Summary
非外傷性脳室内出血のげっ歯類モデルにおける頭蓋内圧のモニタリングは、現在の文献では一般的ではありません。ここでは、ラットモデル動物における脳室内出血時の頭蓋内圧、平均動脈圧、脳灌流圧を測定する技術を実証する。
Abstract
脳室内出血の生存者は、しばしば重大な長期記憶障害を残されます。そのため、脳室内出血モデル動物を用いた研究が不可欠である。本研究では、ラットの非外傷性脳室内出血時の頭蓋内圧、平均動脈圧、脳灌流圧を測定する方法を検討しました。実験デザインには、偽、標準的な200μlの脳室内出血、およびビヒクルコントロールグループの3つのSprague Dawleyグループが含まれていました。実質内光ファイバー内圧センサーを導入することにより、すべてのグループで正確な頭蓋内圧測定値が得られました。脳灌流圧は、頭蓋内圧と平均動脈圧値を知って計算しました。予想通り、脳室内出血群とビヒクル対照群は、それぞれ自家血と人工脳脊髄液の脳室内注射中に頭蓋内圧の上昇とその後の脳灌流圧の低下を経験しました。実質内光ファイバー圧力センサーの追加は、正確な頭蓋内圧変化を監視するのに役立ちます。
Introduction
頭蓋内出血(ICH)の一種である脳室内出血(IVH)は、重大な死亡率と罹患率を伴う壊滅的な病気です。IVHは、頭蓋内脳室内の血液製剤の蓄積として特徴付けられます。孤立したIVHはまれであり、典型的には成人に発生します1。高血圧性出血、破裂した頭蓋内動脈瘤、または別の血管奇形、腫瘍、または外傷に関連している可能性があります1。IVHは、二次的な脳損傷と水頭症2の発症につながります。IVHの生存者は、損傷後に重大な機能障害、記憶障害、および認知障害を残すことがよくあります。これらの長期的な認知障害と記憶障害は、ICH3の生存者の44%にも上ると報告されています。別のタイプのICHであるくも膜下出血(SAH)では、生存者の約半数が記憶障害を抱えることがよく知られており、SAHに加えてIVHを患っている人にとっては、転帰は著しく悪化する傾向があります4,5,6。
IVH後の記憶機能障害の根底にあるメカニズムはまだ解明されていません。機能障害や記憶機能障害のある非外傷性IVHモデルを用いたin vivo研究は、そのような患者の潜在的な治療標的を発見するために不可欠です。IVH後のより重度の記憶と機能障害のある動物モデルは、これらの変化を研究するのに最適です。上級著者の研究室はまた、IVHラットモデルの記憶障害の発症における高頭蓋内圧(ICP)の役割を具体的に調査しています。したがって、IVH中にICPを正確に測定する方法は、調査することが重要でした。今回,IVHラットモデルにおけるICPの精密測定方法について報告する.ICPモニタリングは、以前に外傷性ICHおよびくも膜下出血動物モデルにおいて使用されてきたが、自発的なIVHげっ歯類モデルにおけるICPモニタリングは、文献7,8において一般的に報告されていない。したがって、本明細書で提示された実験デザインには、Sprague Dawleyラットの3つのグループが含まれていました:偽、標準的な200μlの脳室内出血、およびビヒクル制御。IVH群については、自家脳室内血液注入モデルを用いた。ビヒクル対照動物については、滅菌乳酸リンゲル液の脳室内注射を使用した。ICP、平均動脈圧(MAP)、および脳灌流圧(CPP)を術中に記録され、その結果がここに報告されています。
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Protocol
すべての研究方法と動物の世話/維持は、カリフォルニア大学デービス校の制度的ガイドラインに従って実施されました。カリフォルニア大学デービス校の施設動物管理使用委員会(IACUC)は、すべての動物使用プロトコルと実験手順を承認しました(IACUCプロトコル#21874)。
1.動物の住居
- 生後8〜10か月のスプレイグドーリーラットを入手します。実験手順の前に、ラットをビバリウムに収容し、餌と水を自由に摂取して12時間の明暗サイクルを行った後、ケージで一般的な適応のために少なくとも1週間待ちます。.
