झिल्ली के गुण मापना 3D-संरचित रोशनी माइक्रोस्कोपी (3D-SIM) का उपयोग करके अक्षतंतु प्रारंभिक खंड का आवधिक कंकाल
Summary
वर्तमान प्रोटोकॉल सुसंस्कृत चूहे हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन्स और 3 डी-संरचित रोशनी माइक्रोस्कोपी (3 डी-सिम) का उपयोग करके अक्षतंतु प्रारंभिक खंड के झिल्ली आवधिक कंकाल के एक्टिन रिंग्स और झिल्ली आवधिक कंकाल के अन्य घटकों की कल्पना और मापने के लिए एक विधि का वर्णन करता है।
Abstract
अक्षतंतु प्रारंभिक खंड (एआईएस) वह साइट है जिस पर एक्शन पोटेंशियल शुरू होती है और एक परिवहन फिल्टर और प्रसार बाधा का गठन करती है जो सोमाटो-डेंड्रिटिक कार्गो को छंटाई करके न्यूरोनल ध्रुवीयता के रखरखाव में योगदान करती है। एक झिल्ली आवधिक कंकाल (एमपीएस) जिसमें आवधिक एक्टिन के छल्ले शामिल होते हैं, संरचनात्मक प्रोटीन और विभिन्न आयन चैनलों सहित विभिन्न एआईएस प्रोटीन को लंगर डालने के लिए एक पाड़ प्रदान करता है। हालांकि हाल ही में प्रोटिओमिक दृष्टिकोणों ने उपन्यास एआईएस घटकों की काफी संख्या की पहचान की है, एमपीएस की संरचना और इसके व्यक्तिगत घटकों की भूमिकाओं के विवरण की कमी है। एमपीएस (~ 190 एनएम) में व्यक्तिगत एक्टिन रिंगों के बीच की दूरी को एमपीएस के संरचनात्मक विवरणों को हल करने के लिए सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी तकनीकों के रोजगार की आवश्यकता होती है। यह प्रोटोकॉल 3 डी-संरचित रोशनी माइक्रोस्कोपी (3 डी-सिम) का उपयोग करके उप-झिल्लीदार एक्टिन रिंग्स के सापेक्ष एमपीएस में एआईएस प्रोटीन के सटीक स्थानीयकरण की जांच करने के लिए सुसंस्कृत चूहे हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन्स का उपयोग करने के लिए एक विधि का वर्णन करता है। इसके अलावा, व्यक्तिगत घटकों की आवधिकता और एक्टिन के छल्ले के सापेक्ष उनकी स्थिति का मात्रात्मक रूप से आकलन करने के लिए एक विश्लेषणात्मक दृष्टिकोण का भी वर्णन किया गया है।
Introduction
अक्षतंतु प्रारंभिक खंड (एआईएस) कशेरुक न्यूरॉन्स 1 के समीपस्थ अक्षतंतु का एक छोटा, विशिष्ट रूप से विशिष्ट क्षेत्र है। एआईएस में एक परिवहन फिल्टर और प्रसार बाधा शामिल है जो सोमाटो-डेंड्राइटिक कार्गो 2,3,4,5,6,7 को छँटाई करके न्यूरोनल ध्रुवीयता को बनाए रखने में आवश्यक है। इसके अलावा, एआईएस की अद्वितीय संरचना इसे वोल्टेज-गेटेड आयन चैनलों के समूहों को समायोजित करने की अनुमति देती है जो कार्रवाई संभावित दीक्षा की साइट के रूप में इसके कार्य को सुविधाजनक बनाते हैं। एक अत्यधिक स्थिर संरचनात्मक परिसर एआईएस के अद्वितीय कार्यों को रेखांकित करता है। पिछले दशक के भीतर अनुसंधान ने एक झिल्ली आवधिक कंकाल (एमपीएस) की उपस्थिति का खुलासा किया है जिसमें स्पेक्ट्रिन द्वारा जुड़े एक्टिन के छल्ले होते हैं और विभिन्न एआईएस प्रोटीन 9,10 को लंगर डालने के लिए एक पाड़ प्रदान करते हैं।
एमपीएस (~ 190 एनएम) 9,10 में एक्टिन के छल्ले के बीच की दूरी पारंपरिक प्रकाश माइक्रोस्कोपी की संकल्प सीमा के तहत है। एमपीएस की कल्पना करने के लिए इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग करने के शुरुआती प्रयास सफल नहीं थे, क्योंकि इसमें शामिल कठोर तैयारी प्रक्रियाएं एमपीएस की संरचना को संरक्षित करने में विफल रही थीं। इस प्रकार, सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी तकनीकों ने एमपीएस 11 के कुछ संरचनात्मक विवरणों को स्पष्ट करने में अमूल्य साबित किया है। हालांकि, एआईएस संरचनात्मक परिसर की समझ, इसके घटकों की पहचान और कार्य, और इसके स्पैटिओटेम्पोरल विनियमन अभी भी अधूरे हैं। हाल के प्रोटिओमिक अध्ययन प्रोटीन की एक बड़ी सूची बनाने में सफल रहे जो एआईएस 12,13 के संरचनात्मक घटकों के करीब एआईएस के लिए स्थानीयकृत होते हैं। फिर भी, एआईएस परिसर में उनके कार्य और सटीक स्थान के विवरण की कमी है। इस प्रकार, सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी तकनीकें अन्य एमपीएस घटकों के सापेक्ष इन प्रोटीनों की सटीक स्थिति की जांच करने और उनके कार्यों की जांच करने के लिए एक आवश्यक उपकरण के रूप में कार्य करती हैं। कई प्रकाश माइक्रोस्कोपी तकनीकें प्रकाश की विवर्तन सीमा से अधिक रिज़ॉल्यूशन प्राप्त कर सकती हैं, कुछ एकल अणुओं को स्थानीयकृत करने में भी सक्षम हैं। हालांकि, इनमें से कई तकनीकों को आमतौर पर विशेष फ्लोरोफोरस या इमेजिंग बफर की आवश्यकता होती है, और छवि अधिग्रहण अक्सर समय-गहन होता है।
