Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Langsgående intravital mikroskopi ved hjelp av et mammary imaging vindu med utskiftbart lokk

Published: January 20, 2022 doi: 10.3791/63326
Automatic Translation
1,2, 1,2, 3, 1,2
1Center for Cancer Biology, VIB (BE), 2Department of Oncology, KU Leuven (BE), 3Netherlands Cancer Institute, Department of Molecular Pathology, Oncode Institute (NL)

Summary

Denne protokollen beskriver et nytt pattedyr bildevindu med et utskiftbart lokk (R.MIW). Intravital mikroskopi etter implantasjon av R.MIW gir mulighet for langsgående og flerdagers avbildning av den sunne og syke brystkjertelen med cellulær oppløsning i de forskjellige utviklingsstadiene.

Abstract

Brystkjertelens forgrenede struktur er svært dynamisk og gjennomgår flere faser av vekst og ombygging etter fødselen. Intravital mikroskopi i kombinasjon med hudklaffkirurgi eller implantasjon av bildevinduer har blitt brukt til å studere dynamikken i den sunne brystkjertelen på forskjellige utviklingsstadier. De fleste pattedyravbildningsteknologier er begrenset til en tidsramme på timer til dager, mens de fleste brystkjerteloppussingsprosesser forekommer i tidsrammer på dager til uker. For å studere ombygging av brystkjertelen, er det nødvendig med metoder som tillater optisk tilgang til vev av interesse for lengre tidsrammer. Her beskrives en forbedret versjon av titanpattedyravbildningsvinduet med et utskiftbart lokk (R.MIW) som tillater høyoppløselig bildebehandling av brystkjertelen med cellulær oppløsning i opptil flere uker. Det er viktig at R.MIW gir vevstilgang gjennom hele varigheten av det intravitale bildebehandlingseksperimentet og kan derfor brukes til lokal vevsmanipulering, merking, legemiddeladministrasjon eller bildestyrt mikrodeseksjon. Samlet sett muliggjør R.MIW høyoppløselig karakterisering av cellulær dynamikk under utvikling av brystkjertelen, homeostase og sykdom.

Introduction

Pattedyrepitelet er et unikt sekretorisk organ tilstede hos pattedyr, som produserer og utskiller melk for å nære avkom. Gjennom livet gjennomgår brystkjertelen flere runder med utvikling og vekst, som er ledsaget av strukturelle og funksjonelle endringer i vevet1. Avhengig av utviklingsstadiet er celletypene som bidrar til vevsoppussing forskjellige, samt plasseringen i kanaltreet.

Multiphoton intravital mikroskopi (IVM) tillater studiet av mammarycelledynamikk in vivo i den innfødte og minimalt perturberte innstillingen 2,3,4. For å få visuell tilgang til brystkjertelen har flere midlertidige ex vivo- eller hudklaffavbildningsteknikker blitt publisert i ulike stadier av brystkjertelutvikling, inkludert pubertet 4,5,6,7, voksen alder 2,8, amming 9,10,11,12 og tumordynamikk 13,14 ,15. Selv om disse teknikkene resulterer i høy romlig og tidsmessig løst avbildning av pattedyrcelledynamikk, er tidsrammen begrenset til timer, mens de fleste brystkjerteloppussingsprosesser tar dager til uker. Derfor er det nødvendig med metoder som tillater optisk tilgang til vev av interesse for lengre tidsrammer. Gjennom årene har flere permanente bildevinduer blitt utviklet for mammary tumor imaging 15,16,17,18, inkludert en titan pattedyr bildevindu (MIW)2,3,19. Selv om det var veldig nyttig å studere brystsvulstvekst, forble visualisering av den sunne brystkjertelstrukturen begrenset til noen dager. Nylig ble det utviklet et fleksibelt silisiumavbildningsvindu, som tillater visualisering av pubertal brystkjertelen over flere uker20. Brystkjertelen er imidlertid innebygd i en adipocyttrik fettpute, noe som fører til omfattende lysspredning og som et resultat begrenset synlighet av brystkanalstrukturene. Derfor er det nødvendig med overlegne bildeforhold til enhver tid for å visualisere vevsdynamikk over lengre perioder i brystkjertelen. Verken den klassiske MIW, eller det fleksible silisiumvinduet tillater vevsmanipulering eller optimalisering av fysisk vevsplassering før avbildning, da vinduet danner et lukket system etter kirurgi og implantasjon. Som et resultat vil optimal optisk tilgang til det underliggende pattedyrvevet sannsynligvis bli utelukket over lengre tidsperioder. I motsetning tillater hudklaffteknikken optimalisering og omplassering av vevet under bildebehandlingsøkten, og en hudklaff kan gjentas flere ganger2. Gjentatte bildebehandlingsøkter gjennom en hudklaff er imidlertid bare mulig når tilstrekkelig tid (minst 7 dager) tildeles mellom operasjoner for å tillate gjenoppretting av huden og derfor hovedsakelig er egnet til å studere prosesser på lengre tidsskalaer. Videre er det tilrådelig å ikke utføre denne prosedyren mange ganger på grunn av sin invasive natur og stor risiko for infeksjoner og arrdannelse ved sårlukking.

For å overvinne disse begrensningene, det vil si for å sikre optimale bildeforhold i en lengre periode med høy frekvens og samtidig tillate vevsmanipulering, ble en forbedret titanversjon av MIW med et utskiftbart lokk (R.MIW) designet for å visualisere den sunne og syke brystkjertelen over flere dager til uke2 (figur 1A, B). R.MIW ble spesialdesignet for å gi optimal vevstilgang, noe som muliggjør direkte vevsmanipulering over hele IVM-eksperimentets varighet, og tillater dermed visualisering av brystkjertelen til rett tid og sted over lengre perioder. Når R.MIW er lukket, danner den et lufttett system som kan sammenlignes med den klassiske MIW (figur 1C). Når det åpnes under aseptiske forhold, tillater R.MIW lokal vevsmanipulering for å forbedre optisk tilgang og muliggjør også lokal administrering av stoffer, for eksempel veihemmere eller agonister, injeksjon av forskjellige celletyper av interesse, for eksempel kreftcelle- eller immuncellepopulasjoner, eller tilsetning av vevsmerkingsfarger. Lokket kan åpnes når som helst mellom bildebehandlingsøkter uten å forårsake skade på det underliggende vevet.

