Summary
يصف هذا البروتوكول نافذة تصوير ثديي جديدة ذات غطاء قابل للاستبدال (R.MIW). يسمح الفحص المجهري داخل الحيوية بعد زرع R.MIW بالتصوير الطولي والمتعدد الأيام للغدة الثديية السليمة والمريضة بدقة خلوية خلال مراحل النمو المختلفة.
Abstract
البنية المتفرعة للغدة الثديية ديناميكية للغاية وتخضع لعدة مراحل من النمو وإعادة التشكيل بعد الولادة. تم استخدام الفحص المجهري داخل الحيوية بالاشتراك مع جراحة رفرف الجلد أو زرع نوافذ التصوير لدراسة ديناميكيات الغدة الثديية السليمة في مراحل النمو المختلفة. تقتصر معظم تقنيات التصوير الثديي على إطار زمني من ساعات إلى أيام ، في حين أن غالبية عمليات إعادة تشكيل الغدة الثديية تحدث في أطر زمنية من أيام إلى أسابيع. لدراسة إعادة تشكيل الغدة الثديية ، هناك حاجة إلى طرق تسمح بالوصول البصري إلى الأنسجة ذات الأهمية لأطر زمنية ممتدة. هنا ، يتم وصف نسخة محسنة من نافذة التصوير الثديي التيتانيوم مع غطاء قابل للاستبدال (R.MIW) يسمح بتصوير عالي الدقة للغدة الثديية بدقة خلوية لمدة تصل إلى عدة أسابيع. الأهم من ذلك ، يوفر R.MIW الوصول إلى الأنسجة طوال مدة تجربة التصوير داخل الحيوية ، وبالتالي يمكن استخدامه لمعالجة الأنسجة المحلية ، ووضع العلامات ، وإدارة الأدوية ، أو التشريح المجهري الموجه بالصور. يتيح R.MIW مجتمعة توصيفا عالي الدقة للديناميكيات الخلوية أثناء تطور الغدة الثديية والتوازن والمرض.
Introduction
الظهارة الثديية هي عضو إفرازي فريد موجود في الثدييات ، والذي ينتج ويفرز الحليب لتغذية النسل. طوال الحياة ، تخضع الغدة الثديية لجولات متعددة من التطور والنمو ، مصحوبة بتغييرات هيكلية ووظيفية في الأنسجة1. اعتمادا على مرحلة النمو ، تختلف أنواع الخلايا التي تساهم في إعادة تشكيل الأنسجة ، وكذلك الموقع داخل شجرة القنوات.
يسمح الفحص المجهري متعدد الفوتونات داخل الحيوية (IVM) بدراسة ديناميكيات الخلايا الثديية في الجسم الحي في الإعداد الأصلي والحد الأدنى من الاضطراب2،3،4. للحصول على الوصول البصري إلى الغدة الثديية ، تم نشر العديد من تقنيات التصوير المؤقت خارج الجسم الحي أو الجلد خلال مراحل مختلفة من تطور الغدة الثديية ، بما في ذلك البلوغ4،5،6،7 ، والبلوغ2،8 ، والرضاعة9،10،11،12 ، وديناميات الورم13،14 ، 15. على الرغم من أن هذه التقنيات تؤدي إلى تصوير عالي مكانيا وزمنيا لديناميكيات الخلايا الثديية ، إلا أن الإطار الزمني يقتصر على ساعات في حين أن معظم عمليات إعادة تشكيل الغدة الثديية تستغرق أياما إلى أسابيع. لذلك ، هناك حاجة إلى طرق تسمح بالوصول البصري إلى الأنسجة ذات الأهمية للأطر الزمنية الممتدة. على مر السنين ، تم تطوير العديد من نوافذ التصوير الدائمة لتصوير أورام الثدي 15،16،17،18 ، بما في ذلك نافذة تصوير الثدي التيتانيوم (MIW) 2،3،19. على الرغم من أنه مفيد جدا لدراسة نمو الورم الثديي ، إلا أن تصور بنية الغدة الثديية الصحية ظل محدودا لبضعة أيام. في الآونة الأخيرة ، تم تطوير نافذة تصوير سيليكون مرنة ، والتي تسمح بتصور الغدة الثديية البلوغ على مدى عدة أسابيع20. ومع ذلك ، يتم تضمين الغدة الثديية في وسادة دهنية غنية بالخلايا الشحمية ، مما يؤدي إلى تشتت الضوء على نطاق واسع ونتيجة لذلك رؤية محدودة لهياكل القنوات الثديية. لذلك ، هناك حاجة إلى ظروف تصوير متفوقة في جميع الأوقات لتصور ديناميكيات الأنسجة على مدى فترات طويلة من الزمن في الغدة الثديية. لا يسمح MIW الكلاسيكي ، ولا نافذة السيليكون المرنة بمعالجة الأنسجة أو تحسين موقع الأنسجة المادية قبل التصوير ، حيث تشكل النافذة نظاما مغلقا بعد الجراحة والزرع. ونتيجة لذلك، من المرجح أن يصبح الوصول البصري الأمثل إلى الأنسجة الثديية الأساسية مستبعدا على مدى فترات زمنية أطول. في المقابل ، تسمح تقنية رفرف الجلد بتحسين الأنسجة وإعادة وضعها أثناء جلسة التصوير ويمكن تكرار رفرف الجلد عدة مرات2. ومع ذلك ، فإن جلسات التصوير المتكررة من خلال رفرف الجلد ممكنة فقط عندما يتم تخصيص وقت كاف (7 أيام على الأقل) بين العمليات الجراحية للسماح باستعادة الجلد ، وبالتالي فهي مناسبة في الغالب لدراسة العمليات على نطاقات زمنية أطول. علاوة على ذلك ، ينصح بعدم تنفيذ هذا الإجراء عدة مرات بسبب طبيعته الغازية وخطر كبير من العدوى والندوب عند إغلاق الجرح.
للتغلب على هذه القيود ، أي لضمان ظروف التصوير المثلى لفترة طويلة من الزمن بتردد عال وفي الوقت نفسه السماح بمعالجة الأنسجة ، تم تصميم نسخة محسنة من التيتانيوم من MIW مع غطاء قابل للاستبدال (R.MIW) لتصور الغدة الثديية الصحية والمريضة على مدى عدة أيام إلى أسابيع2 (الشكل 1A ، ب) تم تصميم R.MIW خصيصا لتوفير الوصول الأمثل للأنسجة ، مما يتيح التلاعب المباشر بالأنسجة طوال مدة تجربة IVM ، وبالتالي يسمح بتصور الغدة الثديية في الوقت والمكان المناسبين على مدى فترات طويلة من الزمن. عند إغلاقه ، يشكل R.MIW نظاما محكم الإغلاق يمكن مقارنته ب MIW الكلاسيكي (الشكل 1C). عند فتحه في ظل ظروف معقمة، يسمح R.MIW بمعالجة الأنسجة المحلية لتحسين الوصول البصري ويتيح أيضا الإدارة المحلية للمواد، مثل مثبطات المسار أو المنبهات، أو حقن أنواع مختلفة من الخلايا ذات الاهتمام، مثل الخلايا السرطانية أو مجموعات الخلايا المناعية، أو إضافة أصباغ وسم الأنسجة. يمكن فتح الغطاء في أي لحظة بين جلسات التصوير دون التسبب في تلف الأنسجة الكامنة.
