Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Değiştirilebilir Kapaklı Meme Görüntüleme Penceresi Kullanarak Boyuna İntravital Mikroskopi

Published: January 20, 2022 doi: 10.3791/63326
Automatic Translation
1,2, 1,2, 3, 1,2
1Center for Cancer Biology, VIB (BE), 2Department of Oncology, KU Leuven (BE), 3Netherlands Cancer Institute, Department of Molecular Pathology, Oncode Institute (NL)

Summary

Bu protokol, değiştirilebilir kapaklı (R.MIW) yeni bir meme görüntüleme penceresini tanımlar. R.MIW'nin implantasyonundan sonra intravital mikroskopi, farklı gelişim aşamalarında sağlıklı ve hastalıklı meme bezinin hücresel çözünürlükle uzunlamasına ve çok günlük görüntülenmesini sağlar.

Abstract

Meme bezinin dallanmış yapısı oldukça dinamiktir ve doğumdan sonra birkaç büyüme ve yeniden yapılanma aşamasına uğrar. İntravital mikroskopi, cilt flebi cerrahisi veya görüntüleme pencerelerinin implantasyonu ile kombinasyon halinde, farklı gelişim aşamalarında sağlıklı meme bezinin dinamiklerini incelemek için kullanılmıştır. Çoğu meme görüntüleme teknolojisi, saatler ila günler arasında bir zaman dilimi ile sınırlıdır, oysa meme bezi yeniden şekillendirme süreçlerinin çoğu, günlerden haftalara kadar olan zaman dilimlerinde gerçekleşir. Meme bezinin yeniden şekillenmesini incelemek için, uzun zaman dilimleri için ilgilenilen dokuya optik erişime izin veren yöntemler gereklidir. Burada, değiştirilebilir kapaklı (R.MIW) titanyum meme görüntüleme penceresinin, meme bezinin birkaç haftaya kadar hücresel çözünürlükte yüksek çözünürlüklü görüntülenmesini sağlayan geliştirilmiş bir versiyonu açıklanmaktadır. Önemli olarak, R.MIW, intravital görüntüleme deneyinin tüm süresi boyunca doku erişimi sağlar ve bu nedenle lokal doku manipülasyonu, etiketleme, ilaç uygulaması veya görüntü rehberliğinde mikrodiseksiyon için kullanılabilir. Birlikte ele alındığında, R.MIW, meme bezi gelişimi, homeostaz ve hastalık sırasında hücresel dinamiklerin yüksek çözünürlüklü karakterizasyonunu sağlar.

Introduction

Meme epiteli, memelilerde bulunan ve yavruları beslemek için süt üreten ve salgılayan eşsiz bir salgı organıdır. Yaşam boyunca, meme bezi, dokunun yapısal ve fonksiyonel değişikliklerinin eşlik ettiği çok sayıda gelişim ve büyüme turuna uğrar1. Gelişim aşamasına bağlı olarak, doku yeniden şekillenmesine katkıda bulunan hücre tipleri ve duktal ağaç içindeki konumu farklıdır.

Multifoton intravital mikroskopi (IVM), meme hücre dinamiklerinin in vivo olarak doğal ve minimal olarak bozulmuş 2,3,4 ayarında incelenmesine izin verir. Meme bezine görsel erişim sağlamak için, meme bezi gelişiminin farklı aşamalarında, ergenlik 4,5,6,7, yetişkinlik 2,8, laktasyon9,10,11,12 ve tümör dinamiği 13,14 dahil olmak üzere birkaç geçici ex vivo veya cilt flebi görüntüleme tekniği yayınlanmıştır. ,15. Bu teknikler meme hücre dinamiklerinin yüksek uzamsal ve zamansal olarak çözülmüş görüntülenmesine neden olsa da, zaman dilimi saatlerle sınırlıdır, oysa çoğu meme bezi yeniden şekillenme süreci günlerden haftalara kadar sürer. Bu nedenle, uzun zaman dilimleri için ilgilenilen dokuya optik erişime izin veren yöntemler gereklidir. Yıllar geçtikçe, bir titanyum meme görüntüleme penceresi (MIW) 2,3,19 dahil olmak üzere meme tümörü görüntüleme15,16,17,18 için birkaç kalıcı görüntüleme penceresi geliştirilmiştir. Meme tümörü büyümesini incelemek için çok yararlı olmasına rağmen, sağlıklı meme bezi yapısının görselleştirilmesi birkaç gün ile sınırlı kalmıştır. Son zamanlarda, pubertal meme bezinin20. haftada birkaç kez görselleştirilmesini sağlayan esnek bir silikon görüntüleme penceresi geliştirilmiştir. Bununla birlikte, meme bezi adiposit bakımından zengin bir yağ yastığına gömülüdür, bu da geniş ışık saçılmasına ve sonuç olarak meme duktal yapılarının sınırlı görünürlüğüne yol açar. Bu nedenle, meme bezinde uzun süre boyunca doku dinamiklerini görselleştirmek için her zaman üstün görüntüleme koşulları gereklidir. Ne klasik MIW ne de esnek silikon pencere, görüntüleme öncesi doku manipülasyonuna veya fiziksel doku konumunun optimizasyonuna izin vermez, çünkü pencere ameliyat ve implantasyondan sonra kapalı bir sistem oluşturur. Sonuç olarak, altta yatan meme dokusuna optimal optik erişimin daha uzun süreler boyunca engellenmesi muhtemeldir. Buna karşılık, cilt flebi tekniği, görüntüleme seansı sırasında dokunun optimizasyonuna ve yeniden konumlandırılmasına izin verir ve bir cilt flebi birden çok kez tekrarlanabilir2. Bununla birlikte, bir cilt flebi aracılığıyla tekrarlanan görüntüleme seansları, yalnızca cildin iyileşmesine izin vermek için ameliyatlar arasında yeterli zaman (en az 7 gün) ayrıldığında mümkündür ve bu nedenle çoğunlukla daha uzun zaman ölçeklerinde süreçleri incelemek için uygundur. Ayrıca, invaziv doğası ve büyük enfeksiyon riski ve yara kapandığında yara izi bırakması nedeniyle bu prosedürün birçok kez yapılmaması tavsiye edilir.

Bu sınırlamaların üstesinden gelmek, yani yüksek frekansta uzun bir süre boyunca optimal görüntüleme koşullarını sağlamak ve aynı zamanda doku manipülasyonuna izin vermek için, MIW'nin değiştirilebilir kapaklı (R.MIW) geliştirilmiş bir titanyum versiyonu, sağlıklı ve hastalıklı meme bezini birkaç gün ila2 . haftalar arasında görselleştirmek için tasarlanmıştır (Şekil 1A, B). R.MIW, IVM deneyinin tüm süresi boyunca doğrudan doku manipülasyonunu mümkün kılarak optimal doku erişimi sağlamak için özel olarak tasarlanmıştır ve böylece meme bezinin uzun süre boyunca doğru zamanda ve yerde görselleştirilmesine izin verir. Kapatıldığında, R.MIW klasik MIW ile karşılaştırılabilir hava geçirmez bir sistem oluşturur (Şekil 1C). Aseptik koşullar altında açıldığında, R.MIW, optik erişimi iyileştirmek için lokal doku manipülasyonuna izin verir ve ayrıca yol inhibitörleri veya agonistleri, kanser hücresi veya bağışıklık hücresi popülasyonları gibi farklı hücre tiplerinin enjeksiyonu veya doku etiketleme boyalarının eklenmesi gibi maddelerin lokal olarak uygulanmasını sağlar. Kapak, görüntüleme seansları arasında altta yatan dokuya zarar vermeden her an açılabilir.

