Summary
O presente protocolo descreve um método para visualizar e medir anéis de actina e outros componentes do esqueleto periódico da membrana do segmento inicial do axônio usando neurônios hipocampais de ratos cultivados e microscopia de iluminação estruturada em 3D (3D-SIM).
Abstract
O segmento inicial de axônio (AIS) é o local no qual os potenciais de ação iniciam e constituem um filtro de transporte e barreira de difusão que contribuem para a manutenção da polaridade neuronal através da triagem da carga somato-dendrítica. Um esqueleto periódico de membrana (MPS) composto por anéis periódicos de actina fornece um andaime para ancorar várias proteínas AIS, incluindo proteínas estruturais e diferentes canais de íons. Embora as recentes abordagens proteômicas tenham identificado um número considerável de novos componentes AIS, faltam detalhes da estrutura do MPS e dos papéis de seus componentes individuais. A distância entre anéis de actin individuais no MPS (~190 nm) requer a contratação de técnicas de microscopia de super resolução para resolver os detalhes estruturais do MPS. Este protocolo descreve um método para o uso de neurônios hipocampais de ratos cultivados para examinar a localização precisa de uma proteína AIS no MPS em relação aos anéis de actina sub-membranous usando microscopia de iluminação estruturada em 3D (3D-SIM). Além disso, também é descrita uma abordagem analítica para avaliar quantitivamente a periodicidade dos componentes individuais e sua posição em relação aos anéis de actina.
Introduction
O segmento inicial de axônio (AIS) é uma região curta e exclusivamente especializada do axônio proximal de neurônios vertebrados1. A AIS compreende um filtro de transporte e uma barreira de difusão essencial na manutenção da polaridade neuronal, classificando a carga somato-dendrítica2,3,4,5,6,7. Além disso, a estrutura única da AIS permite acomodar clusters de canais de íons fechados de tensão que facilitam sua função como local de iniciação potencial de ação8. Um complexo estrutural altamente estável está por trás das funções únicas da AIS. Pesquisas na última década revelaram a presença de um esqueleto periódico de membrana (MPS) contendo anéis de actina conectados por espectro e fornecendo um andaime para ancorar várias proteínas AIS9,10.
A distância entre os anéis de actin no MPS (~190 nm)9,10 está sob o limite de resolução da microscopia de luz convencional. As primeiras tentativas de utilização de microscopia eletrônica para visualizar o MPS não foram bem sucedidas, pois os severos procedimentos de preparação envolvidos não conseguiram preservar a estrutura do MPS. Assim, as técnicas de microscopia de super resolução têm se mostrado inestimáveis na elucidação de alguns detalhes estruturais do MPS11. No entanto, o entendimento do complexo estrutural da AIS, a identidade e as funções de seus componentes e sua regulação espostetemporal ainda estão incompletos. Estudos proteômicos recentes conseguiram criar uma lista considerável de proteínas que se localizam na AIS perto de componentes estruturais do AIS12,13. Ainda assim, faltam detalhes de sua função e lugar preciso no complexo AIS. Assim, as técnicas de microscopia de superrespeso servem como uma ferramenta essencial para examinar as posições precisas dessas proteínas em relação a outros componentes de MPS e investigar suas funções. Várias técnicas de microscopia leve podem alcançar resoluções superiores ao limite de difração de luz, algumas até capazes de localização de moléculas únicas. No entanto, muitas dessas técnicas normalmente requerem fluoroforos especializados ou tampões de imagem, e a aquisição de imagens é frequentemente intensiva em tempo14.
Microscopia de iluminação estruturada 3D (3D-SIM), devido à sua facilidade de uso e requisitos simples de preparação de amostras, não requer reagentes especiais para a preparação de imagens ou amostras, funciona bem com uma ampla gama de fluoroforos e amostras, pode ser facilmente implementado em múltiplas cores, e é capaz de imagens de células vivas15. Embora a melhor resolução possível que o SIM oferece (~120 nm) seja baixa em comparação com muitas outras técnicas de super-resolução, é suficiente para muitas aplicações (por exemplo, para resolver os componentes do MPS em neurônios). Assim, é fundamental considerar a exigência de aplicações específicas para determinar se o SIM é uma escolha adequada ou se uma resolução ainda maior é necessária. Aqui, um protocolo é descrito para o uso de neurônios hipocampais cultivados e microscopia de iluminação estruturada em 3D (3D-SIM) para examinar a posição e organização de proteínas AIS putativas relativas aos anéis de actina no MPS, conforme implementado em Abouelezz et al.16
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Protocol
Os neurônios hipocampais primários usados nesses experimentos foram colhidos16 a partir do dia 17 embriões de ratos Wistar de ambos os sexos sob as diretrizes éticas da Universidade de Helsinque e da lei finlandesa.
1. Preparação da amostra
- Em tampas de vidro de alta fidelidade, permitem que os neurônios hipocampais de ratos cresçam em condições de cultura esparsas (~5.000-10.000 células/cm2) por 14 dias (14 dias in vitro).
NOTA: O uso de culturas esparsas reduz as chances de sobreposição de neurites, o que ajuda a quantificar o MPS. - Fixar neurônios usando 4% de paraformaldeído por 12 minutos à temperatura ambiente. Lave a tampa uma vez em 0,2% de BSA em PBS (BSA-PBS), depois incubar por 10 min em uma solução de 1% de Triton-X em PBS à temperatura ambiente. Lave uma vez no BSA-PBS.
- Diluir anticorpos anti-ankyrin G (1:200) em BSA-PBS. Adicione a solução de anticorpos ao deslizamento de tampas e incubar durante a noite a 4 °C. Opcionalmente, adicione anticorpos anti-MAP2 de frango (ver Tabela de Materiais) à solução de anticorpos para demarcar o domínio somato-dendrático.
- Lavar células uma vez no BSA-PBS, seguido por 0,1% Triton-X em PBS, em seguida, fazer uma lavagem final em BSA-PBS.
- Diluir anticorpos secundários anti-camundongos com marca fluorforésa (1:200) (ver Tabela de Materiais) em BSA-PBS, adicionar ao deslizamento de tampa e incubar por 1h à temperatura ambiente. Lave as células uma vez no BSA-PBS, uma vez em 0,1% Triton-X na PBS, depois uma vez na PBS.
- Prepare uma solução de 1 μM de falo-bróide marcada em PBS (ver Tabela de Materiais) e adicione-a às células. Incubar por 2h em temperatura ambiente. Lave células uma vez na PBS, uma vez em 0,1% Triton-X na PBS, depois uma vez na PBS.
NOTA: A falooidina com marca AlexaFluor488 foi usada aqui, mas outras tags também funcionarão. - Para montar o deslizamento de tampa em um slide de vidro, aplique uma gota de mídia de montagem em um escorregador de vidro, mergulhe o deslizamento em água deionizada e dab usando uma toalha de papel macio (para remover o excesso de água).
- Coloque a mancha de cobertura no deslizamento de vidro. Incubar em temperatura ambiente por 24 h.
NOTA: Não foram observados efeitos adversos na amostra utilizando-se mídia de montagem de ajuste rígido (índice de refração 1,47 após a cura).
- Coloque a mancha de cobertura no deslizamento de vidro. Incubar em temperatura ambiente por 24 h.
2. Imagem
- Se possível, consulte o pessoal da instalação de microscopia antes da imagem. Use uma calculadora de óleo de imersão (ver Tabela de Materiais) para selecionar o óleo de imersão adequado para a amostra.
- Uma vez que as amostras estejam prontas, certifique-se de que as tampas estejam limpas e limpas de qualquer resíduo ou excesso de mídia de montagem. Se necessário, use uma ponta de algodão mergulhada em água ou etanol para limpar. Coloque a amostra em um microscópio 3D capaz de SIM (ver Tabela de Materiais) e encontre uma célula para imagem.
- Ajuste a potência das linhas laser relevantes e os tempos de exposição para maximizar a relação sinal-ruído sem branquear significativamente a amostra.
NOTA: Uma boa relação sinal-ruído mostrará uma aparência clara em termos de grade focada na amostra e levará a reconstruções precisas de alta resolução. Linhas laser de 488 nm e 640 nm foram utilizadas para visualizar F-actin e ankyrin G, respectivamente. - Defina os limites superiores e inferiores da amostra na dimensão z e prossiga para adquirir uma pilha.
NOTA: foi utilizado aqui o tamanho do passo z de 125 nm. - Para uma reconstrução sim bem sucedida, certifique-se de que o software de microscopia (ver Tabela de Materiais) tenha um arquivo de transferência óptica (OTF) adequado para os corantes usados.
NOTA: Estes são tipicamente criados e mantidos por pessoal especializado. Na ausência de uma OTF funcional, ferramentas de código aberto também estão disponíveis para realizar reconstruções com base em estimativas17. Neste trabalho, os arquivos OTF atualizados foram usados controlados por pessoal especializado. - Execute o algoritmo de reconstrução na pilha para obter uma reconstrução super resolvida. Verifique as reconstruções se há artefatos conhecidos e, se necessário, ajuste os parâmetros para corrigi-los.