الشكل 1: تصميم نافذة التصوير الثديي بغطاء قابل للاستبدال. (أ) منظر علوي ومنظر جانبي للغطاء القابل للاستبدال لنافذة التصوير الثديي مع غطاء زجاجي مقاس 10 مم ملتصق بالحلبة. (ب) المنظر العلوي والمنظر الجانبي لنافذة التصوير الثديي ، والتي تتكون من حلقة خارجية وحلقة داخلية مع أخدود بينهما لتأمين النافذة داخل جلد الماوس باستخدام خياطة سلسلة محفظة. تحتوي الحلقة الخارجية على أخدود صغير يناسب الإسقاطات الأربعة (الأذرع) للغطاء. (ج) الرسوم المتحركة والصور التي تبين آليات فتح وإغلاق الغطاء. تضمن الإسقاطات المائلة تثبيت الغطاء داخل إطار النافذة. تم تعديل هذا الرقم من Messal et al. 2. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
يصف هذا البروتوكول إجراء تصميم وزرع R.MIW ، بالإضافة إلى استراتيجية IVM طولية لإعادة النظر في نفس القنوات الثديية وتصورها بدقة خلوية. يسمح R.MIW بمتابعة انقسامات الخلايا والتغيرات المورفولوجية خلال مراحل النمو المختلفة للغدة الثديية في نماذج الفأر الفلورسنت المتنوعة. يسهل R.MIW معا توصيف عالي الدقة للديناميكيات الخلوية أثناء تطور الغدة الثديية والتوازن والمرض.
Protocol
تم تنفيذ جميع الإجراءات الموضحة في هذه الورقة وفقا للمبادئ التوجيهية ل IACUC و KU Leuven وتم تنفيذها في سياق تطبيق المشروع المعتمد P160/2020. قبل تنفيذ هذا البروتوكول ، يرجى مراجعة استراتيجية التسكين مع الطبيب البيطري المؤسسي وإدارة التسكين قبل وبعد العملية الجراحية وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية.
1. إعداد R.MIW (التوقيت المقدر: 2 ساعة)
ملاحظة: لبناء R.MIW ، من المستحسن العثور على مصنع محلي متخصص في العمل مع المواد الصلبة مثل التيتانيوم ، لأن هذا يتطلب أدوات وخبرات خاصة. عادة ما تمتلك ورش العمل المتخصصة في تصميم وتصنيع الأطراف الاصطناعية من التيتانيوم الآلات والخبرات اللازمة لإنتاج أجزاء R.MIW.
- ضع غطاء R.MIW على سطح معقم مع توجيه الجزء الخارجي من الغطاء لأعلى (وذراعي الغطاء مائلة لأسفل. الشكل 1 ألف).
- ضع غراء لاصق سيانوكريليت حول حافة الغطاء بالكامل وضع غطاء زجاجي دائري مقاس 10 مم بعناية أعلى الغطاء.
ملاحظة: قم دائما بإعداد غطاء احتياطي مع غطاء زجاجي كنسخة احتياطية أثناء العملية الجراحية. - استخدم عصا خشبية معقمة لوضع الغطاء الزجاجي وتطبيق بعض القوة لدفعه لأسفل لضمان وجود ختم محكم الإغلاق بين الغطاء الزجاجي وإطار الغطاء. تأكد من عدم تغطية الثقوب الموجودة في ذراعي الغطاء بالزجاج.
- قم بتطهير الأغطية و R.MIW عن طريق غمر 80٪ من الإيثانول لمدة 30 دقيقة على الأقل في طبق بتري مغلق.
ملاحظة: لا تترك الأغطية لفترة أطول من 1 ساعة في 80٪ من الإيثانول لتجنب ذوبان الغراء اللاصق cyanoacrylate. - قم بإزالة الغراء اللاصق سيانو أكريليت الزائد من الغطاء الزجاجي باستخدام طرف قطني منقوع في الأسيتون.
- قم بتخزين الأغطية و R.MIW في بيئة معقمة حتى الاستخدام مرة أخرى.
ملاحظة: يمكن الاحتفاظ بإطار وأغطية R.MIW في أنبوب أو كيس معقم لمدة أقصاها 1 أسبوع. عند استئناف التجربة ، افحص دائما ما إذا كان الغطاء الزجاجي لا يزال متصلا بشكل صحيح بالغطاء قبل متابعة البروتوكول.
2. التحضير للجراحة (التوقيت المقدر: 15 دقيقة)
ملاحظة: بالنسبة لإجراء زرع R.MIW ، يمكن استخدام إناث الفئران (>عمرها 3.5 أسابيع) من أي سلالة.
- الحفاظ على العقم باستخدام قفازات معقمة ، وتعقيم جميع العناصر التي ستلامس الماوس. اغسل الأدوات الجراحية بالماء والصابون المعتدل ، وجففها بالهواء ، ولفها بورق الألمنيوم بدون زوايا أو حواف مكشوفة ، وقم بالتعقيم باستخدام الأوتوكلاف لمدة 20 دقيقة عند 120 درجة مئوية قبل الجراحة.
- إعداد منصة جراحية معقمة وتعقيم الأسطح بنسبة 80 ٪ من الإيثانول.
ملاحظة: لضمان العقم، يمكن إجراء الجراحة في خزانة التدفق. - قم بتشغيل وسادة التدفئة وقم بتغطية الحصيرة بستارة معقمة. قم بتخطيط الأدوات المعقمة على الستارة المعقمة ووضع R.MIW وما لا يقل عن غطاءين مغطى بالزجاج في محلول ملحي معقم مخزن بالفوسفات (PBS) في طبق بتري (أغلق الغطاء لتجنب التلوث الخارجي).
- تخدير الماوس في غرفة الحث باستخدام خليط 3٪ isoflurane / O2 . تأكد من أن الحيوان مسترخ بما يكفي ليتم التلاعب به بسهولة ونقله إلى قناع الأنف دون أي صراع.
- انقل الماوس من غرفة الحث إلى قناع الأنف المخدر وقلل من مستوى الأيزوفلوران إلى 1.5٪ - 2٪ من خليط الأيزوفلوران / O2 . تحقق من التخدير الكامل عن طريق إجراء اختبار سحب مخلب.
- لإجراء اختبار سحب المخلب ، قرصة مخلب الحيوان بقوة باستخدام أظافر الأصابع أو ملقط نهاية حادة. في حالة عدم وجود أي رد فعل عضلي ، اعتبر الحيوان فاقدا للوعي واستمر في التحضير الجراحي. قم بإجراء هذا الاختبار قبل التلاعب بالحيوانات وكرره بانتظام أثناء إجراءات التخدير والجراحة لتأكيد التخدير.
- ضع مرهم العين لمنع جفاف القرنية.
- حلق المنطقة المحيطة بالغدة الثدييةالرابعة باستخدام شفرة حلاقة (الشكل 2A). استخدمالحلمة رقم 4 كمعلم. إزالة الشعر الفضفاض باستخدام شريط لاصق.
ملاحظة: بدلا من ذلك ، يمكن استخدام كريم إزالة الشعر لإزالة الشعر. - قم بتطهير الجلد المكشوف بنسبة 80٪ من الإيثانول أو البوفيدون واليود ووضع الماوس في المنطقة الجراحية المعقمة على ظهره مع الخطم في قناع أنف مخدر باستخدام خليط 1.5٪ isoflurane / O2 .
- قم بتأمين الأطراف الأمامية والخلفية للماوس باستخدام شريط ورقي.
ملاحظة: اترك الماوس المخدر والمتعافي على وسادة التدفئة قدر الإمكان ، أثناء الجراحة وبعدها. - استخدم ستارة جراحية معقمة مسبقا أو شاشا لتغطية الماوس مع ترك المنطقة الجراحية مكشوفة.
3. زرع R.MIW (التوقيت المقدر: 30 دقيقة)
- تحقق مما إذا كان الحيوان مخدرا بشكل كاف عن طريق إجراء اختبار سحب مخلب. ارفع الجلد بلطف باستخدام ملقط Graefe الناعم وقم بعمل شق قطري 10-15 مم باستخدام مقص زنبركي صغير في الجلد أعلى وسادة الدهون الثدييةالرابعة باستخدام الحلمة الرابعة كنقطة اتجاه (الشكل 2A). تأكد من عدم قطع أو تلف الصفاق أو الغدة الثديية.
