Summary
Övervakning av intrakraniellt tryck i gnagarmodeller av icke-traumatisk intraventrikulär blödning är inte vanligt i den aktuella litteraturen. Häri demonstrerar vi en teknik för att mäta intrakraniellt tryck, medelartärtryck och cerebralt perfusionstryck vid intraventrikulär blödning i en råttdjursmodell.
Abstract
Överlevande av intraventrikulär blödning lämnas ofta med betydande långvarig minnesförlust; Således är forskning som använder intraventrikulära blödningsdjurmodeller avgörande. I denna studie sökte vi efter sätt att mäta intrakraniellt tryck, medelartärtryck och cerebralt perfusionstryck under icke-traumatisk intraventrikulär blödning hos råttor. Den experimentella designen inkluderade tre Sprague Dawley-grupper: bluff, standard 200 μl intraventrikulär blödning och fordonskontrollgrupper. Genom att införa en intraparenkymal fiberoptisk trycksensor erhölls exakta intrakraniella tryckmätningar i alla grupper. Cerebralt perfusionstryck beräknades med kunskap om intrakraniellt tryck och genomsnittliga arteriella tryckvärden. Som förväntat upplevde både intraventrikulär blödning och vehikelkontrollgrupper en ökning av det intrakraniella trycket och efterföljande nedgång i cerebralt perfusionstryck under intraventrikulär injektion av autologt blod respektive artificiell cerebrospinalvätska. Tillägget av en intraparenkymal fiberoptisk trycksensor är fördelaktigt vid övervakning av exakta intrakraniella tryckförändringar.
Introduction
Intraventrikulär blödning (IVH), en typ av intrakraniell blödning (ICH), är en förödande sjukdom som bär signifikant dödlighet och sjuklighet. IVH karakteriseras som ackumulering av blodprodukter inuti intrakraniella ventriklar. Isolerad IVH i mindre vanliga och förekommer vanligtvis hos vuxna1. Det kan vara förknippat med hypertensiv blödning, brusten intrakraniell aneurysm eller annan vaskulär missbildning, tumörer eller trauma1. IVH leder till sekundär hjärnskada samt utveckling av hydrocefalus2. Överlevande av IVH lämnas ofta med betydande funktionella, minnes- och kognitiva funktionsnedsättningar efter sin skada. Dessa långsiktiga kognitiva och minnesunderskott rapporteras i så högt som 44% av överlevande av ICH3. Vid subaraknoidalblödning (SAH), en annan typ av ICH, är det välkänt att ungefär hälften av de överlevande kommer att ha minnesunderskott, och för dem som har IVH utöver SAH tenderar resultaten att vara betydligt sämre 4,5,6.
Underliggande mekanismer för minnesdysfunktion efter IVH återstår att belysa. In vivo-forskning som använder icke-traumatiska IVH-djurmodeller med funktionell och minnesdysfunktion är avgörande för att upptäcka potentiella terapeutiska mål för sådana patienter. Djurmodeller med svårare minne och funktionell dysfunktion efter IVH skulle vara bäst att studera dessa förändringar. Seniorförfattarens laboratorium har också undersökt specifikt rollen av högt intrakraniellt tryck (ICP) i utvecklingen av minnesunderskott i IVH-råttmodeller. Därför var metoder för att exakt mäta ICP under IVH viktiga att undersöka. Häri rapporterar vi om metoder för att exakt mäta ICP i en IVH-råttmodell. Även om ICP-övervakning tidigare har använts i traumatiska ICH- såväl som subaraknoidalblödningsdjurmodeller, är ICP-övervakning i spontana IVH-gnagarmodeller inte lika vanligt rapporterad i litteraturen 7,8. Därför inkluderade den experimentella designen som presenterades här tre grupper av Sprague Dawley-råttor: bluff, standard 200 μl intraventrikulär blödning och fordonskontroll. För IVH-gruppen användes en autolog intraventrikulär blodinjektionsmodell. För vehikelkontrolldjur användes intraventrikulär injektion av steril Laktated Ringers lösning. ICPs, genomsnittliga arteriella tryck (MAPs) och cerebrala perfusionstryck (CPP) registrerades intraoperativt, och resultaten rapporteras häri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla forskningsmetoder och djurvård / underhåll utfördes i enlighet med de institutionella riktlinjerna vid University of California, Davis. Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid University of California, Davis, godkände alla djuranvändningsprotokoll och experimentella förfaranden (IACUC-protokoll #21874).