Figure 1
Resim 1: Değiştirilebilir kapaklı meme görüntüleme penceresinin tasarımı. (A) Halkaya yapıştırılmış 10 mm'lik bir kapak camı ile meme görüntüleme penceresinin değiştirilebilir kapağının üstten görünümü ve yandan görünümü. (B) Bir çanta ipi dikişi kullanarak pencereyi farenin derisi içinde sabitlemek için aralarında bir oluk bulunan bir dış halka ve iç halkadan oluşan meme görüntüleme penceresinin üstten görünümü ve yandan görünümü. Dış bilezik, kapağın dört çıkıntısına (kollarına) uyan küçük bir oluğa sahiptir. (C) Kapağın açılma ve kapanma mekanizmalarını gösteren karikatür ve resimler. Eğimli çıkıntılar, kapağın pencere çerçevesinin içine sabitlendiğinden emin olur. Bu şekil Messal et al. 2. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Bu protokol, R.MIW'nin tasarım ve implantasyon prosedürünün yanı sıra aynı meme kanallarını tekrar ziyaret etmek ve hücresel çözünürlükte görselleştirmek için uzunlamasına bir IVM stratejisini açıklamaktadır. R.MIW, çeşitli floresan muhabir fare modellerinde meme bezinin farklı gelişimsel aşamalarında hücre bölünmelerini ve morfolojik değişiklikleri takip etmeyi sağlar. Birlikte ele alındığında, R.MIW, meme bezi gelişimi, homeostaz ve hastalık sırasında hücresel dinamiklerin yüksek çözünürlüklü karakterizasyonunu kolaylaştırır.

Protocol

Bu yazıda açıklanan tüm prosedürler IACUC ve KU Leuven kılavuzlarına uygun olarak gerçekleştirilmiş ve onaylanmış proje başvurusu P160/2020 kapsamında gerçekleştirilmiştir. Bu protokolü uygulamadan önce, lütfen analjezi stratejisini kurumsal veteriner hekim ile gözden geçirin ve ameliyat öncesi ve sonrası analjezi kurumsal kılavuzlara göre uygulayın.

1. R.MIW'nin hazırlanması (tahmini zamanlama: 2 saat)

NOT: R.MIW'nin yapımı için, titanyum gibi sert malzemelerle çalışma konusunda uzmanlaşmış yerel bir üretici bulmanız önerilir, çünkü bu özel aletler ve uzmanlık gerektirir. Titanyum protezlerin tasarımı ve üretiminde uzmanlaşmış atölyeler genellikle R.MIW parçalarını üretmek için makine ve uzmanlığa sahiptir.

  1. R.MIW'nin kapağını, kapağın dışı yukarı bakacak şekilde steril bir yüzeye yerleştirin (ve kapağın kolları aşağı doğru eğimlidir; Şekil 1A).
  2. Kapağın tüm kenarının etrafına siyanoakrilat yapışkan yapıştırıcı uygulayın ve kapağın üstüne dikkatlice 10 mm'lik yuvarlak bir cam kapak parçası yerleştirin.
    NOT: Cerrahi işlem sırasında her zaman yedek olarak cam kapaklı yedek bir kapak hazırlayın.
  3. Cam kapak kaymasını konumlandırmak için steril bir ahşap çubuk kullanın ve cam kapak kayması ile kapağın çerçevesi arasında hava geçirmez bir sızdırmazlık sağlamak için aşağı itmek üzere biraz kuvvet uygulayın. Kapağın kollarındaki deliklerin cam tarafından örtülmediğinden emin olun.
  4. Kapalı bir Petri kabında en az 30 dakika boyunca% 80 etanol içine batırarak kapakları ve R.MIW'yi dezenfekte edin.
    NOT: Siyanoakrilat yapışkan yapıştırıcının çözünmesini önlemek için kapakları% 80 etanolde 1 saatten daha uzun süre bırakmayın.
  5. Fazla siyanoakrilat yapışkan yapıştırıcıyı, asetona batırılmış bir pamuk ucu kullanarak cam kapak kapağından çıkarın.
  6. Kapakları ve R.MIW'yi daha fazla kullanana kadar steril bir ortamda saklayın.
    NOT: R.MIW çerçevesi ve kapakları steril bir tüp veya torbada en fazla 1 hafta saklanabilir. Deneye devam ederken, protokole devam etmeden önce cam kapak kaymasının hala kapağa düzgün bir şekilde takılıp takılmadığını daima inceleyin.

2. Ameliyat için hazırlık (tahmini zamanlama: 15 dk.)

NOT: R.MIW implantasyon prosedürü için, herhangi bir suşun dişi fareleri (>3.5 haftalık) kullanılabilir.

  1. Steril eldivenler kullanarak steriliteyi koruyun ve fareyle temas edecek tüm öğeleri sterilize edin. Cerrahi aletleri su ve yumuşak sabunla yıkayın, hava kurutun, kenarları veya kenarları açıkta kalmadan alüminyum folyoya sarın ve ameliyattan önce 120 ° C'de 20 dakikalık bir döngü boyunca bir otoklav kullanarak sterilize edin.
  2. Steril bir cerrahi platform hazırlayın ve% 80 etanol ile yüzeyleri sterilize edin.
    NOT: Steriliteyi sağlamak için, ameliyat bir akış kabininde gerçekleştirilebilir.
  3. Isıtma yastığını açın ve paspası steril bir örtü ile örtün. Steril aletleri steril örtü üzerine yerleştirin ve R.MIW'yi ve en az iki cam kaplı kapağı bir Petri kabında steril fosfat tamponlu salin (PBS) içine yerleştirin (dış kontaminasyonu önlemek için kapağı kapatın).
  4. Fareyi bir indüksiyon odasında% 3'lük bir izofluran /O2 karışımı kullanarak anestezi yapın. Hayvanın kolayca manipüle edilebilecek ve herhangi bir mücadele olmadan burun maskesine aktarılabilecek kadar rahat olduğundan emin olun.
  5. Fareyi indüksiyon odasından anestezi burun maskesine aktarın ve izofluran seviyesini% 1.5 -% 2 izofluran /O2 karışımına düşürün. Bir pençe yoksunluk testi yaparak tam anesteziyi doğrulayın.
  6. Pençe çekme testini gerçekleştirmek için, tırnaklarını veya künt uç forsepslerini kullanarak hayvan pençesini sıkıca sıkıştırın. Herhangi bir kas refleksinin yokluğunda, hayvanı bilinçsiz olarak düşünün ve cerrahi hazırlık için devam edin. Hayvan manipülasyonundan önce bu testi yapın ve anesteziyi doğrulamak için anestezik ve cerrahi prosedürler sırasında düzenli olarak tekrarlayın.
  7. Kornea dehidrasyonunu önlemek için göz merhemi uygulayın.
  8. 4. meme bezinin etrafındaki alanı tıraş bıçağı kullanarak tıraş edin (Şekil 2A). 4. memeucunu bir dönüm noktası olarak kullanın. Yapışkan bant kullanarak gevşek tüyleri çıkarın.
    NOT: Alternatif olarak, tüyleri çıkarmak için tüy dökücü krem kullanılabilir.
  9. Maruz kalan cildi% 80 etanol veya povidon-iyot ile dezenfekte edin ve fareyi% 1.5 izofluran /O2 karışımı kullanarak burun ile sırtındaki steril cerrahi bölgeye yerleştirin.
  10. Farenin ön ve arka bacaklarını kağıt bant kullanarak sabitleyin.
    NOT: Anestezi uygulanan ve iyileşen fareyi ameliyat sırasında ve sonrasında mümkün olduğunca ısıtma yastığı üzerinde bırakın.
  11. Ameliyat alanını açıkta bırakırken fareyi örtmek için önceden kesilmiş steril bir cerrahi örtü veya gazlı bez kullanın.

