Summary
Il monitoraggio della pressione intracranica nei modelli di roditori di emorragia intraventricolare non traumatica non è comune nella letteratura corrente. Qui, dimostriamo una tecnica per misurare la pressione intracranica, la pressione arteriosa media e la pressione di perfusione cerebrale durante l'emorragia intraventricolare in un modello animale di ratto.
Abstract
I sopravvissuti all'emorragia intraventricolare sono spesso lasciati con una significativa compromissione della memoria a lungo termine; Pertanto, la ricerca che utilizza modelli animali di emorragia intraventricolare è essenziale. In questo studio, abbiamo cercato modi per misurare la pressione intracranica, la pressione arteriosa media e la pressione di perfusione cerebrale durante l'emorragia intraventricolare non traumatica nei ratti. Il progetto sperimentale includeva tre gruppi di Sprague Dawley: sham, emorragia intraventricolare standard da 200 μl e gruppi di controllo del veicolo. Con l'introduzione di un sensore di pressione intraparenchimale a fibre ottiche, sono state ottenute misurazioni precise della pressione intracranica in tutti i gruppi. Le pressioni di perfusione cerebrale sono state calcolate con la conoscenza della pressione intracranica e dei valori medi della pressione arteriosa. Come previsto, i gruppi di emorragia intraventricolare e di controllo del veicolo hanno entrambi sperimentato un aumento della pressione intracranica e un conseguente calo della pressione di perfusione cerebrale durante l'iniezione intraventricolare di sangue autologo e liquido cerebrospinale artificiale, rispettivamente. L'aggiunta di un sensore di pressione a fibre ottiche intraparenchimali è utile per monitorare precise variazioni della pressione intracranica.
Introduction
L'emorragia intraventricolare (IVH), un tipo di emorragia intracranica (ICH), è una malattia devastante che comporta mortalità e morbilità significative. IVH è caratterizzato come l'accumulo di prodotti sanguigni all'interno dei ventricoli intracranici. L'IVH isolata non è comune e si verifica tipicamente negli adulti1. Può essere associata a emorragia ipertensiva, rottura di aneurisma intracranico o un'altra malformazione vascolare, tumori o traumi1. IVH porta a lesioni cerebrali secondarie e allo sviluppo di idrocefalo2. I sopravvissuti all'IVH sono spesso lasciati con significativi disturbi funzionali, di memoria e cognitivi dopo la loro lesione. Questi deficit cognitivi e di memoria a lungo termine sono riportati nel 44% dei sopravvissuti all'ICH3. Nell'emorragia subaracnoidea (SAH), un altro tipo di ICH, è ben noto che circa la metà dei sopravvissuti avrà deficit di memoria, e per coloro che hanno IVH oltre a SAH, i risultati tendono ad essere significativamente peggiori 4,5,6.
I meccanismi sottostanti della disfunzione della memoria dopo IVH rimangono da chiarire. La ricerca in vivo che utilizza modelli animali IVH non traumatici con disfunzione funzionale e della memoria è essenziale per scoprire potenziali bersagli terapeutici per tali pazienti. I modelli animali con memoria più grave e disfunzione funzionale dopo IVH sarebbero i migliori per studiare questi cambiamenti. Il laboratorio dell'autore senior ha anche studiato specificamente il ruolo dell'alta pressione intracranica (ICP) nello sviluppo di deficit di memoria in modelli di ratto IVH. Pertanto, i metodi per misurare con precisione i PIC durante l'IVH erano importanti da indagare. Qui riportiamo i metodi per misurare con precisione gli ICP in un modello di ratto IVH. Sebbene il monitoraggio ICP sia stato precedentemente utilizzato in modelli animali traumatici di ICH e di emorragia subaracnoidea, il monitoraggio ICP in modelli spontanei di roditori IVH non è come comunemente riportato in letteratura 7,8. Quindi, il disegno sperimentale qui presentato includeva tre gruppi di ratti Sprague Dawley: sham, emorragia intraventricolare standard da 200 μl e controllo del veicolo. Per il gruppo IVH, è stato utilizzato un modello di iniezione di sangue intraventricolare autologo. Per gli animali di controllo del veicolo, è stata utilizzata l'iniezione intraventricolare della soluzione sterile di Ringer lattato. ICP, pressioni arteriose medie (MAP) e pressioni di perfusione cerebrale (CPP) sono state registrate intraoperatoriamente e i risultati sono riportati nel presente documento.