1. Djurstall
- Skaffa Sprague-Dawley-råttor i åldern 8-10 månader gamla. Före varje experimentellt förfarande, hysa råttorna i ett vivarium och låt minst 1 vecka för allmän anpassning i burarna efter en 12-timmars ljus / mörk cykel med mat och vatten ad libitum.
2. Anestesi och preoperativa förfaranden
- Bedöva råttan med 4% isofluran i 4 min. Häng råttan vid tänderna i en liggande position på en intubationsplattform och intubera endotrakealt med hjälp av en endotrakeal kanyl och laryngoskop.
- Placera den bedövade och intuberade råttan på en ventilator (2% isofluran och O2 / N2 bärgas). Råttan bedövas tillräckligt om inget svar på en smärtsam stimulans som en bakbensnypa observeras.
- Sätt i en rektal termometer för att kontinuerligt övervaka temperaturen.
- Utför alla operativa procedurer med steril teknik. Klipp håret på huvudet och lårbensregionen och förbered huden med tre alternerande skrubbar av Betadin och 70% alkohol före operationen.
- Aspirera eventuella ackumulerade andningssekret genom att tillfälligt ta bort råttan från ventilatorn och aspirera sekretet med PE-50-slangar anslutna till en 10 ml spruta.
- Skydda råttans ögon med sterila konstgjorda tårar ögonsalva.
- Injicera lokalt bupivakain (~0,1 ml 0,25% lösning) i huden och subkutana vävnader före snittet i hårbotten.
3. Protokoll för kirurgi
- Placering av intraventrikulär nål och intrakraniell tryckmonitor (ICP)
- Placera råttan i ett benäget läge i en stereotaktisk ram och öronstänger råttan.
- Gör ett snitt på 1,5 cm hårbotten längs mittlinjen med en 15-bladig skalpell.
- Applicera milt tryck med gasväv för hemostas.
- Använd en steril bomullsspetsapplikator, separera periosteum från skallen tills bregma landmärke är synligt.
- Leta reda på och markera bregma med stereotaxi och markera platsen för två bilaterala burrhål, 1,4 mm laterala och 0,9 mm bakre till bregma.
- Använd en handhållen borr för att skapa dessa två små (upp till 2 mm) kranialburrhål i höger och vänster halvklot. Bevattna ut överflödiga benflisor med steril Lactated Ringers lösning.
- På den högra halvklotet, placera en 22-G styrkanyl vid nivån på burrhålet för att föra in 28-G-nålen genom kanylen till djupet av höger lateral ventrikel (4,6 mm i förhållande till bregma) för att skapa IVH.
- Anslut den fiberoptiska trycksensorn till avläsningsenheten. Slå på avläsningsenheten och se till att de valda enheterna är i mmHg. Fyll sedan sensorn genom att sänka ner spetsen i en liten bägare med Lactated Ringers lösning tills avläsningsenheten läser ut noll. När den har nollställts i Lactated Ringers-lösningen är den redo att sättas in.
- På vänster halvklot, sätt försiktigt in trycksensorn till 2-3 mm djup i cortex för ICP-övervakning i realtid.
- Femoral artärkanulering och införande av medelarteriellt tryck (MAP) monitor
- Efter insättning av ICP-monitorn, vrid råttans nedre bagageutrymme för enkel åtkomst till vänster lår och ljumskområde.
- Efter steril beredning och lokal administrering av bupivakain, gör ett 1,5 cm hudsnitt över bakbenet med en 15-bladig skalpell.
- Dissekera ut den vänstra lårbensartären först ytligt med en hemostat och sedan djupare lager med pincett med fina spetsar under ett mikroskop. Identifiera den djupblå lårbensvenen för att hjälpa till att hitta den intilliggande artären.
- Bind av den distala lårbensartären med 3-0 silkesutsutur och placera ett tillfälligt metallklämma på den proximala delen av lårbensartären.
- Ha en andra fiberoptisk trycksensor ansluten till avläsningsenheten som redan är grundad. Sätt in trycksensorn i polyetenröret (PE-50), som sätts in i en Tuohy Borst som sedan stängs. Anslut Tuohy Borst till en 3-vägs stoppkran ansluten till en 1 ml spruta i ena änden och en 22-G nål med PE-50-slang i andra änden.
- Under mikroskopet, gör en 2 mm femoral arteriotomi med mikrosax och kannulera den med PE-50-slang ansluten till resten av installationen.
- Intraventrikulär injektion
- Aspirera 500 μl blod med en 1 ml spruta och vrid 3-vägs stoppkranen för att få trycksensorn att läsa MAP.
- Prima den 28-G intraventrikulära nålen ansluten till PE-50-slangen med aspirerat blod för IVH-djur och Laktated Ringers för fordonskontrolldjuren. Sätt sedan in denna nål i styrkanylen till djupet av höger lateral ventrikel.
- Injicera blodet eller den sterila Laktated Ringers lösning (200 μL) (200 μL) med 100 μl/min hastighet i höger lateral kammare genom att pumpa sprutan på 1 ml med tummen. Före detta och under intraventrikulär injektion, övervaka och registrera ICP, arteriellt blodtryck och rektal temperatur.
- Övervaka och registrera ICP- och MAP-värdena efter injektionen.
- Nedläggning
- Efter avslutad intraventrikulär injektion, dra tillbaka PE-50-slangen som innehåller trycksensorn som sattes in i lårbensartären och applicera det tillfälliga klämman på lårbensartären för att förhindra blödning.
- Bind av den proximala delen av lårbensartären med hjälp av 3-0 silkessuturen.
- Stäng lårbenets snitt på ett avbrutet sätt med 3-0 siden.
- Ta bort styrkanylen med den intraventrikulära nålen och ICP-monitorn.
- Försegla burrhålen med benvax.
- Stäng kranialsnittet med 3-0 silkesutsutur på ett avbrutet sätt.
- Applicera topiskt bupivakain på snittet och injicera 0,35 ml karprofen (5 mg/kg) postoperativt. Lämna inte djur utan uppsikt förrän de har återfått tillräckligt med medvetande för att upprätthålla sternal recumbency.
- Låt råttor återhämta sig helt efter operationen under övervakning och återföra dem till sina hemburar med fri tillgång till mat och vatten efter återhämtning.
4. Postoperativ hantering
- Kontrollera alla postoperativa djur dagligen i sju postoperativa dagar för att övervaka deras återhämtning, neurologiska status, beteende, vikt och snitt.
- Administrera 0,35 ml karprofen (5 mg/kg) genom subkutan injektion vid operationen och den 1:a och 2:a postoperativa dagen.