- حدد المنطقة ذات الأهمية (ROI) بناء على السمات العيانية للأنسجة الثديية ، بما في ذلك موقع العقدة الليمفاوية أو آفة الورم ، وحاول الحفاظ على عائد الاستثمار مركزيا فيما يتعلق بالشق.
- افصل الجلد عن وسادة الدهون الثديية وطبقات الأنسجة الأساسية باستخدام تشريح حاد يصل إلى 5-8 مم في جميع أنحاء خط الشق لإنشاء جيب يناسب إطار R.MIW (الشكل 2BI).
- التقط R.MIW باستخدام ملقط معقم واختبر ما إذا كان الشق كبيرا بما يكفي لإدخال النافذة. إذا لزم الأمر ، قم بتكبير الشق قليلا حتى يتناسب R.MIW.
- قم بإزالة R.MIW ووضع خيط خيط محفظة في جميع أنحاء الشق باستخدام خياطة حريرية 5-0 (مضفر ، غير قابل للامتصاص). ضع الخيط 1-2 مم من حافة الشق من الخارج إلى داخل الجلد ، بدءا من النهاية الذيلية للشق.
- حرك حوالي 5 مم لأعلى على طول الشق ومرر خيط الخيط عبر الجلد من الداخل إلى الخارج. كرر هذا الإجراء على طول حافة الشق ، وبالتالي إنشاء خياطة دائرية تتكون من 5-6 حلقات (الشكل 2BII). يجب أن يكون المخرج النهائي لخيط الخياطة على بعد حوالي 2-5 مم من المدخل الأول.
ملاحظة: احرص على عدم وضع الخيط بالقرب من حافة الشق ، لأن هذا يزيد من خطر تمزق الجلد. وضع الخيط بعيدا جدا عن حافة الشق يزيد من خطر العدوى بين الجلد الزائد وأخدود R.MIW. - ضع R.MIW داخل الشق واستخدم ملقط Graefe لوضع الجلد بعناية في أخدود R.MIW. تأكد من ترك حلقات الخيط في الخارج.
- اسحب حلقات خياطة خيط المحفظة وشد الخيط في أخدود R.MIW عن طريق السحب بلطف على طرفي الخيط (الشكل 2BIII). ربط مع عقدة جراحية وقطع الخيط الزائد.
- ضع الفازلين على الحافة الداخلية ل R.MIW باستخدام مسواك ، مع التأكد من تجنب الأنسجة الكامنة. ادفع إطار النافذة برفق لأسفل باستخدام ملقط معقم أو طرفين من الأصابع، وضع الغطاء في إطار R.MIW (الشكل 1B). سيؤدي ذلك إلى تجنب وجود حجم من الهواء بين أنسجة الغدة الثديية وغطاء R.MIW.
- ضع أطراف الملقط الرقيق من خلال الثقوب الموجودة في ذراعي الغطاء وشد الغطاء عن طريق لف الغطاء في اتجاه عقارب الساعة (حوالي 5 درجات) (الشكل 1C والشكل 2BIV).
- إذا بقي بعض الهواء بعد تشديد غطاء R.MIW ، فاستخدم إبرة أنسولين معقمة لإزالة الهواء الزائد. أدخل الإبرة عبر الجلد إلى التجويف بين الأنسجة الثديية والغطاء واسحب المكبس ببطء ، مما يخلق فراغا بين أنسجة الغدة الثديية وغطاء R.MIW.
- إدارة, بعد الجراحة, مسكن مثل البوبرينورفين (0.1 مغ/كغ مخفف في معقم 0.9٪ كلوريد الصوديوم) عن طريق الحقن تحت الجلد. كرر الحقن تحت الجلد مع البوبرينورفين في 8 ساعات و 16 ساعة بعد الجراحة.
- ضع الماوس مرة أخرى في القفص للتعافي والمراقبة عن كثب حتى يستيقظ تماما ، أو تابع الخطوة 4 للتصوير الفوري.
- في هذه المرحلة ما بعد الجراحة ، راقب الفئران عن كثب بحثا عن علامات عدم الراحة أو المضاعفات بناء على المعلمات الحيوية ، مثل التنفس والتفاعل والسلوك والموقف ووزن الجسم. راقب الجلد المحيط بالنافذة بعناية بحثا عن علامات الالتهاب والنخر. في حالة عدم حدوث أي مضاعفات ، سيسمح R.MIW بجلسات IVM المتكررة على مدار عدة أسابيع بعد الزرع.
الشكل 2: نظرة عامة على الإجراء الجراحي وزرع النافذة . (أ) يتم إجراء شق قطري بالقربمن الحلمة الرابعة للفأر الأنثوي ويتم فصل الجلد والأنسجة الكامنة عن طريق تشريح حاد. (ب) يمكن استخدام العقدة الليمفاوية الإربية وشكل وسادة الدهون للتوجيه الصحيح للنسيج (I). يتم وضع خيط خيط محفظة في الجلد حول الشق (II) ، وبعد تركيبه في إطار النافذة ، يتم تشديد الخيط في الأخدود لتأمين إطار النافذة ، ويتم تأمينه بواسطة عقدة جراحية (III). الخطوة الأخيرة هي إدخال الغطاء وتأمينه في إطار النافذة (IV). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
4. المجهر المتكرر داخل الحيوية من خلال R.MIW
ملاحظة: تم تحسين استراتيجية IVM المتكررة الموضحة هنا لنظام بؤري متعدد الفوتونات مقلوب مجهز بمرحلة آلية وغرفة مناخية مظلمة عند 35.8 درجة مئوية.
- تخدير الماوس في غرفة الحث باستخدام خليط 3٪ isoflurane / O2 . تحقق من فقدان الوعي عن طريق إجراء اختبار سحب مخلب (موضح في الخطوة 2.6). ضع مرهم العين لمنع جفاف القرنية أثناء جلسة التصوير.
- افحص حالة إطار وغطاء R.MIW ، بما في ذلك استقرار الغرز أو أي تلف محتمل للغطاء. في حالة تلف الغطاء ، يمكن استبدال الغطاء كما هو موضح في الخطوة 5.
- انقل الماوس إلى صندوق تصوير مسخن مسبقا (37 درجة مئوية) ، مصنوع خصيصا (الشكل 3A) وضع الماوس برأسه في مخروط الأنف. يتكون صندوق التصوير من إطار يتناسب مع المرحلة الآلية للمجهر. تم تصميم الإطار لعقد تطعيم حسب الطلب مع ثقب قطره R.MIW (الشكل 3A) .
- يتم توصيل مدخل مع مخروط الأنف إلى الجزء الأمامي من الصندوق وتوصيله بمحطة تبخير الأيزوفلوران باستخدام خليط 2٪ -3٪ isoflurane / O2. يتم توصيل منفذ بوحدة تنظيف مخدرة لضمان الدورة الدموية ومنع تراكم الأيزوفلوران في الصندوق. يمكن إغلاق صندوق التصوير باستخدام غطاء شفاف.
- ضع الماوس على الترصيع بطريقة تسقط R.MIW في ثقب تطعيم صندوق التصوير (الشكل 3A). ضع البارافيلم والشريط الورقي على الجزء الخلفي من الماوس لتحقيق الاستقرار في الماوس وتقليل حركة الأنسجة بسبب التنفس.
- أغلق صندوق التصوير بالغطاء وأدخل صندوق التصوير في مرحلة المجهر.
- قلل جرعة الأيزوفلوران تدريجيا على مدار جلسة التصوير للحفاظ على تخدير مستقر ولكن سطحي (عادة ما بين 1.5٪ -0.8٪ خليط isoflurane / O2 ).
- توفير التغذية السليمة أثناء التصوير كما هو موضح أدناه.
- لجلسات التصوير <3 ساعة ، حقن الماوس تحت الجلد مع 200-300 ميكرولتر من PBS المعقمة للترطيب.