NOTA: Os parâmetros padrão do algoritmo normalmente dão resultados precisos. Muitos desses artefatos envolvem alguns padrões repetitivos: linhas listradas junto com múltiplas direções em um plano z, 'ghosting' (características repetidas que aparecem em vários z-planes), ou um padrão hexagonal de "favo de mel" emergindo em algumas áreas. Esses artefatos podem ser fixados com melhor preparação da amostra, uma melhor relação sinal-ruído, ajustando os parâmetros do algoritmo de reconstrução ou garantindo que o índice refrativo do óleo de imersão escolhido seja adequado para o meio de montagem e amostra. Para uma discussão mais detalhada sobre artefatos SIM e uma ferramenta livremente disponível para verificar a presença de artefatos, consulte Ball et al. 18 - Compare a reconstrução do SIM com uma imagem de campo amplo para observar melhorias na resolução.
- Ao executar o SIM multicolor, use o algoritmo de alinhamento para alinhar corretamente os diferentes canais, uma vez que uma reconstrução satisfatória esteja pronta.
NOTA: O algoritmo de alinhamento usa um arquivo de referência de alinhamento gerado usando uma preparação de contas da microsfera de acordo com a instrução do fabricante do microscópio.
3. Análise de imagem
- Os anéis actin no MPS têm uma aparência periódica distinta. Usando o software de análise de imagem (ver Tabela de Materiais), crie uma imagem de projeção de intensidade máxima usando todos os planos focais onde os anéis de actin são visíveis.
- Na imagem de projeção de intensidade máxima, desenhe uma linha perpendicular através de anéis adjacentes visíveis e regisse a intensidade da fluorescência juntamente com a função 'Plot Profile' do software.
- Para calcular a distância média entre o pico, observe a máxima local no perfil da linha e meça a distância entre picos individuais de intensidade fluorescente adjacente.
NOTA: Isso pode ser facilmente calculado, por exemplo, usando a função 'findpeaks' na plataforma MATLAB ou na plataforma GNU Octave (código aberto). - Para avaliar a colocalização de diferentes proteínas com anéis de actina no MPS, execute um procedimento de análise de colocalização19,20,21 sobre reconstruções sim de actin e proteína candidata. Desenhe manualmente uma seleção para definir o AIS como uma região de interesse para o plugin EzColocalization na plataforma de software19 e execute a análise para calcular o coeficiente de correlação (PCC) da co-localização19,20,21. Um valor do PCC próximo a 1 indica forte colocalização.
NOTA: Este protocolo é resumido na Figura 1.
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Representative Results
Usando neurônios hipocampais de ratos cultivados e 3D-SIM, um protocolo é descrito para visualizar e medir anéis de actina e outros componentes do MPS na AIS. Reconstruções de pilhas de imagens mostraram clara periodicidade dos anéis actin (Figura 2A). Em nossas mãos, a média de distância entre picos de anéis actin no MPS, visualizado usando alexa 488-tagged phalloidin, foi de 190,36 ± 1,7 nm (média ± SEM). Isso está em linha com a distância média relatada anteriormente de ~190 nm entre anéis actin no MPS. Da mesma forma, um anticorpo anti-ankyrin G foi usado para visualizar ankyrin G (Figura 2B). A colocalização de ankyrin G e F-actin foi testada na AIS utilizando-se de um procedimento de análise de colocalização para calcular o PCC de co-localização19,20,21. O PCC de colocalização da fluorescência anquilina G e F-actin foi de 0,36 ± 0,03 (média ± SEM, Figura 2B). Como ankyrin G e actin rings ligam βIV-spectrin em diferentes domínios, eles não mostram colocalização significativa. Esses dados foram adaptados de Abouelezz et al.16
Figura 1: Representação esquemática do protocolo de preparação da amostra para imagem 3D-SIM. Os neurônios hipocampais são colhidos a partir de embriões de ratos, dissociados e autorizados a crescer em tampas de vidro na cultura por 14 dias. As células são então fixas e manchadas usando falooidina marcada e anticorpos apropriados, em seguida, montadas em lâminas de vidro para imagens 3D-SIM. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Reconstrução 3D-SIM do esqueleto periódico de membrana (MPS) no segmento inicial de axônio (AIS). (A) F-actin (verde) e anquilo G (magenta) mostram distribuição regular no AIS, visualizado pelo 3D-SIM. Barra de escala = 1 μm. (B) Coeficientes de correlação de Pearson (PCC) de colocalização de anquiloG com F-actin no MPS na AIS. O PCC médio de ankyrin G foi de 0,36 (círculo negro). Os diamantes cinzentos representam células individuais (n = 16), a linha média representa a mediana, as barras de erro representam percentis 25º e 75º. Os dados são adaptados de Abouelezz et al.16Please clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O protocolo descrito aqui fornece um método para visualizar e medir proteínas MPS usando a técnica de super-resolução. Como os anéis de actin e outros componentes MPS exibem uma periodicidade de ~190 nm9,10, abordagens de imagem convencionais limitadas à difração não podem revelar os detalhes do MPS. Várias configurações de microscopia podem resolver estruturas limitadas à difração em super resolução, e o SIM representa uma opção robusta e descomplicada. É importante ressaltar que o SIM é compatível com os fluoroforos mais utilizados, proporcionando flexibilidade significativa. Além disso, o SIM é eficaz na visualização de estruturas potencialmente fracas no MPS, como anéis de actina em neurônios tratados com latrunculina22, bem como neurônios vivos15.