- Ta bort suturerna på den 7: e postoperativa dagen på ett sterilt sätt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Intrakraniella, genomsnittliga arteriella och cerebrala perfusionstryck
Både ICP och MAPs övervakades intraoperativt hos alla djur (figur 1). Råttorna var 8-10 månader gamla med en medelvikt på 495 ± 17 g. ICP-grafer i realtid samlades också in (figur 2). Exklusive bluffgruppen ökade ICPs signifikant under intraventrikulär injektion i IVH såväl som vehikelkontrollgrupper (figur 3). ICP toppade mer i IVH-gruppen (43 mmHg) jämfört med fordonskontrollen (36,5 mmHg). ICP: erna minskade sedan snabbt och normaliserades inom fem minuter efter intraventrikulär injektion i dessa djurgrupper. Den fiberoptiska sensorn användes framgångsrikt för att övervaka ICP och MAPs i realtid. Det observerades att MAPs förblev lika under hela proceduren, medan CPP minskade under intraventrikulär injektion av antingen blod eller Laktated Ringers lösning (figur 3).
Bild 1: Experimentell installation . (A) Placering av burrhål. (B) Skildring av hela experimentupplägget. Förkortningar: A-P, främre till bakre axeln; M-L, medial till lateral axel. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 2: ICP-inspelningar. Registreringar av intrakraniellt tryck (ICP) i realtid hos (A) skendjur, (B) IVH och (C) fordonskontrolldjur. Pil betecknar starten på IVH/LR-injektionen. N=1 i varje grupp. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: ICP-, MAP- och CPP-diagram. (A) Genomsnittligt intrakraniellt tryck (ICP), (B) genomsnittligt arteriellt tryck (MAP) och (C) medelvärde för cerebralt perfusionstryck (CPP) före ventrikelinjektion, under ventrikulär injektion och postventrikulär injektion i IVH och vehikelkontrolldjur. N=1 i varje grupp. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna studie undersökte mekanismer för att mäta ICPs, MAPs och CPPs i en icke-traumatisk IVH-råttdjurmodell. Resultaten registrerades från följande grupper: sham, VH 200 μL och vehikelkontroll (artificiell cerebrospinalvätska intraventrikulär injektion) djur. Denna experimentella design valdes för att undersöka hur ICP kan övervakas under IVH-injektion eftersom vi antog att ökningen av ICP kan bidra till den mer signifikanta sekundära hjärnskadan och därmed minnesunderskottet i IVH-djurmodeller. Därför var målen med denna studie att etablera en IVH-djurmodell med objektiv övervakning av ICP, MAPs och CPP efter icke-traumatisk IVH så att vi kan tillämpa detta ytterligare i framtida experiment som kommer att fokusera på effekterna av ICP inducerade av IVH på efterföljande minnesdysfunktion. Denna pilotstudie visade att ICP och MAPs kan övervakas exakt med hjälp av en fiberoptisk trycksensor införd i vänster lateral ventrikel respektive lårbensartär. ICP ökar signifikant under intraventrikulär injektion av blod och artificiell cerebrospinalvätska. Dessutom minskar motsvarande CPP under intraventrikulär injektion.
Ett av de största problemen för denna studie var att hitta ett sätt att övervaka och registrera de mycket små förändringarna i tryck (ICP och MAPs) exakt. Detta gjordes med hjälp av en fiberoptisk trycksensor. Den fiberoptiska sensorn måste vara liten för att noggrant mäta minimala tryckförändringar. Den fiberoptiska sensorn som användes är isolerad i en kabelmantel för dess skydd. Mantelns ytterdiameter är 0,9 mm och själva sensorspetsens diameter är 420 μm. Vi säkerställde att ICP- och MAP-värden för råtta kunde falla inom det normala driftsområdet för tryck för denna sensor (-50 mmHg till +300 mmHg). Dessutom säkerställdes precisionen hos den fiberoptiska sensorn att vara liten, ±1 mmHg (Opsens Solutions).
Majoriteten av nuvarande prekliniska ICH-modeller vid denna tidpunkt använder gnagare med helblodsinfusion och kollagenas (injektion av kollagenasenzym för att skada den extracellulära matrisen som resulterar i IVH) modeller som de två vanligaste experimentella designerna 9,10. Helblodsinfusionsmodellen involverar infusion av blod via ett kraniotomi- eller burrhål och har rapporterats inte bara hos råttor utan även hos grisar och primatarter. Ingen djurmodell är dock perfekt, och var och en har sina egna fördelar och nackdelar 9,10. När det gäller resultat är beteende, hjärnödem, celldöd och hematomstorlek några av de vanligaste effektmåtten som testats i ICH-studier. Av de beteendetester som bedömer kognitiv och minnesdysfunktion använder majoriteten Morris vattenlabyrinttest10. Vi har inte hittat studier som objektivt mäter ICP i IVH icke-traumatiska råttmodeller.
fann många viktiga problem med preklinisk ICH-litteratur9. fann att en överväldigande majoritet av studierna endast rapporterar om positiva behandlingseffekter. Många studier med negativa resultat publiceras i tidskrifter på lägre nivå eller publiceras inte alls, vilket bidrar till inte en obetydlig publiceringsbias. De fann också att många studier inte beskriver metodiken som randomisering, ålder och kön hos bland annat djur. Brist på blindning, brist på rapportering av fysiologiska variabler samt statistisk kraft är ytterligare svagheter som observerades i den översynen. Allt detta gör det utmanande för andra som försöker replikera experimentet10. Dessutom visade vissa studier, såsom Hatman et al., att inlärnings- och minnesunderskotten tenderar att vara akuta och minska så tidigt som i 8 veckor efter experimentell ICH i djurmodeller11. Därför kanske dessa kortsiktiga minneseffekter i djurmodeller inte korrekt återspeglar det långsiktiga minnet och kognitiv dysfunktion som händer efter ICH hos människor.
Denna studie är inte utan begränsningar. En stor begränsning är djurens låga virke. Detta var en pilotstudie, och framtida djurstudier kommer att innehålla ett större antal djur för att stärka de resultat som observerats häri. En annan begränsning i denna studie är oförmågan att på ett adekvat sätt övervaka MAPs under hela operationen eftersom lårbensartären och Tuohy Borst-systemet båda koagulerar lätt trots användning av låg hepariniserad saltlösning för att spola slangen.
Sammanfattningsvis rapporterar vi här om metoder för exakt övervakning av ICP, MAPs och CPP i en icke-traumatisk IVH-råttdjursmodell. Studier som denna kommer att bana väg för att etablera en mer konsekvent IVH-djurmodell och därefter mer rigorös preklinisk forskning. Preklinisk forskning av högre kvalitet på icke-traumatiska IVH-djurmodeller är avgörande för att belysa potentiella terapeutiska alternativ för IVH-överlevande i framtiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alla författare rapporterar ingen intressekonflikt.
Acknowledgments
Detta arbete finansierades av NINDS-anslaget: K08NS105914
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% bupivacaine | Hospira, Inc. | 409115901 | |
| 1 mL syringe | Covetrus | 60734 | |
| 10% providine iodine solution | Aplicare | MSD093947 | |
| 20 mL syringe | Covidien | 8881520657 | |
| 22 G needles | Becton Dickinson | 305155 | |
| 28 G intraventricular needles | P technologies | 8IC313ISPCXC | C313I/SPC 28-Gneedles to fit 22-G guide cannula with 6 mm projection |
| 3-0 silk suture | Henry Schein, Inc. | SP116 | |
| 3-way-stopcock | Merti Medical Systems | M3SNC | |
| 4% paraformaldehyde | Fisher Chemical | 30525-89-4 | |