3. R.MIW implantasyonu (tahmini zamanlama: 30 dakika)

  1. Bir pençe çekme testi yaparak hayvanın yeterince uyuşturulup uyuşturulmadığını doğrulayın. İnce bir Graefe forseps kullanarak cildi nazikçe kaldırın ve 4. meme ucunu oryantasyon noktası olarak kullanarak 4. meme yağ yastığının üstündeki deride küçük yaylı makas kullanarak 10-15mm'lik diyagonal bir kesi yapın (Şekil 2A). Peritonu veya meme bezini kesmediğinizden veya zarar vermediğinizden emin olun.
  2. Lenf nodu veya tümör lezyonunun yeri de dahil olmak üzere meme dokusunun makroskopik özelliklerine dayanarak ilgilenilen bölgeyi (ROI) tanımlayın ve insizyon açısından ROI'yi merkezi tutmaya çalışın.
  3. R.MIW çerçevesine uyacak bir cep oluşturmak için insizyon çizgisinin her yerinde 5-8 mm'ye kadar künt diseksiyon kullanarak cildi meme yağ yastığından ve altta yatan doku katmanlarından ayırın (Şekil 2BI).
  4. Steril forseps kullanarak R.MIW'yi alın ve insizyonun pencereyi yerleştirecek kadar büyük olup olmadığını test edin. Gerekirse, R.MIW oturana kadar insizyonu hafifçe büyütün.
  5. R.MIW'yi çıkarın ve 5-0 ipek sütür (örgülü, emilemez) kullanarak insizyonun her tarafına bir çanta ipi dikişi yerleştirin. Dikişi, insizyonun kaudal ucundan başlayarak dışarıdan cildin içine doğru insizyonun kenarından 1-2 mm uzağa yerleştirin.
  6. Kesi boyunca yaklaşık 5 mm yukarı doğru hareket ettirin ve dikiş ipliğini deriden içeriden dışarıya doğru geçirin. Bu prosedürü insizyonun kenarı boyunca tekrarlayın, böylece 5-6 döngüden oluşan dairesel bir dikiş oluşturun (Şekil 2BII). Dikiş ipliğinin son çıkışı ilk girişten yaklaşık 2-5 mm uzağa yerleştirilmelidir.
    NOT: Dikişi insizyonun kenarına çok yakın yerleştirmemeye dikkat edin, çünkü bu cilt yırtılma riskini artırır. Dikişin insizyonun kenarından çok uzağa yerleştirilmesi, fazla deri ile R.MIW'nin oluğu arasındaki enfeksiyon riskini artırır.
  7. R.MIW'yi insizyonun içine yerleştirin ve cildi R.MIW'nin oluğuna dikkatlice yerleştirmek için Graefe forsepslerini kullanın. Dikişin halkalarını dışarıda bıraktığınızdan emin olun.
  8. Kese ipi sütürünün halkalarını çekin ve dikişin her iki ucuna hafifçe çekerek R.MIW'nin oluğundaki dikişi sıkın (Şekil 2BIII). Cerrahi düğümlerle bağlayın ve fazla ipliği kesin.
  9. Altta yatan dokudan kaçındığınızdan emin olurken, bir kürdan kullanarak R.MIW'nin iç kenarına petrol jölesi uygulayın. Steril forseps veya iki parmak ucuyla pencere çerçevesini yavaşça aşağı doğru itin ve kapağı R.MIW çerçevesine yerleştirin (Şekil 1B). Bu, meme bezi dokusu ile R.MIW kapağı arasında bir hava hacmini önleyecektir.
  10. İnce forseps uçlarını kapağın kollarındaki deliklerden geçirin ve kapağı saat yönünde (yaklaşık 5°) bükerek kapağı sıkın (Şekil 1C ve Şekil 2BIV).
  11. R.MIW kapağını sıktıktan sonra biraz hava kalırsa, fazla havayı gidermek için steril bir insülin iğnesi kullanın. İğneyi deriden meme dokusu ile kapak arasındaki boşluğa sokun ve pistonu yavaşça çekin, böylece meme bezi dokusu ile R.MIW kapağı arasında bir vakum oluşturun.
  12. Subkutan enjeksiyon ile buprenorfin (steril% 0.9 NaCl ile seyreltilmiş 0.1 mg / kg) gibi analjezi postpostandır. Ameliyattan sonra 8 saat ve 16 saatte buprenorfin ile deri altı enjeksiyonunu tekrarlayın.
  13. Tamamen uyanık olana kadar iyileşmek ve yakından izlemek için fareyi tekrar kafese koyun veya hemen görüntüleme için adım 4'e geçin.
  14. Bu ameliyat sonrası aşamada, fareleri solunum, reaktivite, davranış, duruş ve vücut ağırlığı gibi hayati parametrelere dayanan rahatsızlık belirtileri veya komplikasyonlar açısından yakından izleyin. Pencereyi çevreleyen cildi iltihaplanma ve nekroz belirtileri açısından dikkatlice izleyin. Herhangi bir komplikasyon meydana gelmezse, R.MIW, implantasyondan sonraki birkaç hafta boyunca tekrarlanan IVM seanslarına izin verecektir.

Figure 2
Şekil 2: Cerrahi prosedüre ve pencere implantasyonuna genel bakış . (A) Bir dişi farenin 4. meme ucunun yakınında diyagonal bir kesi yapılır ve künt diseksiyon ile deri ve altta yatan doku kesilir. (B) Kasık lenf nodu ve yağ yastığının şekli, dokunun doğru yönlendirilmesi için kullanılabilir (I). Kesinin etrafındaki cilde bir kese ipi sütürü yerleştirilir (II) ve pencere çerçevesine takıldıktan sonra, dikiş pencere çerçevesini sabitlemek için olukta sıkılır ve cerrahi düğümlerle (III) sabitlenir. Son adım, kapağın pencere çerçevesine (IV) yerleştirilmesi ve kilitlenmesidir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

4. R.MIW ile tekrarlanan intravital mikroskopi

NOT: Burada açıklanan tekrarlanan IVM stratejisi, motorlu bir sahne ve 35.8 ° C'de karanlık bir iklim odası ile donatılmış ters çevrilmiş bir çoklu foton konfokal sistemi için optimize edilmiştir.

