Intrakraniel trykovervågning i ikke-traumatisk intraventrikulær blødningsgnavermodel

Summary

Overvågning af intrakranielt tryk i gnavermodeller af ikke-traumatisk intraventrikulær blødning er ikke almindelig i den nuværende litteratur. Heri demonstrerer vi en teknik til måling af intrakranielt tryk, gennemsnitligt arterielt tryk og cerebralt perfusionstryk under intraventrikulær blødning i en rottedyrsmodel.

Abstract

Overlevende af intraventrikulær blødning efterlades ofte med betydelig nedsat langtidshukommelse; Således er forskning ved hjælp af intraventrikulære blødningsdyrmodeller afgørende. I denne undersøgelse søgte vi måder at måle intrakranielt tryk, gennemsnitligt arterielt tryk og cerebralt perfusionstryk under ikke-traumatisk intraventrikulær blødning hos rotter. Det eksperimentelle design omfattede tre Sprague Dawley-grupper: sham, standard 200 μl intraventrikulær blødning og køretøjskontrolgrupper. Ved at indføre en intraparenkymisk fiberoptisk tryksensor blev der opnået præcise intrakranielle trykmålinger i alle grupper. Cerebrale perfusionstryk blev beregnet med viden om intrakranielt tryk og gennemsnitlige arterielle trykværdier. Som forventet oplevede de intraventrikulære blødnings- og køretøjskontrolgrupper begge en stigning i det intrakranielle tryk og efterfølgende fald i cerebralperfusionstrykket under intraventrikulær injektion af henholdsvis autologt blod og kunstig cerebrospinalvæske. Tilføjelsen af en intraparenkymal fiberoptisk tryksensor er gavnlig til overvågning af præcise intrakranielle trykændringer.

Introduction

Intraventrikulær blødning (IVH), en type intrakraniel blødning (ICH), er en ødelæggende sygdom, der bærer betydelig dødelighed og sygelighed. IVH er karakteriseret som ophobning af blodprodukter inde i de intrakranielle ventrikler. Isoleret IVH i ualmindelige og forekommer typisk hos voksne¹. Det kan være forbundet med hypertensiv blødning, bristet intrakraniel aneurisme eller en anden vaskulær misdannelse, tumorer eller traumer¹. IVH fører til sekundær hjerneskade samt udvikling af hydrocephalus². Overlevende af IVH efterlades ofte med betydelige funktions-, hukommelses- og kognitive svækkelser efter deres skade. Disse langsigtede kognitive og hukommelsesunderskud rapporteres i så højt som 44% af de overlevende af ICH³. I subarachnoid blødning (SAH), en anden type ICH, er det velkendt, at ca. halvdelen af de overlevende vil have hukommelsesunderskud, og for dem, der har IVH ud over SAH, har resultaterne en tendens til at være signifikant værre ^4,5,6.

Underliggende mekanismer for hukommelsesdysfunktion efter IVH mangler stadig at blive belyst. In vivo-forskning, der anvender ikke-traumatiske IVH-dyremodeller med funktionel og hukommelsesdysfunktion, er afgørende for at opdage potentielle terapeutiske mål for sådanne patienter. Dyremodeller med mere alvorlig hukommelse og funktionel dysfunktion efter IVH ville være de bedste til at studere disse ændringer. Seniorforfatterens laboratorium har også undersøgt specifikt rollen som højt intrakranielt tryk (ICP) i udviklingen af hukommelsesunderskud i IVH-rottemodeller. Derfor var metoder til præcist at måle ICP'er under IVH vigtige at undersøge. Heri rapporterer vi om metoder til præcis måling af ICP'er i en IVH-rottemodel. Selvom ICP-overvågning tidligere er blevet brugt i traumatiske ICH- såvel som subarachnoide blødningsdyrmodeller, er ICP-overvågning i spontane IVH-gnavermodeller ikke så almindeligt rapporteret i litteraturen ^7,8. Derfor omfattede det eksperimentelle design, der blev præsenteret heri, tre grupper af Sprague Dawley-rotter: sham, standard 200 μl intraventrikulær blødning og køretøjskontrol. For IVH-gruppen blev der anvendt en autolog intraventrikulær blodinjektionsmodel. Til køretøjskontroldyr blev intraventrikulær injektion af steril Lactated Ringer's opløsning anvendt. ICP'er, gennemsnitlige arterielle tryk (MAP'er) og cerebrale perfusionstryk (CPP'er) blev registreret intraoperativt, og resultaterne rapporteres heri.