Figure 1
Figur 1: Utformingen av pattedyravbildningsvinduet med et utskiftbart lokk. (A) Ovenfra og sidevisning av det utskiftbare lokket på mammary imaging-vinduet med et 10 mm dekselglass limt til ringen. (B) Toppvisning og sidevisning av pattedyrets bildevindu, som består av en ytre ring og indre ring med et spor i mellom for å sikre vinduet i musens hud ved hjelp av en veskestreng sutur. Den ytre ringen har et lite spor som passer til de fire fremspringene (armene) på lokket. (C) Tegneserie og bilder som demonstrerer åpningen og lukkemekanismene på lokket. Skråkantene sørger for at lokket er festet inne i vindusrammen. Denne figuren er endret fra Messal et al. 2. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Denne protokollen beskriver design- og implantasjonsprosedyren til R.MIW, samt en langsgående IVM-strategi for å besøke de samme brystkanalene og deres visualisering med cellulær oppløsning. R.MIW tillater følgende celledelinger og morfologiske endringer i ulike utviklingsfaser av brystkjertelen i forskjellige fluorescerende reportermusmodeller. Samlet sett letter R.MIW høyoppløselig karakterisering av cellulær dynamikk under brystkjertelutvikling, homeostase og sykdom.

Protocol

Alle prosedyrer beskrevet i dette dokumentet ble utført i samsvar med retningslinjene til IACUC og KU Leuven og ble utført innenfor rammen av godkjent prosjektsøknad P160/2020. Før du utfører denne protokollen, må du gjennomgå analgesistrategien med den institusjonelle veterinæren og administrere pre- og postoperativ analgesi i henhold til institusjonelle retningslinjer.

1. Forberedelse av R.MIW (estimert timing: 2 t)

MERK: For bygging av R.MIW anbefales det å finne en lokal produsent som spesialiserer seg på å jobbe med harde materialer som titan, da dette krever spesialverktøy og ekspertise. Verksteder som spesialiserer seg på design og produksjon av titanproteser har vanligvis maskiner og ekspertise til å produsere R.MIW-delene.

  1. Plasser lokket på R.MIW på en steril overflate med utsiden av lokket vendt oppover (og armene på lokket skrånende nedover; Figur 1A).
  2. Påfør cyanoacrylat lim rundt hele kanten av lokket og legg forsiktig en 10 mm rund glassdeksle på toppen av lokket.
    MERK: Lag alltid et ekstra lokk med glassdeksler som reserve under den kirurgiske prosedyren.
  3. Bruk en steril trepinne til å plassere glassdekslene og påfør litt kraft for å skyve den ned for å sikre en lufttett forsegling mellom glassdekslene og rammen på lokket. Pass på at hullene i lokkets armer ikke er dekket av glasset.
  4. Desinfiser lokkene og R.MIW ved å senke ned i 80% etanol i minst 30 minutter i en lukket Petri-tallerken.
    MERK: Ikke la dekslene være lengre enn 1 time i 80 % etanol for å unngå oppløsning av cyanoacrylatlimlimet.
  5. Fjern overflødig cyanoacrylat lim fra glassdekslene ved å bruke en bomullsspiss gjennomvåt i aceton.
  6. Oppbevar lokkene og R.MIW i sterile omgivelser inntil videre bruk.
    MERK: R.MIW-rammen og lokkene kan oppbevares i et sterilt rør eller en pose i maksimalt 1 uke. Når du gjenopptar eksperimentet, må du alltid undersøke om glassdekslene fortsatt er ordentlig festet til lokket før du fortsetter med protokollen.

2. Forberedelse for kirurgi (estimert timing: 15 min)

MERK: For R.MIW-implantasjonsprosedyren kan hunnmus (>3,5 uker gammel) av enhver stamme brukes.

  1. Oppretthold steriliteten ved å bruke sterile hansker, og steriliser alle gjenstander som kommer i kontakt med musen. Vask kirurgiske verktøy med vann og mild såpe, lufttørk, pakk inn aluminiumsfolie uten eksponerte hjørner eller kanter, og steriliser ved hjelp av en autoklav i en syklus på 20 min ved 120 °C før operasjonen.
  2. Forbered en steril kirurgisk plattform og steriliser overflatene med 80% etanol.
    MERK: For å sikre sterilitet kan operasjonen utføres i et strømningsskap.
  3. Slå på varmeputen og dekk matten med en steril gardin. Legg de sterile instrumentene på den sterile gardinen og plasser R.MIW og minst to glassdekte lokk i steril fosfatbufret saltvann (PBS) i en Petri-tallerken (lukk lokket for å unngå ekstern forurensning).
  4. Bedøv musen i et induksjonskammer ved hjelp av en 3% isofluran / O2-blanding . Forsikre deg om at dyret er avslappet nok til å bli lett manipulert og overført til nesemasken uten kamp.
  5. Overfør musen fra induksjonskammeret til en anestesi nesemaske og reduser isoflurannivået til 1,5% - 2% isofluran / O2 blanding. Bekreft full anestesi ved å utføre en poteuttakstest.
  6. For å utføre poteuttakstesten, klem fast dyrepoten ved hjelp av negler eller stumpe ende tang. I fravær av muskel refleks, anser dyret som bevisstløs og fortsett for kirurgisk forberedelse. Utfør denne testen før dyremanipulering og gjenta regelmessig under bedøvelses- og kirurgiske prosedyrer for å bekrefte anestesi.
  7. Påfør øyesalve for å forhindre hornhinnedehydrering.
  8. Barber området rundtden fjerde brystkjertelen ved hjelp av et barberblad (figur 2A). Bruk denfjerde brystvorten som et landemerke. Fjern løse hår ved hjelp av klebrig tape.
    MERK: Alternativt kan depilatorisk krem brukes til å fjerne hårene.
  9. Desinfiser den eksponerte huden med 80% etanol eller povidon-jod og plasser musen i det sterile kirurgiske området på ryggen med snuten i en anestesi nesemaske ved hjelp av 1,5% isofluran / O2 blanding.
  10. Fest musens frem- og bakre lemmer ved hjelp av papirbånd.
    MERK: La den bedøvede og gjenopprettende musen stå på varmeputen så mye som mulig, under og etter operasjonen.
  11. Bruk en precut steril kirurgisk gardin eller gasbind for å dekke musen mens du forlater det kirurgiske området utsatt.