  1. Fareyi bir indüksiyon odasında% 3'lük bir izofluran /O2 karışımı kullanarak anestezi yapın. Bir pençe yoksunluk testi yaparak bilinç kaybını doğrulayın (adım 2.6'da açıklanmıştır). Görüntüleme seansı sırasında kornea dehidrasyonunu önlemek için göz merhemi uygulayın.
  2. Dikişlerin stabilitesi veya kapaktaki olası hasarlar dahil olmak üzere R.MIW çerçevesinin ve kapağının durumunu kontrol edin. Kapağın hasar görmesi durumunda, kapak adım 5'te açıklandığı gibi değiştirilebilir.
  3. Fareyi önceden ısıtılmış (37 °C), özel yapım bir görüntüleme kutusuna (Şekil 3A) aktarın ve fareyi kafayla burun konisine yerleştirin. Görüntüleme kutusu, mikroskopun otomatik aşamasına uyan bir çerçeveden oluşur. Çerçeve, R.MIW çapında bir deliğe sahip özel yapım bir kakma tutacak şekilde tasarlanmıştır (Şekil 3A).
  4. Burun konisi olan bir giriş, kutunun önüne bağlanır ve% 2-3% izofluran /O2 karışımı kullanılarak bir izofluran buharlaştırıcı istasyonuna tutturulur. Dolaşımı sağlamak ve kutuda izofluran birikimini önlemek için anestezik bir süpürme ünitesine bir çıkış bağlanır. Görüntüleme kutusu şeffaf bir kapak kullanılarak kapatılabilir.
  5. Fareyi kakma üzerine, R.MIW görüntüleme kutusu kakma deliğine düşecek şekilde konumlandırın (Şekil 3A). Fareyi stabilize etmek ve solunum nedeniyle doku hareketini azaltmak için farenin arkasına parafilm ve kağıt bant uygulayın.
  6. Görüntüleme kutusunu kapakla kapatın ve görüntüleme kutusunu mikroskop aşamasına yerleştirin.
  7. Stabil, ancak yüzeysel bir anesteziyi sürdürmek için görüntüleme seansı boyunca izofluran dozunu kademeli olarak azaltın (tipik olarak% 1.5 -% 0.8 izofluran /O2 karışımı arasında).
  8. Aşağıda açıklandığı gibi görüntüleme sırasında doğru beslenmeyi sağlayın.
    1. 3 saat < görüntüleme seanslarında, hidrasyon için fareye deri altından 200-300 μL steril PBS enjekte edin.
    2. 3 saat > görüntüleme oturumları için aşağıda özetlenen adımları izleyin.
      1. Uzun süreli görüntüleme için, fareyi besinlerle aşılayın. Bunun için, amino asitler ve glikoz içeren ticari olarak temin edilebilen steril bir demleme karışımı kullanın. Esnek bir iğneyi farenin boynuna deri altından yerleştirin ve kağıt bantla sabitleyin.
      2. Hazırlanan besin karışımı ile 10 mL'lik bir şırıngayı esnek bir silikon tüpe takın ve besin karışımını tüpün sonuna ulaşana kadar itin.
      3. Silikon tüpü esnek iğneye bağlayın. Borunun ucunu alın ve görüntüleme kutusunun deliklerinden birine yerleştirin (iğne ataşman tarafını kutunun içinde bırakarak içeriden dışarıya).
      4. Her 30 dakikada bir 50 μL demleme çözeltisi enjekte edin.
  9. Görüntüleme kutusunu mikroskop aşamasında sabitleyin ve mikroskopun epifloresan modunu kullanarak ilgi alanını tanımlayın.
  10. Fare modeline bağlı olarak istediğiniz mikroskop ayarlarını uygulayın (Şekil 3B). Damar yapıları, kollajen paternleri (ikinci harmonik jenerasyon ile görselleştirilir) ve inguinal lenf nodu da dahil olmak üzere diğer stabil anatomik yapılar yer işaretleri olarak kullanılabilir. 12 bit derinlikte ters çevrilmiş çok fotonlu konfokal mikroskop ve 1,0 ila 4,0 μm arasında değişen Z-adım boyutu (150 ila 800 μm arasında değişen toplam z-yığını) kullanarak 25x su hedefi kullanarak görüntüler elde edin. Aşağıdaki standart ayarları uygulayın: 1024 x 1024 formatı, 600 Hz tarama hızı, çift yönlü mod.
  11. 860 nm'lik bir uyarma dalga boyu ve 425-435 nm'de algılama kullanarak ikinci harmonik nesil gerçekleştirerek kollajen I liflerini görselleştirin. Farklı floroforlar için uyarma ve algılama dalga boyları Tablo 1'de belirtilmiştir.

Tablo 1. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

  1. Dokunun referans haritasını oluşturmak üzere büyük bir genel bakış kutucuk taraması oluşturmak için görüntüleme yazılımı gezgini modunda Spiral işlevini kullanın (Şekil 3B). Spiral genel bakış içinde yatırım getirilerini tanımlayın, Z yığınını belirlemek için üst ve alt Z düzlemlerini tanımlayın. Dokunun ayrıntılı üç boyutlu (xyz) veya dört boyutlu Z yığınlarını (xyzt) elde etmek için Başlat'a basın.
    NOT: Tüm görüntüleme deneyi sırasında fare yakından izlenmelidir. Uzun görüntüleme seansları için nabız oksimetresi ve sıcaklık probu önerilir. Farenin nefes alması düzenli ve aynı hızda olmalıdır. Fare nefes alma belirtileri göstermeye başlarsa, izofluran miktarı azaltılmalıdır.
  2. Her görüntüleme seansının sonunda, tamamen uyanana kadar fareyi bir ısıtma yastığının üzerinde tutun. Fare rahatsızlık belirtileri veya hareket kabiliyetinde azalma belirtileri gösteriyorsa, kafesi ısıtma yastığı üzerinde daha uzun süre tutun ve normal chow yerine besin jelleri sağlayın.
    NOT: Görüntüleme seansları arasında fare, azalmış yiyecek ve su tüketimi, hızlı nefes alma, azalmış hareket, titreme, anormal vücut duruşu veya bakımsız kürk gibi rahatsızlık belirtileri açısından yakından izlenmelidir. Açık rahatsızlık belirtileri olması durumunda, hayvan refahı ile ilgili kurumsal yönergeleri izleyin ve insancıl son noktaya ulaşıldığında deneyi sonlandırın.
  3. Tekrarlanan her görüntüleme oturumu için 4.1-4.12 arasındaki adımları yineleyin ve aynı konumları birden çok zaman noktasında yeniden izlemek için genel bakış kutucuklarını kullanın (Şekil 3B). Görüntüleme sıklığı, araştırma sorusuna ve çalışılan sürecin zamanlamasına bağlı olacaktır ve tipik olarak günde iki kez görüntüleme seanslarından haftada bir kez değişir.
  4. İstenilen deney süresinin sonunda, izofluran ile derin anestezi ve ardından servikal çıkık kullanılarak implante edilmiş bir R.MIW ile hayvanları ötenazi yapın. İstenirse, daha fazla ex vivo analiz için ilgilenilen organları inceleyin.
  5. Alternatif olarak, hayvanı gelecekteki in vivo analizler için canlı tutun. Bu durumda, R.MIW'yi tutan kese sütürünü yay makası ile keserek çıkarın ve künt forseps kullanarak pencere halkasını fare derisinden dikkatlice ayırın. Daha önce pencereyi tutan cildin kenarlarını temizleyin ve basit bir sürekli dikişle (poliglikolik asit gibi emilebilir malzeme) devam edin.
  6. Cilt kapandıktan sonra, başlangıç ve bitiş dikiş ipliklerini iki kare düğümle (4 atış) bağlayın. Doku iskemisini en aza indirmek için, düğümler cilt kenarında kan akışına izin verecek kadar gevşek olmalıdır. Enflamasyonu önlemek ve cildin iyileşmesini teşvik etmek için yarayı povidon-iyot ile dezenfekte edin.

Figure 3
Şekil 3: Uzunlamasına IVM iş akışı. (A) Tipik bir çok günlük IVM deneyinin şematik tasviri. (B) Yetişkin meme bezi içindeki tümörojenik bölgenin görüntülenmesi. Her görüntüleme oturumundan önce, düşük çözünürlüklü bir genel bakış kutucuk taraması (üst panel), sonraki görüntüleme günlerinde ilgilenilen bölgelerin tanımlanmasını kolaylaştırabilir. Kollajen I paterni (ikinci harmonik nesil, macenta), doku yapısı ve floresan proteinli (yeşil, sarı ve kırmızı renkte tasvir edilen) farklı şekilde etiketlenmiş hücrelerin desenleri aynı doku alanını yeniden izlemek için kullanılabilir. Ölçek çubukları 1 mm'yi (genel bakış döşeme taraması) ve 100 μm'yi (alt paneller) temsil eder. (C) R26-Konfeti muhabir yapısının şematik gösterimi. Tamoksifen kaynaklı Cre-rekombinasyonu üzerine, Konfeti stokastik olarak yeniden birleşir ve dört florofordan birinin (nGFP, YFP, RFP veya mCFP) ekspresyonuyla sonuçlanır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

