Repetitiv blodprovtagning från den subklaviska venen hos medveten råtta
Summary
Detta protokoll beskriver en enkel och effektiv metod för att samla blod från den subklaviska venen hos råttor. Det möjliggör snabb, snabb och lätt identifierbar provtagning utan anestesi och erhåller högkvalitativt blod genom repetitiv provinsamling.
Abstract
Råttor används ofta i farmakokinetiska (PK) och toxikokinetiska (TK) studier som behöver samla en viss mängd blod vid specifika tidpunkter för att upptäcka läkemedelsexponering. Provtagningsmetoden för råttblod bestämmer plasmans kvalitet och påverkar ytterligare testresultatens precision. Den subklaviska blodinsamlingsmetoden som beskrivs i detta protokoll samlar blodprover upprepade gånger i djurens medvetna tillstånd för att möta behoven hos PK- och TK-test. Färdigheterna i fasthållningshantering och lämplig procedur för nålsnitt säkerställer framgångsgraden för blodinsamling. Det är lätt att använda samtidigt som kvaliteten på plasma säkerställs och samtidigt tillgodoser djurens välbefinnande. Denna metod kräver emellertid skicklig drift, och en felaktig kan orsaka djursvaghet, smärta, lameness och till och med dödlighet. Den nuvarande metoden har använts i testanläggningen för en 4-veckors oral toxicitetsstudie på Sprague Dawley (SD) råttor med TK. Den maximala mängden blod som samlades in inom 24 timmar översteg inte 20% av djurets totala blod. Djurens kroppsvikt var mer än 200 g för män och kvinnor. Data visade att djurens kroppsvikt ökade stadigt varje vecka, och den kliniska observationen var normal efter upprepad provtagning.
Introduction
Enligtriktlinjerna 1 från International Conference on Harmonization of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use (ICH) och National Medical Products Administration (NMPA) Guidelines2 måste antalet blodinsamlingstidpunkter för råttor i den toxikokinetiska (TK) studien uppfylla kraven i den dynamiska bedömningen av läkemedelsexponering. Den ungefärliga totala blodvolymen hos en råtta är 55-70 ml / kg kroppsvikt3. Insamlingstiderna är i allmänhet intensiva inom 30 minuter efter dosering och minskar efter det, och mer än tio blodprover måste samlas in inom 48 timmar vid rutintestning4. Till exempel samlas blodprover vid 12-tidpunkter (0 min, 5 min, 10 min, 15 min, 30 min, 45 min, 1 h, 2 h, 3 h, 4 h, 8 h och 12 h) i TK-studie av oralt administrerade läkemedel. Forskare måste upprepade gånger samla 200-250 μL blod hos råttor för att få högkvalitativ plasma för TK-testning5.
Bloduppsamlingsställena hos råttor inkluderar svansblodkärl, retroorbital plexusven, submandibulär ven, hjärta, bukaorta6 och så vidare. Bland dem är blodinsamling från den kaudala venen hos råttor en ofta använd metod, vilket kräver erfarna och skickliga operatörer 7,8. Att samla blod från retro-orbital plexusvenen är mindre komplicerat; Denna metod rekommenderas dock inte eftersom den kan skada råttornas syn9, och blod från hjärtat och bukaortan är endast lämpligt för slutlig blodprovstagning10. En annan metod för att samla blod från den submandibulära venen i en medveten råtta har visat sig resultera i fler komplikationer och avslöjade otillräcklig blodprovskvalitet11. Därför kan forskare bedöva djuret för att minska svårigheten att provta. Ändå ökar anestesin också kostnaden för experimentet, och mer allvarligt kommer det att påverka det metaboliska tillståndet hos råttor12. Det nuvarande protokollet använder en snabb och enkel metod för att samla blod i de subklaviska venerna hos råttor utan anestesi, vilket möjliggör noggrann positionering och bilateral alternerande blodinsamling för att erhålla högkvalitativa prover i tid och upprepat.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det finns vissa fördelar med att samla blod från de subklaviska venerna. (1) Eftersom platsen för bloduppsamlingen lätt dissocieras och venös plexus inte är regelbunden på grund av råttornas olika ställningar, kan den beskrivna metoden enkelt lokalisera positionen för venös plexus samtidigt som råttornas stabila och bekväma ställningar bibehålls. (2) Operationen är enkel och gynnsam för snabb utveckling av teknikers färdigheter och mindre smärta för djur. (3) Ett driftläge för att göra djuret bekv?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna forskning finansierades av Guangdong Provincial Key Laboratory of Drug Non-clinical Evaluation and Research (No.2018B030323024) och Key Program “New Drug Creation” av Guangdong Key Research and Development Plan (No.2019B020202001), Guangzhou Fundamental and Application Foundation Research Project (No.202002030249 och No.202002030156).