2.麻酔と術前処置
- ラットを4%イソフルランで4分間麻酔する。挿管プラットフォーム上で仰臥位でラットを歯で吊るし、気管内カニューレと喉頭鏡を使用して気管内に挿管します。
- 麻酔および挿管されたラットを人工呼吸器(2%イソフルランおよびO2 / N2キャリアガス)に置きます。後脚のつまみなどの痛みを伴う刺激に対する反応が観察されない場合、ラットは適切に麻酔されます。.
- 直腸体温計を挿入して、温度を継続的に監視します。
- 滅菌技術を使用してすべての手術手順を実行します。頭と大腿部の髪をクリップし、手術前にベタジンと70%アルコールの3つの交互のスクラブで皮膚を準備します。
- ラットを人工呼吸器から一時的に取り外し、10mLシリンジに接続されたPE-50チューブで分泌物を吸引することにより、蓄積した呼吸器分泌物を吸引します。
- 滅菌人工涙液眼軟膏でラットの目を保護します。
- 頭皮切開の前に、局所ブピバカイン(~0.1 mLの0.25%溶液)を皮膚および皮下組織に注射します。.
3.手術プロトコル
- 脳室内針と頭蓋内圧(ICP)モニターの配置
- ラットを定位フレームの腹臥位に置き、ラットを耳にバーします。
- 15枚刃のメスで正中線に沿って1.5cmの頭皮を切開します。
- 止血のためにガーゼで穏やかな圧力をかけます。
- 滅菌綿チップアプリケーターを使用して、ブレグマのランドマークが見えるまで骨膜を頭蓋骨から分離します。
- 定位固定装置を使用してブレグマを見つけてマークアウトし、ブレグマの横方向1.4 mmと後方0.9 mmの2つの両側のバリ穴の位置をマークします。
- ハンドヘルドドリルを使用して、右半球と左半球にこれらの2つの小さな(最大2 mm)頭蓋バリ穴を作成します。余分な骨片を滅菌乳酸リンゲル溶液で灌漑します。
- 右半球で、22Gのガイドカニューレをバリ穴の高さに配置し、28Gの針をカニューレを通して右側脳室の深さ(ブレグマに対して4.6 mm)に挿入してIVHを作成します。
- 光ファイバ圧力センサーを読み出しユニットに接続します。読み出しユニットの電源を入れ、選択したユニットがmmHgであることを確認します。次に、読み出しユニットがゼロを読み取るまで、ラクテッドリンガー溶液を入れた小さなビーカーに先端を沈めて、センサーをプライミングします。乳酸リンガー溶液でゼロにすると、すべて挿入するように設定されます。
- 左半球で、圧力センサーを皮質に2〜3 mmの深さまでそっと挿入し、リアルタイムのICPモニタリングを行います。
- 大腿動脈カニュレーションと平均動脈圧(MAP)モニターの挿入
- ICPモニターを挿入した後、ラットの下部胴体を回して、左大腿部と鼠径部に簡単にアクセスできるようにします。
- 滅菌製剤と局所ブピバカイン投与の後、15枚羽根のメスで後肢を1.5cmの皮膚切開を行います。
- 左大腿動脈を最初に止血剤で表面的に解剖し、次に顕微鏡下で細かい先端を持つ鉗子を使用してより深い層を解剖します。隣接する動脈の位置を特定するのに役立つ濃い青色の大腿静脈を特定します。
- 3-0シルク縫合糸を使用して遠位大腿動脈を縛り、大腿動脈の近位部分に一時的な金属クリップを置きます。
- 読み出しユニットに接続された2番目の光ファイバー圧力センサーをすでにプライミングします。圧力センサーをポリエチレン(PE-50)チューブに挿入し、それをTuohyBorstに挿入して閉じます。Tuohy Borstを、一方の端が1 mLシリンジに接続された3ウェイ活栓に接続し、もう一方の端にPE-50チューブを備えた22G針を接続します。
- 顕微鏡下で、マイクロハサミで2mmの大腿動脈切開を行い、残りのセットアップに接続されたPE-50チューブでカニューレ挿入します。
- 脳室内注射
- 1 mLシリンジを使用して500 μLの血液を吸引し、3方向活栓を回して圧力センサーにMAPを読み取ります。
- PE-50チューブに接続された28Gの脳室内針を、IVH動物用の吸引血液とビヒクル対照動物用の乳酸リンガーでプライミングします。次に、この針をガイドカニューレに右側脳室の深さまで挿入します。
- 100 μL/分の速度で、1 mLシリンジを親指でポンピングすることにより、血液または滅菌乳酸リンゲル溶液(200 μL)を右脳室に注入します。これに先立って、および心室内注射中に、ICP、動脈血圧、および直腸温度を監視および記録します。
- 注入後の ICP 値と MAP 値を監視および記録します。
- クロージャ