- لجلسات التصوير >3 ساعة، اتبع الخطوات الموضحة أدناه.
- للتصوير على المدى الطويل ، غرس الماوس مع العناصر الغذائية. لهذا ، استخدم خليط معقم متاح تجاريا يحتوي على الأحماض الأمينية والجلوكوز. ضع إبرة مرنة تحت الجلد في عنق الماوس وقم بتأمينها بشريط ورقي.
- قم بتوصيل حقنة سعة 10 مل مع مزيج المغذيات المحضر بأنبوب سيليكون مرن وادفع مزيج المغذيات حتى يصل إلى نهاية الأنبوب.
- قم بتوصيل أنبوب السيليكون بالإبرة المرنة. خذ نهاية الأنبوب وضعه من خلال أحد ثقوب صندوق التصوير (من الداخل إلى الخارج ، مع ترك جانب مرفق الإبرة في الصندوق).
- حقن 50 ميكرولتر من محلول غرس كل 30 دقيقة.
- قم بتأمين صندوق التصوير في مرحلة المجهر وحدد منطقة الاهتمام باستخدام وضع التألق الفائق للمجهر.
- قم بتطبيق إعدادات المجهر المطلوبة اعتمادا على نموذج الماوس (الشكل 3B). يمكن استخدام هياكل الأوعية الدموية وأنماط الكولاجين (التي تصورها الجيل التوافقي الثاني) والهياكل التشريحية المستقرة الأخرى ، بما في ذلك العقدة الليمفاوية الإربية ، كمعالم. احصل على صور باستخدام مجهر بؤري بؤري متعدد الفوتونات مقلوب على عمق 12 بت، وهدف مائي 25x باستخدام حجم Z-step يتراوح من 1.0 إلى 4.0 ميكرومتر (يتراوح إجمالي مكدس z من 150 إلى 800 ميكرومتر). قم بتطبيق الإعدادات القياسية التالية: تنسيق 1024 × 1024 ، سرعة مسح ضوئي 600 هرتز ، وضع ثنائي الاتجاه.
- تصور ألياف الكولاجين I عن طريق إجراء الجيل التوافقي الثاني باستخدام طول موجي مثير يبلغ 860 نانومتر والكشف عند 425-435 نانومتر. ويبين الجدول 1 الأطوال الموجية للإثارة والكشف لمختلف الفلوروفورات.
الجدول 1. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.
- استخدم الدالة Spiral في وضع مستكشف برامج التصوير لإنشاء مسح تجانب نظرة عامة كبير لإنشاء خريطة مرجعية للأنسجة (الشكل 3B). حدد عائد الاستثمار ضمن النظرة العامة الحلزونية، وحدد المستويين Z العلوي والسفلي لتحديد مكدس Z. اضغط على Start (ابدأ ) للحصول على مكدسات Z ثلاثية الأبعاد (xyz) أو رباعية الأبعاد (xyzt) مفصلة للأنسجة.
ملاحظة: أثناء تجربة التصوير بأكملها، يجب مراقبة الماوس عن كثب. بالنسبة لجلسات التصوير الطويلة، يوصى باستخدام مقياس التأكسج النبضي ومسبار درجة الحرارة. يجب أن يكون تنفس الماوس منتظما وبنفس الوتيرة. إذا بدأ الماوس في إظهار علامات اللهاث ، فيجب تقليل كمية الأيزوفلوران. - في نهاية كل جلسة تصوير، احتفظ بالماوس على وسادة التدفئة حتى يستيقظ تماما. إذا أظهر الماوس علامات عدم الراحة أو انخفاض الحركة ، فاحتفظ بالقفص لفترة أطول على وسادة التدفئة وقدم المواد الهلامية المغذية بدلا من تشاو العادية.
ملاحظة: بين جلسات التصوير ، يجب مراقبة الماوس عن كثب بحثا عن علامات عدم الراحة مثل انخفاض استهلاك الطعام والماء ، أو التنفس السريع ، أو انخفاض الحركة ، أو الرعاش ، أو وضع الجسم غير الطبيعي ، أو الفراء غير المحفوظ. في حالة وجود علامات واضحة على عدم الراحة ، اتبع الإرشادات المؤسسية المتعلقة برعاية الحيوان وإنهاء التجربة عند الوصول إلى نقطة النهاية الإنسانية. - كرر الخطوات من 4.1 إلى 4.12 لكل جلسة تصوير متكررة واستخدم تجانب النظرة العامة لتتبع نفس الموضع (الموضعات) عبر نقاط زمنية متعددة (الشكل 3B). يعتمد تواتر التصوير على سؤال البحث وتوقيت العملية المدروسة ، وعادة ما يختلف من جلسات التصوير مرتين في اليوم إلى مرة واحدة في الأسبوع.
- في نهاية الفترة التجريبية المطلوبة ، القتل الرحيم للحيوانات باستخدام R.MIW المزروع باستخدام التخدير العميق مع الأيزوفلوران يليه خلع عنق الرحم. إذا رغبت في ذلك ، قم بتشريح الأجهزة ذات الاهتمام لمزيد من التحليلات خارج الجسم الحي .
- بدلا من ذلك ، حافظ على الحيوان على قيد الحياة للتحليلات المستقبلية في الجسم الحي . في هذه الحالة ، قم بإزالة خياطة الحقيبة التي تحمل R.MIW عن طريق قطعها بمقص زنبركي وفصل حلقة النافذة بعناية عن جلد الماوس باستخدام ملقط حاد. نظف حواف الجلد التي كانت تحمل النافذة سابقا واستمر في خياطة مستمرة بسيطة (مادة قابلة للامتصاص ، مثل حمض البولي جليكوليك).
- بمجرد إغلاق الجلد ، اربط خيوط خياطة البداية والنهاية بعقدتين مربعتين (4 رميات). لتقليل نقص تروية الأنسجة ، يجب أن تكون العقدة فضفاضة بما يكفي للسماح بتدفق الدم عند حافة الجلد. تطهير الجرح مع البوفيدون اليود لمنع الالتهاب وتعزيز التئام الجلد.
الشكل 3: سير عمل IVM الطولي. (أ) تصوير تخطيطي لتجربة نموذجية متعددة الأيام ل IVM. (ب) تصوير منطقة مولدة للورم داخل الغدة الثديية البالغة. قبل كل جلسة تصوير، يمكن أن يسهل مسح تجانب النظرة العامة منخفض الدقة (اللوحة العلوية) تحديد المنطقة (المناطق) ذات الأهمية خلال أيام التصوير اللاحقة. يمكن استخدام نمط الكولاجين I (الجيل التوافقي الثاني ، أرجواني) ، بنية الأنسجة وأنماط الخلايا ذات العلامات التفاضلية مع البروتينات الفلورية (المصورة باللون الأخضر والأصفر والأحمر) لتتبع نفس منطقة الأنسجة. تمثل أشرطة المقياس 1 مم (نظرة عامة على التجانب) و 100 ميكرومتر (اللوحات السفلية). (ج) التمثيل التخطيطي لهيكل مراسل R26-Confetti . عند إعادة تركيب Cre-syne الناجم عن التاموكسيفين ، يتم إعادة دمج Confetti بشكل عشوائي ، مما يؤدي إلى التعبير عن أحد الفلوروفورات الأربعة (nGFP ، YFP ، RFP ، أو mCFP). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
5. فتح وإغلاق غطاء R.MIW بين جلسات التصوير
- الحفاظ على العقم باستخدام قفازات معقمة ، وتعقيم جميع العناصر التي ستلامس الماوس. أدوات الأوتوكلاف الجراحية قبل الجراحة (انظر الخطوة 2 للحصول على التفاصيل).
- قم بتشغيل وسادة التدفئة وقم بتغطية الحصيرة بستارة معقمة وقم بتخدير الماوس في غرفة الحث باستخدام 3٪ من خليط الأيزوفلوران / O2 . تحقق من التخدير الكافي عن طريق إجراء اختبار منعكس انسحاب مخلب.