5. Görüntüleme seansları arasında R.MIW'nin kapağının açılıp kapatılması

  1. Steril eldivenler kullanarak steriliteyi koruyun ve fareyle temas edecek tüm öğeleri sterilize edin. Ameliyattan önce otoklav cerrahi aletleri (ayrıntılar için adım 2'ye bakınız).
  2. Isıtma yastığını açın ve paspası steril bir örtü ile örtün ve fareyi% 3'lük bir izofluran /O2 karışımı kullanarak bir indüksiyon odasında anestezi yapın. Bir pençe yoksunluk refleks testi yaparak yeterli anesteziyi doğrulayın.
  3. Fareyi indüksiyon odasından anestezi burun maskesine aktarın ve izofluran seviyesini% 1.5 -% 2 izofluran /O2 karışımına düşürün.
  4. İnce forseps uçlarını kapağın kollarındaki deliklerden geçirin ve kapağı saat yönünün tersine bükerek kapağı gevşetin. Gerekirse, kapağın gevşetilmesini kolaylaştırmak için pencereye önceden ısıtılmış steril PBS (37 °C) uygulayın.
  5. R.MIW'nin kapağını daha fazla kullanana kadar steril PBS'li steril bir kaba yerleştirin. Kapağın kapağını yarı su ve daha sonra% 80 etanol ile temizleyin. Daha fazla kullanana kadar kapağı steril PBS'de tutun.
  6. Doku yüzeyine birkaç damla steril PBS ekleyerek maruz kalan dokunun kurumasını önleyin.
  7. Maruz kalan dokuya herhangi bir madde veya hücreyi uygulayın veya enjekte edin, maksimum 50 μL hacim kullanılabilir. Sıvı doku tarafından emilene kadar birkaç dakika bekleyin. Alternatif olarak, doku, belirli ROI'ler için görüntüleme koşullarını optimize etmek için steril, künt forseps kullanılarak manipüle edilebilir veya yeniden konumlandırılabilir.
  8. R.MIW'nin iç kenarına petrol jölesi uygulayın ve altta yatan dokudan kaçındığınızdan emin olun. Kapağı adım 3.9'da açıklandığı gibi R.MIW çerçevesine yerleştirin, ince forseps uçlarını kapağın kollarındaki deliklerden geçirin ve kapağı saat yönünde (yaklaşık 5°) bükerek kapağı sıkın.

Representative Results

Meme bezinin farklı gelişim aşamalarında meme epitel hücrelerinin proliferatif dinamiklerini incelemek için tarif edilen protokol gerçekleştirildi. R.MIW'nin tasarımı Şekil 1'de gösterilmiştir ve bir R.MIW'yi implante etme prosedürü Şekil 2'de özetlenmiştir. R.MIW, meme bezi ve cilt arasına cerrahi olarak implante edilir. Pencere halkası içinde tutmak ve farelerin dikişleri çekmesini önlemek için bir dikiş kullanılır (Şekil 2). R.MIW'yi tutan dikişler, hipoalerjenik özelliklere, yumuşak bir dokuya sahip olan ve kullanımı kolay olan emilemeyen ipekten yapılmıştır. R.MIW halkası, implantasyondan sonra inflamasyonu veya nekrozu teşvik etmeyen en biyouyumlu malzemelerden biri olan titanyumdan yapılmıştır21. Aseptik koşullar takip edilirse ve dikişler iyi uygulanırsa, R.MIW meme bezi implantasyonu postoperatif komplikasyon riski düşüktür. Ayrıca, abdominal görüntüleme penceresi implantasyonu22'den farklı olarak, R.MIW implantasyonu fare sağkalımı için sınırlayıcı bir faktör değildir, çünkü meme bezi hayati bir organ değildir ve etik protokolde belirtilen sınıra kadar günlük görüntülemeye izin verir. Pencere implantasyon süresini sınırlayan tek faktör, cildin homeostatik döngüsüdür ve bu da sonunda dikişlerin 4-6 hafta sonra düşmesine neden olacaktır. Bu nedenle, dikişlerin stabilitesini düzenli olarak kontrol etmek önemlidir. İstenirse, pencere stabilitesini sağlamak için dikişler çıkarılabilir ve aseptik koşullar altında (adım 3.5 - 3.8'de açıklandığı gibi) yeni bir çanta ipi sütürü ile değiştirilebilir.

Çok günlük görüntüleme yaklaşımını kullanırken karşılaşılan en büyük zorluk, ardışık günlerde yatırım getirisini geri almaktır. Bu amaçla, yatırım getiri(ler)ini seçmeden önce hızlı bir genel bakış taraması eklenebilir (Şekil 3B). Kollajen ağ sinyali (ikinci harmonik nesil tarafından görselleştirilmiş), doku yapısı ve ayrıca boyalar veya floresan proteinlerle diferansiyel veya stokastik olarak etiketlenmiş hücrelerin yerel kalıpları dahil olmak üzere dokunun aynı bölgesini izlemek için çoklu doku işaretleri kullanılabilir (Şekil 3B). Bu temsili örnekte, bir MMTV-PyMT'nin 4. meme bezine bir R.MIW implante edildi; R26-CreERT2het; R26-Konfetihet dişi fare, palpe edilebilir tümör oluşumunun başlangıcında. Daha sonra, stokastik rekombinasyon, 1.5 mg tamoksifen enjeksiyonu ile indüklendi ve bazı hücrelerde Konfeti yapısının rekombinasyonu ile sonuçlandı (Şekil 3C). Rekombine tümör hücreleri 20 günlük bir süre boyunca takip edildi (Şekil 3B,C). Meme bezinin aynı bölgesinin ardışık günlerde görüntülenmesi engellenirse, pencere daha da temizlemek için aseptik bir ortamda (adım 5.1'de açıklandığı gibi) açılabilir ve görünürlüğü ve görüntü elde etmeyi iyileştirmek için dokuyu yeniden konumlandırabilir (Şekil 3A).

Bu yöntem kullanılarak ergenlik döneminde gelişen meme bezi tek hücre düzeyinde takip edildi. Bir R.MIW aracılığıyla tekrarlanan IVM, R26-CreERT2het kullanılarak gerçekleştirildi; R26-mTmGhet 4-6 haftalıkken dişi fareler, tüm hücrelerin membran tdDomates ile etiketlendiği (Şekil 4A)23. Farelere düşük dozda tamoksifen (0.2 mg / 25 g vücut ağırlığı) enjekte edildi, bu da mTmG yapısının sporadik rekombinasyonuna neden oldu ve meme bezi de dahil olmak üzere tüm dokulardaki bazı hücrelerde kırmızıdan yeşile bir değişikliğe neden oldu (Şekil 4B). Aynı ROI'ler, hücresel çözünürlükte duktal uzama ve duktal dallanma (Şekil 4C) dahil olmak üzere meme bezindeki morfolojik değişiklikleri görselleştirmek için birkaç gün boyunca tekrar gözden geçirildi. Önemli olarak, stokastik hücre etiketleme ve çok günlük IVM'nin bu kombinasyonu, uzama ve dallanma kanallarını çevreleyen stromadaki tek hücrelerin dinamikleri (Şekil 4D) ve inguinal lenf nodu içindeki hücresel dinamikler (Şekil 4E) gibi duktal ortamın dinamik değişikliklerinin görselleştirilmesine de izin verir.

