión los cambios muy pequeños en las presiones (ICP y MAP). Esto se hizo utilizando un sensor de presión de fibra óptica. El sensor de fibra óptica tenía que ser pequeño para medir con precisión los cambios mínimos de presión. El sensor de fibra óptica que se utilizó está aislado en una cubierta de cable para su protección. El diámetro exterior de la funda es de 0,9 mm, y el diámetro de la punta del sensor en sí es de 420 μm. Nos aseguramos de que los valores de ICP y MAP de rata pudieran caer en el rango normal de funcionamiento de presiones para este sensor (-50 mmHg a +300 mmHg). Además, se aseguró que la precisión del sensor de fibra óptica fuera pequeña, ±1 mmHg (Opsens Solutions).
La mayoría de los modelos preclínicos actuales de ICH en este momento utilizan roedores con infusión de sangre total y colagenasa (inyección de enzima colagenasa para dañar la matriz extracelular que resulta en HVI) como los dos diseños experimentales más comunes 9,10. El modelo de infusión de sangre entera implica la infusión de sangre a través de una craneotomía o orificio de rebabas y se ha informado no solo en ratas sino también en cerdos y especies de primates. Sin embargo, ningún modelo animal es perfecto, y cada uno tiene sus propias ventajas y desventajas 9,10. Con respecto a los resultados, el comportamiento, el edema cerebral, la muerte celular y el tamaño del hematoma son algunos de los criterios de valoración más comunes probados en los estudios ICH. De las pruebas de comportamiento que evalúan la disfunción cognitiva y de la memoria, la mayoría utiliza la prueba del laberinto de agua de Morris10. No se han encontrado estudios que midan objetivamente los PIC en modelos de ratas no traumáticas con hemorragia intraventricular.
Una revisión reciente de MacLellan et al. encontró muchos problemas clave con la literatura preclínica de ICH9. MacLellan et al. encontraron que una abrumadora mayoría de los estudios informan solo sobre los efectos positivos del tratamiento. Muchos estudios con resultados negativos se publican en revistas de nivel inferior o no se publican en absoluto, lo que contribuye a un sesgo de publicación no insignificante. También encontraron que muchos estudios no describen la metodología, como la aleatorización, la edad y el sexo de los animales, entre otros. La falta de cegamiento, la falta de variables fisiológicas informadas, así como el poder estadístico son debilidades adicionales que se observaron en esa revisión. Todo esto lo hace desafiante para otros que intentan replicar el experimento10. Además, algunos estudios, como Hatman et al., demostraron que los déficits de aprendizaje y memoria tienden a ser agudos y disminuyen tan pronto como en 8 semanas después de la HIC experimental en modelos animales11. Por lo tanto, estos efectos de memoria a corto plazo en modelos animales podrían no reflejar con precisión la memoria a largo plazo y la disfunción cognitiva que ocurre después de ICH en sujetos humanos.
Este estudio no está exento de limitaciones. Una limitación importante es la baja madera de los animales. Este fue un estudio piloto, y futuros estudios en animales contendrán un mayor número de animales para solidificar los resultados observados en este documento. Otra limitación de este estudio es la incapacidad de monitorear adecuadamente los PAM durante toda la cirugía, ya que la arteria femoral y el sistema Tuohy Borst se coagulan fácilmente a pesar del uso de solución salina heparinizada baja para enjuagar el tubo.