- انقل الماوس من غرفة الحث إلى قناع الأنف المخدر وقلل من مستوى الأيزوفلوران إلى 1.5٪ -2٪ من خليط الأيزوفلوران / O2 .
- ضع أطراف الملقط الرقيق من خلال الثقوب الموجودة في ذراعي الغطاء وقم بفك الغطاء عن طريق لف الغطاء عكس اتجاه عقارب الساعة. إذا لزم الأمر ، ضع بعض PBS المعقمة المسخنة مسبقا (37 درجة مئوية) على النافذة لتسهيل تخفيف الغطاء.
- ضع غطاء R.MIW في طبق معقم مع PBS معقم حتى الاستخدام مرة أخرى. نظف غطاء الغطاء بماء ديمي وبعد ذلك 80٪ إيثانول. احتفظ بالغطاء في PBS معقم حتى مزيد من الاستخدام.
- منع الأنسجة المكشوفة من الجفاف عن طريق إضافة بعض قطرات من PBS المعقمة إلى سطح الأنسجة.
- تطبيق أو حقن أي مادة أو خلايا ذات أهمية على الأنسجة المكشوفة ، يمكن استخدام حجم أقصى قدره 50 ميكرولتر. انتظر بضع دقائق حتى يمتص السائل بواسطة الأنسجة. بدلا من ذلك ، يمكن التلاعب بالأنسجة أو إعادة وضعها باستخدام ملقط معقم وحاد لتحسين ظروف التصوير لعائد استثمار محدد.
- ضع الفازلين على الحافة الداخلية ل R.MIW ، مع التأكد من تجنب الأنسجة الكامنة. ضع الغطاء في إطار R.MIW كما هو موضح في الخطوة 3.9 ، وضع أطراف الملقط الرقيق من خلال الثقوب الموجودة في ذراعي الغطاء ، وشد الغطاء عن طريق لف الغطاء في اتجاه عقارب الساعة (حوالي 5 درجات).
Representative Results
لدراسة الديناميكيات التكاثرية للخلايا الظهارية الثديية خلال مراحل النمو المختلفة للغدة الثديية ، تم تنفيذ البروتوكول الموصوف. يصور الشكل 1 تصميم R.MIW ، ويتم تلخيص إجراء زرع R.MIW في الشكل 2. يتم زرع R.MIW جراحيا بين الغدة الثديية والجلد. يتم استخدام خياطة للاحتفاظ داخل حلقة النافذة ومنع الفئران من سحب الغرز (الشكل 2). الغرز التي تحمل R.MIW مصنوعة من الحرير غير القابل للامتصاص ، والذي له خصائص مضادة للحساسية ، وملمس ناعم ، ويسهل التعامل معه. حلقة R.MIW مصنوعة من التيتانيوم ، واحدة من أكثر المواد المتوافقة بيولوجيا التي لا تعزز الالتهاب أو النخر بعد الزرع21. إذا تم اتباع الظروف المعقمة وتم تنفيذ الغرز بشكل جيد ، فإن زرع الغدة الثديية R.MIW يشكل خطرا منخفضا لمضاعفات ما بعد الجراحة. علاوة على ذلك ، على عكس زرع نافذة تصوير البطن22 ، فإن زرع R.MIW ليس عاملا مقيدا لبقاء الفأر على قيد الحياة لأن الغدة الثديية ليست عضوا حيويا وتسمح بالتصوير اليومي حتى الحد المحدد في البروتوكول الأخلاقي. العامل الوحيد الذي يحد من مدة زرع النافذة هو دوران الاستتباب للجلد ، مما سيؤدي في النهاية إلى سقوط الغرز بعد 4 - 6 أسابيع. لذلك ، من المهم فحص استقرار الغرز بانتظام. إذا رغبت في ذلك ، يمكن إزالة الغرز واستبدالها بخيط جديد من سلسلة المحفظة في ظل ظروف معقمة (كما هو موضح في الخطوات 3.5 - 3.8) لضمان استقرار النافذة.
يتمثل أحد التحديات الرئيسية عند استخدام نهج التصوير متعدد الأيام في استرداد عائد الاستثمار في أيام متتالية. تحقيقا لهذه الغاية ، يمكن تضمين فحص نظرة عامة سريعة قبل تحديد عائد الاستثمار (عائد الاستثمار) (الشكل 3B). يمكن استخدام معالم الأنسجة المتعددة لتتبع نفس المنطقة من الأنسجة ، بما في ذلك إشارة شبكة الكولاجين (التي تصورها الجيل التوافقي الثاني) ، وبنية الأنسجة ، وكذلك الأنماط المحلية للخلايا المصنفة بشكل تفاضلي أو عشوائي بالأصباغ أو البروتينات الفلورية (الشكل 3B). في هذا المثال التمثيلي ، تم زرع R.MIW على الغدة الثديية 4th من MMTV-PyMT. R26-CreERT2هيت; R26-Confettihet أنثى الفأر في بداية تكوين الورم الملموس. في وقت لاحق ، تم تحفيز إعادة التركيب العشوائي عن طريق حقن 1.5 ملغ تاموكسيفين ، مما أدى إلى إعادة تركيب بنية Confetti في بعض الخلايا (الشكل 3C). تمت متابعة الخلايا السرطانية المعاد تجميعها لمدة 20 يوما (الشكل 3B ، C). إذا تم منع تصوير نفس المنطقة من الغدة الثديية على مدى أيام متتالية ، فيمكن فتح النافذة في بيئة معقمة (كما هو موضح في الخطوة 5.1) لمزيد من التوضيح ، وإعادة وضع الأنسجة لتحسين الرؤية واكتساب الصور (الشكل 3A).
باستخدام هذه الطريقة ، تم اتباع الغدة الثديية النامية خلال فترة البلوغ على مستوى الخلية الواحدة. تم إجراء IVM المتكرر من خلال R.MIW باستخدام R26-CreERT2het. R26-mTmGhet الفئران الإناث بين 4-6 أسابيع من العمر ، حيث يتم تصنيف جميع الخلايا مع غشاء tdTomato (الشكل 4A)23. تم حقن الفئران بجرعة منخفضة من تاموكسيفين (0.2 ملغ / 25 جم من وزن الجسم) ، مما أدى إلى إعادة تركيب متفرقة لبنية mTmG ، مما تسبب في تغيير من الأحمر إلى الأخضر في بعض الخلايا في جميع الأنسجة ، بما في ذلك الغدة الثديية (الشكل 4B). وتمت إعادة النظر في نفس عائد الاستثمار على مدى عدة أيام لتصور التغيرات المورفولوجية داخل الغدة الثديية، بما في ذلك استطالة القنوات والتفرع القنوي (الشكل 4C) بدقة خلوية. الأهم من ذلك ، أن هذا المزيج من وضع العلامات على الخلايا العشوائية و IVM متعدد الأيام يسمح أيضا بتصور التغيرات الديناميكية للبيئة القنية ، مثل ديناميكيات الخلايا المفردة في السدى المحيطة بالقنوات المستطيلة والمتفرعة (الشكل 4D) وكذلك الديناميكيات الخلوية داخل العقدة الليمفاوية الإربية (الشكل 4E).