3. R.MIW implantasjon (estimert timing: 30 min)

  1. Kontroller om dyret er tilstrekkelig bedøvet ved å utføre en poteuttakstest. Løft huden forsiktig med en fin Graefe tang og lag et 10-15 mm diagonalt snitt ved hjelp av små vårsaks i huden på toppen av denfjerde mammaryfettputen ved hjelp av denfjerde brystvorten som orienteringspunkt (figur 2A). Pass på at du ikke kutter eller skader bukhinnen eller brystkjertelen.
  2. Definer interesseområdet (ROI) basert på makroskopiske egenskaper i pattedyrvevet, inkludert plasseringen av lymfeknuten eller en tumorlesjon, og prøv å holde avkastningen sentral med hensyn til snittet.
  3. Skill huden fra mammaryfettputen og underliggende vevslag ved hjelp av stump disseksjon på opptil 5-8 mm rundt snittlinjen for å lage en lomme som passer til R.MIW-rammen (figur 2BI).
  4. Plukk opp R.MIW ved hjelp av sterile tang og test om snittet er stort nok til å sette inn vinduet. Om nødvendig, forstørr snittet litt til R.MIW passer inn.
  5. Fjern R.MIW og legg en veskestreng sutur rundt snittet ved hjelp av en 5-0 silke sutur (flettet, ikke-resorberbar). Plasser suturen 1-2 mm fra kanten av snittet fra utsiden til innsiden av huden, fra den kaudale enden av snittet.
  6. Beveg ca. 5 mm opp langs snittet og før suturtråden gjennom huden fra innsiden til utsiden. Gjenta denne prosedyren langs kanten av snittet, og opprett dermed en sirkulær sutur som består av 5-6 løkker (figur 2BII). Den endelige utgangen av suturtråden skal være plassert ca. 2-5 mm fra den første inngangen.
    MERK: Pass på at du ikke plasserer suturen for nær kanten av snittet, da dette øker risikoen for hudtåre. Å plassere suturen for langt fra kanten av snittet øker risikoen for infeksjon mellom overflødig hud og sporet av R.MIW.
  7. Monter R.MIW inne i snittet og bruk Graefe tang for å forsiktig plassere huden i sporet av R.MIW. Pass på å la suturens løkker stå utenfor.
  8. Trekk i løkkene på veskestrengsugingen og stram suturen i sporet på R.MIW ved å trekke forsiktig i begge ender av suturen (figur 2BIII). Bind av med kirurgiske knuter og kutt bort overflødig tråd.
  9. Påfør petroleumjell på den indre kanten av R.MIW ved hjelp av en tannpirker, samtidig som du sørger for å unngå det underliggende vevet. Skyv vindusrammen forsiktig nedover med sterile tang eller to fingertupper, og plasser lokket i R.MIW-rammen (figur 1B). Dette vil unngå et volum luft mellom brystkjertelvevet og R.MIW-lokket.
  10. Plasser spissene på tynne tang gjennom hullene i lokkets armer og stram lokket ved å vri lokket med klokken (ca. 5°) (figur 1C og figur 2BIV).
  11. Hvis det gjenstår noe luft etter at du har strammet R.MIW-lokket, bruker du en steril insulinnål til å fjerne overflødig luft. Introduser nålen gjennom huden i hulrommet mellom brystvevet og lokket og trekk stempelet sakte ut, og dermed skape et vakuum mellom brystkjertelvevet og R.MIW-lokket.
  12. Administrer, etter operasjonen, analgesi som buprenorfin (0,1 mg/kg fortynnet i steril 0,9% NaCl) ved subkutan injeksjon. Gjenta subkutan injeksjon med buprenorfin ved 8 timer og 16 timer etter operasjonen.
  13. Sett musen tilbake i buret for å gjenopprette og overvåke nøye til den er helt våken, eller fortsett med trinn 4 for umiddelbar avbildning.
  14. På dette postkirurgiske stadiet, overvåke musene nøye for tegn på ubehag eller komplikasjoner basert på vitale parametere, for eksempel åndedrett, reaktivitet, oppførsel, holdning og kroppsvekt. Overvåk huden rundt vinduet nøye for tegn på betennelse og nekrose. Hvis det ikke oppstår komplikasjoner, vil R.MIW tillate gjentatte IVM-økter over flere uker etter implantasjon.

Figure 2
Figur 2: Oversikt over kirurgisk prosedyre og vindusimplantasjon. (A) Et diagonalt snitt gjøres nær denfjerde brystvorten til en kvinnelig mus, og huden og underliggende vev kobles fra av stump disseksjon. (B) Den inguinale lymfeknuten og formen på fettputen kan brukes til riktig orientering av vevet (I). En veskestreng sutur er plassert i huden rundt snittet (II), og etter montering i vindusrammen strammes suturen i sporet for å sikre vindusrammen, og sikres med kirurgiske knuter (III). Det siste trinnet er innsetting og låsing av lokket i vindusrammen (IV). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

4. Gjentatt intravital mikroskopi gjennom R.MIW

MERK: Den gjentatte IVM-strategien som er beskrevet her, ble optimalisert for et invertert multifoton konfokalt system utstyrt med et motorisert stadium og et mørkt klimakammer ved 35,8 °C.

  1. Bedøv musen i et induksjonskammer ved hjelp av en 3% isofluran / O2-blanding . Verifiser bevissthetstap ved å utføre en poteuttakstest (beskrevet i trinn 2.6). Påfør øyesalve for å forhindre hornhinnedehydrering under bildebehandlingsøkten.
  2. Kontroller tilstanden til R.MIW-rammen og lokket, inkludert stabiliteten til suturene eller potensiell skade på lokket. Ved skade på lokket kan lokket skiftes ut som beskrevet i trinn 5.
  3. Overfør musen til en forvarmet (37 °C), spesiallaget bildeboks (figur 3A) og plasser musen med hodet inn i nesekjeglen. Bildeboksen består av en ramme som passer innenfor mikroskopets automatiserte stadium. Rammen er designet for å holde et skreddersydd innlegg med et hull diameteren på R.MIW (figur 3A) .
  4. Et innløp med nesekjegle er koblet til forsiden av esken og festet til en isofluran fordamperstasjon ved hjelp av 2% -3% isofluran / O2-blanding. Et uttak er koblet til en bedøvelsesenhet for å sikre sirkulasjon og for å forhindre opphopning av isofluran i esken. Bildeboksen kan lukkes med et gjennomsiktig lokk.
  5. Plasser musen på innlegget slik at R.MIW faller i hullet på bildeboksinnlegget (figur 3A). Påfør parafilm og papirbånd over baksiden av musen for å stabilisere musen og redusere vevsbevegelsen på grunn av åndedrett.
  6. Lukk bildeboksen med lokket og sett inn bildeboksen i mikroskopets stadium.
  7. Reduser isoflurandosen gradvis i løpet av bildebehandlingsøkten for å opprettholde en stabil, men overfladisk anestesi (vanligvis mellom 1,5% -0,8% isofluran / O2-blanding ).
  8. Gi riktig ernæring under avbildning som beskrevet nedenfor.
    1. For bildebehandlingsøkter <3 h, injiser musen subkutant med 200-300 μL steril PBS for hydrering.
    2. Følg fremgangsmåten nedenfor for bildebehandlingsøkter >3 t.
      1. For langsiktig avbildning, tilsett musen med næringsstoffer. For dette, bruk en kommersielt tilgjengelig steril tilførende blanding som inneholder aminosyrer og glukose. Plasser en fleksibel nål subkutant i musens hals og fest den med papirbånd.
      2. Fest en 10 ml sprøyte med den tilberedte næringsblandingen til et fleksibelt silisiumrør og skyv næringsblandingen gjennom til den har nådd enden av røret.
      3. Koble silikonrøret til den fleksible nålen. Ta enden av slangen og plasser den gjennom et av hullene i bildeboksen (fra innsiden til utsiden, og la nålen feste siden i esken).
      4. Injiser 50 μL tilføre oppløsning hver 30.
  9. Sikre bildeboksen i mikroskopets stadium og definer interesseområdet ved hjelp av mikroskopets epifluorescensmodus.
  10. Bruk de ønskede mikroskopinnstillingene avhengig av musemodellen (figur 3B). Karstrukturer, kollagenmønstre (visualisert ved andre harmoniske generasjon) og andre stabile anatomiske strukturer, inkludert inguinal lymfeknute, kan brukes som landemerker. Skaff bilder ved hjelp av et invertert multifoton konfokalt mikroskop med en 12-biters dybde, og et 25x vannmål ved hjelp av en Z-trinns størrelse fra 1,0 til 4,0 μm (total z-stack fra 150 til 800 μm). Bruk følgende standardinnstillinger: 1024 x 1024-format, 600 Hz skannehastighet, toveis modus.
  11. Visualiser kollagen I-fibre ved å utføre andre harmoniske generasjon ved å bruke en eksitasjonsbølgelengde på 860 nm og deteksjon ved 425-435 nm. Eksitasjons- og deteksjonsbølgelengder for de ulike fluoroforene er angitt i tabell 1.