En conclusión, aquí informamos sobre los métodos de monitoreo preciso de los PIC, MAP y CPP en un modelo animal de rata con Hiv no traumática. Estudios como este allanarán el camino hacia el establecimiento de un modelo animal de hemorragia intraventriada más consistente y, posteriormente, una investigación preclínica más rigurosa. La investigación preclínica de mayor calidad en modelos animales de hemorragia intraventriada no traumática es fundamental para dilucidar las posibles opciones terapéuticas para los sobrevivientes de hemorragia intraventricada en el futuro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Todos los autores no informan ningún conflicto de intereses.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por la subvención del NINDS: K08NS105914
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% bupivacaine | Hospira, Inc. | 409115901 | |
| 1 mL syringe | Covetrus | 60734 | |
| 10% providine iodine solution | Aplicare | MSD093947 | |
| 20 mL syringe | Covidien | 8881520657 | |
| 22 G needles | Becton Dickinson | 305155 | |
| 28 G intraventricular needles | P technologies | 8IC313ISPCXC | C313I/SPC 28-Gneedles to fit 22-G guide cannula with 6 mm projection |
| 3-0 silk suture | Henry Schein, Inc. | SP116 | |
| 3-way-stopcock | Merti Medical Systems | M3SNC | |
| 4% paraformaldehyde | Fisher Chemical | 30525-89-4 | |
| AnyMaze software | Any-Maze behavioral tracking software | Stoelting CO, USA | |
| Artificial ointment | Covetrus | 48272 | |
| Blood collection vials with EDTA | Becton Dickinson | 367856 | |
| Bone wax | CP Medical, Inc. | CPB31A | |
| Carprofen | Zoetis, Inc. | 54771-8507-1 | |
| Centrifuge | Beckman | BE-GS6R | Model GS-6R |
| Cotton tip applicators | Covetrus | 71214 | |
| Drill | Dremel | 1600A011JA | |
| Fiberoptic pressure sensors with readout units | Opsens Medical | OPP-M200-X-80SC- 2.0PTFE-XN-100PIT-P1 and LIS-P1-N-62SC | Opp-M200 packaged pressure sensors with LifeSens system |
| Forceps | 11923-13, 11064-07 | ||
| Gauze | Covetrus | 71043 | |
| Guillotine | World Precision Instruments | 51330 | |
| Heating pad with rectal thermometer | CWE, Inc. | 08-13000 ,08-13014 | TC1000 Temperature controller |
| Hemostats | 13013-14, 13008-12 | ||
| Isoflurane | Covetrus | 29405 | |
| Lactated ringers | Baxter Healthcare Corp. | Y345583 | |
| Laryngoscope | American Diagnostic Corporation | 4080 | |
| Metal clip | Fine Scientic Tools | 18056-14 | |
| Micro scissors | Fine Scientic Tools | 15007-08 | |
| Microscope | Leica | model L2 | |
| Needle driver | 12003-15 | ||
| Polyethylene tubing | Thermo Fisher Scientific | 14-170-12B | PE-50 tubing |
| Rats | Envigo | Sprague Dawley rats 8–10 months old | |
| Scalpel | 10010-00 | ||
| Scissors | 14090-11 | ||
| Stereotaxic instrument | Kopf instruments | Model 940 with ear bars | |
| Syringe pump | KD Scientific | 780100 | Model 100 series |
| Tuohy Borst | Abbott | 23242 | |
| Ventilator | Harvard rodent ventilator | 55-0000 | Model 683 |
References
- Gates, P. C., Barnett, H. J. M., Vinters, H. V., Simonsen, R. L., Siu, K.
- Strajle, J., Garton, H. J. L., Maher, C. O., Muraszko, K., Keep, R. F., Xi, G. Mechanisms of hydrocephalus after neonatal and adult intraventricular hemorrhage. Translational Stroke Research. 3, Suppl 1 25-38 (2012).
- Murao, K., Rossi, C., Cordonnier, C. Intracerebral hemorrhage and cognitive decline. Revue Neurologique. 169, 772-778 (2013).
- Al-Khindi, T., Macdonald, R. L., Schweizer, T. A. Cognitive and functional outcome after aneurysmal subarachnoid hemorrhage. Stroke. 41, 519-536 (2010).
- Kreiter, K. T., et al. Predictors of cognitive dysfunction after subarachnoid hemorrhage. Stroke. 33, 200-208 (2002).
- Zanaty, M., et al. Intraventricular extension of an aneurysmal subarachnoid hemorrhage is an independent predictor of a worse functional outcome. Clinical Neurology and Neurosurgery. 170, 67-72 (2018).
- Gabrielian, L., Willshire, L. W., Helps, S. C., vanden Heuvel, C., Mathias, J., Vink, R. Intracranial pressure changes following traumatic brain injury in rats: lack of significant change in the absence of mass lesions or hypoxia. Journal of Neurotrauma. 28, 2103-2111 (2011).
- Kolar, M., Nohejlova, K., Duska, F., Mares, J., Pachl, J. Changes of cortical perfusion in the early phase of subarachnoid bleeding in a rat model and the role of intracranial hypertension. Physiological Research. 66, 545-551 (2017).
- Ariesen, M. J., Claus, S. P., Rinkel, G. J. E., Algra, A. Risk factors for intracerebral hemorrhage in the general population. A systematic review. Stroke. 34, 2060-2066 (2003).
- MacLellan, C. L., Paquette, R., Colbourne, F. A critical appraisal of experimental intracerebral hemorrhage research. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 32, 612-627 (2012).
- Hartman, R., Lekic, T., Rojas, H., Tang, J., Zhang, J. H. Assessing functional outcomes following intracerebral hemorrhage in rats. Brain Research. 1280, 148-157 (2009).
