Summary
Il presente protocollo descrive un metodo per visualizzare e misurare gli anelli di actina e altri componenti dello scheletro periodico di membrana del segmento iniziale dell'assone utilizzando neuroni ippocampali di ratto in coltura e microscopia a illuminazione strutturata in 3D (3D-SIM).
Abstract
Il segmento iniziale dell'assone (AIS) è il sito in cui iniziano i potenziali d'azione e costituisce un filtro di trasporto e una barriera di diffusione che contribuiscono al mantenimento della polarità neuronale ordinando il carico somato-dendritico. Uno scheletro periodico di membrana (MPS) composto da anelli periodici di actina fornisce un'impalcatura per l'ancoraggio di varie proteine AIS, comprese le proteine strutturali e diversi canali ionici. Sebbene i recenti approcci proteomici abbiano identificato un numero considerevole di nuovi componenti AIS, mancano dettagli sulla struttura delle MPS e sui ruoli dei suoi singoli componenti. La distanza tra i singoli anelli di actina nella MPS (~ 190 nm) richiede l'impiego di tecniche di microscopia a super-risoluzione per risolvere i dettagli strutturali della MPS. Questo protocollo descrive un metodo per l'utilizzo di neuroni ippocampali di ratto in coltura per esaminare la localizzazione precisa di una proteina AIS nella MPS rispetto agli anelli di actina sub-membranosa utilizzando la microscopia ad illuminazione strutturata 3D (3D-SIM). Inoltre, viene descritto anche un approccio analitico per valutare quantitativamente la periodicità dei singoli componenti e la loro posizione rispetto agli anelli di actina.
Introduction
Il segmento iniziale dell'assone (AIS) è una regione corta e specializzata dell'assone prossimale dei neuroni vertebrati1. L'AIS comprende un filtro di trasporto e una barriera di diffusione essenziali per mantenere la polarità neuronale ordinando il carico somato-dendritico2,3,4,5,6,7. Inoltre, la struttura unica dell'AIS consente di ospitare cluster di canali ionici voltaggio-dipendenti che facilitano la sua funzione come sito di avvio del potenziale d'azione8. Un complesso strutturale altamente stabile è alla base delle funzioni uniche dell'AIS. La ricerca nell'ultimo decennio ha rivelato la presenza di uno scheletro periodico di membrana (MPS) contenente anelli di actina collegati da spettrina e che fornisce un'impalcatura per l'ancoraggio di varie proteine AIS9,10.
La distanza tra gli anelli di actina nell'MPS (~190 nm)9,10 è inferiore al limite di risoluzione della microscopia ottica convenzionale. I primi tentativi di utilizzare la microscopia elettronica per visualizzare l'MPS non hanno avuto successo, poiché le dure procedure di preparazione coinvolte non sono riuscite a preservare la struttura della MPS. Pertanto, le tecniche di microscopia a super-risoluzione si sono dimostrate preziose per chiarire alcuni dei dettagli strutturali dell'MPS11. Tuttavia, la comprensione del complesso strutturale AIS, l'identità e le funzioni dei suoi componenti e la sua regolazione spaziotemporale sono ancora incomplete. Recenti studi proteomici sono riusciti a creare un considerevole elenco di proteine che si localizzano nell'AIS vicino ai componenti strutturali dell'AIS12,13. Tuttavia, mancano dettagli sulla loro funzione e sul loro posto preciso nel complesso AIS. Pertanto, le tecniche di microscopia a super-risoluzione servono come strumento essenziale per esaminare le posizioni accurate di queste proteine rispetto ad altri componenti MPS e studiare le loro funzioni. Diverse tecniche di microscopia ottica possono raggiungere risoluzioni superiori al limite di diffrazione della luce, alcune addirittura in grado di localizzare singole molecole. Tuttavia, molte di queste tecniche richiedono in genere fluorofori specializzati o buffer di imaging e l'acquisizione delle immagini richiede spesso molto tempo14.
La microscopia a illuminazione strutturata 3D (3D-SIM), grazie alla sua facilità d'uso e ai semplici requisiti di preparazione dei campioni, non richiede reagenti speciali per l'imaging o la preparazione dei campioni, funziona bene con una vasta gamma di fluorofori e campioni, può essere facilmente implementata in più colori ed è in grado di eseguire l'imaging di cellule vive15. Mentre la migliore risoluzione possibile offerta dalla SIM (~ 120 nm) è bassa rispetto a molte altre tecniche di super-risoluzione, è sufficiente per molte applicazioni (ad esempio, per risolvere i componenti della MPS nei neuroni). Pertanto, è fondamentale considerare il requisito per applicazioni specifiche per determinare se la SIM è una scelta adatta o se è necessaria una risoluzione ancora più elevata. Qui, viene descritto un protocollo per l'utilizzo di neuroni ippocampali in coltura e microscopia di illuminazione strutturata 3D (3D-SIM) per esaminare la posizione e l'organizzazione di presunte proteine AIS rispetto agli anelli di actina nelle MPS, come implementato in Abouelezz et al.16
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Protocol
I neuroni primari dell'ippocampo utilizzati in questi esperimenti sono stati raccolti16 da embrioni embrionali di ratto Wistar del giorno 17 di entrambi i sessi secondo le linee guida etiche dell'Università di Helsinki e della legge finlandese.
1. Preparazione del campione
- Su coperture di vetro ad alta fedeltà, consentire ai neuroni dell'ippocampo di ratto di crescere in condizioni di coltura sparse (~ 5.000-10.000 cellule / cm2) per 14 giorni (14 giorni in vitro).
NOTA: l'uso di colture sparse riduce le possibilità di sovrapposizione dei neuriti, il che aiuta a quantificare l'MPS. - Fissare i neuroni usando il 4% di paraformaldeide per 12 minuti a temperatura ambiente. Lavare il coverslip una volta nello 0,2% di BSA in PBS (BSA-PBS), quindi incubare per 10 minuti in una soluzione all'1% di Triton-X in PBS a temperatura ambiente. Lavare una volta in BSA-PBS.
- Anticorpi anti-anchirina G diluiti (1:200) in BSA-PBS. Aggiungere una soluzione anticorpale al coverslip e incubare durante la notte a 4 °C. Facoltativamente, aggiungere anticorpi anti-MAP2 di pollo (vedere Tabella dei materiali) alla soluzione anticorpale per delimitare il dominio somato-dendritico.
- Lavare le cellule una volta in BSA-PBS, seguito dallo 0,1% di Triton-X in PBS, quindi fare un lavaggio finale in BSA-PBS.
- Diluire gli anticorpi secondari anti-topo marcati con fluoroforo (1:200) (vedere Tabella dei materiali) in BSA-PBS, aggiungere al coverslip e incubare per 1 ora a temperatura ambiente. Lavare le cellule una volta in BSA-PBS, una volta nello 0,1% di Triton-X in PBS, quindi una volta in PBS.
- Preparare una soluzione da 1 μM di falloidina marcata in PBS (vedere Tabella dei materiali) e aggiungerla alle celle. Incubare per 2 ore a temperatura ambiente. Lavare le cellule una volta in PBS, una volta nello 0,1% di Triton-X in PBS, quindi una volta in PBS.
NOTA: la falloidina con tag AlexaFluor488 è stata utilizzata qui, ma anche altri tag funzioneranno. - Per montare il coperchio su un vetrino, applicare una goccia di supporto di montaggio su un vetrino, immergere il coperchio in acqua deionizzata e tamponare usando un tovagliolo di carta morbida (per rimuovere l'acqua in eccesso).
- Posizionare il coperchio sul vetrino. Incubare a temperatura ambiente per 24 ore.
NOTA: non sono stati osservati effetti avversi sul campione utilizzando supporti di montaggio rigidi (indice di rifrazione 1,47 dopo la polimerizzazione).
- Posizionare il coperchio sul vetrino. Incubare a temperatura ambiente per 24 ore.
2. Imaging
- Se possibile, consultare il personale della struttura di microscopia prima dell'imaging. Utilizzare un calcolatore di olio ad immersione (vedere Tabella dei materiali) per selezionare l'olio ad immersione adatto al campione.
