Summary
פרוטוקול זה מתאר חלון הדמיה חדש של יונקים עם מכסה הניתן להחלפה (R.MIW). מיקרוסקופיה תוך-ורידית לאחר השתלת ה-R.MIW מאפשרת הדמיה אורכית ורב-יומית של בלוטת החלב הבריאה והחולה עם רזולוציה תאית בשלבי ההתפתחות השונים.
Abstract
המבנה המסועף של בלוטת החלב הוא דינמי מאוד ועובר מספר שלבים של גדילה ושיפוץ לאחר הלידה. מיקרוסקופיה תוך ורידית בשילוב עם ניתוח דש העור או השתלת חלונות הדמיה שימשה לחקר הדינמיקה של בלוטת החלב הבריאה בשלבי התפתחות שונים. רוב טכנולוגיות הדמיית החלב מוגבלות למסגרת זמן של שעות עד ימים, בעוד שרוב תהליכי שיפוץ בלוטות החלב מתרחשים במסגרות זמן של ימים עד שבועות. כדי לחקור שיפוץ בלוטות החלב, נדרשות שיטות המאפשרות גישה אופטית לרקמה המעניינת למסגרות זמן ממושכות. כאן מתוארת גרסה משופרת של חלון ההדמיה של יונק הטיטניום עם מכסה הניתן להחלפה (R.MIW) המאפשר הדמיה ברזולוציה גבוהה של בלוטת החלב ברזולוציה תאית למשך עד מספר שבועות. חשוב לציין שה-R.MIW מספק גישה לרקמות לאורך כל משך ניסוי ההדמיה התוך-לוויטלית, ולכן הוא יכול לשמש למניפולציה מקומית של רקמות, תיוג, מתן תרופות או מיקרו-דיסקציה מונחית תמונה. יחד, R.MIW מאפשר אפיון ברזולוציה גבוהה של הדינמיקה התאית במהלך התפתחות בלוטות החלב, הומאוסטזיס ומחלות.
Introduction
אפיתל החלב הוא איבר הפרשה ייחודי הנמצא ביונקים, המייצר ומפריש חלב להזנת הצאצאים. במהלך החיים, בלוטת החלב עוברת סבבים מרובים של התפתחות וצמיחה, אשר מלווים בשינויים מבניים ותפקודיים של הרקמה1. בהתאם לשלב ההתפתחותי, סוגי התאים התורמים לשיפוץ הרקמות שונים, כמו גם המיקום בתוך עץ הצינור.
מיקרוסקופיה תוך-ורידית מרובת-פוטון (IVM) מאפשרת לחקור את הדינמיקה של תאי החלב in vivo בהגדרה הטבעית והמזערית שלהפרעה 2,3,4. כדי לקבל גישה חזותית לבלוטת החלב, פורסמו מספר טכניקות זמניות להדמיית ex vivo או דש העור במהלך שלבים שונים של התפתחות בלוטת החלב, כולל גיל ההתבגרות 4,5,6,7, בגרות 2,8, הנקה 9,10,11,12, ודינמיקת הגידול13,14 ,15. אף על פי שטכניקות אלה גורמות להדמיה מרחבית וזמנית גבוהה של דינמיקה של תאי החלב, מסגרת הזמן מוגבלת לשעות בעוד שרוב תהליכי שיפוץ בלוטת החלב נמשכים ימים עד שבועות. לכן, נדרשות שיטות המאפשרות גישה אופטית לרקמה המעניינת למשך מסגרות זמן ממושכות. במהלך השנים פותחו מספר חלונות הדמיה קבועים להדמיית גידולי יונקיםבהדמיית 15,16,17,18, כולל חלון הדמיה של יונקים מטיטניום (MIW)2,3,19. למרות מאוד שימושי כדי לחקור צמיחת גידול החלב, הדמיה של מבנה בלוטת החלב בריא נשאר מוגבל למספר ימים. לאחרונה פותח חלון הדמיה גמיש מסיליקון, המאפשר הדמיה של בלוטת החלב של ההתבגרות במשךמספר שבועות 20. עם זאת, בלוטת החלב מוטבעת בכרית שומן עשירה באדיפוציטים, מה שמוביל לפיזור אור נרחב וכתוצאה מכך הראות המוגבלת של מבני צינורות החלב. לכן, תנאי הדמיה מעולים נדרשים בכל עת כדי לדמיין את הדינמיקה של הרקמות על פני פרקי זמן ממושכים בבלוטת החלב. לא ה-MIW הקלאסי, ולא חלון הסיליקון הגמיש מאפשרים מניפולציה של רקמות או אופטימיזציה של מיקום הרקמה הפיזית לפני ההדמיה, שכן החלון יוצר מערכת סגורה לאחר ניתוח והשתלה. כתוצאה מכך, גישה אופטית אופטימלית לרקמת החלב הבסיסית עשויה להיות מונעת על פני תקופות זמן ארוכות יותר. לעומת זאת, טכניקת דש העור מאפשרת אופטימיזציה ומיקום מחדש של הרקמה במהלך סשן ההדמיה וניתן לחזור על דש העור מספר פעמים2. עם זאת, מפגשי הדמיה חוזרים ונשנים דרך דש העור אפשריים רק כאשר מוקצה מספיק זמן (לפחות 7 ימים) בין ניתוחים כדי לאפשר התאוששות של העור ולכן הוא מתאים בעיקר לתהליכי מחקר בקני מידה ארוכים יותר של זמן. יתר על כן, מומלץ לא לבצע הליך זה פעמים רבות בגלל אופיו הפולשני והסיכון הגדול לזיהומים וצלקות עם סגירת הפצע.
כדי להתגבר על המגבלות הללו, כלומר, כדי להבטיח תנאי הדמיה אופטימליים לפרק זמן ממושך בתדירות גבוהה ובמקביל לאפשר מניפולציה של רקמות, גרסה משופרת של הטיטניום של ה-MIW עם מכסה הניתן להחלפה (R.MIW) תוכננה כדי לדמיין את בלוטת החלב הבריאה והחולה במשך מספר ימים עד שבועות2 (איור 1A, ב). ה-R.MIW תוכנן בהתאמה אישית כדי לספק גישה אופטימלית לרקמות, מה שמאפשר מניפולציה ישירה של רקמות לאורך כל משך הניסוי של IVM, ובכך מאפשר הדמיה של בלוטת החלב בזמן ובמקום הנכונים לאורך פרקי זמן ממושכים. כאשר הוא סגור, R.MIW יוצר מערכת אטומה הדומה ל-MIW הקלאסי (איור 1C). כאשר הוא נפתח בתנאים אספטיים, ה-R.MIW מאפשר מניפולציה מקומית של רקמות כדי לשפר את הגישה האופטית וגם מאפשר מתן מקומי של חומרים, כגון מעכבי מסלולים או אגוניסטים, הזרקה של סוגי תאים שונים בעלי עניין, כגון אוכלוסיות תאים סרטניים או תאי מערכת החיסון, או תוספת של צבעי תיוג רקמות. ניתן לפתוח את המכסה בכל רגע בין מפגשי ההדמיה מבלי לגרום נזק לרקמה שמתחת.