الشكل 4: IVM متعدد الأيام من التشكل المتفرع عند البلوغ. (A) البلوغ R26-CreERT2 ؛ تم حقن الفئران R26-mTmG في سن تتراوح بين 4-6 أسابيع بجرعة منخفضة من تاموكسيفين مما أدى إلى إعادة تركيب أليل R26-mTmG بوساطة Cre وتم تصويرها في الأيام 1 و 3 و 5 لمتابعة التغيرات الديناميكية في تطوير الغدة الثديية. (ب) التمثيل التخطيطي لبنية الماوس R26-mTmG ، والتي تؤدي في ظروف غير معاد دمجها إلى التعبير في كل مكان عن غشاء tdTomato (mT). عند إعادة التركيب بوساطة Cre ، يتم تبديل mT لتعبير غشاء eGFP (mG). (ج) تقديم ثلاثي الأبعاد لقناة ثديية ممدودة ومتفرعة على مدى أيام متعددة يتم تصويرها من خلال R.MIW في R26-CreERT2 ؛ R26-mTmG أنثى الفأر في 6 أسابيع من العمر. (D) صور أحادية المستوى Z للطرف المتفرع (الألواح العلوية) والفرع الممدود (الألواح السفلية). يتم تصوير mT باللون الأحمر ، ويمثل mG باللون السماوي ، وتمثل أشرطة المقياس 100 ميكرومتر (A و B). يتم تمييز الخلايا المفردة في السدى بواسطة العلامات النجمية البيضاء. لاحظ أنه تم زيادة شدة الإشارة يدويا لتسليط الضوء على الخلايا المفردة في السدى ، مما أدى إلى ظهور مفرط التعرض قليلا للخلايا الظهارية الثديية. (ه) صور تمثيلية للعقدة الليمفاوية الأربية ل R26-CreERT2؛ تم تصوير الماوس الأنثوي R26-mTmG من خلال R.MIW ، مما يعرض نظرة عامة على مسح تجانب (اللوحة اليسرى) ، وصور التكبير (اللوحات اليمنى) لمستوى Z واحد (أعلى) ، وعرض 3D (أسفل). يظهر الجيل التوافقي الثاني (الكولاجين I) باللون الأخضر و mT باللون الأحمر و mG باللون السماوي. تمثل أشرطة المقياس 500 ميكرومتر (مسح تجانب نظرة عامة) و 100 ميكرومتر (صور التكبير/التصغير). تم تعديل لوحات الشكل C و D من Messal et al. 2. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
وبالمثل ، في الغدة الثديية البالغة ، يسمح نهج R.MIW المقترح بتصور نفس الهياكل القنية على مدى أيام متعددة مع رؤية لا مثيل لها. حتى استخدام نماذج مراسل الفلورسنت الأقل سطوعا24 ، مثل نموذج الماوس Cdh1-mCFP (Ecadherin-mCFP) ، يسمح بتصور استقرار القنوات والتغيرات المورفولوجية الدقيقة بدقة خلوية (الشكل 5). لاحظ أن الرؤية بين اليوم 3 واليوم 5 تحسنت بشكل ملحوظ بعد تغيير موضع الأنسجة (الشكل 5).
الشكل 5: تصوير متعدد الأيام للغدة الثديية البالغة . قدم 3D صورا لبنية القناة الثديية لأنثى بالغة Cdh1-mCFP (سماوية ، تشير إلى تعبير الخلايا المضيئة الإيجابية Ecadherin) على مدى عدة أيام متتالية. تم استخدام نمط الكولاجين I (الجيل التوافقي الثاني ، أرجواني) لتتبع نفس عائد الاستثمار ، وتم استخدام إشارة Cdh1-mCFP لوضع علامة على الخلايا القنية (المضيئة). لاحظ أنه تم تحسين الرؤية بعد اليوم 3 من خلال فتح غطاء R.MIW وإعادة وضع الأنسجة. تمثل أشرطة المقياس 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
لتقييم عدم التجانس التكاثري للخلايا الظهارية الثديية خلال الدورة الهرمونية على مستوى الخلية الواحدة ، تم استخدام نموذج الفأر المراسل Kikume Green-Red (KikGR) القابل للتحويل الضوئي25,26 ، والذي يحتوي على تعبير في كل مكان عن بروتين KikGR. KikGR هو فلوروفور ساطع يخضع للتحويل من الأخضر إلى الأحمر عند التعرض للضوء البنفسجي ويمكن استخدام النسبة الحمراء / الخضراء كوكيل للنشاط التكاثري للخلية2 (الشكل 6A ، B). باستخدام نهج R.MIW ، اتبعنا نفس الخلايا داخل الشجرة القنية للغدة الثديية البالغة على مدار عدة أيام ووجدنا عدم تجانس تكاثري غير متوقع سابقا في جميع أنحاء الشجرة القنية (الشكل 6C). تم توزيع الخلايا التكاثرية العالية والمنخفضة بالتساوي على المناطق المحولة المختلفة (الشكل 6C ، D). ومن اللافت للنظر أنه على المستوى المحلي، أظهرت الخلايا المجاورة اختلافات كبيرة في نسبتها الحمراء/الخضراء (الشكل 6C، D). كشف القياس الكمي للنسبة الحمراء / الخضراء للخلايا المختلفة (كبديل لنشاطها التكاثري) بعد 10 أيام من التحويل الضوئي ، عن معدلات تخفيف متغيرة للغاية لبعض الخلايا داخل نفس البيئة الدقيقة القنية (الشكل 6E). وتكشف هذه البيانات مجتمعة عن عدم تجانس تكاثري محلي ملحوظ داخل الغدة الثديية البالغة، وفي الوقت نفسه، عن معدل دوران عالمي موحد.
الشكل 6: IVM الطولي لعدم التجانس التكاثري في الغدة الثديية البالغة باستخدام نموذج فأر KikGR. (A) تم تصوير فئران KikGR في اليوم 0 قبل وبعد التعرض للضوء البنفسجي. تكررت جلسات التصوير في الأيام 2 و 6 و 10 بعد التحويل. (ب) تصوير تخطيطي للنتائج الافتراضية عند التحويل الضوئي للخلايا الظهارية الثديية KikGR بعد الانتشار (اللوحة اليسرى) وعدم الانتشار (اللوحة اليمنى) كدالة للوقت. (ج) تم تصوير نفس المنطقة من الغدة الثديية من خلال R.MIW على مدى 10 أيام. تم تحويل المناطق الأصغر حجما ضوئيا في اليوم 0 وتظهر معدل تخفيف مماثل للإشارة الحمراء Kikume بمرور الوقت ، مما يشير إلى معدل دوران متساو في جميع أنحاء الظهارة. (د) تظهر صور التكبير/التصغير (الطائرات Z المفردة) للمناطق المشار إليها في اللوحة C عدم تجانس تكاثري على المستوى الخلوي بعد 6 و 10 أيام من تحويل الصور. تمثل أشرطة المقياس 100 ميكرومتر (اللوحة C) و 10 ميكرومتر (اللوحة D). (ه) القياس الكمي للنسبة الحمراء/الخضراء للخلايا المختارة عشوائيا (n = 48 خلية) في ثلاث مناطق محولة ضوئيا. وتدل النسبة المرتفعة/الحمراء على انخفاض معدل التخفيف وانخفاض النشاط التكاثري، في حين أن انخفاض النسبة الحمراء/الخضراء يدل على ارتفاع معدل التخفيف والانتشار. تم تعديل لوحات الشكل C-E من Messal et al. 2. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Discussion
يسمح R.MIW بالتصوير الطولي للغدة الثديية السليمة والمريضة في بيئتها الأصلية والأقل تعطيلا ويسمح بالتصور المتكرر للغدة الثديية في مراحل النمو المتنوعة. يسمح تصميم R.MIW بفتح النافذة في أي وقت أثناء التجربة. قد يعوق الوصول البصري على المدى الطويل إلى الأنسجة ذات الأهمية ، على سبيل المثال ، من خلال تراكم حطام الخلايا على الغطاء الزجاجي. في مثل هذه الحالات ، يمكن فتح R.MIW قبل أو مباشرة بعد جلسة التصوير للسماح بتنظيف منطقة الأنسجة المرئية والغطاء بالكامل. يسمح الغطاء القابل للإزالة أيضا بالتلاعب بالأنسجة بالإضافة إلى التطبيق المحلي للمواد ، مثل مثبطات وعلاجات محددة ، أو وضع علامات على الأصباغ ، أو أنواع معينة من الخلايا ذات الاهتمام.
