3D 구조화 조명 현미경(3D-SIM)을 사용하여 축삭 초기 세그먼트의 멤브레인 주기적 골격의 특성 측정
Summary
본 프로토콜은 배양된 래트 해마 뉴런 및 3D 구조화된 조명 현미경(3D-SIM)을 사용하여 축색 초기 분절의 막주기적 골격의 액틴 고리 및 기타 성분을 시각화하고 측정하는 방법을 기술한다.
Abstract
축삭 초기 세그먼트 (AIS)는 작용 전위가 시작되고 소마토 수지상 화물을 분류하여 신경 극성의 유지에 기여하는 수송 필터 및 확산 장벽을 구성하는 부위입니다. 주기적 액틴 고리를 포함하는 막 주기적 골격 (MPS)은 구조 단백질 및 상이한 이온 채널을 포함하는 다양한 AIS 단백질을 앵커링하기 위한 스캐폴드를 제공한다. 최근의 프로테오믹 접근법이 상당한 수의 새로운 AIS 성분을 확인했지만, MPS의 구조와 개별 구성 요소의 역할에 대한 세부 사항은 부족합니다. MPS (~ 190nm)에서 개별 액틴 링 사이의 거리는 MPS의 구조적 세부 사항을 해결하기 위해 초분해능 현미경 검사 기술을 사용해야합니다. 이 프로토콜은 배양된 래트 해마 뉴런을 사용하여 3D 구조화된 조명 현미경(3D-SIM)을 사용하여 막하 액틴 고리에 비해 MPS 내의 AIS 단백질의 정확한 국소화를 조사하는 방법을 기술한다. 또한, 개별 성분의 주기성 및 액틴 고리에 대한 그들의 위치를 정량적으로 평가하기 위한 분석적 접근법이 또한 설명된다.
Introduction
축삭 초기 세그먼트(AIS)는 척추동물 뉴런의 근위 축삭의 짧고 독특하게 전문화된 영역이다1. AIS는 소마토-수지상 화물 2,3,4,5,6,7을 분류하여 뉴런 극성을 유지하는 데 필수적인 수송 필터 및 확산 장벽을 포함한다. 또한, AIS의 독특한 구조는 작용 전위 개시 부위로서의 기능을 용이하게 하는 전압 게이팅된 이온 채널의 클러스터를 수용할 수 있게 한다8. 매우 안정적인 구조 단지는 AIS의 고유 한 기능의 기초가됩니다. 지난 10년 동안의 연구는 스펙트린에 의해 연결된 액틴 고리를 함유하는 막 주기적 골격(MPS)의 존재를 밝혀냈으며, 다양한 AIS 단백질9,10을 앵커링하기 위한 스캐폴드를 제공한다.
MPS (∼190 nm)9,10에서 액틴 링 사이의 거리는 종래의 광 현미경의 해상도 한계 미만이다. MPS를 시각화하기 위해 전자 현미경을 사용하려는 초기 시도는 MPS의 구조를 보존하지 못했기 때문에 성공하지 못했습니다. 따라서, 초분해능 현미경 기술은 MPS11의 구조적 세부 사항 중 일부를 밝히는 데 매우 중요한 것으로 입증되었습니다. 그러나 AIS 구조 복합체에 대한 이해, 구성 요소의 정체성과 기능, 시공간 조절은 여전히 불완전합니다. 최근의 프로테오믹 연구는 AIS12,13의 구조적 성분에 가까운 AIS에 국한되는 단백질의 상당한 목록을 만드는 데 성공했다. 그럼에도 불구하고 AIS 단지의 기능과 정확한 위치에 대한 세부 사항은 부족합니다. 따라서 초분해능 현미경 검사 기술은 다른 MPS 구성 요소에 비해 이러한 단백질의 정확한 위치를 검사하고 기능을 조사하는 데 필수적인 도구 역할을합니다. 몇몇 광 현미경 기술은 빛의 회절 한계보다 높은 분해능을 달성할 수 있으며, 일부는 단일 분자를 국소화할 수도 있다. 그러나, 이러한 기술들 중 다수는 전형적으로 특수한 형광단 또는 이미징 버퍼를 필요로 하며, 이미지 획득은 종종 시간-집약적이다14.
3D 구조화된 조명 현미경(3D-SIM)은 사용 편의성과 간단한 샘플 준비 요구 사항으로 인해 이미징 또는 샘플 준비를 위한 특수 시약이 필요하지 않으며 다양한 형광단 및 샘플과 잘 작동하며 여러 색상으로 쉽게 구현할 수 있으며 라이브 셀 이미징이 가능합니다15. SIM이 제공하는 최상의 해상도(~120nm)는 다른 많은 초분해능 기술에 비해 낮지만, 많은 응용 분야(예: 뉴런에서 MPS의 구성 요소 해결)에 충분합니다. 따라서 SIM이 적합한 선택인지 또는 더 높은 해상도가 필요한지 여부를 결정하기 위해 특정 응용 프로그램에 대한 요구 사항을 고려하는 것이 중요합니다. 여기에서, Abouelezz et al.16에서 구현된 바와 같이, 배양된 해마 뉴런 및 3D 구조화된 조명 현미경(3D-SIM)을 사용하여 MPS 내의 액틴 고리에 대한 추정적 AIS 단백질의 위치 및 조직을 조사하기 위한 프로토콜이 기술되어 있다.16
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 설명된 프로토콜은 초분해능 기술을 사용하여 MPS 단백질을 시각화하고 측정하는 방법을 제공한다. 액틴 링 및 기타 MPS 성분은 ~190 nm9,10의 주기성을 나타내므로, 기존의 회절 제한 이미징 접근법은 MPS의 세부사항을 밝힐 수 없다. 여러 현미경 검사 설정을 통해 회절 제한 구조를 초분해능으로 해결할 수 있으며 SIM은 강력하고 복잡하지 않은 옵션?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Pirta Hotulainen 박사는이 원고를 준비하는 데 매우 귀중한 비판적 의견으로 인정 받고 있습니다. Rimante Minkeviciene 박사는 원래 실험에 사용 된 신경 배양을 준비하는 데 도움을 준 것으로 인정 받고 있습니다. 모든 이미징은 Biomedicum Imaging Unit에서 수행되었다. 이 작품은 핀란드 아카데미 (D.M., SA 266351)와 박사 과정 Brain & Mind (A.A.)의 지원을 받았습니다.
Materials
| 24-well plates | Corning | 3524 | |
| 4% Paraformaldehyde | |||
| Alexa-488 Phalloidin | ThermoFisher | A12379 | |
| Alexa-647 anti-mouse | ThermoFisher | A31571 | |
| Anti-Ankyrin G antibody | UC Davis/NIH NeuroMab Facility, Clone 106/36 | 75-146 | |
| Anti-MAP2 antibody | Merck Millipore | AB5543 | |
| B-27 | Invitrogen | 17504044 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | BioWest | P6154 | |
| Deltavision OMX SR | GE Healthcare Life Sciences | N/A | |
| Fiji software package | ImageJ | ||
| GNU Octave | GNU | ||
| High performance coverslips | Marienfeld | 117530 | |
| Immersion Oil Calculator | Cytiva Life Sciences | https://tinyurl.com/ImmersionOilCalculator | |
| L-Glutamine | VWR | ICNA1680149 | |
| MATLAB R2020a | Mathworks | ||
| Neurobasal media | Invitrogen | 21103049 | |
| OMX SR | Delta Vision OMX | ||
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | |
| ProLong Gold mounting media | Invitrogen | P10144 | |
| softWoRx Deconvolution | Cytiva Life Sciences | ||
| Superfrost Slides | Epredia | ISO 8037/1 | |
| TetraSpeck microspheres 0.1 µm | ThermoFisher | T7279 | |
| Triton-X | Sigma | X100 |
References
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