איור 1: עיצוב חלון הדמיה של החלב עם מכסה הניתן להחלפה. (A) מבט עליון ומבט מהצד של המכסה הניתן להחלפה של חלון הדמיית החלב עם כיסוי בקוטר 10 מ"מ המודבק לטבעת. (B) מבט עליון ומבט מהצד של חלון ההדמיה של החלב, המורכב מטבעת חיצונית וטבעת פנימית עם חריץ ביניהם כדי לאבטח את החלון בתוך עורו של העכבר באמצעות תפר מיתר ארנק. לטבעת החיצונית יש חריץ קטן שמתאים לארבע הקרנות (הזרועות) של המכסה. (C) קריקטורה ותמונות המדגימות את מנגנוני הפתיחה והסגירה של המכסה. הקרנות ההטיה מוודאות שהמכסה קבוע בתוך מסגרת החלון. נתון זה שונה מ- Messal et al. 2. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
פרוטוקול זה מתאר את הליך התכנון וההשתלה של R.MIW, כמו גם אסטרטגיית IVM אורכית כדי לבחון מחדש את אותם צינורות החלב ואת ההדמיה שלהם ברזולוציה תאית. ה-R.MIW מאפשר לעקוב אחר חלוקות תאים ושינויים מורפולוגיים במהלך שלבים התפתחותיים שונים של בלוטת החלב במודלים מגוונים של עכברים מדווחים פלואורסצנטיים. יחד, R.MIW מאפשר אפיון ברזולוציה גבוהה של הדינמיקה התאית במהלך התפתחות בלוטת החלב, הומאוסטזיס ומחלות.
Protocol
כל ההליכים המתוארים במאמר זה בוצעו בהתאם להנחיות של IACUC ו- KU Leuven ובוצעו במסגרת בקשת הפרויקט המאושרת P160/2020. לפני ביצוע פרוטוקול זה, אנא עיין באסטרטגיית משככי הכאבים עם הווטרינר המוסדי ונהל משככי כאבים לפני ואחרי הניתוח בהתאם להנחיות המוסדיות.
1. הכנת ה-R.MIW (תזמון משוער: 2 שעות)
הערה: לבניית R.MIW, מומלץ למצוא יצרן מקומי המתמחה בעבודה עם חומרים קשים כגון טיטניום, שכן זה דורש כלים מיוחדים ומומחיות. לסדנאות המתמחות בתכנון וייצור של תותבות טיטניום יש בדרך כלל את המכונות והמומחיות לייצר את חלקי R.MIW.
- מניחים את המכסה של ה-R.MIW על משטח סטרילי כאשר החלק החיצוני של המכסה פונה כלפי מעלה (וזרועות המכסה משופעות כלפי מטה; איור 1A).
- יש למרוח דבק ציאנואקרילט סביב כל שפת המכסה ולהניח בזהירות כיסוי זכוכית עגול בקוטר 10 מ"מ על גבי המכסה.
הערה: הכן תמיד מכסה רזרבי עם כיסוי זכוכית כגיבוי במהלך ההליך הכירורגי. - השתמשו במקל עץ סטרילי כדי למקם את מכסה הזכוכית ולהפעיל כוח מסוים כדי לדחוף אותו כלפי מטה כדי להבטיח אטימה אטומה לאוויר בין מכסה הזכוכית למסגרת המכסה. וודאו שהחורים בזרועות המכסה אינם מכוסים על ידי הזכוכית.
- יש לחטא את המכסים ואת ה-R.MIW על ידי טבילה ב-80% אתנול למשך 30 דקות לפחות בצלחת פטרי סגורה.
הערה: אין להשאיר את המכסים במשך יותר משעה אחת ב-80% אתנול כדי למנוע את פירוק הדבק הציאנואקרילט. - הסירו את עודפי דבק הציאנואקרילט מכיסוי הזכוכית באמצעות קצה כותנה ספוג באצטון.
- אחסנו את המכסים ואת ה-R.MIW בסביבה סטרילית עד לשימוש נוסף.
הערה: ניתן לשמור את המסגרת והמכסים של R.MIW בצינור או בשקית סטרילית למשך שבוע לכל היותר. בעת חידוש הניסוי, בדקו תמיד אם מכסה הזכוכית עדיין מחובר כראוי למכסה לפני שתמשיכו בפרוטוקול.
2. הכנה לניתוח (תזמון משוער: 15 דקות)
הערה: עבור הליך השתלת R.MIW, ניתן להשתמש בעכברים נקבות (>3.5 שבועות) מכל זן.
- שמרו על סטריליות על ידי שימוש בכפפות סטריליות, ועקרו את כל הפריטים שיבואו במגע עם העכבר. לשטוף כלי ניתוח עם מים וסבון עדין, אוויר יבש, לעטוף בנייר אלומיניום ללא פינות או קצוות חשופים, ולעקר באמצעות autoclave למחזור של 20 דקות ב 120 מעלות צלזיוס לפני הניתוח.
- להכין פלטפורמה כירורגית סטרילית ולעקר את המשטחים עם 80% אתנול.
הערה: כדי להבטיח עקרות, הניתוח יכול להתבצע בארון זרימה. - הפעילו את כרית החימום וכסו את המחצלת בוילון סטרילי. מקבעים את המכשירים הסטריליים על הווילון הסטרילי ומניחים את ה-R.MIW ומינימום של שני מכסים מכוסים זכוכית במי מלח סטריליים עם מאגר פוספט (PBS) בצלחת פטרי (סגרו את המכסה כדי למנוע זיהום חיצוני).
- הרדמה את העכבר בתא אינדוקציה באמצעות תערובת איזופלורן/O2 של 3%. יש לוודא כי החיה רגועה מספיק כדי שניתן יהיה לתמרן אותה בקלות ולהעביר אותה למסכת האף ללא כל מאבק.
- העבירו את העכבר מתא האינדוקציה למסכת האף להרדמה והפחיתו את רמת האיזופלורן לתערובת איזופלורן ל-1.5% - 2% איזופלורן/O2 . אמת הרדמה מלאה על ידי ביצוע בדיקת גמילה מכפה.
- כדי לבצע את בדיקת הנסיגה של הכפה, צובטים בחוזקה את כף החיה באמצעות ציפורניים או מלקחיים קהים. בהיעדר כל רפלקס שרירים, לשקול את החיה כמו מחוסר הכרה ולהמשיך להכנה כירורגית. בצע בדיקה זו לפני מניפולציה של בעלי חיים וחזור על הפעולה באופן קבוע במהלך הליכי ההרדמה והניתוחים כדי לאשר הרדמה.
- יש למרוח משחה לעיניים כדי למנוע התייבשות של הקרנית.
- גילחו את האזור סביב בלוטת החלבהרביעית באמצעות סכין גילוח (איור 2A). השתמש בפטמההרביעית כציון דרך. הסר שערות רופפות באמצעות סרט דביק.
הערה: לחלופין, ניתן להשתמש בקרם דפילטור כדי להסיר את השערות. - יש לחטא את העור החשוף ב-80% אתנול או פובידון-יוד ולמקם את העכבר באזור הניתוחי הסטרילי בגבו עם החוטם למסכת אף הרדמה באמצעות תערובת איזופלורן/O2 של 1.5%.
- אבטח את הגפיים הקדמיות והאחוריות של העכבר באמצעות נייר דבק.
הערה: השאירו את העכבר המרדים והמחלים על משטח החימום ככל האפשר, במהלך הניתוח ולאחריו. - השתמשו בוילון כירורגי סטרילי מקדים או גזה כדי לכסות את העכבר תוך השארת האזור הכירורגי חשוף.
3. השתלת R.MIW (תזמון משוער: 30 דקות)
- ודא אם החיה מורדמת כראוי על ידי ביצוע בדיקת גמילה מכפות. הרימו את העור בעדינות באמצעות מלקחיים עדינים של Graefe ובצעו חתך אלכסוני בקוטר 10-15 מ"מ באמצעות מספריים קפיציים קטנים בעור על גבי כרית השומן של החלבהרביעית תוך שימוש בפטמהה-4 כנקודת כיוון (איור 2A). הקפידו לא לחתוך או לפגוע בצפק או בבלוטת החלב.