Um aspecto essencial para o sucesso deste protocolo é preservar a integridade do MPS em primeiro lugar. As etapas mais críticas para o sucesso da imagem SIM ocorrem durante a preparação da amostra. Por exemplo, fixação moderada (4% PFA para 12 min em temperatura ambiente) e permeabilização forte (1% Triton-X por 10 min) fornecem os melhores resultados. É crucial ter em mente que tratamentos severos que podem ser necessários para preparações específicas podem ter um efeito negativo sobre a integridade estrutural do MPS. Portanto, talvez seja melhor considerar a modificação desses tratamentos para maximizar a preservação do MPS.
O outro fator crucial a ser considerado ao preparar amostras para imagens é maximizar a densidade de rotulagem. Idealmente, cada molécula seria marcada e detectada. Por exemplo, o anticorpo anti-ankyrin G usado neste experimento é comumente usado para rotular o AIS. Proporciona excelente desempenho em microscopia de fluorescência convencional, mesmo quando usado em uma diluição de 1:1000 e incubado por apenas 1h à temperatura ambiente. No entanto, para obter uma boa densidade de rotulagem para microscopia de super-resolução, é altamente eficaz usar 5 vezes essa concentração (1:200) e incubar o anticorpo durante a noite a 4 °C. Embora os requisitos específicos para cada anticorpo ou técnica de rotulagem variem e precisem ser determinados experimentalmente, talvez seja útil ter isso em mente.
Além disso, é essencial notar que alcançar uma alta relação sinal-ruído se presta bem a reconstruções sim precisas e bem sucedidas. Uma boa regra é que o padrão da grade deve ser visível nas imagens individuais uma vez que a modalidade SIM esteja engajada. No entanto, isso nem sempre é possível.
Por fim, é essencial notar que o SIM está entre as técnicas de superres resolução mais fracas na resolução do power14. Assim, embora seja geralmente suficiente para revelar periodicidade e organização geral de proteínas MPS, é significativamente menos capaz de fornecer detalhes sobre suas interações do que microscopia de reconstrução óptica estocástica (STORM)10. Além disso, a utilidade da técnica descrita aqui limita-se ao estudo de proteínas para as quais um anticorpo específico e de bom desempenho está disponível. No entanto, isso pode ser parcialmente contornado através da expressão exógena de proteínas marcadas15.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Pirta Hotulainen é reconhecida por seus comentários críticos, inestimáveis para a preparação deste manuscrito. Dr. Rimante Minkeviciene é reconhecida por sua ajuda na preparação das culturas neuronais usadas para os experimentos originais. Todas as imagens foram realizadas na Unidade de Imagem do Biomedicum. Este trabalho foi apoiado pela Academia da Finlândia (D.M., SA 266351) e pelo Programa de Doutorado Brain & Mind (A.A.)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well plates | Corning | 3524 | |
| 4% Paraformaldehyde | |||
| Alexa-488 Phalloidin | ThermoFisher | A12379 | |
| Alexa-647 anti-mouse | ThermoFisher | A31571 | |
| Anti-Ankyrin G antibody | UC Davis/NIH NeuroMab Facility, Clone 106/36 | 75-146 | |
| Anti-MAP2 antibody | Merck Millipore | AB5543 | |
| B-27 | Invitrogen | 17504044 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | BioWest | P6154 | |
| Deltavision OMX SR | GE Healthcare Life Sciences | N/A | |
| Fiji software package | ImageJ | ||
| GNU Octave | GNU | ||
| High performance coverslips | Marienfeld | 117530 | |
| Immersion Oil Calculator | Cytiva Life Sciences | https://tinyurl.com/ImmersionOilCalculator | |
| L-Glutamine | VWR | ICNA1680149 | |
| MATLAB R2020a | Mathworks | ||
| Neurobasal media | Invitrogen | 21103049 | |
| OMX SR | Delta Vision OMX | ||
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | |
| ProLong Gold mounting media | Invitrogen | P10144 | |
| softWoRx Deconvolution | Cytiva Life Sciences | ||
| Superfrost Slides | Epredia | ISO 8037/1 | |
| TetraSpeck microspheres 0.1 µm | ThermoFisher | T7279 | |
| Triton-X | Sigma | X100 |
References
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