Protocol

Alle forskningsmetoder og dyrepleje / vedligeholdelse blev udført i overensstemmelse med de institutionelle retningslinjer ved University of California, Davis. Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved University of California, Davis, godkendte alle protokoller og eksperimentelle procedurer for dyrebrug (IACUC-protokol #21874).

1. Opstaldning af dyr

1. Få Sprague-Dawley rotter i alderen 8-10 måneder gamle. Før enhver eksperimentel procedure skal du huse rotterne i et vivarium og tillade mindst 1 uge til generel tilpasning i deres bure efter en 12-timers lys / mørk cyklus med mad og vand ad libitum.

2. Anæstesi og præoperative procedurer

1. Anæstetik rotten med 4% isofluran i 4 min. Hæng rotten ved tænderne i en liggende stilling på en intubationsplatform, og intuber endotrachealt ved hjælp af en endotracheal kanyle og laryngoskop.
2. Anbring den bedøvede og intuberede rotte på en ventilator (2% isofluran og O2 / N2 bærergas). Rotten bedøves tilstrækkeligt, hvis der ikke observeres noget svar på en smertefuld stimulus, såsom en bagbensklemme.
3. Indsæt et rektalt termometer for kontinuerligt at overvåge temperaturen.
4. Udfør alle operative procedurer ved hjælp af steril teknik. Klip håret på hovedet og lårbensregionen, og forbered huden med tre skiftende skrubber af betadin og 70% alkohol inden operationen.
5. Aspirer eventuelle akkumulerede åndedrætssekretioner ved midlertidigt at fjerne rotten fra ventilatoren og opsuge sekreterne med PE-50 slanger forbundet til en 10 ml sprøjte.
6. Beskyt rottens øjne med steril kunstig tårer øjensalve.
7. Injicer lokal bupivacain (~ 0,1 ml 0,25% opløsning) i huden og subkutant væv før hovedbundssnittet.