Figure 4
Şekil 4: Pubertal dallanma morfogenezinin çok günlük IVM'si. (A) Pubertal R26-CreERT2; 4-6 haftalık yaştaki R26-mTmG farelerine, R26-mTmG alelinin Cre-aracılı rekombinasyonuna yol açan düşük dozda tamoksifen enjekte edildi ve gelişmekte olan meme bezindeki dinamik değişiklikleri takip etmek için 1, 3 ve 5. günlerde görüntülendi. (B) R26-mTmG fare yapısının şematik gösterimi, yeniden birleştirilmemiş koşullarda membran tdTomato'nun (mT) her yerde ekspresyonuyla sonuçlanır. Cre-aracılı rekombinasyon üzerine, mT membran eGFP (mG) ekspresyonu için değiştirilir. (C) Bir R26-CreERT2'de bir R.MIW aracılığıyla görüntülenen uzamış ve dallanan bir meme kanalının birden fazla gün boyunca 3D görüntüsü; 6 haftalıkken R26-mTmG dişi fare. (D) Dallanma ucunun (üst paneller) ve uzama dalının (alt paneller) tek Z-düzlemi görüntüleri. mT kırmızı, mG ise camgöbeği ile tasvir edilmiştir, ölçek çubukları 100 μm'yi (A ve B) temsil eder. Stromadaki tek hücreler beyaz yıldızlarla vurgulanır. Stromdaki tek hücreleri vurgulamak için sinyal yoğunluğunun manuel olarak arttırıldığını ve meme epitel hücrelerinin biraz fazla maruz kalmasına yol açtığını unutmayın. (E) Bir R26-CreERT2'nin inguinal lenf nodunun temsili görüntüleri; R26-mTmG dişi farenin R.MIW üzerinden görüntülenmesi, genel bakış kutucuğu taraması (sol panel), tek bir Z-düzleminin (üstte) yakınlaştırma görüntüleri (sağ paneller) ve 3B işleme (altta) gösterilir. İkinci harmonik nesil (kollajen I) yeşil, mT kırmızı ve mG camgöbeği ile gösterilir. Ölçek çubukları 500 μm (genel bakış kutucuk taraması) ve 100 μm (yakınlaştırma görüntüleri) değerlerini temsil eder. Şekil panelleri C ve D, Messal ve ark. 2'den değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Benzer şekilde, yetişkin meme bezinde, önerilen R.MIW yaklaşımı, aynı duktal yapıların birkaç gün boyunca ödün vermeyen görünürlükle görselleştirilmesine izin verir. Cdh1-mCFP (Ecadherin-mCFP) fare modeli gibi daha az parlak floresan muhabir modelleri24'ün kullanımı bile, duktal stabilitenin ve ince morfolojik değişikliklerin hücresel çözünürlükte görselleştirilmesine izin verir (Şekil 5). 3. gün ile 5. gün arasındaki görünürlüğün, doku yeniden konumlandırmasından sonra önemli ölçüde arttığını unutmayın (Şekil 5).

Figure 5
Şekil 5: Yetişkin meme bezinin çok günlük görüntülemesi . 3D, yetişkin bir dişi Cdh1-mCFP (camgöbeği, Ecadherin-pozitif luminal hücreler ekspresyonunu işaretleyen) faresinin meme duktal yapısının görüntülerini ardışık birkaç gün boyunca işledi. Aynı ROI'yi yeniden izlemek için kollajen I paterni (ikinci harmonik nesil, macenta) kullanıldı ve duktal (luminal) hücreleri işaretlemek için Cdh1-mCFP sinyali kullanıldı. 3. günden sonraki görünürlüğün, R.MIW kapağının açılması ve dokunun yeniden konumlandırılmasıyla iyileştirildiğini unutmayın. Ölçek çubukları 100 μm'yi temsil eder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tek hücre düzeyinde hormonal döngü sırasında meme epitel hücrelerinin proliferatif heterojenliğini değerlendirmek için, KikGR proteininin her yerde ekspresyonuna sahip olan foto-dönüştürülebilir Kikume Yeşil-Kırmızı (KikGR) muhabir fare modeli25,26 kullanılmıştır. KikGR, mor ışığa maruz kaldığında yeşil-kırmızı dönüşüme uğrayan parlak bir florofordur ve kırmızı/yeşil oran, hücre2'nin proliferatif aktivitesi için bir vekil olarak kullanılabilir (Şekil 6A, B). R.MIW yaklaşımını kullanarak, yetişkin meme bezinin duktal ağacındaki aynı hücreleri birkaç gün boyunca takip ettik ve duktal ağaç boyunca daha önce beklenmeyen proliferatif heterojenite bulduk (Şekil 6C). Yüksek ve düşük proliferatif hücreler dönüştürülmüş farklı alanlara eşit olarak dağılmıştır (Şekil 6C, D). Çarpıcı bir şekilde, yerel düzeyde, komşu hücreler kırmızı/yeşil oranlarında büyük farklılıklar göstermiştir (Şekil 6C, D). Foto-dönüşümden 10 gün sonra farklı hücrelerin kırmızı/yeşil oranının (proliferatif aktiviteleri için bir vekil olarak) ölçülmesi, aynı duktal mikro ortamdaki bazı hücrelerin oldukça değişken seyreltme oranlarını ortaya koymuştur (Şekil 6E). Birlikte, bu veriler yetişkin meme bezinde dikkate değer bir lokal proliferatif heterojenliği ve aynı zamanda küresel bir tekdüze ciro oranını ortaya koymaktadır.

Figure 6
Şekil 6: KikGR fare modeli kullanılarak yetişkin meme bezinde proliferatif heterojenliğin uzunlamasına IVM'si. (A) KikGR fareleri, mor ışığa maruz kalmadan önce ve sonra 0. günde görüntülendi. Görüntüleme seansları dönüşümden sonra 2, 6 ve 10. günlerde tekrarlandı. (B) KikGR meme epitel hücrelerinin proliferasyon (sol panel) ve zamanın bir fonksiyonu olarak proliferasyon (sağ panel) sonrası foto-dönüşümü üzerine varsayımsal sonuçların şematik tasviri. (C) Meme bezinin aynı bölgesi, 10 günlük bir süre boyunca bir R.MIW aracılığıyla görüntülendi. Daha küçük bölgeler 0. günde foto-dönüştürüldü ve zaman içinde Kikume kırmızı sinyalinin benzer bir seyreltme oranını gösterdi ve bu da epitel boyunca eşit bir devir hızına işaret etti. (D) C panelinde belirtilen bölgelerin yakınlaştırma görüntüleri (tek Z-düzlemleri), foto-dönüşümden 6 ve 10 gün sonra hücresel düzeyde proliferatif heterojenlik gösterir. Ölçek çubukları 100 μm (panel C) ve 10 μm'yi (panel D) temsil eder. (E) Foto-dönüştürülmüş üç alanda rastgele seçilen hücrelerin (n = 48 hücre) kırmızı/yeşil oranının ölçülmesi. Yüksek kırmızı/yeşil oranı düşük seyreltme oranının ve düşük proliferatif aktivitenin göstergesiyken, düşük kırmızı/yeşil oranı yüksek seyreltme oranının ve proliferasyonun göstergesidir. Şekil panelleri C-E Messal ve ark. 2'den değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

R.MIW, doğal ve minimal olarak bozulmuş ortamında sağlıklı ve hastalıklı meme bezinin uzunlamasına görüntülenmesine izin verir ve meme bezinin çeşitli gelişim aşamalarında tekrar tekrar görselleştirilmesine izin verir. R.MIW tasarımı, pencerenin deney sırasında herhangi bir noktada açılmasını sağlar. İlgilenilen dokuya uzun süreli görsel erişim, örneğin, kapak kayması üzerinde hücre kalıntılarının birikmesiyle engellenebilir. Bu gibi durumlarda, R.MIW, tüm görünür doku alanının ve kapağın temizlenmesini sağlamak için bir görüntüleme seansından önce veya hemen sonra açılabilir. Çıkarılabilir kapak ayrıca dokunun manipülasyonuna ve spesifik inhibitörler ve tedaviler, etiketleme boyaları veya ilgilenilen spesifik hücre tipleri gibi maddelerin lokal uygulamasına izin verir.