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Protocol
Tutti i metodi di ricerca e la cura / manutenzione degli animali sono stati eseguiti in conformità con le linee guida istituzionali dell'Università della California, Davis. L'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Università della California, Davis, ha approvato tutti i protocolli di utilizzo degli animali e le procedure sperimentali (protocollo IACUC #21874).
1. Ricovero per animali
- Ottenere ratti Sprague-Dawley di età 8-10 mesi. Prima di qualsiasi procedura sperimentale, ospitare i ratti in un vivaio e attendere almeno 1 settimana per l'adattamento generale nelle loro gabbie dopo un ciclo luce/buio di 12 ore con cibo e acqua ad libitum.
2. Anestesia e procedure preoperatorie
- Anestetizzare il ratto con isoflurano al 4% per 4 min. Appendere il ratto per i denti in posizione supina su una piattaforma di intubazione e intubare endotrachealmente usando una cannula endotracheale e un laringoscopio.
- Porre il ratto anestetizzato e intubato su un ventilatore (isoflurano al 2% e gas vettore O2/N2). Il ratto è adeguatamente anestetizzato se non si osserva alcuna risposta a uno stimolo doloroso come un pizzico della zampa posteriore.
- Inserire un termometro rettale per monitorare continuamente la temperatura.
- Eseguire tutte le procedure operative utilizzando la tecnica sterile. Tagliare i capelli sulla testa e sulla regione femorale e preparare la pelle con tre scrub alternati di Betadine e alcol al 70% prima dell'intervento chirurgico.
- Aspirare le secrezioni respiratorie accumulate rimuovendo temporaneamente il ratto dal ventilatore e aspirando le secrezioni con un tubo PE-50 collegato a una siringa da 10 ml.
- Proteggi gli occhi del ratto con sterili unguenti per gli occhi di lacrime artificiali.
- Iniettare bupivacaina locale (~0,1 ml di soluzione allo 0,25%) nella pelle e nei tessuti sottocutanei prima dell'incisione del cuoio capelluto.
3. Protocollo chirurgico
- Posizionamento dell'ago intraventricolare e del monitor della pressione intracranica (ICP)
- Posizionare il ratto in posizione prona in una cornice stereotassica e barra auricolare il ratto.
- Fare un'incisione del cuoio capelluto di 1,5 cm lungo la linea mediana con un bisturi a 15 lame.
- Applicare una leggera pressione con una garza per l'emostasi.
- Utilizzando un applicatore sterile di cotone, separare il periostio dal cranio fino a quando il punto di riferimento del bregma è visibile.
- Individuare e contrassegnare il bregma usando la stereotassi e contrassegnare la posizione di due fori di bava bilaterali, 1,4 mm laterali e 0,9 mm posteriormente al bregma.
- Utilizzando un trapano portatile, creare questi due piccoli fori di bava cranica (fino a 2 mm) negli emisferi destro e sinistro. Irrigare eventuali trucioli ossei in eccesso con la soluzione sterile di Ringer lattato.
- Nell'emisfero destro, posizionare una cannula guida 22-G a livello del foro di bava per inserire l'ago 28-G attraverso la cannula fino alla profondità del ventricolo laterale destro (4,6 mm rispetto al bregma) al fine di creare IVH.
- Collegare il sensore di pressione in fibra ottica all'unità di lettura. Accendere l'unità di lettura e assicurarsi che le unità selezionate siano in mmHg. Quindi innescare il sensore immergendo la sua punta in un piccolo becher con la soluzione di Ringer lattato fino a quando l'unità di lettura legge zero. Una volta azzerato nella soluzione Lactated Ringers, è tutto pronto per essere inserito.
- Nell'emisfero sinistro, inserire delicatamente il sensore di pressione a 2-3 mm di profondità nella corteccia per il monitoraggio ICP in tempo reale.
- Annulamento dell'arteria femorale e inserimento del monitor della pressione arteriosa media (MAP)
- Dopo l'inserimento del monitor ICP, ruotare il tronco inferiore del ratto per un facile accesso alla coscia sinistra e alla zona inguinale.
- Dopo la preparazione sterile e la somministrazione locale di bupivacaina, praticare un'incisione cutanea di 1,5 cm sull'arto posteriore con un bisturi a 15 lame.
- Sezionare l'arteria femorale sinistra prima superficialmente con un emostatico e poi strati più profondi usando una pinza con punte sottili al microscopio. Identificare la vena femorale blu profondo per aiutare a localizzare l'arteria adiacente.
- Legare l'arteria femorale distale usando una sutura di seta 3-0 e posizionare una clip metallica temporanea sulla porzione prossimale dell'arteria femorale.