3. Kirurgi protokol

1. Placering af intraventrikulær nål og intrakraniel tryk (ICP) monitor
   1. Placer rotten i en udsat position i en stereotaktisk ramme og ørestang rotten.
   2. Lav et 1,5 cm hovedbundssnit langs midterlinjen med en 15-bladet skalpel.
   3. Påfør mildt tryk med gasbind til hæmostase.
   4. Brug en steril bomuldsspidsapplikator til at adskille periosteum fra kraniet, indtil bregma-vartegnet er synligt.
   5. Find og markér bregma ved hjælp af stereotaxis, og markér placeringen af to bilaterale burrhuller, 1,4 mm laterale og 0,9 mm bageste til bregmaen.
   6. Brug en håndholdt boremaskine til at skabe disse to små (op til 2 mm) kraniale burrhuller i højre og venstre halvkugle. Skyl overskydende knoglechips ud med steril Lactated Ringer's opløsning.
   7. På højre halvkugle skal du placere en 22-G styrekanyle på niveau med burrhullet for at indsætte 28-G-nålen gennem kanylen til dybden af højre laterale ventrikel (4,6 mm i forhold til bregma) for at skabe IVH.
   8. Tilslut den fiberoptiske tryksensor til udlæsningsenheden. Tænd for udlæsningsenheden, og sørg for, at de valgte enheder er i mmHg. Forprim derefter sensoren ved at nedsænke spidsen i et lille bægerglas med Lactated Ringers opløsning, indtil udlæsningsenheden aflæser nul. Når det er nulstillet i Lactated Ringers-løsningen, er det hele klar til at blive indsat.
   9. På venstre halvkugle skal du forsigtigt indsætte tryksensoren i 2-3 mm dybde i cortex for ICP-overvågning i realtid.
2. Lårbensarterie kannulation og indsættelse af gennemsnitlig arteriel tryk (MAP) monitor
   1. Efter indsættelse af ICP-skærmen skal du dreje rottens nedre bagagerum for nem adgang til venstre lår og lyskeområde.
   2. Efter steril forberedelse og lokal bupivacainadministration laves et 1,5 cm hudsnit over bagbenet med en 15-bladet skalpel.
   3. Disseker den venstre lårbensarterie først overfladisk med en hæmostat og derefter dybere lag ved hjælp af tang med fine spidser under et mikroskop. Identificer den dybe blå lårbensvene for at hjælpe med at lokalisere den tilstødende arterie.
   4. Bind den distale lårbensarterie ved hjælp af 3-0 silkesutur og læg en midlertidig metalklemme på den proksimale del af lårbensarterien.
   5. Har en anden fiberoptisk tryksensor tilsluttet udlæsningsenheden, der allerede er primet. Indsæt tryksensoren i polyethylen (PE-50) slangen, som indsættes i en Tuohy Borst, der derefter lukkes. Tilslut Tuohy Borst til en 3-vejs stophane forbundet til en 1 ml sprøjte i den ene ende og en 22-G nål med PE-50 slange i den anden ende.
   6. Under mikroskopet laves en 2 mm lårbensarteriotomi med mikrosaks og kannulerer den med PE-50 slanger forbundet med resten af opsætningen.
3. Intraventrikulær injektion
   1. Aspirer 500 μL blod ved hjælp af en 1 ml sprøjte, og drej 3-vejs stophanen for at få tryksensoren til at læse MAP.
   2. Prime den 28-G intraventrikulære nål forbundet med PE-50 slanger med det aspirerede blod til IVH-dyr og Lactated Ringer's til køretøjets kontroldyr. Indsæt derefter denne nål i styrekanylen til dybden af højre laterale ventrikel.
   3. Brug 100 μL/min hastighed til at injicere blodet eller den sterile Lactated Ringers opløsning (200 μL) i højre laterale ventrikel ved at pumpe 1 ml sprøjten med tommelfingeren. Før dette og under intraventrikulær injektion skal du overvåge og registrere ICP, arterielt blodtryk og rektal temperatur.
   4. Overvåg og registrer ICP- og MAP-værdierne efter injektion.
4. Afslutning
   1. Efter afslutning af intraventrikulær injektion trækkes PE-50-slangen indeholdende trykføleren, der blev indsat i lårarterien, og påfør det midlertidige klip på lårarterien for at forhindre blødning.
   2. Bind den proksimale del af lårbensarterien ved hjælp af 3-0 silkesuturen.
   3. Luk lårbenet på en afbrudt måde ved hjælp af 3-0 silke.
   4. Fjern styrekanylen med intraventrikulær nål og ICP-monitoren.
   5. Forsegl burrhullerne med knoglevoks.
   6. Luk kraniesnittet med 3-0 silkesutur på en afbrudt måde.
   7. Påfør topisk bupivacain på snittet og injicer 0,35 ml carprofen (5 mg/kg) postoperativt. Efterlad ikke dyr uden opsyn, før de har genvundet tilstrækkelig bevidsthed til at opretholde sternal liggenden.
   8. Lad rotter komme sig helt efter operationen under tilsyn og returnere dem til deres hjemmebure med fri adgang til mad og vand efter genopretning.

4. Postoperativ forvaltning

1. Kontroller alle postoperative dyr dagligt i syv postoperative dage for at overvåge deres genopretning, neurologiske status, adfærd, vægt og snit.
2. 0,35 ml carprofen (5 mg/kg) administreres ved subkutan injektion på operationstidspunktet og på 1. og 2. postoperative dag^.
3. Fjern suturerne på den 7. postoperative dag på en steril måde^.

Representative Results

Intrakranielt, gennemsnitligt arterielt og cerebralt perfusionstryk
Både ICP'er og flerårige planer blev overvåget intraoperativt hos alle dyr (figur 1). Rotter var 8-10 måneder gamle med en gennemsnitsvægt på 495 ± 17 g. Der blev også indsamlet ICP-grafer i realtid (figur 2). Bortset fra skingruppen steg ICP'erne betydeligt under intraventrikulær injektion i IVH samt køretøjskontrolgrupper (figur 3). ICP'erne toppede mere i IVH-gruppen (43 mmHg) sammenlignet med køretøjskontrollen (36,5 mmHg). ICP'erne faldt derefter hurtigt og normaliserede inden for fem minutter efter intraventrikulær injektion i disse dyregrupper. Den fiberoptiske sensor blev med succes brugt til at overvåge ICP'er og MAP'er i realtid. Det blev observeret, at MAP'er forblev ens under hele proceduren, mens CPP'er faldt under intraventrikulær injektion af enten blod eller Lactated Ringers opløsning (figur 3).