- הגדר את אזור העניין (ROI) בהתבסס על תכונות מקרוסקופיות של רקמת החלב, כולל מיקום בלוטת הלימפה או נגע הגידול, ונסה לשמור על ROI מרכזי ביחס לחתך.
- הפרד את העור מכרית השומן של החלב ואת שכבות הרקמה שמתחתיו באמצעות כריתה קהה של עד 5-8 מ"מ סביב קו החתך כדי ליצור כיס שיתאים למסגרת R.MIW (איור 2BI).
- הרימו את ה-R.MIW באמצעות מלקחיים סטריליים ובדקו אם החתך גדול מספיק כדי להכניס את החלון. במידת הצורך, הגדל מעט את החתך עד שה- R.MIW ישתלב.
- הסר את ה- R.MIW והנח תפר מיתר ארנק סביב החתך באמצעות תפר משי 5-0 (קלוע, לא ניתן לספיגה). מניחים את התפר 1-2 מ"מ מקצה החתך מבחוץ אל פנים העור, החל מהקצה הקאודלי של החתך.
- נעים כ-5 מ"מ למעלה לאורך החתך ומעבירים את חוט התפר דרך העור מבפנים לחוץ. חזור על הליך זה לאורך קצה החתך, ובכך צור תפר מעגלי המורכב מ-5-6 לולאות (איור 2BII). היציאה הסופית של חוט התפר צריכה להיות ממוקמת במרחק של כ-2-5 מ"מ מהכניסה הראשונה.
הערה: היזהרו שלא למקם את התפר קרוב מדי לקצה החתך, מכיוון שהדבר מגביר את הסיכון לקרע בעור. הצבת התפר רחוק מדי מקצה החתך מגבירה את הסיכון לזיהום בין עודפי העור לחריץ של R.MIW. - התאם את ה- R.MIW בתוך החתך והשתמש במלקחיים של Graefe כדי למקם בזהירות את העור בחריץ של ה- R.MIW. הקפידו להשאיר את הלולאות של התפר בחוץ.
- משכו את הלולאות של תפר הארנק והידקו את התפר בחריץ של ה-R.MIW על ידי משיכה עדינה בשני קצות התפר (איור 2BIII). קשרו קשרים כירורגיים וחתכו את החוט העודף.
- יש למרוח ג'לי נפט על השפה הפנימית של ה-R.MIW באמצעות קיסם, תוך הקפדה על הימנעות מהרקמה שמתחתיה. דחפו בעדינות את מסגרת החלון כלפי מטה עם מלקחיים סטריליים או שתי קצות אצבעות, והניחו את המכסה לתוך מסגרת R.MIW (איור 1B). זה ימנע נפח של אוויר בין רקמת בלוטת החלב למכסה R.MIW.
- מניחים את קצות המלקחיים הדקים דרך החורים בזרועות המכסה ומהדקים את המכסה על ידי סיבוב המכסה בכיוון השעון (בערך 5°) (איור 1C ואיור 2BIV).
- אם נשאר מעט אוויר לאחר הידוק מכסה ה-R.MIW, השתמשו במחט אינסולין סטרילית כדי להסיר את עודפי האוויר. מכניסים את המחט דרך העור לתוך החלל שבין רקמת החלב למכסה ושולפים באיטיות את הבוכנה, ובכך יוצרים ואקום בין רקמת בלוטת החלב למכסה R.MIW.
- מתן, לאחר ניתוח, משכך כאבים כגון buprenorphine (0.1 מ"ג / ק"ג מדולל סטרילי 0.9% NaCl) על ידי הזרקה תת עורית. יש לחזור על הזרקה תת עורית עם בופרנורפין ב-8 שעות ו-16 שעות לאחר הניתוח.
- החזירו את העכבר לכלוב כדי להתאושש ולנטר מקרוב עד שהוא ער לחלוטין, או המשיכו עם שלב 4 להדמיה מיידית.
- בשלב זה שלאחר הניתוח, עקוב מקרוב אחר העכברים לאיתור סימנים של אי נוחות או סיבוכים בהתבסס על פרמטרים חיוניים, כגון נשימה, תגובתיות, התנהגות, יציבה ומשקל גוף. עקוב בקפידה אחר העור המקיף את החלון לאיתור סימנים של דלקת ונמק. אם לא יתרחשו סיבוכים, ה-R.MIW יאפשר מפגשי IVM חוזרים ונשנים במשך מספר שבועות לאחר ההשתלה.
איור 2: סקירה כללית של ההליך הכירורגי והשתלת החלון. (A) חתך אלכסוני נעשה ליד הפטמההרביעית של עכבר נקבה, והעור והרקמה שמתחתיה מנותקים על ידי דיסקציה קהה. (B) ניתן להשתמש בבלוטת הלימפה המפשעתית ובצורה של כרית השומן עבור הכיוון הנכון של הרקמה (I). תפר מיתר ארנק ממוקם בעור סביב החתך (II), ולאחר התאמת מסגרת החלון, התפר מהודק בחריץ כדי לאבטח את מסגרת החלון, ומאובטח על ידי קשרים כירורגיים (III). השלב האחרון הוא החדרה ונעילה של המכסה לתוך מסגרת החלון (IV). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
4. מיקרוסקופיה תוך-ורידית חוזרת ונשנית באמצעות R.MIW
הערה: אסטרטגיית IVM החוזרת על עצמה שתוארה כאן הותאמה למערכת קונפוקלית מרובת פוטונים הפוכה המצוידת בשלב ממונע ותא אקלים כהה בטמפרטורה של 35 °C (64 °F).
- הרדמה את העכבר בתא אינדוקציה באמצעות תערובת איזופלורן/O2 של 3%. אמת אובדן הכרה על ידי ביצוע בדיקת נסיגה מכפה (המתוארת בשלב 2.6). יש למרוח משחה לעיניים כדי למנוע התייבשות הקרנית במהלך ההדמיה.
- בדוק את מצב המסגרת והמכסה של R.MIW, כולל יציבות התפרים או כל נזק פוטנציאלי למכסה. במקרה של נזק למכסה, ניתן להחליף את המכסה כמתואר בשלב 5.
- העבירו את העכבר לתיבת הדמיה מותאמת אישית (איור 3A) שחוממה מראש (37 מעלות צלזיוס) והניחו את העכבר עם הראש לתוך חרוט האף. תיבת ההדמיה מורכבת ממסגרת שמתאימה לשלב האוטומטי של המיקרוסקופ. המסגרת נועדה להכיל שיבוץ בהתאמה אישית עם חור בקוטר של R.MIW (איור 3A) .
- מפרצון עם חרוט אף מחובר לקדמת הקופסה ומחובר לתחנת אידוי איזופלורן באמצעות תערובת איזופלורן/O 2%-3% איזופלורן/O2. שקע מחובר ליחידת נבלות הרדמה כדי להבטיח סירקולציה ולמנוע הצטברות של איזופלורן בתיבה. ניתן לסגור את תיבת ההדמיה באמצעות מכסה שקוף.
- מקם את העכבר על השיבוץ באופן כזה שה-R.MIW נופל בחור של שיבוץ תיבת ההדמיה (איור 3A). יש למרוח פרפילם וסרט נייר על גב העכבר כדי לייצב את העכבר ולהפחית את תנועת הרקמה עקב הנשימה.
- סגור את תיבת ההדמיה עם המכסה והכנס את תיבת ההדמיה לשלב המיקרוסקופ.
- הפחיתו את מינון האיזופלורן בהדרגה במהלך סשן ההדמיה כדי לקיים הרדמה יציבה אך שטחית (בדרך כלל בין 1.5%-0.8% תערובת איזופלורן/O2 ).
- ספק תזונה נכונה במהלך ההדמיה כמתואר להלן.
- למפגשי הדמיה <3 שעות, יש להזריק לעכבר באופן תת עורי 200-300 μL של PBS סטרילי להידרציה.
- עבור הפעלות הדמיה >3 שעות, בצע את השלבים המפורטים להלן.
- להדמיה ארוכת טווח, החדירו לעכבר חומרים מזינים. לשם כך, השתמש בתערובת החדרה סטרילית זמינה מסחרית המכילה חומצות אמינו וגלוקוז. מניחים מחט גמישה באופן תת עורי בצווארו של העכבר ומהדקים אותה בנייר דבק.
- חברו מזרק של 10 מ"ל עם תערובת החומרים המזינים המוכנים לצינור סיליקון גמיש ודחפו את תערובת החומרים המזינים עד שהיא מגיעה לקצה הצינור.
- חבר את צינור הסיליקון למחט הגמישה. קחו את קצה הצינורות והניחו אותו דרך אחד החורים של תיבת ההדמיה (מבפנים לחוץ, והשאירו את צד חיבור המחט בתיבה).
- הזריקו 50 μL של תמיסת החדרה כל 30 דקות.
- אבטח את תיבת ההדמיה בשלב המיקרוסקופ והגדר את אזור העניין באמצעות מצב האפיפלואורסצנציה של המיקרוסקופ.
- החל את הגדרות המיקרוסקופ הרצויות בהתאם למודל העכבר (איור 3B). מבני כלי שיט, דפוסי קולגן (שהודמיינו על ידי דור הרמוני שני) ומבנים אנטומיים יציבים אחרים, כולל בלוטת הלימפה המפשעתית, עשויים לשמש כציוני דרך. השג תמונות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי מרובה-פוטון הפוך בעומק של 12 סיביות, ומטרת מים של פי 25 באמצעות גודל מדרגת Z הנע בין 1.0 ל-4.0 מיקרומטר (ערימת z כוללת הנעה בין 150 ל-800 מיקרומטר). החל את ההגדרות הסטנדרטיות הבאות: פורמט 1024 x 1024, מהירות סריקה של 600 הרץ, מצב דו-כיווני.
- דמיינו את סיבי הקולגן I על ידי ביצוע דור הרמוני שני על ידי שימוש באורך גל עירור של 860 ננומטר וזיהוי ב-425-435 ננומטר. אורכי גל של עירור וגילוי עבור הפלואורופורים השונים מצוינים בטבלה 1.
טבלה 1. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
- השתמש בפונקציה הספירלית במצב נווט תוכנת הדמיה כדי ליצור סריקת אריחי סקירה גדולה כדי ליצור מפת ייחוס של הרקמה (איור 3B). הגדר את ה- ROIs בתוך הסקירה הספירלית, הגדר את מישורי Z העליונים והתחתונים כדי לקבוע את מחסנית Z. לחץ על התחל כדי לקבל ערימות Z תלת-ממדיות מפורטות (xyz) או ארבע-ממדיות (xyzt) של הרקמה.
הערה: במהלך כל ניסוי ההדמיה יש לעקוב מקרוב אחר העכבר. למפגשי הדמיה ארוכים, מומלץ להשתמש באוקסימטר דופק ובבדיקת טמפרטורה. הנשימה של העכבר צריכה להיות קבועה ובאותו קצב. אם העכבר מתחיל להראות סימנים של גזים, יש להפחית את כמות האיזופלורן. - בסוף כל מפגש הדמיה, השאירו את העכבר על משטח חימום עד שהוא ער לחלוטין. אם העכבר מראה סימנים של אי נוחות או ניידות מופחתת, שמור את הכלוב למשך זמן רב יותר על כרית החימום וספק ג'לים מזינים במקום צ'או הרגיל.
הערה: בין מפגשי הדמיה, העכבר צריך להיות במעקב צמוד אחר סימנים של אי נוחות כגון צריכת מזון ומים מופחתת, נשימה מהירה, ירידה בתנועה, רעד, תנוחת גוף חריגה או פרווה לא מטופחת. במקרה של סימנים ברורים של אי נוחות, יש לעקוב אחר ההנחיות המוסדיות בנוגע לרווחת בעלי החיים ולסיים את הניסוי כאשר נקודת הקצה ההומאנית מגיעה. - חזור על שלבים 4.1-4.12 עבור כל הפעלת הדמיה חוזרת והשתמש באריחי הסקירה כדי לשחזר את אותם מיקומים על פני נקודות זמן מרובות (איור 3B). תדירות ההדמיה תהיה תלויה בשאלת המחקר ובתזמון התהליך הנחקר, ובדרך כלל משתנה ממפגשי הדמיה פעמיים ביום לפעם בשבוע.
- בסוף תקופת הניסוי הרצויה, להרדים את בעלי החיים עם R.MIW מושתל באמצעות הרדמה עמוקה עם איזופלורן ואחריו פריקה צוואר הרחם. אם תרצה, לנתח את האיברים המעניינים לניתוחים נוספים של ex vivo .
- לחלופין, שמרו על החיה בחיים לצורך ניתוחים עתידיים של in vivo . במקרה כזה, הסר את תפר השקית המחזיק את ה- R.MIW על ידי חיתוךו עם מספריים קפיץ ונתק בזהירות את טבעת החלון מעור העכבר באמצעות מלקחיים קהים. נקו את שולי העור שהחזיקו בעבר את החלון והמשיכו עם תפר רציף פשוט (חומר נספג, כגון חומצה פוליגליקולית).
- לאחר סגירת העור, קשרו את חוטי התפר ההתחלתיים והסופים בשני קשרים מרובעים (4 זריקות). כדי למזער איסכמיה רקמתית, הקשרים צריכים להיות רופפים מספיק כדי לאפשר זרימת דם בקצה העור. יש לחטא את הפצע בפובידון-יוד כדי למנוע דלקת ולקדם את ריפוי העור.
איור 3: זרימת עבודה של IVM אורכי. (A) תיאור סכמטי של ניסוי IVM טיפוסי בן מספר ימים. (B) הדמיה של אזור סרטני בתוך בלוטת החלב הבוגרת. לפני כל מפגש הדמיה, סריקת אריחי סקירה ברזולוציה נמוכה (פאנל עליון) יכולה להקל על זיהוי האזורים המעניינים במהלך ימי ההדמיה הבאים. ניתן להשתמש בתבנית קולגן I (דור הרמוני שני, מג'נטה), מבנה רקמה ותבניות של תאים המסומנים באופן דיפרנציאלי עם חלבונים פלואורסצנטיים (המתוארים בירוק, צהוב ואדום) כדי לשחזר את אותו אזור רקמה. פסי קנה מידה מייצגים 1 מ"מ (סריקת אריחים סקירה) ו- 100 מיקרומטר (לוחות תחתונים). (C) ייצוג סכמטי של מבנה הכתב R26-קונפטי . לאחר רקומבינציה של קר-רקומבינציה המושרה על ידי טמוקסיפן, הקונפטי בונה רקומבינים סטוכסטיים, וכתוצאה מכך ביטוי של אחד מארבעת הפלואורופורים (nGFP, YFP, RFP או mCFP). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
5. פתיחה וסגירה של המכסה של ה-R.MIW בין מפגשי הדמיה
- שמרו על סטריליות על ידי שימוש בכפפות סטריליות, ועקרו את כל הפריטים שיבואו במגע עם העכבר. כלי ניתוח אוטוקלאבים לפני הניתוח (ראה שלב 2 לפרטים).
- הפעילו את כרית החימום וכסו את המחצלת בוילון סטרילי והרדימו את העכבר בתא אינדוקציה באמצעות תערובת של 3% איזופלורן/O2 . אמת הרדמה נאותה על ידי ביצוע בדיקת רפלקס גמילה מכפות.
- העבירו את העכבר מתא האינדוקציה למסכת האף להרדמה והפחיתו את רמת האיזופלורן לתערובת איזופלורן/O2 % של 1.5%-2%.
- מניחים את קצות המלקחיים הדקים דרך החורים בזרועות המכסה ומשחררים את המכסה על ידי סיבוב המכסה נגד כיוון השעון. במידת הצורך, יש למרוח כמה PBS סטרילי מחומם מראש (37 °C) על החלון כדי להקל על התרופפות המכסה.
- מניחים את המכסה של ה-R.MIW במנה סטרילית עם PBS סטרילי עד לשימוש נוסף. נקו את הכיסוי של המכסה עם דמי-מים ולאחר מכן 80% אתנול. יש לשמור על המכסה ב-PBS סטרילי עד לשימוש נוסף.
- מנעו מהרקמה החשופה להתייבש על ידי הוספת כמה טיפות של PBS סטרילי לפני השטח של הרקמה.
- להחיל או להזריק כל חומר או תאים בעלי עניין על הרקמה החשופה, נפח מקסימלי של 50 μL ניתן להשתמש. יש להמתין מספר דקות עד שהנוזל ייספג ברקמה. לחלופין, ניתן לתמרן את הרקמה או למקם אותה מחדש באמצעות מלקחיים סטריליים ובוטה כדי לייעל את תנאי ההדמיה עבור ROIs ספציפיים.
- יש למרוח ג'לי נפט על השפה הפנימית של ה-R.MIW, תוך הקפדה להימנע מהרקמה הבסיסית. מקם את המכסה לתוך מסגרת R.MIW כמתואר בשלב 3.9, מקם את קצות המלקחיים הדקים דרך החורים בזרועות המכסה, והידק את המכסה על ידי סיבוב המכסה בכיוון השעון (כ-5°).
Representative Results
כדי לחקור את הדינמיקה המתפשטת של תאי אפיתל החלב במהלך שלבי ההתפתחות השונים של בלוטת החלב, בוצע הפרוטוקול המתואר. העיצוב של R.MIW מתואר באיור 1, וההליך להשתלת R.MIW מסוכם באיור 2. ה- R.MIW מושתל בניתוח בין בלוטת החלב לעור. תפר משמש כדי להחזיק בתוך טבעת החלון ולמנוע מהעכברים למשוך את התפרים (איור 2). התפרים המחזיקים את ה-R.MIW עשויים ממשי שאינו נספג, בעל תכונות היפואלרגניות, מרקם רך וקל לטיפול בו. טבעת R.MIW עשויה מטיטניום, אחד החומרים הניתנים ביותר להתאמה ביולוגית שאינם מקדמים דלקת או נמק לאחר השתלה21. אם התנאים האספטיים עוקבים אחריהם והתפרים מבוצעים היטב, השתלת בלוטת החלב R.MIW מהווה סיכון נמוך לסיבוכים לאחר הניתוח. יתר על כן, בניגוד להדמיית בטן השתלת חלון22, השתלת R.MIW אינה גורם מגביל להישרדות העכבר מכיוון שבלוטת החלב אינה איבר חיוני ומאפשרת הדמיה יומית עד לגבול שצוין בפרוטוקול האתי. הגורם היחיד שמגביל את משך השתלת החלון הוא המחזור ההומאוסטטי של העור, מה שיוביל בסופו של דבר לכך שהתפרים ייפלו לאחר 4 - 6 שבועות. לכן, חשוב לבדוק באופן קבוע את יציבות התפרים. אם תרצה, ניתן להסיר את התפרים ולהחליפם בתפר חדש של מיתר ארנק בתנאים אספטיים (כמתואר בשלבים 3.5 - 3.8) כדי להרגיע את יציבות החלון.
אתגר מרכזי בעת שימוש בגישת ההדמיה הרב-יומית הוא שחזור החזר על ההשקעה בימים רצופים. לשם כך, ניתן לכלול סריקת סקירה מהירה לפני בחירת החזר ההשקעה (איור 3B). ניתן להשתמש בציוני דרך מרובים של רקמות כדי לשחזר את אותו אזור ברקמה, כולל אות רשת הקולגן (שהודגם על ידי דור הרמוני שני), מבנה הרקמה, כמו גם דפוסים מקומיים של תאים באופן דיפרנציאלי או סטוכסטי המסומנים בצבעים או בחלבונים פלואורסצנטיים (איור 3B). בדוגמה מייצגת זו, הושתל R.MIW על בלוטת החלב הרביעית של MMTV-PyMT; R26-CreERT2het; R26-קונפטיhet עכבר נקבה בתחילת היווצרות גידול מוחשי. לאחר מכן, רקומבינציה סטוכסטית הושרה על ידי הזרקה של טמוקסיפן של 1.5 מ"ג, וכתוצאה מכך רקומבינציה של מבנה הקונפטי בתאים מסוימים (איור 3C). תאי הגידול הרקומבינריים היו במעקב במשך תקופה של 20 יום (איור 3B,C). אם מונעים הדמיה של אותו אזור בבלוטת החלב במשך ימים רצופים, ניתן לפתוח את החלון בסביבה אספטית (כמתואר בשלב 5.1) כדי להבהיר עוד יותר, ולמקם מחדש את הרקמה כדי לשפר את הראות ואת רכישת התמונה (איור 3A).
בשיטה זו, בלוטת החלב המתפתחת במהלך גיל ההתבגרות הייתה מלווה ברמת התא הבודד. IVM חוזר באמצעות R.MIW בוצע באמצעות R26-CreERT2het; R26-mTmGנקבת עכברים בין גיל 4-6 שבועות, שבה כל התאים מסומנים עם ממברנה tdTomato (איור 4A)23. לעכברים הוזרק מינון נמוך של טמוקסיפן (0.2 מ"ג/25 גרם משקל גוף), וכתוצאה מכך נוצר רקומבינציה ספורדית של מבנה ה-mTmG, מה שגרם לשינוי מאדום לירוק בחלק מהתאים בכל הרקמות, כולל בלוטת החלב (איור 4B). אותם ROIs נבדקו מחדש במשך מספר ימים כדי לדמיין שינויים מורפולוגיים בתוך בלוטת החלב, כולל התארכות צינורית והסתעפות צינורית (איור 4C) ברזולוציה תאית. חשוב לציין שהשילוב הזה של תיוג תאים סטוכסטיים ו-IVM רב-יומי מאפשר גם לדמיין את השינויים הדינמיים של הסביבה הצינורית, כמו הדינמיקה של תאים בודדים בסטרומה המקיפה את התעלות המוארכות והמסתעפות (איור 4D), כמו גם את הדינמיקה התאית בתוך צומת הלימפה המפשעתית (איור 4E).
איור 4: IVM רב-יומי של מורפוגנזה מסתעפת של ההתבגרות. (A) Pubertal R26-CreERT2; עכברי R26-mTmG בגילם בין 4-6 שבועות הוזרקו להם מינון נמוך של טמוקסיפן שהוביל לרקומבינציה בתיווך Cre של אלל R26-mTmG והם צולמו בימים 1, 3 ו-5 כדי לעקוב אחר השינויים הדינמיים בהתפתחות בלוטת החלב. (B) ייצוג סכמטי של מבנה העכבר R26-mTmG , אשר בתנאים שאינם רקומבינים גורם לביטוי בכל מקום של ממברנה tdTomato (mT). עם רקומבינציה בתיווך Cre, mT מוחלף לביטוי eGFP (mG) של ממברנה. (C) עיבוד תלת-ממדי של צינור חלב מוארך ומסתעף במשך מספר ימים שצולם דרך R.MIW ב-R26-CreERT2; עכבר נקבת R26-mTmG בגיל 6 שבועות. (D) תמונות במישור Z יחיד של קצה ההסתעפות (לוחות עליונים) והענף המתארך (לוחות תחתונים). mT מתואר באדום, ו- mG בציאן, פסי קנה מידה מייצגים 100 מיקרומטר (A ו- B). תאים בודדים בסטרומה מודגשים על ידי כוכביות לבנות. שים לב שעוצמת האות הוגדלה באופן ידני כדי להדגיש את התאים הבודדים בסטרומה, מה שהוביל למראה מעט מוגזם של תאי האפיתל של החלב. (E) תמונות מייצגות של בלוטת המפשעתים של R26-CreERT2; עכבר נקבה R26-mTmG שצולם באמצעות R.MIW, המציג סריקת אריחי סקירה כללית (פאנל שמאלי), תמונות זום (לוחות ימניים) של מישור Z יחיד (למעלה) ועיבוד תלת-ממדי (למטה). הדור ההרמוני השני (קולגן I) מוצג בירוק, mT באדום ו-mG בציאן. סרגלי קנה מידה מייצגים 500 מיקרומטר (אריחי סקירה) ו- 100 מיקרומטר (תמונות זום). לוחות איורים C ו- D משתנים מ- Messal et al. 2. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
באופן דומה, בבלוטת החלב הבוגרת, גישת R.MIW המוצעת מאפשרת הדמיה של אותם מבני צינורות במשך מספר ימים עם ראות ללא פשרות. אפילו השימוש במודלים של כתבים פלואורסצנטיים פחות בהירים24, כגון מודל העכבר Cdh1-mCFP (Ecadherin-mCFP), מאפשר הדמיה של יציבות צינורית ושינויים מורפולוגיים עדינים ברזולוציה תאית (איור 5). שימו לב שהראות בין היום ה-3 ליום ה-5 השתפרה באופן משמעותי לאחר מיקום מחדש של הרקמה (איור 5).
איור 5: הדמיה מרובת ימים של בלוטת החלב הבוגרת. 3D עיבדה תמונות של מבנה תעלת יונקים של נקבה בוגרת Cdh1-mCFP (ציאן, המסמן את ביטוי תאי הלומינל החיוביים לאקדהרין) של עכבר במשך מספר ימים רצופים. תבנית הקולגן I (הדור ההרמוני השני, מגנטה) שימשה כדי לשחזר את אותו ROI, ואות Cdh1-mCFP שימש לסימון התאים הצינוריים (לומינליים). שים לב כי הראות לאחר היום השלישי שופרה על ידי פתיחת מכסה R.MIW ומיקום מחדש של הרקמה. סרגלי קנה מידה מייצגים 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
כדי להעריך את ההטרוגניות המתפשטת של תאי האפיתל של החלב במהלך המחזור ההורמונלי ברמה החד-תאית, נעשה שימוש במודל העכבר העיתונאי Kikume Green-Red (KikGR) הניתן להמרה,מודל 25,26, שיש לו ביטוי בכל מקום של חלבון KikGR. KikGR הוא פלואורופור בהיר שעובר המרה מירוק לאדום עם חשיפה לאור סגול, והיחס בין אדום לירוק יכול לשמש כמתווך לפעילות ההתפשטות של תא2 (איור 6A,B). באמצעות גישת R.MIW, עקבנו אחר אותם תאים בתוך העץ הצינורי של בלוטת החלב הבוגרת במשך מספר ימים ומצאנו הטרוגניות התפשטות בלתי צפויה בעבר בכל עץ הצינור (איור 6C). תאים שגשוג גבוהים ונמוכים חולקו באופן שווה על פני האזורים המומרים השונים (איור 6C,D). באופן מדהים, ברמה המקומית, תאים שכנים הראו הבדלים גדולים ביחס האדום/ירוק שלהם (איור 6C,D). כימות היחס בין אדום לירוק של תאים שונים (כמיופה כוח לפעילות ההתפשטות שלהם) 10 ימים לאחר המרת תמונות, חשף שיעורי דילול משתנים מאוד של תאים מסוימים באותה סביבת מיקרו-צינור (איור 6E). יחד, נתונים אלה חושפים הטרוגניות התפשטות מקומית יוצאת דופן בתוך בלוטת החלב הבוגרת, ובמקביל, שיעור תחלופה אחיד עולמי.
איור 6: IVM אורכי של הטרוגניות מתפשטת בבלוטת החלב הבוגרת באמצעות מודל העכבר KikGR. (A) עכברי KikGR צולמו ביום 0 לפני ואחרי החשיפה לאור סגול. מפגשי ההדמיה חזרו על עצמם בימים 2, 6 ו-10 לאחר ההמרה. (B) תיאור סכמטי של התוצאות ההיפותטיות עם המרת תמונה של תאי אפיתל החלב KikGR בעקבות התפשטות (לוח שמאלי) וללא התפשטות (לוח ימני) כפונקציה של זמן. (C) אותו אזור של בלוטת החלב צולם דרך R.MIW במשך תקופה של 10 ימים. אזורים קטנים יותר הומרו באופן מצולם ביום 0 והראו קצב דילול דומה של האות האדום של קיקומה לאורך זמן, מה שמעיד על קצב תחלופה שווה בכל האפיתל. (D) תמונות זום (מישורי Z בודדים) של האזורים המצוינים בלוח C מראות הטרוגניות מתפשטת ברמה התאית 6 ו-10 ימים לאחר המרת תמונות. סרגלי קנה מידה מייצגים 100 מיקרומטר (לוח C) ו- 10 מיקרומטר (לוח D). (E) כימות היחס בין אדום לירוק של תאים שנבחרו באקראי (n = 48 תאים) בשלושה אזורים שהומרו באופן מצולם. יחס גבוה בין אדום לירוק מעיד על קצב דילול נמוך ופעילות שגשוג נמוכה, בעוד שיחס נמוך בין אדום לירוק מעיד על קצב דילול והתפשטות גבוהים. לוחות איורים C- E שונו מ- Messal et al. 2. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
Discussion
ה- R.MIW מאפשר הדמיה אורכית של בלוטת החלב הבריאה והחולה בסביבתה הטבעית והמופרעת באופן מינימלי ומאפשר הדמיה חוזרת ונשנית של בלוטת החלב בשלבי התפתחות מגוונים. עיצוב R.MIW מאפשר לפתוח את החלון בכל שלב במהלך הניסוי. גישה חזותית ארוכת טווח לרקמה המעניינת עלולה להיפגע, למשל, על ידי הצטברות של פסולת תאים על הכיסוי. במקרים כאלה, ניתן לפתוח את ה- R.MIW לפני או מיד לאחר סשן הדמיה כדי לאפשר ניקוי של כל אזור הרקמה והמכסה הנראים לעין. המכסה הנשלף מאפשר גם מניפולציות של הרקמה, כמו גם יישום מקומי של חומרים, כגון מעכבים וטיפולים ספציפיים, צבעי תיוג או סוגי תאים ספציפיים בעלי עניין.
שיטה זו מתגברת על המגבלה של 4,7,8,13 פרוצדורות העור של החלב שתוארו קודם לכן, המוגבלות לסשן הדמיה אחד, ויכולות לדמיין תהליכים כגון הסתעפות מורפוגנזה (איור 5), תחלופת רקמות הומאוסטטית (איור 6), או צמיחת גידול ברמה התאית (איור 3B ). עם זאת, יחד עם זאת, ה- R.MIW מאפשר מניפולציה מקומית של הרקמה בין מפגשי ההדמיה, המהווים נכס גדול של ה- R.MIW בהשוואה ל- MIW 3,18 שפורסם בעבר ולכל שאר חלונות ההדמיה20,22. בעת פתיחת R.MIW, חשוב לשמור על תנאים אספטיים בכל עת כדי למנוע כל מקור של זיהום. היכולת לפתוח את ה-R.MIW בסביבה אספטית מאפשרת אופטימיזציה של תנאי ההדמיה לפני כל מפגש הדמיה, מה שמשפר מאוד את הגישה החזותית ארוכת הטווח לרקמה המעניינת. באופן ספציפי, בבלוטת החלב, אשר מוטבעת בסטרומה עשירה באדיפוציטים, זה בעל ערך רב. יתר על כן, המכסה הניתן להחלפה יכול לאפשר באופן ייחודי מתן מקומי של טיפולים, סוגי תאים שונים, צבעי תיוג, מיקרודיסקציה מונחית תמונה, או כל מניפולציה מקומית אחרת של הרקמה ללא צורך לסיים את ניסוי ההיפוך ההפוכותי. לדוגמה, כדי לחקור את התחלת הגידול, ניתן להזריק אוכלוסיות ספציפיות של תאים סרטניים ישירות לעץ הצינור או לסטרומה בנקודת זמן מוגדרת של IVM ומיקום מדויק של בלוטות החלב, כל עוד החזר ההשקעה הזה נגיש דרך טבעת R.MIW. כדי לחקור את התקדמות הגידול, אוכלוסיות ספציפיות של תאים סרטניים (במיקום מסוים, בסביבת מיקרו מסוימת, או עם התנהגות מסוימת) יכולות להיות מסומנות באופן מצולם במהלך סשן ההיפוך ההפוכותי ולאחר מכן לנתח אותן במיקרוסקופ כריתה פלואורסצנטי לאחר פתיחת ה- R.MIW. תאים מבודדים יכולים להיות מעובדים עוד יותר לצורך ניתוחים במורד הזרם, כגון ריצוף mRNA (חד-תאי). על ידי שימוש בגישה זו, ניתן להצמיד את התנהגות תאי in vivo לפרופילי ביטוי מולקולריים. היתרון של מתן תרופות מקומי המתאפשר על ידי R.MIW מאפשר לצלם את הרקמה לפני הטיפול ומיד לאחריו. המרווח הדרוש כדי להסיר את העכבר מתיבת ההדמיה ולאחר מכן לבצע מתן תרופות מקומי לאחר פתיחת מכסה R.MIW יכול להתבצע תוך דקות, מה שמאפשר לכידת פאזה מיידית של תרופות הפועלות במהירות.
אנו מראים כי IVM של בלוטת החלב דרך R.MIW תואם למודלים רבים ושונים של עכברים מדווחים פלואורסצנטיים. הסביבה העשירה בשומן מאתגרת לצילום, ולכן מומלץ להשתמש בפלואורופורים בהירים. עם זאת, כפי שמוצג כאן, ניתן לדמיין אפילו פלואורופורים בהירים פחות כגון mCFP באמצעות R.MIW בתנאי הדמיה אופטימליים. באופן בלתי נמנע, כרית השומן תמנע את ההדמיה של מבני הצינורות העמוקים יותר, ותגביל את ההדמיה לצינורות השטחיים יותר. תמונת סקירה ברזולוציה נמוכה בתחילת כל ניסוי IVM תסייע לזהות את המבנים הצינוריים המעניינים שהם שטחיים מספיק להדמיה ברזולוציה גבוהה. מניפולציה מקומית של רקמות, הסרת רקמת חיבור או מיקום מחדש של רקמת השומן לאחר פתיחת ה-R.MIW יכולים לייעל את ה-IVM עבור ROIs ספציפיים שמונחים על ידי רקמת השומן. זהו יתרון חשוב על פני כל עיצובי החלונות הקודמים, שאינם מאפשרים לבצע מניפולציות אלה וידרשו הסרה מלאה של החלון עצמו. באופן ספציפי, להדמיה של בלוטת הלימפה המפשעתית, מומלץ להסיר בעדינות את רקמת השומן יתר על המידה, מה שמפחית את פיזור האור ומאפשר הדמיה ברזולוציה גבוהה. בעת מניפולציה של הרקמה, תמיד לשמור על מצבים אספטיים ולמנוע דימום או נזק חמור לרקמה, כפי שהם עשויים להשפיע על התהליכים הנחקרים במהלך ניסוי IVM.
ה- R.MIW עשוי מטיטניום, חומר המשמש בדרך כלל בפרקטיקה הקלינית להחלפת רקמות קשות כגון מפרקים או צלחות עצם. לטיטניום יש מספר יתרונות על פני חלונות פלדה, כולל האופי הקליל והאינרטישלה 21. לאחרונה, מספר חומרים אחרים שימשו ליצירת סוגי חלונות הדמיה חדשניים, כולל חלון הסיליקון הגמיש20. בניגוד ל-R.MIW, החלון הגמיש אינו דורש תפרים כלשהם להשתלה ומתאים כמעט לכל תנוחה אנטומית, במיוחד במקרה של רקמות רכות ושבריריות. לחלונות הסיליקון יש השפעה מינימלית על תנועתיות בעלי החיים בשל אופיים הקל והמעוות, וייתכן שהם מתאימים יותר לניסויים החוקרים התרחבות וצמיחה מהירה של רקמות20. יתרון נוסף על פני גרסת הטיטניום הוא שחלונות הסיליקון תואמים לדרכי הדמיה אחרות, כולל הדמיית תהודה מגנטית 20,27. עם זאת, יהיה חשוב לזכור כי המטרות מותאמות עבור כיסויי זכוכית 0.17 מ"מ. יתר על כן, רקמת החלב רגישה לתנועות נשימה, שקשה להגביל באמצעות החלון הגמיש, במיוחד בעת שימוש במיקרוסקופ הפוך. ממצאי נשימה ממוזערים על ידי עיצוב R.MIW וקיבוע ה- R.MIW בשיבוץ של תיבת ההדמיה. כתוצאה מכך, תמונות שנרכשו באמצעות הגדרת R.MIW המוצעת אינן מעוותות עקב ממצאי נשימה. עם זאת, סחף קל בלוקליזציה של רקמות יכול להתרחש, שהם בדרך כלל הדרגתיים וניתן לתקן אותם באמצעות תוכנה לתיקון תנועה לאחר הרכישה28. עם ארגז הכלים ההולך וגדל של טכנולוגיות IVM 2,20, הדרישות הספציפיות עבור כל ניסוי יקבעו בסופו של דבר את הדרך הטובה ביותר להדמיה in vivo של הרקמה המעניינת. לעיצובי חלונות שונים יש יתרונות וחסרונות שונים ובהתאם לשאלת המחקר, למערך המיקרוסקופיה הזמין, לרזולוציה המרחבית והזמנית הנדרשת ולטווח הזמן הכולל של התהליך הנחקר, יש לקבוע את הגישה האופטימלית.