3 डी संरचित रोशनी माइक्रोस्कोपी (3 डी-सिम), उपयोग में आसानी और सरल नमूना तैयारी आवश्यकताओं के कारण, इमेजिंग या नमूना तैयारी के लिए कोई विशेष अभिकर्मकों की आवश्यकता नहीं होती है, फ्लोरोफोरस और नमूनों की एक विस्तृत सरणी के साथ अच्छी तरह से काम करता है, कई रंगों में आसानी से लागू किया जा सकता है, और लाइव-सेल इमेजिंग 15 में सक्षम है। जबकि सबसे अच्छा संभव रिज़ॉल्यूशन सिम प्रदान करता है (~ 120 एनएम) कई अन्य सुपर-रिज़ॉल्यूशन तकनीकों की तुलना में कम है, यह कई अनुप्रयोगों के लिए पर्याप्त है (उदाहरण के लिए, न्यूरॉन्स में एमपीएस के घटकों को हल करने के लिए)। इस प्रकार, यह निर्धारित करने के लिए विशिष्ट अनुप्रयोगों की आवश्यकता पर विचार करना महत्वपूर्ण है कि क्या सिम एक उपयुक्त विकल्प है या यदि एक उच्च रिज़ॉल्यूशन आवश्यक है। यहां, सुसंस्कृत हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन्स और 3 डी-संरचित रोशनी माइक्रोस्कोपी (3 डी-सिम) का उपयोग करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है ताकि एमपीएस में एक्टिन के छल्ले के सापेक्ष एआईएस प्रोटीन की स्थिति और संगठन की जांच की जा सके, जैसा कि Abouelezz et al.16 में लागू किया गया है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां वर्णित प्रोटोकॉल सुपर-रिज़ॉल्यूशन तकनीक का उपयोग करके एमपीएस प्रोटीन को विज़ुअलाइज़ करने और मापने के लिए एक विधि प्रदान करता है। चूंकि एक्टिन रिंग्स और अन्य एमपीएस घटक ~ 190 nm9,10 की आवधि…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
डॉ Pirta Hotulainen उसकी महत्वपूर्ण टिप्पणियों के लिए स्वीकार किया जाता है, इस पांडुलिपि को तैयार करने के लिए अमूल्य. डॉ Rimante Minkeviciene मूल प्रयोगों के लिए इस्तेमाल न्यूरोनल संस्कृतियों को तैयार करने में उसकी मदद के लिए स्वीकार किया जाता है। सभी इमेजिंग बायोमेडिकम इमेजिंग यूनिट में किया गया था। इस काम को फिनलैंड की अकादमी (डी.M, एसए 266351) और डॉक्टरेट प्रोग्राम ब्रेन एंड माइंड (ए.ए.) द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| 24-well plates | Corning | 3524 | |
| 4% Paraformaldehyde | |||
| Alexa-488 Phalloidin | ThermoFisher | A12379 | |
| Alexa-647 anti-mouse | ThermoFisher | A31571 | |
| Anti-Ankyrin G antibody | UC Davis/NIH NeuroMab Facility, Clone 106/36 | 75-146 | |
| Anti-MAP2 antibody | Merck Millipore | AB5543 | |
| B-27 | Invitrogen | 17504044 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | BioWest | P6154 | |
| Deltavision OMX SR | GE Healthcare Life Sciences | N/A | |
| Fiji software package | ImageJ | ||
| GNU Octave | GNU | ||
| High performance coverslips | Marienfeld | 117530 | |
| Immersion Oil Calculator | Cytiva Life Sciences | https://tinyurl.com/ImmersionOilCalculator | |
| L-Glutamine | VWR | ICNA1680149 | |
| MATLAB R2020a | Mathworks | ||
| Neurobasal media | Invitrogen | 21103049 | |
| OMX SR | Delta Vision OMX | ||
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | |
| ProLong Gold mounting media | Invitrogen | P10144 | |
| softWoRx Deconvolution | Cytiva Life Sciences | ||
| Superfrost Slides | Epredia | ISO 8037/1 | |
| TetraSpeck microspheres 0.1 µm | ThermoFisher | T7279 | |
| Triton-X | Sigma | X100 |
References
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