Figur 1: Eksperimentel opsætning . (A) Placering af burrhuller. (B) Skildring af hele forsøgsopsætningen. Forkortelser: A-P, anterior til bageste akse; M-L, medial til lateral akse. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 2: ICP-registreringer. Registreringer af intrakranielt tryk i realtid (ICP) i (A) skin, (B) IVH og (C) køretøjskontroldyr. Pilen angiver starten på IVH/LR-injektionen. N=1 i hver gruppe. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 3: ICP-, MAP- og CPP-grafer. (A) Gennemsnitligt intrakranielt tryk (ICP), (B) gennemsnitligt arterielt tryk (MAP) og (C) gennemsnitlige cerebrale perfusionstryk (CPP) værdier før ventrikulær injektion under ventrikulær injektion og postventrikulær injektion i IVH og køretøjskontroldyr. N=1 i hver gruppe. Klik her for at se en større version af denne figur.

Discussion

Denne undersøgelse undersøgte mekanismer til måling af ICP'er, MAP'er og CPP'er i en ikke-traumatisk IVH-rottedyrsmodel. Resultaterne blev registreret fra følgende grupper: sham, VH 200 μL og køretøjskontrol (kunstig cerebrospinalvæske intraventrikulær injektion) dyr. Dette eksperimentelle design blev valgt for at undersøge, hvordan ICP'er kan overvåges under IVH-injektion, da vi antog, at stigningen i ICP'er kan bidrage til den mere signifikante sekundære hjerneskade og dermed hukommelsesunderskud i IVH-dyremodeller. Derfor var målene med denne undersøgelse at etablere en IVH-dyremodel med objektiv overvågning af ICP'er, MAP'er og CPP'er efter ikke-traumatisk IVH, så vi kan anvende dette yderligere i fremtidige eksperimenter, der vil fokusere på virkningerne af ICP'er induceret af IVH på efterfølgende hukommelsesdysfunktion. Denne pilotundersøgelse viste, at ICP'er og MAP'er kan overvåges nøjagtigt ved hjælp af en fiberoptisk tryksensor introduceret i henholdsvis venstre laterale ventrikel og lårbensarterie. ICP'er øges signifikant under intraventrikulær injektion af blod og kunstig cerebrospinalvæske. Derudover falder de tilsvarende CPP'er under intraventrikulær injektion.

En af de største bekymringer for denne undersøgelse var at finde en måde at overvåge og registrere de meget små ændringer i tryk (ICP'er og MAP'er) nøjagtigt. Dette blev gjort ved hjælp af en fiberoptisk tryksensor. Den fiberoptiske sensor skulle være lille for nøjagtigt at måle minimale trykændringer. Den fiberoptiske sensor, der blev brugt, er isoleret i en kabelkappe for dens beskyttelse. Kappens ydre diameter er 0,9 mm, og diameteren på selve sensorspidsen er 420 μm. Vi sikrede, at rotte-ICP- og MAP-værdier kunne falde inden for det normale driftsområde for tryk for denne sensor (-50 mmHg til +300 mmHg). Præcisionen af den fiberoptiske sensor blev også sikret at være lille, ±1 mmHg (Opsens Solutions).

Størstedelen af de nuværende prækliniske ICH-modeller på nuværende tidspunkt bruger gnavere med fuldblodsinfusion og collagenase (injektion af collagenaseenzym for at skade den ekstracellulære matrix, der resulterer i IVH) modeller som de to mest almindelige eksperimentelle designs ^9,10. Fuldblodsinfusionsmodellen involverer infusion af blod via en kraniotomi eller burrhul og er blevet rapporteret ikke kun hos rotter, men også hos svin og primatarter. Ingen dyremodel er dog perfekt, og hver har sine egne fordele og ulemper ^9,10. Med hensyn til resultater er adfærd, cerebralt ødem, celledød og hæmatomstørrelse nogle af de mest almindelige endepunkter, der er testet i ICH-undersøgelser. Af adfærdstestene, der vurderer kognitiv og hukommelsesdysfunktion, bruger flertallet Morris vandlabyrinttesten¹⁰. Vi har ikke fundet undersøgelser, der objektivt måler ICP'er i IVH ikke-traumatiske rottemodeller.

En nylig gennemgang af MacLellan et al. fandt mange nøgleproblemer med præklinisk ICH-litteratur⁹. MacLellan et al. fandt ud af, at et overvældende flertal af undersøgelserne kun rapporterer om positive behandlingseffekter. Mange undersøgelser med negative resultater offentliggøres i tidsskrifter på lavere niveau eller offentliggøres slet ikke, hvilket bidrager til en ikke ubetydelig publikationsbias. De fandt også, at mange undersøgelser ikke beskriver metoden som randomisering, alder og køn af dyr, blandt andre. Manglende blinding, manglende rapportering af fysiologiske variabler samt statistisk styrke er yderligere svagheder, der blev observeret i denne gennemgang. Alt dette gør det udfordrende for andre, der forsøger at replikere eksperimentet¹⁰. Derudover viste nogle undersøgelser, såsom Hatman et al., at lærings- og hukommelsesunderskuddet har tendens til at være akut og aftage så tidligt som i 8 uger efter eksperimentel ICH i dyremodeller¹¹. Derfor afspejler disse korttidshukommelseseffekter i dyremodeller muligvis ikke nøjagtigt den langsigtede hukommelse og kognitive dysfunktion, der sker efter ICH hos mennesker.

Denne undersøgelse er ikke uden begrænsninger. En stor begrænsning er dyrenes lave tømmer. Dette var en pilotundersøgelse, og fremtidige dyreforsøg vil indeholde et større antal dyr for at størkne de resultater, der er observeret heri. En anden begrænsning af denne undersøgelse er manglende evne til tilstrækkeligt at overvåge MAP'erne i hele operationens varighed, da lårbensarterien og Tuohy Borst-systemet begge størkner let på trods af brugen af lavt hepariniseret saltvand til at skylle slangen.

Afslutningsvis rapporterer vi heri om metoder til præcis overvågning af ICP'er, MAP'er og CPP'er i en ikke-traumatisk IVH-rottedyrsmodel. Undersøgelser som denne vil bane vejen for at etablere en mere konsistent IVH-dyremodel og efterfølgende strengere præklinisk forskning. Præklinisk forskning af højere kvalitet på ikke-traumatiske IVH-dyremodeller er afgørende for at belyse potentielle terapeutiske muligheder for IVH-overlevende i fremtiden.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% bupivacaine	Hospira, Inc.	409115901
1 mL syringe	Covetrus	60734
10% providine iodine solution	Aplicare	MSD093947
20 mL syringe	Covidien	8881520657
22 G needles	Becton Dickinson	305155
28 G intraventricular needles	P technologies	8IC313ISPCXC	C313I/SPC 28-Gneedles to fit 22-G guide cannula with 6 mm projection
3-0 silk suture	Henry Schein, Inc.	SP116
3-way-stopcock	Merti Medical Systems	M3SNC
4% paraformaldehyde	Fisher Chemical	30525-89-4
AnyMaze software	Any-Maze behavioral tracking software		Stoelting CO, USA
Artificial ointment	Covetrus	48272
Blood collection vials with EDTA	Becton Dickinson	367856
Bone wax	CP Medical, Inc.	CPB31A
Carprofen	Zoetis, Inc.	54771-8507-1
Centrifuge	Beckman	BE-GS6R	Model GS-6R
Cotton tip applicators	Covetrus	71214
Drill	Dremel	1600A011JA
Fiberoptic pressure sensors with readout units	Opsens Medical	OPP-M200-X-80SC- 2.0PTFE-XN-100PIT-P1 and LIS-P1-N-62SC	Opp-M200 packaged pressure sensors with LifeSens system
Forceps		11923-13, 11064-07
Gauze	Covetrus	71043
Guillotine	World Precision Instruments	51330
Heating pad with rectal thermometer	CWE, Inc.	08-13000 ,08-13014	TC1000 Temperature controller
Hemostats		13013-14,  13008-12
Isoflurane	Covetrus	29405
Lactated ringers	Baxter Healthcare Corp.	Y345583
Laryngoscope	American Diagnostic Corporation	4080
Metal clip	Fine Scientic Tools	18056-14
Micro scissors	Fine Scientic Tools	15007-08
Microscope	Leica	model L2
Needle driver		12003-15
Polyethylene tubing	Thermo Fisher Scientific	14-170-12B	PE-50 tubing
Rats	Envigo		Sprague Dawley rats 8–10 months old
Scalpel		10010-00
Scissors		14090-11
Stereotaxic instrument	Kopf instruments		Model 940 with ear bars
Syringe pump	KD Scientific	780100	Model 100 series
Tuohy Borst	Abbott	23242
Ventilator	Harvard rodent ventilator	55-0000	Model 683