Bu yöntem, bir görüntüleme seansı ile sınırlı olan daha önce tarif edilen meme deri flebi prosedürleri 4,7,8,13'ün sınırlamasının üstesinden gelir ve dallanma morfogenezi (Şekil 5), homeostatik doku döngüsü (Şekil 6) veya hücresel düzeyde tümör büyümesi (Şekil 3B) gibi süreçleri görselleştirebilir. ). Bununla birlikte, aynı zamanda, R.MIW, daha önce yayınlanan MIW3,18 ve diğer tüm görüntüleme pencereleri20,22'ye kıyasla R.MIW'nin büyük bir varlığını içeren görüntüleme oturumları arasında dokunun lokal manipülasyonuna izin verir. R.MIW'yi açarken, herhangi bir enfeksiyon kaynağını önlemek için her zaman aseptik koşulları korumak önemlidir. R.MIW'yi aseptik bir ortamda açma yeteneği, her görüntüleme seansından önce görüntüleme koşullarının optimize edilmesini sağlar ve bu da ilgilenilen dokuya uzun vadeli görsel erişimi büyük ölçüde geliştirir. Spesifik olarak, adiposit bakımından zengin bir stroma içine gömülü olan meme bezinde, bu çok değerlidir. Dahası, değiştirilebilir kapak, IVM deneyini sonlandırmaya gerek kalmadan terapötiklerin, farklı hücre tiplerinin, etiketleme boyalarının, görüntü rehberliğinde mikrodiseksiyonun veya dokunun başka herhangi bir lokal manipülasyonunun lokal olarak uygulanmasını benzersiz bir şekilde mümkün kılabilir. Örneğin, tümör başlangıcını incelemek için, spesifik kanser hücresi popülasyonları, bu ROI'ye R.MIW halkası aracılığıyla erişilebildiği sürece, belirlenmiş bir IVM zaman noktasında ve hassas meme bezi konumunda doğrudan duktal ağaca veya stromaya enjekte edilebilir. Tümör progresyonunu incelemek için, spesifik kanser hücresi popülasyonları (belirli bir yerde, belirli bir mikro ortamda veya belirli bir davranışla) IVM oturumu sırasında foto-işaretlenebilir ve daha sonra R.MIW'nin açılmasından sonra bir floresan diseksiyon mikroskobu kullanılarak mikrodiseke edilebilir. İzole hücreler, (tek hücreli) mRNA dizilimi gibi aşağı akış analizleri için daha fazla işlenebilir. Bu yaklaşımı kullanarak, in vivo hücre davranışını moleküler ekspresyon profilleriyle birleştirebilirsiniz. R.MIW tarafından sağlanan lokal ilaç uygulamasının avantajı, dokunun tedaviden önce ve hemen sonra görüntülenmesini sağlar. Fareyi görüntüleme kutusundan çıkarmak ve daha sonra R.MIW kapağını açtıktan sonra lokal ilaç uygulamasını gerçekleştirmek için gereken aralık dakikalar içinde gerçekleştirilebilir ve bu da hızlı etkili ilaçların anında faz yakalamasını sağlar.

R.MIW aracılığıyla meme bezinin IVM'sinin birçok farklı floresan muhabir fare modeliyle uyumlu olduğunu gösteriyoruz. Yağ bakımından zengin ortamın görüntülenmesi zordur ve bu nedenle parlak floroforların kullanılması önerilir. Bununla birlikte, burada gösterildiği gibi, mCFP gibi daha az parlak floroforlar bile optimum görüntüleme koşullarında R.MIW aracılığıyla görselleştirilebilir. Kaçınılmaz olarak, yağ yastığı daha derin duktal yapıların görüntülenmesini engelleyecek ve görüntülemeyi daha yüzeysel kanallarla sınırlayacaktır. Her IVM deneyinin başlangıcında düşük çözünürlüklü bir genel bakış görüntüsü, yüksek çözünürlüklü görüntüleme için yeterince yüzeysel olan ilgili duktal yapıların belirlenmesine yardımcı olacaktır. Lokal doku manipülasyonu, bağ dokusunun çıkarılması veya R.MIW'yi açtıktan sonra yağ dokusunun yeniden konumlandırılması, IVM'yi yağ dokusu tarafından kaplanan spesifik ROI'ler için optimize edebilir. Bu, bu manipülasyonların yapılmasına izin vermeyen ve pencerenin kendisinin tamamen kaldırılmasını gerektiren önceki tüm pencere tasarımlarına göre önemli bir avantajdır. Spesifik olarak, inguinal lenf nodunun görselleştirilmesi için, ışık saçılımını azaltan ve yüksek çözünürlüklü görüntülemeyi mümkün kılan üstteki yağ dokusunun nazikçe çıkarılması önerilir. Dokuyu manipüle ederken, her zaman aseptik koşulları koruyun ve IVM deneyi sırasında incelenen süreçleri etkileyebileceğinden, kanamayı veya dokuya ciddi hasarı önleyin.

R.MIW, eklemler veya kemik plakaları gibi sert dokuların yerini almak için klinik pratikte yaygın olarak kullanılan bir malzeme olan titanyumdan yapılmıştır. Titanyum, hafif ve inert karakteri21 de dahil olmak üzere çelik pencerelere göre çeşitli avantajlara sahiptir. Son zamanlarda, esnek silikon pencere20 de dahil olmak üzere yeni görüntüleme penceresi tipleri oluşturmak için birkaç başka malzeme kullanıldı. R.MIW'nin aksine, esnek pencere implantasyon için herhangi bir dikiş gerektirmez ve özellikle yumuşak ve kırılgan dokular söz konusu olduğunda, hemen hemen her anatomik pozisyon için uygundur. Silikon pencereler, hafif ve deforme olabilen doğaları nedeniyle hayvan hareketliliği üzerinde minimum etkiye sahiptir ve belki de hızlı doku genişlemesi ve büyümesini inceleyen deneylerde daha uygundur20. Titanyum versiyona göre bir diğer avantaj, silikon pencerelerin manyetik rezonans görüntüleme20,27 dahil olmak üzere diğer görüntüleme modaliteleriyle uyumlu olmasıdır. Ancak, hedeflerin 0,17 mm cam kapaklar için optimize edildiğini akılda tutmak önemli olacaktır. Dahası, meme dokusu, özellikle ters çevrilmiş bir mikroskop kullanıldığında, esnek pencereyi kullanarak kısıtlanması zor olan solunum hareketlerine karşı hassastır. Solunum artefaktları, R.MIW tasarımı ve R.MIW'nin görüntüleme kutusunun kakma içine sabitlenmesi ile en aza indirilir. Sonuç olarak, önerilen R.MIW kurulumu kullanılarak elde edilen görüntüler, solunum eserleri nedeniyle bozulmaz. Bununla birlikte, doku lokalizasyonunda genellikle kademeli olan ve edinim sonrası hareket düzeltme yazılımı28 kullanılarak düzeltilebilen küçük sapmalar meydana gelebilir. IVM teknolojileri2,20'nin artan araç kutusuyla, her deney için özel gereksinimler sonunda ilgilenilen dokunun in vivo görselleştirmesinin en iyi yolunu belirleyecektir. Farklı pencere tasarımlarının farklı avantajları ve dezavantajları vardır ve araştırma sorusuna, mevcut mikroskopi kurulumuna, gerekli mekansal ve zamansal çözünürlüğe ve çalışılan sürecin toplam zaman aralığına bağlı olarak, en uygun yaklaşımın belirlenmesi gerekir.

Özetle, R.MIW, MEME BEZI GELIŞIMI, HOMEOSTAZ VE HASTALıK sırasında hücresel dinamiklerin yüksek çözünürlüklü karakterizasyonunu birkaç gün ila haftalar boyunca kolaylaştırır.

