Повторяющийся забор крови из подключичной вены сознательной крысы
Summary
Настоящий протокол описывает простой и эффективный метод сбора крови из подключичной вены у крыс. Он обеспечивает быстрый, своевременный и легко идентифицируемый отбор проб без анестезии и получение высококачественной крови путем повторного отбора образцов.
Abstract
Крысы широко используются в фармакокинетических (ПК) и токсикокинетических (ТЗ) исследованиях, которые должны собирать определенное количество крови в определенные моменты времени для обнаружения воздействия лекарств. Метод забора крови крыс определяет качество плазмы и дополнительно влияет на точность результатов теста. Метод сбора крови в подключичных вен, описанный в этом протоколе, многократно собирает образцы крови в сознательном состоянии животных для удовлетворения потребностей тестов на ПК и ТЗ. Навыки удерживающего обращения и соответствующая процедура разреза иглы обеспечивают успешность забора крови. Он прост в эксплуатации, обеспечивая при этом качество плазмы и в то же время заботясь о благополучии животных. Однако этот метод требует квалифицированной операции, а неправильный может вызвать у животных слабость, боль, хромоту и даже смертность. Текущий метод был использован в испытательном центре для 4-недельного исследования пероральной токсичности на крысах Sprague Dawley (SD) с ТЗ. Максимальное количество крови, собранной в течение 24 ч, не превышало 20% от общей крови животного. Масса тела животных составляла более 200 г у самцов и самок. Данные показали, что масса тела животных неуклонно увеличивалась каждую неделю, и клиническое наблюдение было нормальным после повторяющегося сбора образцов.
Introduction
В соответствии с руководящими принципами1 Международной конференции по гармонизации технических требований к регистрации лекарственных средств для использования человеком (ICH) и руководящимипринципами 2 Национального управления по медицинским изделиям (NMPA), количество временных точек сбора крови крыс в токсикокинетическом (TK) исследовании должно соответствовать требованиям динамической оценки воздействия лекарственных средств. Приблизительный общий объем крови крысы составляет 55-70 мл/кг массы тела3. Точки времени сбора, как правило, интенсивны в течение 30 минут после дозирования и уменьшаются после этого, и более десяти образцов крови должны быть собраны в течение 48 часов в обычном тестировании4. Например, образцы крови собирают в 12-ти временных точках (0 мин, 5 мин, 10 мин, 15 мин, 30 мин, 45 мин, 1 ч, 2 ч, 3 ч, 4 ч, 8 ч и 12 ч) при исследовании ТЗ перорально вводимых препаратов. Исследователи должны неоднократно собирать 200-250 мкл крови у крыс, чтобы получить высококачественную плазму для тестирования ТЗ5.
Участки сбора крови у крыс включают хвостовые кровеносные сосуды, ретроорбитальную сплетение, подчелюстную вену, сердце, брюшную аорту6 и так далее. Среди них сбор крови из каудальной вены крыс является часто используемым методом, который требует опытных и квалифицированных операторов 7,8. Собрать кровь из ретроорбитального сплетения вены менее сложно; однако этот метод не рекомендуется, так как он может повредить зрение крыс9, а кровь из сердца и брюшной аорты подходит только для окончательного забора крови10. Было показано, что другой метод сбора крови из подчелюстной вены у сознательной крысы приводит к большему количеству осложнений и выявил недостаточное качество образца крови11. Поэтому исследователи могут обезболить животное, чтобы уменьшить сложность отбора проб. Тем не менее, анестезия также увеличивает стоимость эксперимента, и что более серьезно, это повлияет на метаболическое состояние крыс12. Настоящий протокол использует быстрый и простой метод сбора крови в подключичных венах крыс без анестезии, что позволяет точно позиционировать и двусторонний переменный сбор крови для получения высококачественных образцов своевременным и повторным образом.
Protocol
Representative Results
Discussion
Существуют определенные преимущества сбора крови из подключичных вен. (1) Поскольку место сбора крови легко диссоциируется, а венозное сплетение не является регулярным из-за различных поз крыс, описанный метод может легко локализовать положение венозного сплетения при сохранении стаб…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование финансировалось Ключевой лабораторией доклинической оценки и исследований лекарственных средств провинции Гуандун (No 2018B030323024) и Ключевой программой «Создание новых лекарств» Плана клинических исследований и разработок Гуандун (No 2019B020202001), Исследовательский проект Фонда фундаментальных и прикладных программ Гуанчжоу (No 202002030249 и No 202002030156).
Materials
| 1.0 mL syringe (with needle, 26 G, 0.45 mm x 15.5 mm) | Jiangxi Hongda Medical Equipment Group LTD.(Nanchang, Jiangxi Province, China) | 20210629 | |
| 75% alcohol | Shandong Lierkang Medical Technology Co., Ltd. (Dezhou, Shandong Province, China) | 210717 | |
| Animal source | Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd. | grade: SPF | laboratory animal production license number: SCXK (Hunan) 2019-0004, laboratory animal quality certificate number: 4307272101972847 |
| Cotton swab | Caoxian Hualu Sanitary Materials Co., Ltd.(Heze, Shandong Province, China) | 20210301 | Need to be sterilized. |
| Electric shaver | Shenzhen Codos Electric Appliance Co. , Ltd.(Shenzhen, Guangdong Province, China) | CP-6800 | |
| EP tube, 1.5 mL | Genetimes ExCell Technology,Inc.(Shanghai, China) | ||
| Heparin sodium (2 mL:12500 IU) | Tianjin biochem pharmaceutical Co.,Ltd(Tianjing, China) | 51200702 | Prepare 1250 IU/mL heparin sodium solution. Add heparin sodium solution into the EP tube in advance and make it evenly distributed on the wall of the EP tube, and dry it at 60°C for use. |
| Labtip (volume range 5-200 μL) | Thermo Fisher Scientific Oy | 94300120 | |
| Low speed refrigerated centrifuge | Hunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., Ltd.(Changsha, Hunan Province, China) | L535R | |
| Pipette gun (20-200 μL) | BRAND | 12N92305 | |
| Rats (SD) | Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd. (Changsha, Hunan Province, China) | ||
| Sharp tool container | Taizhou Huangyan Yikang Plastic Factory (Taizhou, Zhejiang Province, China) | ||
| Eye drop | This reagent is not a commodity and the manufacturer requires it to be tested. In the principle of confidentiality, the manufacturer and model cannot be provided. |
References
- Shravya, K., et al. International conference on harmonization of technical requirements for registration of pharmaceuticals for human use. ICH M2 EWG. Electronic common technical document. , (2014).
- Tan, Y., et al. . The China Food and Drug Administration (CFDA). , (2015).
- McGuill, M. W., Andrew, N. R. Biological effects of blood loss: Implications for sampling volumes and techniques. ILAR Journal. 31 (4), 5-20 (1989).
- Aguilar-Mariscal, H., et al. Oral pharmacokinetics of meloxicam in the rat using a high-performance liquid chromatography method in micro-whole-blood samples. Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology. 29 (9), 587-592 (2007).
- Korfmacher, W., et al. Utility of capillary microsampling for rat pharmacokinetic studies: Comparison of tail-vein bleed to jugular vein cannula sampling. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 76, 7-14 (2015).
- JoVE. JoVE Science Education Database. Blood Withdrawal I. JoVE. , (2021).
- Yang, H., et al. Subclavian vein puncture as an alternative method of blood sample collection in rats. Journal of Visualized Experiments. (141), e58499 (2018).
- Zou, W., et al. Repeated blood collection from tail vein of non-anesthetized rats with a vacuum blood collection system. Journal of Visualized Experiments. (130), e55852 (2017).
- Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. Journal of Pharmacology & Pharmacotherapeutics. 1 (2), 87-93 (2010).
- Itziar, F., Arantza, P., Nahia, D., Virginia, P., Juan, R. Clinical biochemistry parameters in C57BL/6J mice after blood collection from the submandibular vein and retroorbital plexus. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 49 (2), 202-206 (2010).
- Heimann, M., Roth, D. R., Ledieu, D., Pfister, R., Classen, W. Sublingual and submandibular blood collection in mice: A comparison of effects on body weight, food consumption and tissue damage. Laboratory Animals. 44 (4), 352-358 (2010).
- Wren-Dail, M. A., et al. Effect of isoflurane anesthesia on circadian metabolism and physiology in rats. Comparative Medicine. 67 (2), 138-146 (2017).
- National Institute of Health. . Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. 8th edition. , (2011).
- Lee, G., Goosens, K. A. Sampling blood from the lateral tail vein of the rat. Journal of Visualized Experiments. (99), e52766 (2015).
- Diehl, K., et al. A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. Journal of Applied Toxicology. 21 (1), 15-23 (2001).
- Casal, D., et al. Functional and physiological methods of evaluating median nerve regeneration in the rat. Journal of Visualized Experiments. (158), e59767 (2020).