| AnyMaze software | Any-Maze behavioral tracking software | Stoelting CO, USA | |
| Artificial ointment | Covetrus | 48272 | |
| Blood collection vials with EDTA | Becton Dickinson | 367856 | |
| Bone wax | CP Medical, Inc. | CPB31A | |
| Carprofen | Zoetis, Inc. | 54771-8507-1 | |
| Centrifuge | Beckman | BE-GS6R | Model GS-6R |
| Cotton tip applicators | Covetrus | 71214 | |
| Drill | Dremel | 1600A011JA | |
| Fiberoptic pressure sensors with readout units | Opsens Medical | OPP-M200-X-80SC- 2.0PTFE-XN-100PIT-P1 and LIS-P1-N-62SC | Opp-M200 packaged pressure sensors with LifeSens system |
| Forceps | 11923-13, 11064-07 | ||
| Gauze | Covetrus | 71043 | |
| Guillotine | World Precision Instruments | 51330 | |
| Heating pad with rectal thermometer | CWE, Inc. | 08-13000 ,08-13014 | TC1000 Temperature controller |
| Hemostats | 13013-14, 13008-12 | ||
| Isoflurane | Covetrus | 29405 | |
| Lactated ringers | Baxter Healthcare Corp. | Y345583 | |
| Laryngoscope | American Diagnostic Corporation | 4080 | |
| Metal clip | Fine Scientic Tools | 18056-14 | |
| Micro scissors | Fine Scientic Tools | 15007-08 | |
| Microscope | Leica | model L2 | |
| Needle driver | 12003-15 | ||
| Polyethylene tubing | Thermo Fisher Scientific | 14-170-12B | PE-50 tubing |
| Rats | Envigo | Sprague Dawley rats 8–10 months old | |
| Scalpel | 10010-00 | ||
| Scissors | 14090-11 | ||
| Stereotaxic instrument | Kopf instruments | Model 940 with ear bars | |
| Syringe pump | KD Scientific | 780100 | Model 100 series |
| Tuohy Borst | Abbott | 23242 | |
| Ventilator | Harvard rodent ventilator | 55-0000 | Model 683 |
References
- Gates, P. C., Barnett, H. J. M., Vinters, H. V., Simonsen, R. L., Siu, K.
- Strajle, J., Garton, H. J. L., Maher, C. O., Muraszko, K., Keep, R. F., Xi, G. Mechanisms of hydrocephalus after neonatal and adult intraventricular hemorrhage. Translational Stroke Research. 3, Suppl 1 25-38 (2012).
- Murao, K., Rossi, C., Cordonnier, C. Intracerebral hemorrhage and cognitive decline. Revue Neurologique. 169, 772-778 (2013).
- Al-Khindi, T., Macdonald, R. L., Schweizer, T. A. Cognitive and functional outcome after aneurysmal subarachnoid hemorrhage. Stroke. 41, 519-536 (2010).
- Kreiter, K. T., et al. Predictors of cognitive dysfunction after subarachnoid hemorrhage. Stroke. 33, 200-208 (2002).
- Zanaty, M., et al. Intraventricular extension of an aneurysmal subarachnoid hemorrhage is an independent predictor of a worse functional outcome. Clinical Neurology and Neurosurgery. 170, 67-72 (2018).
- Gabrielian, L., Willshire, L. W., Helps, S. C., vanden Heuvel, C., Mathias, J., Vink, R. Intracranial pressure changes following traumatic brain injury in rats: lack of significant change in the absence of mass lesions or hypoxia. Journal of Neurotrauma. 28, 2103-2111 (2011).
- Kolar, M., Nohejlova, K., Duska, F., Mares, J., Pachl, J. Changes of cortical perfusion in the early phase of subarachnoid bleeding in a rat model and the role of intracranial hypertension. Physiological Research. 66, 545-551 (2017).
- Ariesen, M. J., Claus, S. P., Rinkel, G. J. E., Algra, A. Risk factors for intracerebral hemorrhage in the general population. A systematic review. Stroke. 34, 2060-2066 (2003).
- MacLellan, C. L., Paquette, R., Colbourne, F. A critical appraisal of experimental intracerebral hemorrhage research. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 32, 612-627 (2012).
- Hartman, R., Lekic, T., Rojas, H., Tang, J., Zhang, J. H. Assessing functional outcomes following intracerebral hemorrhage in rats. Brain Research. 1280, 148-157 (2009).