- Una volta che i campioni sono pronti, assicurarsi che i coperchi siano puliti e privi di residui o supporti di montaggio in eccesso. Se necessario, utilizzare una punta di cotone imbevuta di acqua o etanolo per pulire. Posizionare il campione in un microscopio 3D compatibile con SIM (vedere Tabella dei materiali) e trovare una cella da visualizzare.
- Regolare la potenza delle linee laser pertinenti e i tempi di esposizione per massimizzare il rapporto segnale-rumore senza sbiancare significativamente il campione.
NOTA: un buon rapporto segnale-rumore mostrerà un aspetto chiaro simile a una griglia focalizzato sul campione e porterà a accurate ricostruzioni ad alta risoluzione. Le linee laser a 488 nm e 640 nm sono state utilizzate per visualizzare rispettivamente F-actina e anchirina G. - Impostate i limiti superiore e inferiore del campione nella dimensione z e procedete all'acquisizione di una pila.
NOTA: qui è stata utilizzata la dimensione z-step di 125 nm. - Per una ricostruzione SIM di successo, assicurarsi che il software di microscopia (vedere Tabella dei materiali) disponga di un file di trasferimento ottico (OTF) adatto ai coloranti utilizzati.
NOTA: questi sono in genere creati e mantenuti da personale specializzato. In assenza di un sistema operativo di negoziazione funzionale, sono disponibili anche strumenti open source per eseguire ricostruzioni basate su stime17. In questo lavoro, sono stati utilizzati file OTF aggiornati controllati da personale specializzato. - Eseguire l'algoritmo di ricostruzione sullo stack per ottenere una ricostruzione super-risolta. Controllare le ricostruzioni per gli artefatti noti e, se necessario, regolare i parametri per correggerli.
NOTA: i parametri predefiniti dell'algoritmo in genere forniscono risultati accurati. Molti di questi artefatti coinvolgono alcuni modelli ripetuti: linee a strisce insieme a più direzioni su un piano z, "ghosting" (caratteristiche ripetute che appaiono in vari piani z) o un modello esagonale a "nido d'ape" che emerge in alcune aree. Questi artefatti possono spesso essere riparati con una migliore preparazione del campione, un migliore rapporto segnale-rumore, regolando i parametri dell'algoritmo di ricostruzione o assicurando che l'indice di rifrazione dell'olio di immersione scelto sia adatto per il mezzo di montaggio e il campione. Per una discussione più dettagliata degli artefatti SIM e uno strumento disponibile gratuitamente per verificare la presenza di artefatti, vedere Ball et al. 18 anni - Confronta la ricostruzione della SIM con un'immagine ad ampio campo per osservare i miglioramenti della risoluzione.
- Quando si esegue una SIM multicolore, utilizzare l'algoritmo di allineamento per allineare correttamente i diversi canali una volta pronta una ricostruzione soddisfacente.
NOTA: l'algoritmo di allineamento utilizza un file di riferimento di allineamento generato utilizzando una preparazione di perline di microsfera secondo le istruzioni del produttore del microscopio.
3. Analisi delle immagini
- Gli anelli di actina nelle MPS hanno un aspetto periodico distintivo. Utilizzando un software di analisi delle immagini (vedi Tabella dei materiali), creare un'immagine di proiezione di massima intensità utilizzando tutti i piani focali in cui sono visibili gli anelli di actina.
- Sull'immagine di proiezione a massima intensità, disegna una linea perpendicolare attraverso anelli adiacenti visibili e registra l'intensità di fluorescenza insieme alla funzione "Plot Profile" della linea del software.
- Per calcolare la distanza media tra i picchi, annotare i massimi locali nel profilo della linea e misurare la distanza tra i singoli picchi di intensità fluorescente adiacenti.
NOTA: Questo può essere facilmente calcolato, ad esempio, usando la funzione 'findpeaks' in MATLAB o la piattaforma GNU Octave (open-source). - Per valutare la colocalizzazione di diverse proteine con anelli di actina nelle MPS, eseguire una procedura di analisi di colocalizzazione19,20,21 sulle ricostruzioni SIM dell'actina e della proteina candidata. Disegna manualmente una selezione per definire l'AIS come regione di interesse per il plug-in EzColocalization nella piattaforma software19 ed esegui l'analisi per calcolare il coefficiente di correlazione (PCC) di Pearson di co-localizzazione19,20,21. Un valore PCC vicino a 1 indica una forte colocalizzazione.
Nota : questo protocollo è riepilogato nella Figura 1.
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Representative Results
Utilizzando neuroni ippocampali di ratto in coltura e 3D-SIM, viene descritto un protocollo per visualizzare e misurare gli anelli di actina e altri componenti della MPS nell'AIS. Le ricostruzioni delle pile di immagini hanno mostrato una chiara periodicità degli anelli di actina (Figura 2A). Nelle nostre mani, la distanza media inter-picco degli anelli di actina nell'MPS, visualizzata utilizzando la falloidina con tag Alexa 488, era di 190,36 ± 1,7 nm (± seM). Ciò è in linea con la distanza media precedentemente riportata di ~ 190 nm tra gli anelli di actina nell'MPS. Allo stesso modo, un anticorpo anti-anchirina G è stato utilizzato per visualizzare l'anchirina G (Figura 2B). La colocalizzazione di anchirina G e F-actina è stata testata nell'AIS utilizzando una procedura di analisi di colocalizzazione per calcolare il PCC di co-localizzazione19,20,21. Il PCC di colocalizzazione dell'anchirina G e della fluorescenza di F-actina è stato di 0,36 ± 0,03 (media ± SEM, Figura 2B). Poiché gli anelli di anchirina G e actina legano la βIV-spettrina in domini diversi, non mostrano una colocalizzazione significativa. Questi dati sono stati adattati da Abouelezz et al.16
Figura 1: Rappresentazione schematica del protocollo per la preparazione del campione per l'imaging 3D-SIM. I neuroni dell'ippocampo vengono raccolti da embrioni di ratto, dissociati e lasciati crescere su coperture di vetro in coltura per 14 giorni. Le cellule vengono quindi fissate e colorate utilizzando falloidina marcata e anticorpi appropriati, quindi montate su vetrini per l'imaging 3D-SIM. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Ricostruzione 3D-SIM dello scheletro periodico di membrana (MPS) nel segmento iniziale dell'assone (AIS). (A) F-actina (verde) e anchirina G (magenta) mostrano una distribuzione regolare nell'AIS, visualizzata da 3D-SIM. Barra di scala = 1 μm. (B) Coefficienti di correlazione di Pearson (PCC) di colocalizzazione dell'anchirina G con F-actina nell'MPS nell'AIS. Il PCC medio dell'anchirina G era 0,36 (cerchio nero). I diamanti grigi rappresentano le singole celle (n = 16), la linea mediana rappresenta la mediana, le barre di errore rappresentano il 25 ° e il 75 ° percentile. I dati sono adattati da Abouelezz et al.16Per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il protocollo qui descritto fornisce un metodo per visualizzare e misurare le proteine MPS utilizzando la tecnica della super-risoluzione. Poiché gli anelli di actina e altri componenti MPS mostrano una periodicità di ~ 190 nm9,10, gli approcci di imaging convenzionali limitati alla diffrazione non possono rivelare i dettagli dell'MPS. Diverse configurazioni di microscopia possono risolvere strutture limitate alla diffrazione in super-risoluzione e la SIM rappresenta un'opzione robusta e semplice. È importante sottolineare che la SIM è compatibile con i fluorofori più utilizzati, offrendo una notevole flessibilità. Inoltre, la SIM è efficace nel visualizzare strutture potenzialmente deboli nelle MPS, come gli anelli di actina nei neuroni trattati con latrunculina22, così come i neuroni vivi15.
Un aspetto essenziale per il successo di questo protocollo è in primo luogo preservare l'integrità dell'MPS. I passaggi più critici per il successo dell'imaging SIM si verificano durante la preparazione del campione. Ad esempio, una fissazione moderata (4% PFA per 12 minuti a temperatura ambiente) e una forte permeabilizzazione (1% Triton-X per 10 minuti) forniscono i migliori risultati. È fondamentale tenere presente che trattamenti duri che possono essere richiesti per preparazioni specifiche possono avere un effetto negativo sull'integrità strutturale delle MPS. Pertanto, è forse meglio considerare la modifica di tali trattamenti per massimizzare la conservazione delle MPS.