تتغلب هذه الطريقة على قيود إجراءات سديلة الجلد الثديي الموصوفة سابقا4،7،8،13 ، والتي تقتصر على جلسة تصوير واحدة ، ويمكنها تصور عمليات مثل التشكل المتفرع (الشكل 5) ، أو دوران الأنسجة الاستتبابية (الشكل 6) ، أو نمو الورم على المستوى الخلوي (الشكل 3 ب) ). ومع ذلك ، في الوقت نفسه ، يسمح R.MIW بالتلاعب المحلي بالأنسجة بين جلسات التصوير ، والتي تضم رصيدا كبيرا من R.MIW مقارنة ب MIW 3,18 المنشورة سابقا وجميع نوافذ التصوير الأخرى20,22. عند فتح R.MIW ، من المهم الحفاظ على ظروف معقمة في جميع الأوقات لمنع أي مصدر للعدوى. تسمح القدرة على فتح R.MIW في بيئة معقمة بتحسين ظروف التصوير قبل كل جلسة تصوير ، مما يحسن بشكل كبير الوصول البصري طويل الأجل إلى الأنسجة محل الاهتمام. على وجه التحديد ، في الغدة الثديية ، التي يتم تضمينها في سدى غنية بالخلايا الشحمية ، هذا ذو قيمة كبيرة. علاوة على ذلك ، يمكن للغطاء القابل للاستبدال أن يمكن بشكل فريد الإدارة المحلية للعلاجات ، أو أنواع الخلايا المختلفة ، أو أصباغ وضع العلامات ، أو التشريح المجهري الموجه بالصور ، أو أي معالجة محلية أخرى للأنسجة دون الحاجة إلى إنهاء تجربة IVM. على سبيل المثال ، لدراسة بدء الورم ، يمكن حقن مجموعات محددة من الخلايا السرطانية مباشرة في شجرة الأقنية أو السدى في نقطة زمنية محددة IVM وموقع دقيق للغدة الثديية ، طالما يمكن الوصول إلى عائد الاستثمار هذا من خلال حلقة R.MIW. لدراسة تطور الورم ، يمكن وضع علامة ضوئية على مجموعات محددة من الخلايا السرطانية (في موقع محدد ، أو في بيئة دقيقة محددة ، أو بسلوك معين) أثناء جلسة IVM وبعد ذلك تشريحها باستخدام مجهر تشريح الفلورسنت بعد فتح R.MIW. ويمكن مواصلة معالجة الخلايا المعزولة لإجراء التحليلات النهائية، مثل تسلسل الحمض النووي الريبوزي المرسال (أحادي الخلية). باستخدام هذا النهج ، يمكن للمرء أن يقرن سلوك الخلايا الحية بملامح التعبير الجزيئي. تسمح ميزة إدارة الأدوية المحلية التي يتيحها R.MIW بتصوير الأنسجة قبل العلاج وبعده مباشرة. يمكن إجراء الفاصل الزمني اللازم لإزالة الماوس من صندوق التصوير وإجراء إدارة الدواء المحلية بعد فتح غطاء R.MIW في دقائق ، مما يسمح بالتقاط المرحلة الفورية للأدوية سريعة المفعول.
نظهر أن IVM للغدة الثديية من خلال R.MIW متوافق مع العديد من نماذج الماوس مراسل الفلورسنت المختلفة. البيئة الغنية بالدهون تمثل تحديا للتصوير ، وبالتالي يوصى باستخدام الفلوروفورات الساطعة. ومع ذلك ، كما هو موضح هنا ، يمكن تصور الفلوروفورات الأقل سطوعا مثل mCFP من خلال R.MIW في ظروف التصوير المثلى. حتما ، سوف تمنع وسادة الدهون تصوير الهياكل القنية العميقة ، وتقصر التصوير على القنوات الأكثر سطحية. ستساعد صورة نظرة عامة منخفضة الدقة في بداية كل تجربة IVM على تحديد الهياكل القنية ذات الأهمية السطحية بما فيه الكفاية للتصوير عالي الدقة. يمكن للتلاعب بالأنسجة المحلية أو إزالة النسيج الضام أو إعادة وضع الأنسجة الدهنية بعد فتح R.MIW تحسين IVM لعائد الاستثمار المحدد الذي يتم تراكبه بواسطة الأنسجة الدهنية. هذه ميزة مهمة على جميع تصميمات النوافذ السابقة ، والتي لا تسمح بإجراء هذه التلاعب وتتطلب إزالة كاملة للنافذة نفسها. على وجه التحديد ، لتصور العقدة الليمفاوية الإربية ، يوصى بإزالة الأنسجة الدهنية العلوية بلطف ، مما يقلل من تشتت الضوء ويتيح التصوير عالي الدقة. عند التلاعب بالأنسجة ، احتفظ دائما بالظروف المعقمة ومنع النزيف أو الأضرار الجسيمة للأنسجة ، لأنها قد تؤثر على العمليات التي تتم دراستها أثناء تجربة IVM.
يتكون R.MIW من التيتانيوم ، وهي مادة شائعة الاستخدام في الممارسة السريرية لتحل محل الأنسجة الصلبة مثل المفاصل أو ألواح العظام. يتمتع التيتانيوم بالعديد من المزايا مقارنة بالنوافذ الفولاذية ، بما في ذلك طابعه الخفيف الوزن والخامل21. في الآونة الأخيرة ، تم استخدام العديد من المواد الأخرى لإنشاء أنواع جديدة من نوافذ التصوير ، بما في ذلك نافذة السيليكون المرنة20. على النقيض من R.MIW ، لا تتطلب النافذة المرنة أي خيوط للزرع وهي مناسبة لأي موضع تشريحي تقريبا ، وتحديدا في حالة الأنسجة الرخوة والهشة. نوافذ السيليكون لها تأثير ضئيل على حركة الحيوانات بسبب طبيعتها خفيفة الوزن والقابلة للتشوه وربما أكثر ملاءمة في التجارب التي تدرس التوسع السريع للأنسجة ونموها20. ميزة أخرى على إصدار التيتانيوم هي أن نوافذ السيليكون متوافقة مع طرق التصوير الأخرى ، بما في ذلك التصوير بالرنين المغناطيسي20,27. ومع ذلك ، سيكون من المهم أن تضع في اعتبارك أن الأهداف محسنة للأغطية الزجاجية مقاس 0.17 مم. علاوة على ذلك ، فإن الأنسجة الثديية عرضة لحركات التنفس ، والتي يصعب تقييدها باستخدام النافذة المرنة ، خاصة عند استخدام المجهر المقلوب. يتم تقليل القطع الأثرية للتنفس من خلال تصميم R.MIW وتثبيت R.MIW في تطعيم صندوق التصوير. ونتيجة لذلك ، لا يتم تشويه الصور التي تم الحصول عليها باستخدام إعداد R.MIW المقترح بسبب تنفس القطع الأثرية. ومع ذلك ، يمكن أن تحدث انجرافات طفيفة في توطين الأنسجة ، والتي عادة ما تكون تدريجية ويمكن تصحيحها باستخدام برنامج تصحيح الحركة بعد الاستحواذ28. مع زيادة مجموعة أدوات تقنيات IVM 2,20 ، فإن المتطلبات المحددة لكل تجربة ستحدد في النهاية أفضل طريقة لتصور الأنسجة محل الاهتمام في الجسم الحي. تتميز تصميمات النوافذ المختلفة بمزايا وعيوب مختلفة ، واعتمادا على سؤال البحث ، وإعداد الفحص المجهري المتاح ، والدقة المكانية والزمنية المطلوبة ، والفترة الزمنية الإجمالية للعملية المدروسة ، يجب تحديد النهج الأمثل.