Materials
| 1.0 mL syringe (with needle, 26 G, 0.45 mm x 15.5 mm) | Jiangxi Hongda Medical Equipment Group LTD.(Nanchang, Jiangxi Province, China) | 20210629 | |
| 75% alcohol | Shandong Lierkang Medical Technology Co., Ltd. (Dezhou, Shandong Province, China) | 210717 | |
| Animal source | Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd. | grade: SPF | laboratory animal production license number: SCXK (Hunan) 2019-0004, laboratory animal quality certificate number: 4307272101972847 |
| Cotton swab | Caoxian Hualu Sanitary Materials Co., Ltd.(Heze, Shandong Province, China) | 20210301 | Need to be sterilized. |
| Electric shaver | Shenzhen Codos Electric Appliance Co. , Ltd.(Shenzhen, Guangdong Province, China) | CP-6800 | |
| EP tube, 1.5 mL | Genetimes ExCell Technology,Inc.(Shanghai, China) | ||
| Heparin sodium (2 mL:12500 IU) | Tianjin biochem pharmaceutical Co.,Ltd(Tianjing, China) | 51200702 | Prepare 1250 IU/mL heparin sodium solution. Add heparin sodium solution into the EP tube in advance and make it evenly distributed on the wall of the EP tube, and dry it at 60°C for use. |
| Labtip (volume range 5-200 μL) | Thermo Fisher Scientific Oy | 94300120 | |
| Low speed refrigerated centrifuge | Hunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., Ltd.(Changsha, Hunan Province, China) | L535R | |
| Pipette gun (20-200 μL) | BRAND | 12N92305 | |
| Rats (SD) | Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd. (Changsha, Hunan Province, China) | ||
| Sharp tool container | Taizhou Huangyan Yikang Plastic Factory (Taizhou, Zhejiang Province, China) | ||
| Eye drop | This reagent is not a commodity and the manufacturer requires it to be tested. In the principle of confidentiality, the manufacturer and model cannot be provided. |
References
- Shravya, K., et al. International conference on harmonization of technical requirements for registration of pharmaceuticals for human use. ICH M2 EWG. Electronic common technical document. , (2014).
- Tan, Y., et al. . The China Food and Drug Administration (CFDA). , (2015).
- McGuill, M. W., Andrew, N. R. Biological effects of blood loss: Implications for sampling volumes and techniques. ILAR Journal. 31 (4), 5-20 (1989).
- Aguilar-Mariscal, H., et al. Oral pharmacokinetics of meloxicam in the rat using a high-performance liquid chromatography method in micro-whole-blood samples. Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology. 29 (9), 587-592 (2007).
- Korfmacher, W., et al. Utility of capillary microsampling for rat pharmacokinetic studies: Comparison of tail-vein bleed to jugular vein cannula sampling. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 76, 7-14 (2015).
- JoVE. JoVE Science Education Database. Blood Withdrawal I. JoVE. , (2021).
- Yang, H., et al. Subclavian vein puncture as an alternative method of blood sample collection in rats. Journal of Visualized Experiments. (141), e58499 (2018).
- Zou, W., et al. Repeated blood collection from tail vein of non-anesthetized rats with a vacuum blood collection system. Journal of Visualized Experiments. (130), e55852 (2017).
- Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. Journal of Pharmacology & Pharmacotherapeutics. 1 (2), 87-93 (2010).
- Itziar, F., Arantza, P., Nahia, D., Virginia, P., Juan, R. Clinical biochemistry parameters in C57BL/6J mice after blood collection from the submandibular vein and retroorbital plexus. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 49 (2), 202-206 (2010).
- Heimann, M., Roth, D. R., Ledieu, D., Pfister, R., Classen, W. Sublingual and submandibular blood collection in mice: A comparison of effects on body weight, food consumption and tissue damage. Laboratory Animals. 44 (4), 352-358 (2010).
- Wren-Dail, M. A., et al. Effect of isoflurane anesthesia on circadian metabolism and physiology in rats. Comparative Medicine. 67 (2), 138-146 (2017).
- National Institute of Health. . Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. 8th edition. , (2011).
- Lee, G., Goosens, K. A. Sampling blood from the lateral tail vein of the rat. Journal of Visualized Experiments. (99), e52766 (2015).
- Diehl, K., et al. A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. Journal of Applied Toxicology. 21 (1), 15-23 (2001).
- Casal, D., et al. Functional and physiological methods of evaluating median nerve regeneration in the rat. Journal of Visualized Experiments. (158), e59767 (2020).