Tabell 1. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

  1. Bruk Spiral-funksjonen i bildebehandlingsprogramvarenavigatormodus til å generere en stor oversiktsfliser som kan opprette et referansekart over vevet (figur 3B). Definer ROIene i spiraloversikten, definer de øvre og nedre Z-planene for å bestemme Z-stakken. Trykk på Start for å få detaljerte tredimensjonale (xyz) eller firedimensjonale Z-stabler (xyzt) av vevet.
    MERK: Under hele bildebehandlingseksperimentet skal musen overvåkes nøye. For lange bildebehandlingsøkter anbefales pulsoksymeter og temperatursonde. Musens pust skal være vanlig og i samme tempo. Hvis musen begynner å vise tegn på gisping, bør mengden isofluran reduseres.
  2. På slutten av hver bildeøkt holder du musen på en varmepute til den er helt våken. Hvis musen viser tegn på ubehag eller redusert mobilitet, hold buret i lengre tid på varmeputen og gi næringsgeler i stedet for vanlig chow.
    MERK: Mellom bildebehandlingsøkter bør musen overvåkes nøye for tegn på ubehag som redusert mat- og vannforbruk, rask pusting, redusert bevegelse, skjelving, unormal kroppsstilling eller ubelagt pels. Ved klare tegn på ubehag, følg institusjonelle retningslinjer for dyrevelferd og avslutt eksperimentet når det humane endepunktet nås.
  3. Gjenta trinn 4.1-4.12 for hver gjentatte bildeøkt, og bruk oversiktsflisene til å gå tilbake til samme posisjon(er) over flere tidspunkter (figur 3B). Bildefrekvensen vil avhenge av problemstillingen og tidspunktet for den studerte prosessen, og varierer vanligvis fra bildebehandlingsøkter to ganger om dagen til en gang i uken.
  4. På slutten av ønsket eksperimentell periode, euthanize dyrene med en implantert R.MIW ved hjelp av dyp anestesi med isofluran etterfulgt av cervical dislokasjon. Disseker om ønskelig interesseorganene for ytterligere ex vivo-analyser .
  5. Alternativt kan du holde dyret i live for fremtidige in vivo-analyser . I så fall fjerner du posens sutur som holder R.MIW ved å kutte den med vårsaks og forsiktig løsne vindusringen fra musehuden ved hjelp av stumpe tang. Rydd opp kantene på huden som tidligere holdt vinduet og fortsett med en enkel kontinuerlig sutur (absorberbart materiale, for eksempel polyglykolsyre).
  6. Når huden er lukket, knytter du start- og sluttsugetrådene med to firkantede knuter (4 kaster). For å minimere vevs iskemi, bør knutene være løse nok til å tillate blodstrøm ved hudkanten. Desinfiser såret med povidon-jod for å forhindre betennelse og for å fremme helbredelse av huden.

Figure 3
Figur 3: Longitudinal IVM-arbeidsflyt. (A) Skjematisk skildring av et typisk flerdagers IVM-eksperiment. (B) Avbildning av en tumorigrisk region i den voksne brystkjertelen. Før hver bildeøkt kan en oversiktsfliser med lav oppløsning (topppanel) gjøre det enklere å identifisere området(e) av interesse i forhold til påfølgende bildedager. Kollagen I-mønsteret (andre harmoniske generasjon, magenta), vevsstruktur og mønstre av differensialt merkede celler med fluorescerende proteiner (avbildet i grønt, gult og rødt) kan brukes til å spore det samme vevsområdet. Skalastenger representerer 1 mm (oversiktsfliser) og 100 μm (bunnpaneler). (C) Skjematisk representasjon av R26-Confetti reporter konstruksjon. Ved tamoxifen-indusert Cre-rekombinasjon rekombinerer Konfettien stokastisk, noe som resulterer i uttrykk for en av de fire fluoroforene (nGFP, YFP, RFP eller mCFP). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