باختصار ، يسهل R.MIW توصيف عالي الدقة للديناميكيات الخلوية أثناء تطور الغدة الثديية والتوازن والمرض على مدى عدة أيام إلى أسابيع.
Disclosures
ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل من قبل مؤسسة الأبحاث فلاندرز (منحة الدكتوراه للبحوث الأساسية 11L7222N إلى M.C.) ، ومؤسسة Boehringer Ingelheim (زمالة الدكتوراه إلى C.L.G.J.S) ، وزمالة EMBO لما بعد الدكتوراه (منحة ALTF 1035-2020 إلى C.L.G.J.S.) ، وجائزة الدكتور جوزيف شتاينر (إلى J.v.R).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% NaCl | BD | 306573 | Other brands available |
| 10 mm round coverglass | Fisher scientific | 10696365 | Other brands available |
| 5-0 braided silk suturs | Ethicon | W580 | |
| 80% Ethanol | homemade | NA | |
| Anesthesia induction box | Kentscientific | VetFlo-MSEKIT | |
| Buprenorphine (Vetergesic®) | Ecuphar | NA | |
| Cotton tips (sterile) | Fisher scientific | 13113743 | Other brands available |
| Cyanoacrylate adhesive | Loctite | NA | Other brands available |
| Eye ointment | Duratears | NA | |
| Flexible butterfly needle | Greiner Bio-One | 450120 | Other brands available |
| Graefe forceps (blunt) | Fine Science Tools | 11051-10 | |
| Heating pad | Kentscientific | RightTemp Jr. | Other brands available |
| Imaging box | Custom made | NA | |
| Infuse nutrient mixture | Braun | Nutriflex special 70/240 | |
| Insulin syringes | BD | 324911 | Other brands available |
| Inverted multi-photon microscope with automated stage | Leica Microsystems | NA | |
| Isoflurane vaporizer | Kentscientific | VetFlo-1231K | |
| Needle holder | Fine Science Tools | 12510-14 | |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | P7793 | semi-transparent tape |
| Paper tape tesa | Tesa | NA | |
| Petroleum Jelly | Vaseline | NA | |
| Razor blades | Fisher scientific | 11904325 | Other brands available |
| Silicon tubing | Solutions Elastomeres | NA | Any houseware |
| Spring scissors (small) | Fine Science Tools | 15018-10 | |
| Sterile PBS | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
| Syringe (10 ml) | BD | 305482 | Other brands available |
| Thin forceps | Fine Science Tools | 11413-11 | |
| Titanium lid for mammary imaging window | Custom made | NA | |
| Titanium mammary imaging window | Custom made | NA | |
| Wooden sticks toothpicks | Fisher scientific | NC1678836 | Other brands available |
References
- Watson, C. J., Khaled, W. T. Mammary development in the embryo and adult: new insights into the journey of morphogenesis and commitment. Development. 147 (22), Cambridge, England. (2020).
- Messal, H. A., van Rheenen, J., Scheele, C. L. G. J. An Intravital Microscopy Toolbox to Study Mammary Gland Dynamics from Cellular Level to Organ Scale. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 26 (1), 9-27 (2021).
- Kedrin, D., et al. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nature Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).
- Dawson, C. A., Mueller, S. N., Lindeman, G. J., Rios, A. C., Visvader, J. E. Intravital microscopy of dynamic single-cell behavior in mouse mammary tissue. Nature Protocols. 16 (4), 1907-1935 (2021).
- Scheele, C. L., et al. Identity and dynamics of mammary stem cells during branching morphogenesis. Nature. 542 (7641), 313-317 (2017).
- Kotsuma, M., et al. Nondestructive, serial in vivo imaging of a tissue-flap using a tissue adhesion barrier. IntraVital. 1 (1), 69-76 (2012).
- Ingman, W. V., Wyckoff, J., Gouon-Evans, V., Condeelis, J., Pollard, J. W. Macrophages promote collagen fibrillogenesis around terminal end buds of the developing mammary gland. Developmental Dynamics: an official publication of the American Association of Anatomists. 235 (12), 3222-3229 (2006).
- Entenberg, D., et al. large-volume, high-resolution intravital imaging for tissue-wide analysis of single cell dynamics. Methods (San Diego, Calif). 128, 65-77 (2017).
- Masedunskas, A., Weigert, R., Mather, I. H. Intravital Imaging of the Lactating Mammary Gland in Transgenic Mice Expressing Fluorescent Proteins. Advances in Intravital Microscopy. , Springer. Netherlands. 187-204 (2014).
- Masedunskas, A., Chen, Y., Stussman, R., Weigert, R., Mather, I. H. Kinetics of milk lipid droplet transport, growth, and secretion revealed by intravital imaging: lipid droplet release is intermittently stimulated by oxytocin. Molecular Biology of the Cell. 28 (7), 935-946 (2017).
- Mather, I. H., Masedunskas, A., Chen, Y., Weigert, R. Symposium review: Intravital imaging of the lactating mammary gland in live mice reveals novel aspects of milk-lipid secretion. Journal of Dairy Science. 102 (3), 2760-2782 (2019).
- Stevenson, A. J., et al. Multiscale imaging of basal cell dynamics in the functionally mature mammary gland. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (43), 26822-26832 (2020).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Preparation of Mice for Long-Term Intravital Imaging of the Mammary Gland. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5562 (2011).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of Vital Signs for Long-Term Survival of Mice under Anesthesia. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5563 (2011).
- Harney, A. S., Wang, Y., Condeelis, J. S., Entenberg, D. Extended Time-lapse Intravital Imaging of Real-time Multicellular Dynamics in the Tumor Microenvironment. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (112), e54042 (2016).
- Harper, K. L., et al. Mechanism of early dissemination and metastasis in Her2+ mammary cancer. Nature. 540 (7634), 588-592 (2016).
- Sobolik, T., et al. Development of novel murine mammary imaging windows to examine wound healing effects on leukocyte trafficking in mammary tumors with intravital imaging. IntraVital. 5 (1), 1125562 (2016).
- Shan, S., Sorg, B., Dewhirst, M. W. A novel rodent mammary window of orthotopic breast cancer for intravital microscopy. Microvascular Research. 65 (2), 109-117 (2003).
- Zomer, A., et al. Intravital imaging of cancer stem cell plasticity in mammary tumors. Stem Cells. 31 (3), 602-606 (2013).
- Jacquemin, G., et al. Longitudinal high-resolution imaging through a flexible intravital imaging window. Science Advances. 7 (25), (2021).
- Niinomi, M. Recent research and development in titanium alloys for biomedical applications and healthcare goods. Science and Technology of Advanced Materials. 4 (5), 445-454 (2003).
- Ritsma, L., et al. Surgical implantation of an abdominal imaging window for intravital microscopy. Nature Protocols. 8 (3), 583-594 (2013).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, N., Luo, L. A global double-fluorescent cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), New York, N.Y. 593-605 (2007).
- Snippert, H. J., et al. Intestinal Crypt Homeostasis Results from Neutral Competition between Symmetrically Dividing Lgr5 Stem Cells. Cell. 143 (1), 134-144 (2010).
- Nowotschin, S., Hadjantonakis, A. K. Use of KikGR a photoconvertible green-to-red fluorescent protein for cell labeling and lineage analysis in ES cells and mouse embryos. BMC Developmental Biology. 9, 49 (2009).
- Kurotaki, Y., Hatta, K., Nakao, K., Nabeshima, Y. I., Fujimori, T. Blastocyst Axis Is Specified Independently of Early Cell Lineage But Aligns with the ZP Shape. Science. 316 (5825), New York, N.Y. 719-723 (2007).
- Heo, C., et al. A soft, transparent, freely accessible cranial window for chronic imaging and electrophysiology. Scientific Reports. 6, 27818 (2016).
- Warren, S. C., et al. Removing physiological motion from Intravital and clinical functional imaging data. eLife. 7, 35800 (2018).