- Avere un secondo sensore di pressione a fibre ottiche collegato all'unità di lettura già innescata. Inserire il sensore di pressione nel tubo in polietilene (PE-50), che viene inserito in un Tuohy Borst che viene poi chiuso. Collegare il Tuohy Borst a un rubinetto a 3 vie collegato a una siringa da 1 mL a un'estremità e un ago da 22 G con tubo PE-50 all'altra estremità.
- Al microscopio, eseguire un'arteriotomia femorale di 2 mm con micro forbici e incannularla con tubi PE-50 collegati al resto della configurazione.
- Iniezione intraventricolare
- Aspirare 500 μL di sangue utilizzando una siringa da 1 mL e ruotare il rubinetto a 3 vie per far leggere MAP al sensore di pressione.
- Innesca l'ago intraventricolare da 28 G collegato al tubo PE-50 con il sangue aspirato per gli animali IVH e il linger lattato per gli animali di controllo del veicolo. Quindi inserire questo ago nella cannula guida fino alla profondità del ventricolo laterale destro.
- Utilizzando una velocità di 100 μL/min, iniettare il sangue o la soluzione sterile di Ringer lattato (200 μL) nel ventricolo laterale destro pompando la siringa da 1 mL con il pollice. Prima di questo e durante l'iniezione intraventricolare, monitorare e registrare ICP, pressione arteriosa e temperatura rettale.
- Monitorare e registrare i valori ICP e MAP post-iniezione.
- Chiusura
- Dopo il completamento dell'iniezione intraventricolare, prelevare il tubo PE-50 contenente il sensore di pressione inserito nell'arteria femorale e applicare la clip temporanea all'arteria femorale per prevenire il sanguinamento.
- Legare la porzione prossimale dell'arteria femorale usando la sutura di seta 3-0.
- Chiudere l'incisione femorale in modo interrotto usando la seta 3-0.
- Rimuovere la cannula guida con l'ago intraventricolare e il monitor ICP.
- Sigillare i fori di bava con cera ossea.
- Chiudere l'incisione cranica con sutura di seta 3-0 in modo interrotto.
- Applicare bupivacaina topica all'incisione e iniettare 0,35 ml di carprofen (5 mg/kg) dopo l'intervento. Non lasciare gli animali incustoditi fino a quando non hanno riacquistato sufficiente coscienza per mantenere la recumenza sternale.
- Consentire ai ratti di riprendersi completamente dopo l'intervento chirurgico sotto supervisione e riportarli nelle loro gabbie di casa con libero accesso al cibo e all'acqua dopo il recupero.
4. Gestione postoperatoria
- Controlla tutti gli animali postoperatori ogni giorno per sette giorni postoperatori per monitorare il loro recupero, lo stato neurologico, il comportamento, il peso e le incisioni.
- Somministrare 0,35 ml di carprofen (5 mg/kg) mediante iniezione sottocutanea al momento dell'intervento chirurgico e nel 1° e 2 °giorno postoperatorio .
- Rimuovere le suture il 7° giorno postoperatorio in modo sterile.
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Representative Results
Pressioni di perfusione intracranica, arteriosa media e cerebrale
Sia i PIC che i MAP sono stati monitorati intraoperatoriamente in tutti gli animali (figura 1). I ratti avevano 8-10 mesi con un peso medio di 495 ± 17 g. Sono stati raccolti anche grafici ICP in tempo reale (Figura 2). Escludendo il gruppo fittizio, gli ICP sono aumentati significativamente durante l'iniezione intraventricolare nell'IVH e nei gruppi di controllo del veicolo (Figura 3). I picchi hanno raggiunto il picco maggiore nel gruppo IVH (43 mmHg) rispetto al controllo del veicolo (36,5 mmHg). Gli ICP sono poi diminuiti rapidamente e normalizzati entro cinque minuti dall'iniezione intraventricolare in quei gruppi animali. Il sensore a fibre ottiche è stato utilizzato con successo per monitorare ICP e MAP in tempo reale. È stato osservato che i MAP sono rimasti simili durante tutta la procedura, mentre i CPP sono diminuiti durante l'iniezione intraventricolare di sangue o della soluzione di Ringer lattato (Figura 3).
