Måling af egenskaber for membranens periodiske skelet i Axon Initial Segment ved hjælp af 3D-struktureret belysningsmikroskopi (3D-SIM)
Summary
Den foreliggende protokol beskriver en metode til at visualisere og måle actinringe og andre komponenter i membranens periodiske skelet af axon-initialsegmentet ved hjælp af dyrkede rotte hippocampale neuroner og 3D-struktureret belysningsmikroskopi (3D-SIM).
Abstract
Axon initialsegmentet (AIS) er det sted, hvor aktionspotentialer initierer og udgør et transportfilter og diffusionsbarriere, der bidrager til opretholdelsen af neuronal polaritet ved at sortere somato-dendritisk last. Et membran periodisk skelet (MPS) bestående af periodiske actinringe giver et stillads til forankring af forskellige AIS-proteiner, herunder strukturelle proteiner og forskellige ionkanaler. Selv om de seneste proteomiske tilgange har identificeret et betydeligt antal nye AIS-komponenter, mangler der detaljer om MPS’s struktur og de enkelte komponenters roller. Afstanden mellem individuelle actinringe i MPS (~ 190 nm) nødvendiggør anvendelse af superopløsningsmikroskopiteknikker til at løse de strukturelle detaljer i MPS. Denne protokol beskriver en metode til anvendelse af dyrkede rotte hippocampale neuroner til at undersøge den præcise lokalisering af et AIS-protein i MPS i forhold til submembranøse actinringe ved hjælp af 3D-struktureret belysningsmikroskopi (3D-SIM). Derudover beskrives også en analytisk tilgang til kvantitativt at vurdere periodiciteten af individuelle komponenter og deres position i forhold til actinringe.
Introduction
Axon-initialsegmentet (AIS) er en kort, unikt specialiseret region af den proksimale axon af hvirveldyrneuroner1. AIS består af et transportfilter og diffusionsbarriere, der er afgørende for at opretholde neuronal polaritet ved at sortere somato-dendritisk last2,3,4,5,6,7. Derudover gør AIS’s unikke struktur det muligt at rumme klynger af spændingsgated ionkanaler, der letter dets funktion som stedet for potentiel initiering af handling8. Et meget stabilt strukturelt kompleks ligger til grund for AIS’s unikke funktioner. Forskning inden for det sidste årti har afsløret tilstedeværelsen af et membran periodisk skelet (MPS), der indeholder actinringe forbundet med spectrin og giver et stillads til forankring af forskellige AIS-proteiner9,10.
Afstanden mellem actinringe i MPS (~ 190 nm) 9,10 er under opløsningsgrænsen for konventionel lysmikroskopi. Tidlige forsøg på at bruge elektronmikroskopi til at visualisere MPS var ikke vellykkede, da de involverede hårde forberedelsesprocedurer ikke kunne bevare MPS-strukturen. Således har superopløsningsmikroskopiteknikker vist sig uvurderlige til at belyse nogle af de strukturelle detaljer i MPS11. Forståelsen af AIS-strukturkomplekset, identiteten og funktionerne i dets komponenter og dets rumlige tidsmæssige regulering er imidlertid stadig ufuldstændig. Nylige proteomiske undersøgelser lykkedes at skabe en betydelig liste over proteiner, der lokaliserer til AIS tæt på strukturelle komponenter i AIS12,13. Alligevel mangler detaljer om deres funktion og præcise sted i AIS-komplekset. Således tjener superopløsningsmikroskopiteknikker som et vigtigt redskab til at undersøge de nøjagtige positioner af disse proteiner i forhold til andre MPS-komponenter og undersøge deres funktioner. Flere lysmikroskopiteknikker kan opnå opløsninger, der er højere end diffraktionsgrænsen for lys, nogle endda i stand til at lokalisere enkeltmolekyler. Imidlertid kræver mange af disse teknikker typisk specialiserede fluoroforer eller billeddannende buffere, og billedoptagelse er ofte tidskrævende14.
3D-struktureret belysningsmikroskopi (3D-SIM) kræver på grund af sin brugervenlighed og enkle krav til prøveforberedelse ingen specielle reagenser til billeddannelse eller prøveforberedelse, fungerer godt med en bred vifte af fluoroforer og prøver, kan let implementeres i flere farver og er i stand til levende cellebilleddannelse15. Mens den bedst mulige opløsning SIM tilbyder (~ 120 nm) er lav sammenlignet med mange andre superopløsningsteknikker, er det tilstrækkeligt til mange applikationer (for eksempel til løsning af komponenterne i MPS i neuroner). Det er således afgørende at overveje kravet om specifikke applikationer for at afgøre, om SIM er et passende valg, eller om en endnu højere opløsning er nødvendig. Her beskrives en protokol for anvendelse af dyrkede hippocampale neuroner og 3D-struktureret belysningsmikroskopi (3D-SIM) til at undersøge positionen og organiseringen af formodede AIS-proteiner i forhold til actinringe i MPS, som implementeret i Abouelezz et al.16
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollen beskrevet her giver en metode til visualisering og måling af MPS-proteiner ved hjælp af superopløsningsteknikken. Da actinringe og andre MPS-komponenter viser en periodicitet på ~ 190 nm9,10, kan konventionelle diffraktionsbegrænsede billeddannelsesmetoder ikke afsløre detaljerne i MPS. Flere mikroskopiopsætninger kan løse diffraktionsbegrænsede strukturer i superopløsning, og SIM repræsenterer en robust og ukompliceret mulighed. Det er vig…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr. Pirta Hotulainen er anerkendt for sine kritiske kommentarer, uvurderlige for udarbejdelsen af dette manuskript. Dr. Rimante Minkeviciene er anerkendt for sin hjælp med at forberede de neuronale kulturer, der blev brugt til de oprindelige eksperimenter. Al billeddannelse blev udført i Biomedicum Imaging Unit. Dette arbejde blev støttet af Finlands Akademi (D.M., SA 266351) og Ph.d.-programmet Brain & Mind (AA)
Materials
| 24-well plates | Corning | 3524 | |
| 4% Paraformaldehyde | |||
| Alexa-488 Phalloidin | ThermoFisher | A12379 | |
| Alexa-647 anti-mouse | ThermoFisher | A31571 | |
| Anti-Ankyrin G antibody | UC Davis/NIH NeuroMab Facility, Clone 106/36 | 75-146 | |
| Anti-MAP2 antibody | Merck Millipore | AB5543 | |
| B-27 | Invitrogen | 17504044 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | BioWest | P6154 | |
| Deltavision OMX SR | GE Healthcare Life Sciences | N/A | |
| Fiji software package | ImageJ | ||
| GNU Octave | GNU | ||
| High performance coverslips | Marienfeld | 117530 | |
| Immersion Oil Calculator | Cytiva Life Sciences | https://tinyurl.com/ImmersionOilCalculator | |
| L-Glutamine | VWR | ICNA1680149 | |
| MATLAB R2020a | Mathworks | ||
| Neurobasal media | Invitrogen | 21103049 | |
| OMX SR | Delta Vision OMX | ||
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | |
| ProLong Gold mounting media | Invitrogen | P10144 | |
| softWoRx Deconvolution | Cytiva Life Sciences | ||
| Superfrost Slides | Epredia | ISO 8037/1 | |
| TetraSpeck microspheres 0.1 µm | ThermoFisher | T7279 | |
| Triton-X | Sigma | X100 |
References
- Leterrier, C. The Axon initial segment, 50 years later: A nexus for neuronal organization and function. Current Topics in Membranes. 77, 185-233 (2016).
- Leterrier, C., Dargent, B. No pasaran! Role of the axon initial segment in the regulation of protein transport and the maintenance of axonal identity. Seminars in Cell & Developmental Biology. 27, 44-51 (2014).