5. Åpne og lukke lokket på R.MIW mellom bildebehandlingsøkter

  1. Oppretthold steriliteten ved å bruke sterile hansker, og steriliser alle gjenstander som kommer i kontakt med musen. Autoklaver kirurgiske verktøy før operasjonen (se trinn 2 for detaljer).
  2. Slå på varmeputen og dekk matten med en steril gardin og bedøv musen i et induksjonskammer ved hjelp av en 3% isofluran / O2-blanding . Kontroller tilstrekkelig anestesi ved å utføre en paw abstinens reflekstest.
  3. Overfør musen fra induksjonskammeret til en anestesi nesemaske og reduser isoflurannivået til 1,5% -2% isofluran / O2-blanding .
  4. Plasser spissene på tynne tang gjennom hullene i lokkets armer og løsne lokket ved å vri lokket mot klokken. Bruk eventuelt litt forvarmet steril PBS (37 °C) på vinduet for å lette løsningen av lokket.
  5. Sett lokket på R.MIW i en steril tallerken med steril PBS til videre bruk. Rengjør lokkets dekselglass med demi-vann og deretter 80% etanol. Oppbevar lokket i steril PBS inntil videre bruk.
  6. Forhindre at det eksponerte vevet tørker ut ved å tilsette noen dråper steril PBS til vevsoverflaten.
  7. Påfør eller injiser noe stoff eller celler av interesse på det eksponerte vevet, et maksimalt volum på 50 μL kan brukes. Vent noen minutter til væsken absorberes av vevet. Alternativt kan vevet manipuleres eller omplasseres ved hjelp av sterile, stumpe tang for å optimalisere bildeforholdene for spesifikke ROIer.
  8. Påfør petroleumjell på den indre kanten av R.MIW, sørg for å unngå det underliggende vevet. Plasser lokket i R.MIW-rammen som beskrevet i trinn 3.9, plasser spissene på tynne tang gjennom hullene i lokkets armer, og stram lokket ved å vri lokket med klokken (ca. 5°).

Representative Results

For å studere den proliferative dynamikken i pattedyr epitelceller under de forskjellige utviklingsstadiene av brystkjertelen ble den beskrevne protokollen utført. Utformingen av R.MIW er avbildet i figur 1, og prosedyren for å implantere en R.MIW er oppsummert i figur 2. R.MIW er kirurgisk implantert mellom brystkjertelen og huden. En sutur brukes til å holde i vindusringen og forhindre at musene trekker på suturene (figur 2). Suturene som holder R.MIW er laget av ikke-absorberbar silke, som har hypoallergene egenskaper, en myk tekstur og er lett å håndtere. R.MIW-ringen er laget av titan, et av de mest biokompatible materialene som ikke fremmer betennelse eller nekrose etter implantasjon21. Hvis de aseptiske forholdene følges og suturene er godt utført, utgjør R.MIW brystkjertelimplantasjon en lav risiko for postoperative komplikasjoner. Dessuten, i motsetning til abdominal bildevindu implantasjon22, R.MIW implantasjon er ikke en begrensende faktor for musen overlevelse fordi brystkjertelen er ikke et viktig organ og tillater daglig bildebehandling opp til grensen angitt i etisk protokoll. Den eneste faktoren som begrenser varigheten av vindusimplantasjon er den homeostatiske omsetningen av huden, noe som til slutt vil føre til at suturene faller ut etter 4 - 6 uker. Derfor er det viktig å regelmessig inspisere stabiliteten til suturene. Om ønskelig kan suturene fjernes og erstattes av en ny veskestrengsuging under aseptiske forhold (som beskrevet i trinn 3.5 - 3.8) for å berolige vindusstabiliteten.

En stor utfordring ved bruk av flerdagers bildebehandling er å gå tilbake til en avkastning på påfølgende dager. For dette formål kan en rask oversiktsskanning inkluderes før du velger avkastningen(e) (figur 3B). Flere vevslandemerker kan brukes til å spore samme område av vevet, inkludert kollagennettverkssignalet (visualisert ved andre harmoniske generasjon), vevsstruktur, samt lokale mønstre av celler differensielt eller stokastisk merket med fargestoffer eller fluorescerende proteiner (figur 3B). I dette representative eksemplet ble en R.MIW implantert på den fjerde brystkjertelen til en MMTV-PyMT; R26-CreERT2het; R26-Konfettihet kvinnelig mus ved utbruddet av håndgripelig tumordannelse. Deretter ble stokastisk rekombinasjon indusert ved injeksjon av 1,5 mg tamoksifen, noe som resulterte i rekombinasjon av Konfetti-konstruksjonen i noen celler (figur 3C). De rekombinerte tumorcellene ble fulgt i en periode på 20 dager (figur 3B, C). Hvis avbildning av samme region i brystkjertelen over påfølgende dager er utelukket, kan vinduet åpnes i et aseptisk miljø (som beskrevet i trinn 5.1) for å rydde opp ytterligere, og omplassere vevet for å forbedre synligheten og bildeanskaffelsen (figur 3A).

Ved hjelp av denne metoden ble den utviklende brystkjertelen under puberteten fulgt på encellet nivå. Gjentatt IVM gjennom en R.MIW ble utført ved hjelp av R26-CreERT2het; R26-mTmGhet kvinnelige mus mellom 4-6 uker, hvor alle celler er merket med membran tdTomato (Figur 4A)23. Mus ble injisert med en lav dose tamoksifen (0,2 mg/25 g kroppsvekt), noe som resulterte i sporadisk rekombinasjon av mTmG-konstruksjonen, noe som førte til en endring fra rødt til grønt i noen celler i alle vev, inkludert brystkjertelen (figur 4B). De samme ROIene ble revidert over flere dager for å visualisere morfologiske endringer i brystkjertelen, inkludert kanalforlengelse og kanalforgrening (figur 4C) med cellulær oppløsning. Det er viktig at denne kombinasjonen av stokastisk cellemerking og flerdagers IVM også gjør det mulig å visualisere de dynamiske endringene i kanalmiljøet, for eksempel dynamikken i enkeltceller i stromaen rundt de langstrakte og forgrenede kanalene (figur 4D) samt den cellulære dynamikken i den inguinale lymfeknuten (figur 4E).

Figure 4
Figur 4: Multi-day IVM av pubertal forgrening morphogenesis. (A) Pubertal R26-CreERT2; R26-mTmG-mus i alderen 4-6 uker ble injisert med en lav dose tamoksifen som førte til Cre-mediert rekombinasjon av R26-mTmG-allelen og ble avbildet på dag 1, 3 og 5 for å følge de dynamiske endringene i utviklende brystkjertel. (B) Skjematisk representasjon av R26-mTmG-musekonstruksjonen , som under ikke-rekombinerte forhold resulterer i allestedsnærværende uttrykk for membran tdTomato (mT). Ved cre-mediert rekombinasjon byttes mT for membran eGFP (mG)-uttrykk. (C) 3D-gjengivelse av en langstrakt og forgrenende pattedyrkanal over flere dager avbildet gjennom en R.MIW i en R26-CreERT2; R26-mTmG kvinnelig mus ved 6 ukers alder. (D) Enkle Z-plane bilder av forgreningsspissen (topppanelene) og den forlengende grenen (bunnpaneler). mT er avbildet i rødt, og mG i cyan, skalastenger representerer 100 μm (A og B). Enkeltceller i stromaen er uthevet av hvite stjerner. Legg merke til at signalintensiteten ble manuelt økt for å markere enkeltcellene i stromaen, noe som førte til et litt overeksponert utseende av pattedyrets epitelceller. (E) Representative bilder av den inguinale lymfeknuten til en R26-CreERT2; R26-mTmG kvinnelig mus avbildet gjennom en R.MIW, som viser en oversikt fliser skanning (venstre panel), zoom bilder (høyre paneler) av en enkelt Z-plan (topp), og en 3D-gjengivelse (bunn). Andre harmoniske generasjon (kollagen I) vises i grønt, mT i rødt og mG i cyan. Skalalinjer representerer 500 μm (oversiktsfliser) og 100 μm (zoombilder). Figurpanelene C og D er modifisert fra Messal et al. 2. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