Figura 1: Configurazione sperimentale . (A) Posizione dei fori di bava. (B) Rappresentazione dell'intera configurazione sperimentale. Abbreviazioni: A-P, asse anteriore-posteriore; M-L, asse da mediale a laterale. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Registrazioni ICP. Registrazioni in tempo reale della pressione intracranica (ICP) in (A) sham, (B) IVH e (C) animali di controllo del veicolo. La freccia indica l'inizio dell'iniezione IVH/LR. N=1 in ciascun gruppo. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Grafici ICP, MAP e CPP. (A) pressione intracranica media (ICP), (B) pressione arteriosa media (MAP) e (C) pressione media di perfusione cerebrale (CPP) valori prima dell'iniezione ventricolare, durante l'iniezione ventricolare e post-ventricolare negli animali IVH e di controllo del veicolo. N=1 in ciascun gruppo. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
Questo studio ha studiato i meccanismi per misurare ICP, MAP e CPP in un modello animale di ratto IVH non traumatico. I risultati sono stati registrati dai seguenti gruppi: sham, VH 200 μL e animali di controllo del veicolo (iniezione intraventricolare di liquido cerebrospinale artificiale). Questo disegno sperimentale è stato scelto per studiare come le ICP possono essere monitorate durante l'iniezione IVH poiché abbiamo ipotizzato che il picco di ICP possa contribuire alla lesione cerebrale secondaria più significativa e quindi al deficit di memoria nei modelli animali IVH. Pertanto, gli obiettivi di questo studio erano di stabilire un modello animale IVH con monitoraggio obiettivo di ICP, MAP e CPP dopo IVH non traumatica in modo da poterlo applicare ulteriormente in esperimenti futuri che si concentreranno sugli effetti delle ICP indotte da IVH sulla successiva disfunzione della memoria. Questo studio pilota ha scoperto che ICP e MAP possono essere monitorati con precisione utilizzando un sensore di pressione a fibre ottiche introdotto rispettivamente nel ventricolo laterale sinistro e nell'arteria femorale. Le ICP aumentano significativamente durante l'iniezione intraventricolare di sangue e liquido cerebrospinale artificiale. Inoltre, i CPP corrispondenti diminuiscono durante l'iniezione intraventricolare.
Una delle maggiori preoccupazioni per questo studio era trovare un modo per monitorare e registrare accuratamente le piccolissime variazioni delle pressioni (ICP e MAP). Questo è stato fatto utilizzando un sensore di pressione a fibre ottiche. Il sensore a fibre ottiche doveva essere piccolo per misurare con precisione le variazioni minime di pressione. Il sensore a fibre ottiche utilizzato è isolato in una guaina per cavi per la sua protezione. Il diametro esterno della guaina è di 0,9 mm e il diametro della punta del sensore stesso è di 420 μm. Ci siamo assicurati che i valori ICP e MAP del ratto potessero rientrare nel normale intervallo di pressione operativa per questo sensore (da -50 mmHg a +300 mmHg). Inoltre, la precisione del sensore a fibre ottiche è stata garantita per essere piccola, ±1 mmHg (Opsens Solutions).
La maggior parte degli attuali modelli preclinici di ICH in questo momento utilizza roditori con infusione di sangue intero e collagenasi (iniezione di enzima collagenasi al fine di danneggiare la matrice extracellulare con conseguente IVH) come i due disegni sperimentali più comuni 9,10. Il modello di infusione di sangue intero prevede l'infusione di sangue attraverso una craniotomia o un foro di bava ed è stato riportato non solo nei ratti, ma anche nei suini e nelle specie di primati. Tuttavia, nessun modello animale è perfetto e ognuno ha i suoi vantaggi e svantaggi 9,10. Per quanto riguarda i risultati, il comportamento, l'edema cerebrale, la morte cellulare e le dimensioni dell'ematoma sono alcuni degli endpoint più comuni testati negli studi ICH. Dei test comportamentali che valutano la disfunzione cognitiva e della memoria, la maggior parte utilizza il test del labirinto d'acqua di Morris10. Non abbiamo trovato studi che misurano oggettivamente le ICP in modelli di ratto non traumatici IVH.
Una recente revisione di MacLellan et al. ha trovato molti problemi chiave con la letteratura pre-clinica ICH9. MacLellan et al. hanno scoperto che la stragrande maggioranza degli studi riporta solo effetti positivi del trattamento. Molti studi con risultati negativi sono pubblicati su riviste di livello inferiore o non pubblicati affatto, contribuendo a un pregiudizio di pubblicazione non insignificante. Hanno anche scoperto che molti studi non descrivono la metodologia come la randomizzazione, l'età e il sesso degli animali, tra gli altri. La mancanza di accecamento, la mancanza di variabili fisiologiche di segnalazione e il potere statistico sono ulteriori debolezze che sono state osservate in tale revisione. Tutto ciò rende difficile per gli altri che tentano di replicare l'esperimento10. Inoltre, alcuni studi, come Hatman et al., hanno dimostrato che i deficit di apprendimento e memoria tendono ad essere acuti e diminuiscono già in 8 settimane dopo l'ICH sperimentale nei modelli animali11. Quindi, questi effetti della memoria a breve termine nei modelli animali potrebbero non riflettere accuratamente la memoria a lungo termine e la disfunzione cognitiva che si verifica dopo ICH nei soggetti umani.