- 脳室内注射が完了したら、大腿動脈に挿入した圧力センサーを含むPE-50チューブを引き出し、出血を防ぐために一時的なクリップを大腿動脈に適用します。
- 3-0シルク縫合糸を使用して大腿動脈の近位部分を結びます。
- 3-0シルクを使用して中断された方法で大腿骨切開を閉じます。
- 脳室内針とICPモニターでガイドカニューレを取り外します。
- バリ穴を骨ワックスで塞ぎます。
- 中断された方法で3-0シルク縫合糸で頭蓋切開を閉じます。
- 局所ブピバカインを切開部に塗布し、術後に0.35 mLのカルプロフェン(5 mg / kg)を注射します。.動物が胸骨横臥を維持するのに十分な意識を取り戻すまで、動物を放置しないでください。
- ラットが監督下で手術後に完全に回復し、回復後に餌と水に自由にアクセスできるホームケージに戻します。
4.術後管理
- 術後7日間、すべての術後動物を毎日チェックして、回復、神経学的状態、行動、体重、および切開を監視します。
- 0.35 mLのカルプロフェン(5 mg / kg)を、手術時および術後1日目と2日目に皮下注射で投与します。.
- 術後7 日目に滅菌方法で縫合糸を取り外します。
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Representative Results
頭蓋内圧、平均動脈圧、脳灌流圧
ICPとMAPの両方がすべての動物で術中にモニターされました(図1)。ラットは生後8〜10ヶ月で、平均体重は495±17gでした。リアルタイムのICPグラフも収集されました(図2)。偽群を除くと、ICPはIVHおよびビヒクル対照群の脳室内注射中に有意に増加しました(図3)。ICPは、車両制御(36.5 mmHg)と比較して、IVHグループ(43 mmHg)でよりピークに達しました。その後、ICPは急速に減少し、これらの動物群の脳室内注射後5分以内に正常化しました。.光ファイバーセンサーは、ICPとMAPをリアルタイムで監視するために正常に使用されました。MAPは手順全体を通して同様のままであったのに対し、CPPは血液または乳酸リンゲル溶液の脳室内注射中に減少することが観察されました(図3)。
図1:実験のセットアップ 。 (A)バリ穴の位置。(B)実験セットアップ全体の描写。略語:A-P、前方から後軸。M-L、内側から外側軸。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:ICP記録。 (A)偽動物、(B)IVH、および(C)ビヒクル対照動物におけるリアルタイムの頭蓋内圧(ICP)記録。矢印はIVH / LR注射の開始を示します。各グループでN = 1。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:ICP、MAP、およびCPPグラフ。 IVHおよびビヒクル対照動物における(A)平均頭蓋内圧(ICP)、(B)平均動脈圧(MAP)、および(C)平均脳灌流圧(CPP)値は、心室注射前、心室注射中、および心室注射後。各グループでN = 1。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
この研究では、非外傷性IVHラット動物モデルでICP、MAP、およびCPPを測定するメカニズムを調査しました。結果は以下の群から記録された:偽、VH 200μL、およびビヒクル対照(人工脳脊髄液脳室内注射)動物。この実験デザインは、ICPのスパイクがより重大な二次脳損傷、したがってIVH動物モデルの記憶障害に寄与する可能性があると仮定したため、IVH注射中にICPを監視する方法を調査するために選択されました。したがって、この研究の目的は、非外傷性IVH後のICP、MAP、およびCPPを客観的にモニタリングしたIVH動物モデルを確立し、IVHによって誘発されるICPがその後の記憶機能障害に及ぼす影響に焦点を当てた将来の実験でこれをさらに適用できるようにすることでした。このパイロット研究では、ICPとMAPは、それぞれ左側脳室と大腿動脈に導入された光ファイバー圧力センサーを使用して正確に監視できることがわかりました。ICPは、血液および人工脳脊髄液の脳室内注射中に有意に増加する。さらに、対応するCPPは脳室内注射中に減少します。