På samme måte, i den voksne brystkjertelen, tillater den foreslåtte R.MIW-tilnærmingen visualisering av de samme kanalstrukturene over flere dager med kompromissløs synlighet. Selv bruken av mindre lyse fluorescerende reportermodeller24, for eksempel Cdh1-mCFP (Ecadherin-mCFP) musemodell, tillater visualisering av kanalstabilitet og subtile morfologiske endringer med cellulær oppløsning (figur 5). Vær oppmerksom på at synligheten mellom dag 3 og dag 5 forbedret seg betydelig etter vevsplassering (figur 5).

Figure 5
Figur 5: Flerdagsavbildning av den voksne brystkjertelen. 3D-gjengitte bilder av en brystkanalstruktur av en voksen kvinne Cdh1-mCFP (cyan, som markerer Ecadherin-positive lyscelleuttrykk) musen over flere påfølgende dager. Kollagen I-mønsteret (andre harmoniske generasjon, magenta) ble brukt til å spore samme avkastning, og Cdh1-mCFP-signalet ble brukt til å markere kanalcellene (luminal). Vær oppmerksom på at synligheten etter dag 3 ble forbedret ved åpningen av R.MIW-lokket og omplassering av vevet. Skalastenger representerer 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

For å vurdere proliferativ heterogenitet av pattedyrets epitelceller under hormonsyklusen på encellet nivå, ble den fotokonvertible Kikume Green-Red (KikGR) reportermusmodellen25,26 brukt, som har allestedsnærværende uttrykk for KikGR-proteinet. KikGR er en lys fluorofor som gjennomgår grønn-til-rød konvertering ved eksponering for fiolett lys og det røde / grønne forholdet kan brukes som proxy for spredningsaktiviteten til en celle2 (figur 6A, B). Ved hjelp av R.MIW-tilnærmingen fulgte vi de samme cellene i kanaltreet i den voksne brystkjertelen over flere dager og fant tidligere uforutsett proliferativ heterogenitet gjennom kanaltreet (figur 6C). Høye og lave proliferative celler ble likt fordelt over de forskjellige konverterte områdene (figur 6C,D). Påfallende, på lokalt nivå, viste nærliggende celler store forskjeller i deres røde / grønne forhold (figur 6C,D). Kvantifisering av det røde/grønne forholdet mellom ulike celler (som proxy for deres proliferative aktivitet) 10 dager etter fotokonvertering, viste svært variable fortynningshastigheter for noen celler i samme kanalmiljø (figur 6E). Sammen avslører disse dataene en bemerkelsesverdig lokal proliferativ heterogenitet i den voksne brystkjertelen, og samtidig en global jevn omsetningsrate.

Figure 6
Figur 6: Langsgående IVM av proliferativ heterogenitet i voksenpattedyrkjertelen ved hjelp av KikGR-musemodellen. (A) KikGR-mus ble avbildet på dag 0 før og etter eksponering for fiolett lys. Bildebehandlingsøktene ble gjentatt på dag 2, 6 og 10 etter konvertering. (B) Skjematisk skildring av de hypotetiske resultatene ved fotokonvertering av KikGR-pattedyr epitelceller etter spredning (venstre panel) og ingen spredning (høyre panel) som en funksjon av tid. (C) Det samme området av brystkjertelen ble avbildet gjennom en R.MIW over en periode på 10 dager. Mindre regioner ble fotoomdannet på dag 0 og viser en lignende fortynningshastighet av Kikume rødt signal over tid, noe som indikerer en lik omsetningshastighet gjennom epitelet. (D) Zoombilder (enkelt Z-plan) av de angitte områdene i panel C viser proliferativ heterogenitet på cellenivå 6 og 10 dager etter fotokonvertering. Skalastolper representerer 100 μm (panel C) og 10 μm (panel D). (E) Kvantifisering av det røde/grønne forholdet mellom tilfeldig merkede celler (n = 48 celler) i tre foto-konverterte områder. Et høyt rødt/grønt forhold indikerer lav fortynningshastighet og lavproliferasjonsaktivitet, mens et lavt rødt/grønt forhold indikerer en høy fortynningshastighet og spredning. Figurpanelene C- E er modifisert fra Messal et al. 2. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Discussion

R.MIW tillater langsgående avbildning av den sunne og syke brystkjertelen i sitt opprinnelige og minimalt forstyrrede miljø og tillater gjentatt visualisering av brystkjertelen på ulike utviklingsstadier. R.MIW-designen gjør at vinduet kan åpnes når som helst under eksperimentet. Langsiktig visuell tilgang til vev av interesse kan hindres, for eksempel ved opphopning av celleavfall på dekslene. I slike tilfeller kan R.MIW åpnes før eller umiddelbart etter en bildeøkt for å tillate rengjøring av hele det synlige vevsområdet og lokket. Det avtakbare lokket tillater også manipulasjoner av vevet, samt lokal påføring av stoffer, for eksempel spesifikke hemmere og terapier, merking av fargestoffer eller spesifikke celletyper av interesse.