Questo studio non è privo di limitazioni. Una delle principali limitazioni è il basso legname degli animali. Questo è stato uno studio pilota e i futuri studi sugli animali conterranno un numero maggiore di animali per consolidare i risultati osservati qui. Un'altra limitazione di questo studio è l'incapacità di monitorare adeguatamente le MAP per tutta la durata dell'intervento chirurgico poiché l'arteria femorale e il sistema Tuohy Borst si coagulano facilmente nonostante l'uso di soluzione salina eparinizzata bassa per lavare il tubo.
In conclusione, qui riportiamo i metodi per monitorare con precisione ICP, MAP e CPP in un modello animale di ratto IVH non traumatico. Studi come questo apriranno la strada verso la creazione di un modello animale IVH più coerente e successivamente una ricerca pre-clinica più rigorosa. La ricerca pre-clinica di qualità superiore su modelli animali IVH non traumatici è fondamentale per chiarire le potenziali opzioni terapeutiche per i sopravvissuti all'IVH in futuro.
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Disclosures
Tutti gli autori non segnalano alcun conflitto di interessi.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato finanziato dalla sovvenzione NINDS: K08NS105914
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% bupivacaine | Hospira, Inc. | 409115901 | |
| 1 mL syringe | Covetrus | 60734 | |
| 10% providine iodine solution | Aplicare | MSD093947 | |
| 20 mL syringe | Covidien | 8881520657 | |
| 22 G needles | Becton Dickinson | 305155 | |
| 28 G intraventricular needles | P technologies | 8IC313ISPCXC | C313I/SPC 28-Gneedles to fit 22-G guide cannula with 6 mm projection |
| 3-0 silk suture | Henry Schein, Inc. | SP116 | |
| 3-way-stopcock | Merti Medical Systems | M3SNC | |
| 4% paraformaldehyde | Fisher Chemical | 30525-89-4 | |
| AnyMaze software | Any-Maze behavioral tracking software | Stoelting CO, USA | |
| Artificial ointment | Covetrus | 48272 | |
| Blood collection vials with EDTA | Becton Dickinson | 367856 | |
| Bone wax | CP Medical, Inc. | CPB31A | |
| Carprofen | Zoetis, Inc. | 54771-8507-1 | |
| Centrifuge | Beckman | BE-GS6R | Model GS-6R |
| Cotton tip applicators | Covetrus | 71214 | |
| Drill | Dremel | 1600A011JA | |
| Fiberoptic pressure sensors with readout units | Opsens Medical | OPP-M200-X-80SC- 2.0PTFE-XN-100PIT-P1 and LIS-P1-N-62SC | Opp-M200 packaged pressure sensors with LifeSens system |
| Forceps | 11923-13, 11064-07 | ||
| Gauze | Covetrus | 71043 | |
| Guillotine | World Precision Instruments | 51330 | |
| Heating pad with rectal thermometer | CWE, Inc. | 08-13000 ,08-13014 | TC1000 Temperature controller |
| Hemostats | 13013-14, 13008-12 | ||
| Isoflurane | Covetrus | 29405 | |
| Lactated ringers | Baxter Healthcare Corp. | Y345583 | |
| Laryngoscope | American Diagnostic Corporation | 4080 | |
| Metal clip | Fine Scientic Tools | 18056-14 | |
| Micro scissors | Fine Scientic Tools | 15007-08 | |
| Microscope | Leica | model L2 | |
| Needle driver | 12003-15 | ||
| Polyethylene tubing | Thermo Fisher Scientific | 14-170-12B | PE-50 tubing |
| Rats | Envigo | Sprague Dawley rats 8–10 months old | |
| Scalpel | 10010-00 | ||
| Scissors | 14090-11 | ||
| Stereotaxic instrument | Kopf instruments | Model 940 with ear bars | |
| Syringe pump | KD Scientific | 780100 | Model 100 series |
| Tuohy Borst | Abbott | 23242 | |
| Ventilator | Harvard rodent ventilator | 55-0000 | Model 683 |
References
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