L'altro fattore cruciale da considerare quando si preparano i campioni per l'imaging è massimizzare la densità di etichettatura. Idealmente, ogni molecola verrebbe etichettata e rilevata. Ad esempio, l'anticorpo anti-anchirina G utilizzato in questo esperimento è comunemente usato per etichettare l'AIS. Fornisce prestazioni eccezionali nella microscopia a fluorescenza convenzionale, anche se utilizzato a una diluizione di 1:1000 e incubato per solo 1 ora a temperatura ambiente. Tuttavia, per ottenere una buona densità di marcatura per la microscopia a super-risoluzione, è altamente efficace utilizzare 5 volte quella concentrazione (1:200) e incubare l'anticorpo durante la notte a 4 °C. Mentre i requisiti specifici per ogni anticorpo o tecnica di etichettatura varieranno e dovranno essere determinati sperimentalmente, è forse utile tenerlo a mente.
Inoltre, è essenziale notare che il raggiungimento di un elevato rapporto segnale-rumore si presta bene a ricostruzioni SIM accurate e di successo. Una buona regola empirica è che il modello di griglia dovrebbe essere visibile nelle singole immagini una volta attivata la modalità SIM. Tuttavia, questo non è sempre possibile.
Infine, è essenziale notare che la SIM è tra le tecniche di super-risoluzione più deboli nella risoluzione della potenza14. Pertanto, mentre è generalmente sufficiente per rivelare la periodicità e l'organizzazione complessiva delle proteine MPS, è significativamente meno in grado di fornire dettagli sulle loro interazioni rispetto alla microscopia a ricostruzione ottica stocastica (STORM)10. Inoltre, l'utilità della tecnica qui descritta è limitata allo studio delle proteine per le quali è disponibile un anticorpo specifico e ben performante. Tuttavia, questo può essere in parte aggirato attraverso l'espressione esogena di proteine marcate15.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
La dottoressa Pirta Hotulainen è riconosciuta per i suoi commenti critici, preziosi per la preparazione di questo manoscritto. La dottoressa Rimante Minkeviciene è riconosciuta per il suo aiuto nella preparazione delle colture neuronali utilizzate per gli esperimenti originali. Tutte le immagini sono state eseguite nell'unità di imaging biomedico. Questo lavoro è stato sostenuto dall'Accademia di Finlandia (D.M., SA 266351) e dal programma di dottorato Brain & Mind (A.A.)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well plates | Corning | 3524 | |
| 4% Paraformaldehyde | |||
| Alexa-488 Phalloidin | ThermoFisher | A12379 | |
| Alexa-647 anti-mouse | ThermoFisher | A31571 | |
| Anti-Ankyrin G antibody | UC Davis/NIH NeuroMab Facility, Clone 106/36 | 75-146 | |
| Anti-MAP2 antibody | Merck Millipore | AB5543 | |
| B-27 | Invitrogen | 17504044 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | BioWest | P6154 | |
| Deltavision OMX SR | GE Healthcare Life Sciences | N/A | |
| Fiji software package | ImageJ | ||
| GNU Octave | GNU | ||
| High performance coverslips | Marienfeld | 117530 | |
| Immersion Oil Calculator | Cytiva Life Sciences | https://tinyurl.com/ImmersionOilCalculator | |
| L-Glutamine | VWR | ICNA1680149 | |
| MATLAB R2020a | Mathworks | ||
| Neurobasal media | Invitrogen | 21103049 | |
| OMX SR | Delta Vision OMX | ||
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | |
| ProLong Gold mounting media | Invitrogen | P10144 | |
| softWoRx Deconvolution | Cytiva Life Sciences | ||
| Superfrost Slides | Epredia | ISO 8037/1 | |
| TetraSpeck microspheres 0.1 µm | ThermoFisher | T7279 | |
| Triton-X | Sigma | X100 |
References
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