לסיכום, R.MIW מאפשר אפיון ברזולוציה גבוהה של הדינמיקה התאית במהלך התפתחות בלוטות החלב, הומאוסטזיס ומחלות במשך מספר ימים עד שבועות.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי קרן המחקר פלנדריה (מענק דוקטורט מחקר בסיסי 11L7222N ל- M.C.), קרן בוהרינגר אינגלהיים (מלגת דוקטורט ל- C.L.G.J.S), מלגת פוסט-דוקטורט של EMBO (מענק ALTF 1035-2020 ל- C.L.G.J.S.), ופרס דוקטור ג'וזף שטיינר (ל- J.v.R).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% NaCl | BD | 306573 | Other brands available |
| 10 mm round coverglass | Fisher scientific | 10696365 | Other brands available |
| 5-0 braided silk suturs | Ethicon | W580 | |
| 80% Ethanol | homemade | NA | |
| Anesthesia induction box | Kentscientific | VetFlo-MSEKIT | |
| Buprenorphine (Vetergesic®) | Ecuphar | NA | |
| Cotton tips (sterile) | Fisher scientific | 13113743 | Other brands available |
| Cyanoacrylate adhesive | Loctite | NA | Other brands available |
| Eye ointment | Duratears | NA | |
| Flexible butterfly needle | Greiner Bio-One | 450120 | Other brands available |
| Graefe forceps (blunt) | Fine Science Tools | 11051-10 | |
| Heating pad | Kentscientific | RightTemp Jr. | Other brands available |
| Imaging box | Custom made | NA | |
| Infuse nutrient mixture | Braun | Nutriflex special 70/240 | |
| Insulin syringes | BD | 324911 | Other brands available |
| Inverted multi-photon microscope with automated stage | Leica Microsystems | NA | |
| Isoflurane vaporizer | Kentscientific | VetFlo-1231K | |
| Needle holder | Fine Science Tools | 12510-14 | |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | P7793 | semi-transparent tape |
| Paper tape tesa | Tesa | NA | |
| Petroleum Jelly | Vaseline | NA | |
| Razor blades | Fisher scientific | 11904325 | Other brands available |
| Silicon tubing | Solutions Elastomeres | NA | Any houseware |
| Spring scissors (small) | Fine Science Tools | 15018-10 | |
| Sterile PBS | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
| Syringe (10 ml) | BD | 305482 | Other brands available |
| Thin forceps | Fine Science Tools | 11413-11 | |
| Titanium lid for mammary imaging window | Custom made | NA | |
| Titanium mammary imaging window | Custom made | NA | |
| Wooden sticks toothpicks | Fisher scientific | NC1678836 | Other brands available |
References
- Watson, C. J., Khaled, W. T. Mammary development in the embryo and adult: new insights into the journey of morphogenesis and commitment. Development. 147 (22), Cambridge, England. (2020).
- Messal, H. A., van Rheenen, J., Scheele, C. L. G. J. An Intravital Microscopy Toolbox to Study Mammary Gland Dynamics from Cellular Level to Organ Scale. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 26 (1), 9-27 (2021).
- Kedrin, D., et al. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nature Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).
- Dawson, C. A., Mueller, S. N., Lindeman, G. J., Rios, A. C., Visvader, J. E. Intravital microscopy of dynamic single-cell behavior in mouse mammary tissue. Nature Protocols. 16 (4), 1907-1935 (2021).
- Scheele, C. L., et al. Identity and dynamics of mammary stem cells during branching morphogenesis. Nature. 542 (7641), 313-317 (2017).
- Kotsuma, M., et al. Nondestructive, serial in vivo imaging of a tissue-flap using a tissue adhesion barrier. IntraVital. 1 (1), 69-76 (2012).
- Ingman, W. V., Wyckoff, J., Gouon-Evans, V., Condeelis, J., Pollard, J. W. Macrophages promote collagen fibrillogenesis around terminal end buds of the developing mammary gland. Developmental Dynamics: an official publication of the American Association of Anatomists. 235 (12), 3222-3229 (2006).
- Entenberg, D., et al. large-volume, high-resolution intravital imaging for tissue-wide analysis of single cell dynamics. Methods (San Diego, Calif). 128, 65-77 (2017).
- Masedunskas, A., Weigert, R., Mather, I. H. Intravital Imaging of the Lactating Mammary Gland in Transgenic Mice Expressing Fluorescent Proteins. Advances in Intravital Microscopy. , Springer. Netherlands. 187-204 (2014).
- Masedunskas, A., Chen, Y., Stussman, R., Weigert, R., Mather, I. H. Kinetics of milk lipid droplet transport, growth, and secretion revealed by intravital imaging: lipid droplet release is intermittently stimulated by oxytocin. Molecular Biology of the Cell. 28 (7), 935-946 (2017).
- Mather, I. H., Masedunskas, A., Chen, Y., Weigert, R. Symposium review: Intravital imaging of the lactating mammary gland in live mice reveals novel aspects of milk-lipid secretion. Journal of Dairy Science. 102 (3), 2760-2782 (2019).
- Stevenson, A. J., et al. Multiscale imaging of basal cell dynamics in the functionally mature mammary gland. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (43), 26822-26832 (2020).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Preparation of Mice for Long-Term Intravital Imaging of the Mammary Gland. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5562 (2011).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of Vital Signs for Long-Term Survival of Mice under Anesthesia. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5563 (2011).
- Harney, A. S., Wang, Y., Condeelis, J. S., Entenberg, D. Extended Time-lapse Intravital Imaging of Real-time Multicellular Dynamics in the Tumor Microenvironment. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (112), e54042 (2016).
- Harper, K. L., et al. Mechanism of early dissemination and metastasis in Her2+ mammary cancer. Nature. 540 (7634), 588-592 (2016).
- Sobolik, T., et al. Development of novel murine mammary imaging windows to examine wound healing effects on leukocyte trafficking in mammary tumors with intravital imaging. IntraVital. 5 (1), 1125562 (2016).
- Shan, S., Sorg, B., Dewhirst, M. W. A novel rodent mammary window of orthotopic breast cancer for intravital microscopy. Microvascular Research. 65 (2), 109-117 (2003).
- Zomer, A., et al. Intravital imaging of cancer stem cell plasticity in mammary tumors. Stem Cells. 31 (3), 602-606 (2013).
- Jacquemin, G., et al. Longitudinal high-resolution imaging through a flexible intravital imaging window. Science Advances. 7 (25), (2021).
- Niinomi, M. Recent research and development in titanium alloys for biomedical applications and healthcare goods. Science and Technology of Advanced Materials. 4 (5), 445-454 (2003).
- Ritsma, L., et al. Surgical implantation of an abdominal imaging window for intravital microscopy. Nature Protocols. 8 (3), 583-594 (2013).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, N., Luo, L. A global double-fluorescent cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), New York, N.Y. 593-605 (2007).
- Snippert, H. J., et al. Intestinal Crypt Homeostasis Results from Neutral Competition between Symmetrically Dividing Lgr5 Stem Cells. Cell. 143 (1), 134-144 (2010).
- Nowotschin, S., Hadjantonakis, A. K. Use of KikGR a photoconvertible green-to-red fluorescent protein for cell labeling and lineage analysis in ES cells and mouse embryos. BMC Developmental Biology. 9, 49 (2009).
- Kurotaki, Y., Hatta, K., Nakao, K., Nabeshima, Y. I., Fujimori, T. Blastocyst Axis Is Specified Independently of Early Cell Lineage But Aligns with the ZP Shape. Science. 316 (5825), New York, N.Y. 719-723 (2007).
- Heo, C., et al. A soft, transparent, freely accessible cranial window for chronic imaging and electrophysiology. Scientific Reports. 6, 27818 (2016).
- Warren, S. C., et al. Removing physiological motion from Intravital and clinical functional imaging data. eLife. 7, 35800 (2018).