Disclosures

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur

Acknowledgments

Bu çalışma, Araştırma Vakfı Flanders (doktora hibesi temel araştırma 11L7222N - M.C.), Boehringer Ingelheim Vakfı (C.L.G.J.S.'ye Doktora Bursu), bir EMBO doktora sonrası bursu (C.L.G.J.S.'ye ALTF 1035-2020 hibe) ve Doktor Josef Steiner Ödülü (J.v.R.'ye) tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.9% NaCl BD 306573 Other brands available
10 mm round coverglass Fisher scientific 10696365 Other brands available
5-0 braided silk suturs Ethicon W580
80% Ethanol homemade NA
Anesthesia induction box Kentscientific VetFlo-MSEKIT
Buprenorphine (Vetergesic®) Ecuphar NA
Cotton tips (sterile) Fisher scientific 13113743 Other brands available
Cyanoacrylate adhesive Loctite NA Other brands available
Eye ointment Duratears NA
Flexible butterfly needle Greiner Bio-One 450120 Other brands available
Graefe forceps (blunt) Fine Science Tools 11051-10
Heating pad Kentscientific RightTemp Jr. Other brands available
Imaging box Custom made NA
Infuse nutrient mixture Braun Nutriflex special 70/240
Insulin syringes BD 324911 Other brands available
Inverted multi-photon microscope with automated stage Leica Microsystems NA
Isoflurane vaporizer Kentscientific VetFlo-1231K
Needle holder Fine Science Tools 12510-14
Parafilm Sigma-Aldrich P7793 semi-transparent tape
Paper tape tesa Tesa NA
Petroleum Jelly Vaseline NA
Razor blades Fisher scientific 11904325 Other brands available
Silicon tubing Solutions Elastomeres NA Any houseware
Spring scissors (small) Fine Science Tools 15018-10
Sterile PBS ThermoFisher Scientific 10010023
Syringe (10 ml) BD 305482 Other brands available
Thin forceps Fine Science Tools 11413-11
Titanium lid for mammary imaging window Custom made NA
Titanium mammary imaging window Custom made NA
Wooden sticks toothpicks Fisher scientific NC1678836 Other brands available

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Watson, C. J., Khaled, W. T. Mammary development in the embryo and adult: new insights into the journey of morphogenesis and commitment. Development. 147 (22), Cambridge, England. (2020).
  2. Messal, H. A., van Rheenen, J., Scheele, C. L. G. J. An Intravital Microscopy Toolbox to Study Mammary Gland Dynamics from Cellular Level to Organ Scale. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 26 (1), 9-27 (2021).
  3. Kedrin, D., et al. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nature Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).
  4. Dawson, C. A., Mueller, S. N., Lindeman, G. J., Rios, A. C., Visvader, J. E. Intravital microscopy of dynamic single-cell behavior in mouse mammary tissue. Nature Protocols. 16 (4), 1907-1935 (2021).
  5. Scheele, C. L., et al. Identity and dynamics of mammary stem cells during branching morphogenesis. Nature. 542 (7641), 313-317 (2017).
  6. Kotsuma, M., et al. Nondestructive, serial in vivo imaging of a tissue-flap using a tissue adhesion barrier. IntraVital. 1 (1), 69-76 (2012).
  7. Ingman, W. V., Wyckoff, J., Gouon-Evans, V., Condeelis, J., Pollard, J. W. Macrophages promote collagen fibrillogenesis around terminal end buds of the developing mammary gland. Developmental Dynamics: an official publication of the American Association of Anatomists. 235 (12), 3222-3229 (2006).
  8. Entenberg, D., et al. large-volume, high-resolution intravital imaging for tissue-wide analysis of single cell dynamics. Methods (San Diego, Calif). 128, 65-77 (2017).
  9. Masedunskas, A., Weigert, R., Mather, I. H. Intravital Imaging of the Lactating Mammary Gland in Transgenic Mice Expressing Fluorescent Proteins. Advances in Intravital Microscopy. , Springer. Netherlands. 187-204 (2014).
  10. Masedunskas, A., Chen, Y., Stussman, R., Weigert, R., Mather, I. H. Kinetics of milk lipid droplet transport, growth, and secretion revealed by intravital imaging: lipid droplet release is intermittently stimulated by oxytocin. Molecular Biology of the Cell. 28 (7), 935-946 (2017).
  11. Mather, I. H., Masedunskas, A., Chen, Y., Weigert, R. Symposium review: Intravital imaging of the lactating mammary gland in live mice reveals novel aspects of milk-lipid secretion. Journal of Dairy Science. 102 (3), 2760-2782 (2019).
  12. Stevenson, A. J., et al. Multiscale imaging of basal cell dynamics in the functionally mature mammary gland. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (43), 26822-26832 (2020).
  13. Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Preparation of Mice for Long-Term Intravital Imaging of the Mammary Gland. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5562 (2011).
  14. Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of Vital Signs for Long-Term Survival of Mice under Anesthesia. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5563 (2011).
  15. Harney, A. S., Wang, Y., Condeelis, J. S., Entenberg, D. Extended Time-lapse Intravital Imaging of Real-time Multicellular Dynamics in the Tumor Microenvironment. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (112), e54042 (2016).
  16. Harper, K. L., et al. Mechanism of early dissemination and metastasis in Her2+ mammary cancer. Nature. 540 (7634), 588-592 (2016).
  17. Sobolik, T., et al. Development of novel murine mammary imaging windows to examine wound healing effects on leukocyte trafficking in mammary tumors with intravital imaging. IntraVital. 5 (1), 1125562 (2016).
  18. Shan, S., Sorg, B., Dewhirst, M. W. A novel rodent mammary window of orthotopic breast cancer for intravital microscopy. Microvascular Research. 65 (2), 109-117 (2003).
  19. Zomer, A., et al. Intravital imaging of cancer stem cell plasticity in mammary tumors. Stem Cells. 31 (3), 602-606 (2013).
  20. Jacquemin, G., et al. Longitudinal high-resolution imaging through a flexible intravital imaging window. Science Advances. 7 (25), (2021).
  21. Niinomi, M. Recent research and development in titanium alloys for biomedical applications and healthcare goods. Science and Technology of Advanced Materials. 4 (5), 445-454 (2003).
  22. Ritsma, L., et al. Surgical implantation of an abdominal imaging window for intravital microscopy. Nature Protocols. 8 (3), 583-594 (2013).
  23. Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, N., Luo, L. A global double-fluorescent cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), New York, N.Y. 593-605 (2007).
  24. Snippert, H. J., et al. Intestinal Crypt Homeostasis Results from Neutral Competition between Symmetrically Dividing Lgr5 Stem Cells. Cell. 143 (1), 134-144 (2010).
  25. Nowotschin, S., Hadjantonakis, A. K. Use of KikGR a photoconvertible green-to-red fluorescent protein for cell labeling and lineage analysis in ES cells and mouse embryos. BMC Developmental Biology. 9, 49 (2009).
  26. Kurotaki, Y., Hatta, K., Nakao, K., Nabeshima, Y. I., Fujimori, T. Blastocyst Axis Is Specified Independently of Early Cell Lineage But Aligns with the ZP Shape. Science. 316 (5825), New York, N.Y. 719-723 (2007).
  27. Heo, C., et al. A soft, transparent, freely accessible cranial window for chronic imaging and electrophysiology. Scientific Reports. 6, 27818 (2016).
  28. Warren, S. C., et al. Removing physiological motion from Intravital and clinical functional imaging data. eLife. 7, 35800 (2018).

Tags

Biyoloji Sayı 179
Değiştirilebilir Kapaklı Meme Görüntüleme Penceresi Kullanarak Boyuna İntravital Mikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mourao, L., Ciwinska, M., van… More

Mourao, L., Ciwinska, M., van Rheenen, J., Scheele, C. L. G. J. Longitudinal Intravital Microscopy Using a Mammary Imaging Window with Replaceable Lid. J. Vis. Exp. (179), e63326, doi:10.3791/63326 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter