Summary
本方案描述了一种使用培养的大鼠海马神经元和3D结构照明显微镜（3D-SIM）可视化和测量肌动蛋白环和轴突初始节段的膜周期性骨架的其它组分的方法。
Abstract
轴突初始段（AIS）是动作电位启动的位点，并构成传递过滤器和扩散屏障，通过对体突状货物进行分类，有助于维持神经元极性。由周期性肌动蛋白环组成的膜周期性骨架（MPS）为锚定各种AIS蛋白（包括结构蛋白和不同的离子通道）提供了支架。尽管最近的蛋白质组学方法已经确定了相当多的新型AIS成分，但缺乏MPS结构及其各个组件的作用的细节。MPS中单个肌动蛋白环之间的距离（~190nm）需要使用超分辨率显微镜技术来解决MPS的结构细节。该协议描述了一种使用培养的大鼠海马神经元使用3D结构照明显微镜（3D-SIM）检查MPS中AIS蛋白相对于膜下肌动蛋白环的精确定位的方法。此外，还描述了一种定量评估单个组分的周期性及其相对于肌动蛋白环的位置的分析方法。
Introduction
轴突初始节段（AIS）是脊椎动物神经元近端轴突的一个短而独特的特化区域1。AIS包括一个传输过滤器和扩散屏障，通过对躯体树突货物进行分类来维持神经元极性2，3，4，5，6，7。此外，AIS的独特结构使其能够容纳电压门控离子通道簇，从而促进其作为动作电位启动位点的功能8。高度稳定的结构综合体是AIS独特功能的基础。过去十年的研究表明，存在一种膜周期性骨架（MPS），其中含有通过光谱连接的肌动蛋白环，并为锚定各种AIS蛋白提供了支架9，10。
MPS中肌动蛋白环之间的距离（~190nm）9，10 低于常规光学显微镜的分辨率极限。早期使用电子显微镜可视化MPS的尝试并不成功，因为所涉及的苛刻的制备程序未能保留MPS的结构。因此，超分辨率显微镜技术已被证明在阐明MPS11的一些结构细节方面具有无可估量的价值。然而，对AIS结构复合体的理解，其组成部分的身份和功能，以及其时空调节仍不完整。最近的蛋白质组学研究成功地创建了一个相当大的蛋白质列表，这些蛋白质定位到AIS，接近AIS12，13的结构组分。尽管如此，它们的功能细节和在AIS综合体中的精确位置仍然缺乏。因此，超分辨率显微镜技术是检查这些蛋白质相对于其他MPS组分的准确位置并研究其功能的重要工具。一些光学显微镜技术可以达到高于光衍射极限的分辨率，有些甚至能够定位单个分子。然而，其中许多技术通常需要专门的荧光团或成像缓冲液，并且图像采集通常需要大量时间14。
3D结构化照明显微镜（3D-SIM）由于其易于使用和简单的样品制备要求，不需要特殊的试剂进行成像或样品制备，可与各种荧光团和样品配合使用，可以很容易地以多种颜色实现，并且能够进行活细胞成像15。虽然与许多其他超分辨率技术相比，SIM提供的最佳分辨率（~120 nm）较低，但对于许多应用（例如，用于解析神经元中MPS的组分）来说，它就足够了。因此，至关重要的是要考虑特定应用的要求，以确定SIM卡是否是合适的选择，或者是否需要更高的分辨率。在这里，描述了一种方案，用于使用培养的海马神经元和3D结构照明显微镜（3D-SIM）来检查推定的AIS蛋白相对于MPS中肌动蛋白环的位置和组织，如Abouelezz等人所实现的那样。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
这些实验中使用的原代海马神经元是根据赫尔辛基大学的道德准则和芬兰法律从胚胎第17天的Wistar大鼠胚胎中收获的16 。
1. 样品制备
- 在高保真玻璃盖玻片上，让大鼠海马神经元在稀疏培养条件下（约5，000-10，000个细胞/ cm 2）生长14天（体外14天）。
注意：使用稀疏培养物可减少神经突重叠的机会，这有助于量化 MPS。 - 在室温下使用4%多聚甲醛固定神经元12分钟。在PBS（BSA-PBS）中用0.2%BSA洗涤盖玻片一次，然后在室温下在PBS中的1%Triton-X溶液中孵育10分钟。在 BSA-PBS 中洗涤一次。
- 稀释BSA-PBS中的抗炔酸甘油G抗体（1：200）。将抗体溶液加入盖玻片中，并在4°C下孵育过夜。 任选地，将鸡抗MAP2抗体（见 材料表）添加到抗体溶液中以划分躯体树突结构域。