この研究の主な関心事の1つは、圧力(ICPとMAP)の非常に小さな変化を正確に監視および記録する方法を見つけることでした。これは、光ファイバー圧力センサーを使用して行われました。光ファイバーセンサーは、圧力の最小限の変化を正確に測定するために小さくする必要がありました。使用された光ファイバーセンサーは、保護のためにケーブルシースで絶縁されています。シースの外径は0.9mm、センサー先端自体の直径は420μmです。ラットのICPおよびMAP値が、このセンサーの通常の圧力動作範囲(-50 mmHg〜+ 300 mmHg)に収まることを確認しました。また、光ファイバーセンサーの精度は±1mmHgと小さくなりました(オプセンスソリューションズ)。
現時点での現在の前臨床ICHモデルの大部分は、全血注入およびコラゲナーゼ(IVHをもたらす細胞外マトリックスを損傷するためのコラゲナーゼ酵素の注射)モデルを有するげっ歯類を2つの最も一般的な実験デザインとして使用している9,10。全血注入モデルは、開頭術またはバリ穴を介して血液を注入することを含み、ラットだけでなくブタおよび霊長類種においても報告されている。ただし、完璧な動物モデルはなく、それぞれに長所と短所があります9,10。アウトカムに関しては、行動、脳浮腫、細胞死、および血腫サイズは、ICH研究でテストされた最も一般的なエンドポイントの一部です。認知機能障害と記憶機能障害を評価する行動テストのうち、大多数はモリス水迷路テストを利用しています10。IVH非外傷性ラットモデルでICPを客観的に測定した研究は見つからなかった。
MacLellanらによる最近のレビューでは、前臨床ICH文献に多くの重要な問題が見つかりました9。MacLenlanらは、圧倒的多数の研究が肯定的な治療効果についてのみ報告していることを発見しました。否定的な結果をもたらす多くの研究は、下位層のジャーナルに掲載されているか、まったく発表されておらず、わずかな出版バイアスではありません。彼らはまた、多くの研究が、とりわけ動物の無作為化、年齢および性別などの方法論を説明していないことを発見した。盲検化の欠如、生理学的変数の報告の欠如、および統計的検出力は、そのレビューで観察された追加の弱点です。これらすべてが、実験10を再現しようとする他の人にとって困難になります。さらに、Hatmanらなどのいくつかの研究では、動物モデルでの実験的ICH後8週間で学習障害と記憶障害が急性になり、早くも減少する傾向があることが示されました11。したがって、動物モデルにおけるこれらの短期記憶効果は、ヒト被験者のICH後に起こる長期記憶および認知機能障害を正確に反映していない可能性があります。
この研究には制限がないわけではありません。主な制限は、動物の木材が少ないことです。これはパイロット研究であり、将来の動物実験には、ここで観察された結果を固めるために、より多くの動物が含まれる予定です。この研究のもう一つの制限は、大腿動脈とTuohy Borstシステムの両方がチューブを洗い流すために低ヘパリン化生理食塩水を使用しているにもかかわらず簡単に凝固するため、手術全体の期間中MAPを適切に監視できないことです。
結論として、ここでは、非外傷性IVHラット動物モデルにおけるICP、MAP、およびCPPを正確にモニタリングする方法について報告します。このような研究は、より一貫性のあるIVH動物モデルを確立し、その後、より厳密な前臨床研究への道を開くでしょう。非外傷性IVH動物モデルに関するより質の高い前臨床研究は、将来のIVH生存者の潜在的な治療選択肢を解明するために重要です。
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Disclosures
すべての著者は利益相反を報告していない。
Acknowledgments
この作業は、NINDS助成金K08NS105914によって資金提供されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% bupivacaine | Hospira, Inc. | 409115901 | |
| 1 mL syringe | Covetrus | 60734 | |
| 10% providine iodine solution | Aplicare | MSD093947 | |
| 20 mL syringe | Covidien | 8881520657 | |
| 22 G needles | Becton Dickinson | 305155 | |
| 28 G intraventricular needles | P technologies | 8IC313ISPCXC | C313I/SPC 28-Gneedles to fit 22-G guide cannula with 6 mm projection |
| 3-0 silk suture | Henry Schein, Inc. | SP116 | |
| 3-way-stopcock | Merti Medical Systems | M3SNC | |
| 4% paraformaldehyde | Fisher Chemical | 30525-89-4 | |
| AnyMaze software | Any-Maze behavioral tracking software | Stoelting CO, USA | |
| Artificial ointment | Covetrus | 48272 | |
| Blood collection vials with EDTA | Becton Dickinson | 367856 | |
| Bone wax | CP Medical, Inc. | CPB31A | |
| Carprofen | Zoetis, Inc. | 54771-8507-1 | |
| Centrifuge | Beckman | BE-GS6R | Model GS-6R |
| Cotton tip applicators | Covetrus | 71214 | |
| Drill | Dremel | 1600A011JA | |
| Fiberoptic pressure sensors with readout units | Opsens Medical | OPP-M200-X-80SC- 2.0PTFE-XN-100PIT-P1 and LIS-P1-N-62SC | Opp-M200 packaged pressure sensors with LifeSens system |
| Forceps | 11923-13, 11064-07 | ||
| Gauze | Covetrus | 71043 | |
| Guillotine | World Precision Instruments | 51330 | |
| Heating pad with rectal thermometer | CWE, Inc. | 08-13000 ,08-13014 | TC1000 Temperature controller |
| Hemostats | 13013-14, 13008-12 | ||
| Isoflurane | Covetrus | 29405 | |
| Lactated ringers | Baxter Healthcare Corp. | Y345583 | |
| Laryngoscope | American Diagnostic Corporation | 4080 | |
| Metal clip | Fine Scientic Tools | 18056-14 | |
| Micro scissors | Fine Scientic Tools | 15007-08 | |
| Microscope | Leica | model L2 | |
| Needle driver | 12003-15 | ||
| Polyethylene tubing | Thermo Fisher Scientific | 14-170-12B | PE-50 tubing |
| Rats | Envigo | Sprague Dawley rats 8–10 months old | |
| Scalpel | 10010-00 | ||
| Scissors | 14090-11 | ||
| Stereotaxic instrument | Kopf instruments | Model 940 with ear bars | |
| Syringe pump | KD Scientific | 780100 | Model 100 series |
| Tuohy Borst | Abbott | 23242 | |
| Ventilator | Harvard rodent ventilator | 55-0000 | Model 683 |
References
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