Denne metoden overvinner begrensningen av de tidligere beskrevne mammary hudklaffprosedyrene 4,7,8,13, som er begrenset til en bildeøkt, og kan visualisere prosesser som forgrening av morfogenese (figur 5), homeostatisk vevsomsetning (figur 6) eller tumorvekst på cellenivå (figur 3B ). Likevel tillater R.MIW samtidig lokal manipulering av vevet mellom bildebehandlingsøkter, som utgjør en stor ressurs for R.MIW sammenlignet med den tidligere publiserte MIW 3,18 og alle andre bildevinduer 20,22. Når du åpner R.MIW, er det viktig å opprettholde aseptiske forhold til enhver tid for å forhindre infeksjonskilde. Muligheten til å åpne R.MIW i et aseptisk miljø gjør det mulig å optimalisere bildeforholdene før hver bildeøkt, noe som i stor grad forbedrer langsiktig visuell tilgang til interessevevet. Spesielt i brystkjertelen, som er innebygd i en adipocyttrik stroma, er dette av stor verdi. Videre kan det utskiftbare lokket unikt muliggjøre lokal administrering av terapeutiske behandlinger, forskjellige celletyper, merking av fargestoffer, bildestyrt mikrodeseksjon eller annen lokal manipulering av vevet uten å måtte avslutte IVM-eksperimentet. For eksempel, for å studere tumorinitiering, kan spesifikke kreftcellepopulasjoner injiseres direkte i kanaltreet eller stroma på et bestemt IVM-tidspunkt og presist brystkjertelplassering, så lenge denne avkastningen er tilgjengelig gjennom R.MIW-ringen. For å studere tumorprogresjon kan spesifikke kreftcellepopulasjoner (på et bestemt sted, i et bestemt mikromiljø eller med en bestemt oppførsel) bli fotomerket under IVM-økten og deretter mikrodissert ved hjelp av et fluorescerende disseksjonsmikroskop etter åpningen av R.MIW. Isolerte celler kan viderebehandles for nedstrømsanalyser, for eksempel (encellet) mRNA-sekvensering. Ved å bruke denne tilnærmingen kan man koble in vivo-celleatferd til molekylære uttrykksprofiler. Fordelen med lokal legemiddeladministrasjon aktivert av R.MIW gjør at vevet kan avbildes før og direkte etter behandling. Intervallet som trengs for å fjerne musen fra bildeboksen og deretter utføre lokal legemiddeladministrasjon etter åpning av R.MIW-lokket, kan utføres på få minutter, noe som gjør det mulig å fange opp hurtigvirkende legemidler umiddelbart.

Vi viser at IVM av brystkjertelen gjennom R.MIW er kompatibel med mange forskjellige fluorescerende reportermusmodeller. Det fettrike miljøet er utfordrende å avbilde, og derfor anbefales bruk av lyse fluoroforer. Som vist her, kan imidlertid enda mindre lyse fluoroforer som mCFP visualiseres gjennom R.MIW under optimale bildeforhold. Uunngåelig vil fettputen utelukke avbildningen av de dypere kanalstrukturene, og begrense avbildningen til de mer overfladiske kanalene. Et oversiktsbilde med lav oppløsning ved starten av hvert IVM-eksperiment vil bidra til å identifisere de ductale strukturene av interesse som er tilstrekkelig overfladiske for høyoppløselig avbildning. Lokal vevsmanipulering, fjerning av bindevev eller reposisjonering av fettvevet etter åpning av R.MIW kan optimalisere IVM for spesifikke ROIer som er overlagt av fettvev. Dette er en viktig fordel i forhold til alle tidligere vindusdesign, som ikke tillater å utføre disse manipulasjonene og vil kreve fullstendig fjerning av selve vinduet. Spesielt for visualisering av den inguinale lymfeknuten, anbefales det å forsiktig fjerne det overdrevne fettvevet, noe som reduserer lysspredning og muliggjør høyoppløselig avbildning. Når du manipulerer vevet, må du alltid holde aseptiske forhold og forhindre blødning eller alvorlig skade på vevet, da de kan påvirke prosessene som studeres under IVM-eksperimentet.

R.MIW er laget av titan, et materiale som vanligvis brukes i klinisk praksis for å erstatte harde vev som ledd eller benplater. Titan har flere fordeler i forhold til stålvinduer, inkludert den lette og inerte karakteren21. Nylig ble flere andre materialer brukt til å generere nye bildevindustyper, inkludert det fleksible silisiumvinduet20. I motsetning til R.MIW krever det fleksible vinduet ingen suturer for implantasjon og er egnet for nesten enhver anatomisk posisjon, spesielt når det gjelder mykt og skjøre vev. Silisiumvinduer har minimal innvirkning på dyremotiliteten på grunn av deres lette og deformerbare natur og kanskje mer egnet i eksperimenter som studerer rask vevsutvidelse og vekst20. En annen fordel i forhold til titanversjonen er at silisiumvinduer er kompatible med andre bildemodaliteter, inkludert magnetisk resonansavbildning20,27. Det vil imidlertid være viktig å huske på at målene er optimalisert for 0,17 mm glassdeksler. Videre er pattedyrvev utsatt for pustebevegelser, som er vanskelig å begrense ved hjelp av det fleksible vinduet, spesielt når du bruker et invertert mikroskop. Pusteartefakter minimeres av R.MIW-designen og fikseringen av R.MIW i avbildningsboksens innlegg. Som et resultat er bilder som er anskaffet ved hjelp av det foreslåtte R.MIW-oppsettet, ikke forvrengt på grunn av pusteartefakter. Imidlertid kan mindre operasjoner i vev lokalisering oppstå, som vanligvis er gradvise og kan korrigeres ved hjelp av post-oppkjøp bevegelseskorrigering programvare28. Med den økende verktøykassen til IVM-teknologier 2,20, vil de spesifikke kravene for hvert eksperiment til slutt bestemme den beste måten å in vivo visualisering av vevet av interesse. Ulike vindusdesign har forskjellige fordeler og ulemper, og avhengig av forskningsspørsmålet, det tilgjengelige mikroskopioppsettet, den nødvendige romlige og tidsmessige oppløsningen, og den totale tidsperioden for den studerte prosessen, må den optimale tilnærmingen bestemmes.

Oppsummert letter R.MIW høyoppløselig karakterisering av cellulær dynamikk under brystkjertelutvikling, homeostase og sykdom over flere dager til uker.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av Forskningsstiftelsen Flandern (PhD grant fundamental research 11L7222N to M.C.), Boehringer Ingelheim Foundation (PhD Fellowship to C.L.G.J.S), et EMBO postdoktorstipend (stipend ALTF 1035-2020 til C.L.G.J.S.), og Doctor Josef Steiner Award (til J.v.R.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.9% NaCl BD 306573 Other brands available
10 mm round coverglass Fisher scientific 10696365 Other brands available
5-0 braided silk suturs Ethicon W580
80% Ethanol homemade NA
Anesthesia induction box Kentscientific VetFlo-MSEKIT
Buprenorphine (Vetergesic®) Ecuphar NA
Cotton tips (sterile) Fisher scientific 13113743 Other brands available
Cyanoacrylate adhesive Loctite NA Other brands available
Eye ointment Duratears NA
Flexible butterfly needle Greiner Bio-One 450120 Other brands available
Graefe forceps (blunt) Fine Science Tools 11051-10
Heating pad Kentscientific RightTemp Jr. Other brands available
Imaging box Custom made NA
Infuse nutrient mixture Braun Nutriflex special 70/240
Insulin syringes BD 324911 Other brands available
Inverted multi-photon microscope with automated stage Leica Microsystems NA
Isoflurane vaporizer Kentscientific VetFlo-1231K
Needle holder Fine Science Tools 12510-14
Parafilm Sigma-Aldrich P7793 semi-transparent tape
Paper tape tesa Tesa NA
Petroleum Jelly Vaseline NA
Razor blades Fisher scientific 11904325 Other brands available
Silicon tubing Solutions Elastomeres NA Any houseware
Spring scissors (small) Fine Science Tools 15018-10
Sterile PBS ThermoFisher Scientific 10010023
Syringe (10 ml) BD 305482 Other brands available
Thin forceps Fine Science Tools 11413-11
Titanium lid for mammary imaging window Custom made NA
Titanium mammary imaging window Custom made NA
Wooden sticks toothpicks Fisher scientific NC1678836 Other brands available