- 在BSA-PBS中洗涤细胞一次，然后在PBS中洗涤0.1%Triton-X，然后在BSA-PBS中进行最后洗涤。
- 在BSA-PBS中稀释荧光团标记的抗小鼠二抗（1：200）（见 材料表），加入盖玻片中，并在室温下孵育1小时。在BSA-PBS中洗涤细胞一次，在PBS中洗涤0.1%Triton-X一次，然后在PBS中洗涤一次。
- 在PBS中制备1μM标记的鬼臼素溶液（见 材料表）并将其添加到细胞中。在室温下孵育2小时。在PBS中洗涤细胞一次，在PBS中洗涤一次在0.1%Triton-X中，然后在PBS中洗涤一次。
注意： AlexaFluor488 标记的素在这里使用，但其他标签也可以。 - 要将盖玻片安装在载玻片上，请在载玻片上滴上一滴安装介质，将盖玻片浸入去离子水中，然后用柔软的纸巾轻拍（以除去多余的水）。
- 将盖玻片放在载玻片上。在室温下孵育24小时。
注：使用硬镶嵌介质（固化后折射率为1.47）未观察到对样品的不良影响。
- 将盖玻片放在载玻片上。在室温下孵育24小时。
2. 成像
- 如果可能，请在成像前咨询显微镜设备的人员。使用浸油计算器（见 材料表）选择适合样品的浸油。
- 样品准备就绪后，请确保盖玻片清洁，没有任何残留物或多余的安装介质。如有必要，请使用浸入水或乙醇的棉签进行清洁。将样品置于支持3D SIM的显微镜中（参见 材料表）并找到一个细胞进行成像。
- 调整相关激光线的功率和曝光时间，以最大限度地提高信噪比，而不会显著漂白样品。
注意：良好的信噪比将显示出清晰的网格状外观，聚焦在样品上，并导致精确的高分辨率重建。分别使用488 nm和640 nm激光线来可视化F-肌动蛋白和ankyrin G。 - 在 z 维中设置样本的上限和下限，然后继续获取堆栈。
注意：此处使用的 z 步长为 125 nm。 - 要成功重建SIM卡，请确保显微镜软件（见 材料表）具有适合所用染料的光学传输文件（OTF）。
注意：这些通常由专业人员创建和维护。在没有功能性OTF的情况下，也可以使用开源工具根据估计值进行重建17。在这项工作中，最新的OTF文件由专业人员控制。 - 在堆栈上运行重构算法，获取超解析重构。检查重建中是否存在已知伪影，如有必要，请调整参数以更正它们。
注意：默认算法参数通常提供准确的结果。其中许多伪影涉及一些重复模式：条纹线以及一个z平面上的多个方向，“重影”（出现在各种z平面中的重复特征），或在某些区域出现的六边形“蜂窝”图案。这些伪影通常可以通过更好的样品制备，更好的信噪比，调整重建算法的参数或确保所选浸油的折射率适合安装介质和样品来固定。有关SIM伪影的更详细讨论以及用于检查伪影是否存在的免费工具，请参阅Ball等人。17 - 将 SIM 卡重建与宽视场图像进行比较，以观察分辨率的提高。
- 执行多色 SIM 卡时，一旦完成令人满意的重建，请使用对齐算法正确对齐不同的通道。
注意：比对算法使用根据显微镜制造商的说明使用微球微球制备生成的比对参考文件。
3. 图像分析
- MPS中的肌动蛋白环具有独特的周期性外观。使用图像分析软件（见 材料表），使用可见肌动蛋白环的所有焦平面创建最大强度投影图像。
- 在最大强度投影图像上，在可见的相邻环上绘制一条垂直线，并记录荧光强度以及软件的线“绘图曲线”功能。
- 要计算平均峰间距离，请注意线轮廓中的局部最大值，并测量各个相邻荧光强度峰之间的距离。
注意：这可以很容易地计算出来，例如，使用MATLAB中的“findpeaks”功能或（开源的）GNU Octave平台。 - 为了评估MPS中具有肌动蛋白环的不同蛋白质的共定位，请对肌动蛋白和候选蛋白质的SIM重建运行共定位分析程序19，20，21。手动绘制选择以将AIS定义为软件平台中EzColocalization插件的感兴趣区域19，并运行分析以计算共定位的Pearson相关系数（PCC）19，20，21。PCC 值接近 1 表示强共定位。
注意：此协议总结如图 1 所示。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
使用培养的大鼠海马神经元和3D-SIM，描述了一种方案来可视化和测量AIS中MPS的肌动蛋白环和其他组分。图像堆栈的重建显示出肌动蛋白环的明显周期性（图2A）。在我们手中，使用 Alexa 488 标记的霉素可视化的 MPS 中肌动蛋白环的平均峰值间距离为 190 . 36±1 . 7nm （平均±SEM）。这与先前报道的MPS中肌动蛋白环之间的平均距离~190nm一致。同样，抗强耐菌素G抗体用于可视化强耐素G（图2B）。使用共定位分析程序在AIS中测试了ankyrin G和F-actin的共定位，以计算共定位的PCC19，20，21。ankyrin G和F-肌动蛋白荧光共定位的PCC为0.36±0.03（平均±SEM， 图2B）。由于ankyrin G和肌动蛋白环在不同的结构域上结合βIV-光谱，它们没有显示出显着的共定位。这些数据改编自Abouelezz等人16
图 1：用于 3D-SIM 成像样品制备的实验方案示意图。 从大鼠胚胎中收获海马神经元，解离，并在培养物中的玻璃盖玻片上生长14天。然后使用标记的素和适当的抗体固定和染色细胞，然后安装在载玻片上进行 3D - SIM 成像。 请点击此处查看此图的放大版本。
图 2：轴突初始段 （AIS） 中膜周期性骨架 （MPS） 的 3D-SIM 重建。 （A） F-肌动蛋白（绿色）和 ankyrin G（洋红色）显示了 AIS 中的规则分布，由 3D-SIM 可视化。比例尺 = 1 μm. （B） AIS 中 MPS 中 ankyrin G 与 F-actin 共定位的 Pearson 相关系数 （PCC）。Ankyrin G的平均PCC为0.36（黑色圆圈）。灰色菱形表示单个单元格（n = 16），中线表示中位数，误差线表示第 25和第 75百分位数。数据改编自Abouelezz等人.16请单击此处查看此图的放大版本。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
这里描述的方案提供了一种使用超分辨率技术可视化和测量MPS蛋白的方法。由于肌动蛋白环和其他MPS组分的周期性约为190 nm9，10，因此传统的衍射限制成像方法无法揭示MPS的细节。几种显微镜设置可以分辨超分辨率的衍射极限结构，而SIM代表了一种强大而简单的选择。重要的是，SIM与最广泛使用的荧光团兼容，提供了极大的灵活性。此外，SIM 可有效可视化 MPS 中可能暗淡的结构，例如经透阻蛋白治疗的神经元中的肌动蛋白环22 以及活神经元15。
该协议成功的一个重要方面是首先保持MPS的完整性。成功进行SIM成像的最关键步骤发生在样品制备过程中。例如，适度固定（室温下12分钟为4%PFA）和强透化（1%Triton-X持续10分钟）可提供最佳效果。重要的是要记住，特定制剂可能需要的苛刻处理可能会对MPS的结构完整性产生负面影响。因此，也许最好考虑修改这些处理方法，以最大限度地保护MPS。
准备成像样品时要考虑的另一个关键因素是最大化标记密度。理想情况下，每个分子都会被标记和检测。例如，本实验中使用的抗ankyrin G抗体通常用于标记AIS。即使在1：1000的稀释度下使用并在室温下孵育仅1小时，它也在传统的荧光显微镜中具有出色的性能。然而，为了获得超分辨率显微镜的良好标记密度，使用5倍浓度（1：200）并在4°C下孵育抗体过夜是非常有效的。 虽然每种抗体或标记技术的具体要求会有所不同，需要通过实验来确定，但牢记这一点可能会有所帮助。
此外，必须注意的是，实现高信噪比非常适合准确和成功的SIM卡重建。一个好的经验法则是，一旦SIM模态被接合，网格模式应该在单个图像中可见。但是，这并不总是可能的。
最后，必须注意的是，SIM是解析功耗14方面最弱的超分辨率技术之一。因此，虽然它通常足以揭示MPS蛋白的周期性和整体组织，但它提供其相互作用的细节的能力明显低于随机光学重建显微镜（STORM）10。此外，这里描述的技术的实用性仅限于研究具有特异性，性能良好的抗体的蛋白质。然而，这可以通过标记蛋白的外源性表达来部分规避15。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
Pirta Hotulainen博士因其批评性评论而受到认可，这对准备这份手稿非常宝贵。Rimante Minkeviciene博士因其在制备用于原始实验的神经元培养物方面的帮助而受到认可。所有成像均在生物医学成像单元进行。这项工作得到了芬兰科学院（D.M.，SA 266351）和博士课程Brain & Mind（A.A.）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well plates | Corning | 3524 | |
| 4% Paraformaldehyde | |||
| Alexa-488 Phalloidin | ThermoFisher | A12379 | |
| Alexa-647 anti-mouse | ThermoFisher | A31571 | |
| Anti-Ankyrin G antibody | UC Davis/NIH NeuroMab Facility, Clone 106/36 | 75-146 | |
| Anti-MAP2 antibody | Merck Millipore | AB5543 | |
| B-27 | Invitrogen | 17504044 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | BioWest | P6154 | |
| Deltavision OMX SR | GE Healthcare Life Sciences | N/A | |
| Fiji software package | ImageJ | ||
| GNU Octave | GNU | ||
| High performance coverslips | Marienfeld | 117530 | |
| Immersion Oil Calculator | Cytiva Life Sciences | https://tinyurl.com/ImmersionOilCalculator | |
| L-Glutamine | VWR | ICNA1680149 | |
| MATLAB R2020a | Mathworks | ||
| Neurobasal media | Invitrogen | 21103049 | |
| OMX SR | Delta Vision OMX | ||
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | |
| ProLong Gold mounting media | Invitrogen | P10144 | |
| softWoRx Deconvolution | Cytiva Life Sciences | ||
| Superfrost Slides | Epredia | ISO 8037/1 | |
| TetraSpeck microspheres 0.1 µm | ThermoFisher | T7279 | |
| Triton-X | Sigma | X100 |
References
- Leterrier, C. The Axon initial segment, 50 years later: A nexus for neuronal organization and function. Current Topics in Membranes. 77, 185-233 (2016).
- Leterrier, C., Dargent, B. No pasaran! Role of the axon initial segment in the regulation of protein transport and the maintenance of axonal identity. Seminars in Cell & Developmental Biology. 27, 44-51 (2014).
- Brachet, A., et al. Ankyrin G restricts ion channel diffusion at the axonal initial segment before the establishment of the diffusion barrier. Journal of Cell Biology. 191 (2), 383-395 (2010).
- Nakada, C., et al. Accumulation of anchored proteins forms membrane diffusion barriers during neuronal polarization. Nature Cell Biology. 5 (7), 626-632 (2003).
- Song, A. H., et al. A selective filter for cytoplasmic transport at the axon initial segment. Cell. 136 (6), 1148-1160 (2009).
- Sun, X., et al. Selective filtering defect at the axon initial segment in Alzheimer's disease mouse models. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (39), 14271-14276 (2014).
- Winckler, B., Forscher, P., Mellman, I. A diffusion barrier maintains distribution of membrane proteins in polarized neurons. Nature. 397 (6721), 698-701 (1999).
- Kole, M. H., et al. Action potential generation requires a high sodium channel density in the axon initial segment. Nature Neuroscience. 11 (2), 178-186 (2008).
- Xu, K., Zhong, G., Zhuang, X. Actin, spectrin, and associated proteins form a periodic cytoskeletal structure in axons. Science. 339 (6118), 452-456 (2013).
- Leterrier, C., et al. Nanoscale architecture of the axon initial segment reveals an organized and robust scaffold. Cell Reports. 13 (12), 2781-2793 (2015).
- Leterrier, C. The axon initial segment: An updated viewpoint. The Journal of Neuroscience. 38 (9), 2135-2145 (2018).
- Hamdan, H., et al. Mapping axon initial segment structure and function by multiplexed proximity biotinylation. Nature Communications. 11 (1), 100 (2020).
- Zhou, R., et al. Proteomic and functional analyses of the periodic membrane skeleton in neurons. bioRxiv. , (2020).
- Valli, J., et al. Seeing beyond the limit: A guide to choosing the right super-resolution microscopy technique. Journal of Biological Chemistry. 297 (1), 100791 (2021).
- Wang, T., et al. Radial contractility of actomyosin rings facilitates axonal trafficking and structural stability. Journal of Cell Biology. 219 (5), 201902001 (2020).
- Abouelezz, A., Stefen, H., Segerstråle, M., Micinski, D., Minkeviciene, R., Lahti, L., Hardeman, E., Gunning, P., Hoogenraad, C., Taira, T., Fath, T., Hotulainen, P. Tropomyosin Tpm3.1 is required to maintain the structure and function of the axon initial segment. iScience. 23 (5), 101053 (2020).
- Muller, M., Monkemoller, V., Hennig, S., Hubner, W., Huser, T. Open-source image reconstruction of super-resolution structured illumination microscopy data in ImageJ. Nature Communications. 7, 10980 (2016).
- Ball, G., et al. SIMcheck: a toolbox for successful super-resolution structured illumination microscopy. Scientific Reports. 5, 15915 (2015).
- Stauffer, W., Sheng, H., Lim, H. N. EzColocalization: An ImageJ plugin for visualizing and measuring colocalization in cells and organisms. Scientific Reports. 8 (1), 15764 (2018).
- Dunn, K. W., Kamocka, M. M., McDonald, J. H. A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 300 (4), 723-742 (2011).
- Lahti, L. Data analysis supplement to the research article Abouelezz, Stefen, Segerstråle, Micinski, Minkeviciene, Lahti, Hardeman, Gunning, Hoogenraad, Taira, Fath, & Hotulainen. Tropomyosin Tpm3.1 Is Required to Maintain the Structure and Function of the Axon Initial Segment. , (2021).
- Abouelezz, A., Micinski, D., Lipponen, A., Hotulainen, P. Sub-membranous actin rings in the axon initial segment are resistant to the action of latrunculin. Journal of Biological Chemistry. 400 (9), 1141-1146 (2019).