- Brachet, A., et al. Ankyrin G restricts ion channel diffusion at the axonal initial segment before the establishment of the diffusion barrier. Journal of Cell Biology. 191 (2), 383-395 (2010).
- Nakada, C., et al. Accumulation of anchored proteins forms membrane diffusion barriers during neuronal polarization. Nature Cell Biology. 5 (7), 626-632 (2003).
- Song, A. H., et al. A selective filter for cytoplasmic transport at the axon initial segment. Cell. 136 (6), 1148-1160 (2009).
- Sun, X., et al. Selective filtering defect at the axon initial segment in Alzheimer’s disease mouse models. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (39), 14271-14276 (2014).
- Winckler, B., Forscher, P., Mellman, I. A diffusion barrier maintains distribution of membrane proteins in polarized neurons. Nature. 397 (6721), 698-701 (1999).
- Kole, M. H., et al. Action potential generation requires a high sodium channel density in the axon initial segment. Nature Neuroscience. 11 (2), 178-186 (2008).
- Xu, K., Zhong, G., Zhuang, X. Actin, spectrin, and associated proteins form a periodic cytoskeletal structure in axons. Science. 339 (6118), 452-456 (2013).
- Leterrier, C., et al. Nanoscale architecture of the axon initial segment reveals an organized and robust scaffold. Cell Reports. 13 (12), 2781-2793 (2015).
- Leterrier, C. The axon initial segment: An updated viewpoint. The Journal of Neuroscience. 38 (9), 2135-2145 (2018).
- Hamdan, H., et al. Mapping axon initial segment structure and function by multiplexed proximity biotinylation. Nature Communications. 11 (1), 100 (2020).
- Zhou, R., et al. Proteomic and functional analyses of the periodic membrane skeleton in neurons. bioRxiv. , (2020).
- Valli, J., et al. Seeing beyond the limit: A guide to choosing the right super-resolution microscopy technique. Journal of Biological Chemistry. 297 (1), 100791 (2021).
- Wang, T., et al. Radial contractility of actomyosin rings facilitates axonal trafficking and structural stability. Journal of Cell Biology. 219 (5), 201902001 (2020).
- Abouelezz, A., Stefen, H., Segerstråle, M., Micinski, D., Minkeviciene, R., Lahti, L., Hardeman, E., Gunning, P., Hoogenraad, C., Taira, T., Fath, T., Hotulainen, P. Tropomyosin Tpm3.1 is required to maintain the structure and function of the axon initial segment. iScience. 23 (5), 101053 (2020).
- Muller, M., Monkemoller, V., Hennig, S., Hubner, W., Huser, T. Open-source image reconstruction of super-resolution structured illumination microscopy data in ImageJ. Nature Communications. 7, 10980 (2016).
- Ball, G., et al. SIMcheck: a toolbox for successful super-resolution structured illumination microscopy. Scientific Reports. 5, 15915 (2015).
- Stauffer, W., Sheng, H., Lim, H. N. EzColocalization: An ImageJ plugin for visualizing and measuring colocalization in cells and organisms. Scientific Reports. 8 (1), 15764 (2018).
- Dunn, K. W., Kamocka, M. M., McDonald, J. H. A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 300 (4), 723-742 (2011).
- Lahti, L. Data analysis supplement to the research article Abouelezz, Stefen, Segerstråle, Micinski, Minkeviciene, Lahti, Hardeman, Gunning, Hoogenraad, Taira, Fath, & Hotulainen. Tropomyosin Tpm3.1 Is Required to Maintain the Structure and Function of the Axon Initial Segment. , (2021).
- Abouelezz, A., Micinski, D., Lipponen, A., Hotulainen, P. Sub-membranous actin rings in the axon initial segment are resistant to the action of latrunculin. Journal of Biological Chemistry. 400 (9), 1141-1146 (2019).