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Watson, C. J., Khaled, W. T. Mammary development in the embryo and adult: new insights into the journey of morphogenesis and commitment. Development. 147 (22), Cambridge, England. (2020).
  2. Messal, H. A., van Rheenen, J., Scheele, C. L. G. J. An Intravital Microscopy Toolbox to Study Mammary Gland Dynamics from Cellular Level to Organ Scale. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 26 (1), 9-27 (2021).
  3. Kedrin, D., et al. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nature Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).
  4. Dawson, C. A., Mueller, S. N., Lindeman, G. J., Rios, A. C., Visvader, J. E. Intravital microscopy of dynamic single-cell behavior in mouse mammary tissue. Nature Protocols. 16 (4), 1907-1935 (2021).
  5. Scheele, C. L., et al. Identity and dynamics of mammary stem cells during branching morphogenesis. Nature. 542 (7641), 313-317 (2017).
  6. Kotsuma, M., et al. Nondestructive, serial in vivo imaging of a tissue-flap using a tissue adhesion barrier. IntraVital. 1 (1), 69-76 (2012).
  7. Ingman, W. V., Wyckoff, J., Gouon-Evans, V., Condeelis, J., Pollard, J. W. Macrophages promote collagen fibrillogenesis around terminal end buds of the developing mammary gland. Developmental Dynamics: an official publication of the American Association of Anatomists. 235 (12), 3222-3229 (2006).
  8. Entenberg, D., et al. large-volume, high-resolution intravital imaging for tissue-wide analysis of single cell dynamics. Methods (San Diego, Calif). 128, 65-77 (2017).
  9. Masedunskas, A., Weigert, R., Mather, I. H. Intravital Imaging of the Lactating Mammary Gland in Transgenic Mice Expressing Fluorescent Proteins. Advances in Intravital Microscopy. , Springer. Netherlands. 187-204 (2014).
  10. Masedunskas, A., Chen, Y., Stussman, R., Weigert, R., Mather, I. H. Kinetics of milk lipid droplet transport, growth, and secretion revealed by intravital imaging: lipid droplet release is intermittently stimulated by oxytocin. Molecular Biology of the Cell. 28 (7), 935-946 (2017).
  11. Mather, I. H., Masedunskas, A., Chen, Y., Weigert, R. Symposium review: Intravital imaging of the lactating mammary gland in live mice reveals novel aspects of milk-lipid secretion. Journal of Dairy Science. 102 (3), 2760-2782 (2019).
  12. Stevenson, A. J., et al. Multiscale imaging of basal cell dynamics in the functionally mature mammary gland. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (43), 26822-26832 (2020).
  13. Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Preparation of Mice for Long-Term Intravital Imaging of the Mammary Gland. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5562 (2011).
  14. Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of Vital Signs for Long-Term Survival of Mice under Anesthesia. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5563 (2011).
  15. Harney, A. S., Wang, Y., Condeelis, J. S., Entenberg, D. Extended Time-lapse Intravital Imaging of Real-time Multicellular Dynamics in the Tumor Microenvironment. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (112), e54042 (2016).
  16. Harper, K. L., et al. Mechanism of early dissemination and metastasis in Her2+ mammary cancer. Nature. 540 (7634), 588-592 (2016).
  17. Sobolik, T., et al. Development of novel murine mammary imaging windows to examine wound healing effects on leukocyte trafficking in mammary tumors with intravital imaging. IntraVital. 5 (1), 1125562 (2016).
  18. Shan, S., Sorg, B., Dewhirst, M. W. A novel rodent mammary window of orthotopic breast cancer for intravital microscopy. Microvascular Research. 65 (2), 109-117 (2003).
  19. Zomer, A., et al. Intravital imaging of cancer stem cell plasticity in mammary tumors. Stem Cells. 31 (3), 602-606 (2013).
  20. Jacquemin, G., et al. Longitudinal high-resolution imaging through a flexible intravital imaging window. Science Advances. 7 (25), (2021).
  21. Niinomi, M. Recent research and development in titanium alloys for biomedical applications and healthcare goods. Science and Technology of Advanced Materials. 4 (5), 445-454 (2003).
  22. Ritsma, L., et al. Surgical implantation of an abdominal imaging window for intravital microscopy. Nature Protocols. 8 (3), 583-594 (2013).
  23. Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, N., Luo, L. A global double-fluorescent cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), New York, N.Y. 593-605 (2007).
  24. Snippert, H. J., et al. Intestinal Crypt Homeostasis Results from Neutral Competition between Symmetrically Dividing Lgr5 Stem Cells. Cell. 143 (1), 134-144 (2010).
  25. Nowotschin, S., Hadjantonakis, A. K. Use of KikGR a photoconvertible green-to-red fluorescent protein for cell labeling and lineage analysis in ES cells and mouse embryos. BMC Developmental Biology. 9, 49 (2009).
  26. Kurotaki, Y., Hatta, K., Nakao, K., Nabeshima, Y. I., Fujimori, T. Blastocyst Axis Is Specified Independently of Early Cell Lineage But Aligns with the ZP Shape. Science. 316 (5825), New York, N.Y. 719-723 (2007).
  27. Heo, C., et al. A soft, transparent, freely accessible cranial window for chronic imaging and electrophysiology. Scientific Reports. 6, 27818 (2016).
  28. Warren, S. C., et al. Removing physiological motion from Intravital and clinical functional imaging data. eLife. 7, 35800 (2018).

Tags

Biologi utgave 179
Langsgående intravital mikroskopi ved hjelp av et mammary imaging vindu med utskiftbart lokk
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mourao, L., Ciwinska, M., van… More

Mourao, L., Ciwinska, M., van Rheenen, J., Scheele, C. L. G. J. Longitudinal Intravital Microscopy Using a Mammary Imaging Window with Replaceable Lid. J. Vis. Exp. (179), e63326, doi:10.3791/63326 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter