Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

التحول الطبيعي، والتعبير عن البروتين، والحفظ بالتبريد لثغرة البكتيريا الزرقاء الخيطية الفيرميديوم

Published: February 1, 2022 doi: 10.3791/63470
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 2, 3, 3, 1
1Botanical Institute, Karlsruhe Institute of Technology KIT, 2Institute for Biological Interfaces 5 (IBG 5), Karlsruhe Institute of Technology KIT, 3Institut für Technische Mikrobiologie, Hochschule Mannheim

Summary

Phormidium lacuna هي بكتيريا زرقاء خيطية تم عزلها من برك الصخور البحرية. تصف هذه المقالة عزل الخيوط عن المصادر الطبيعية ، واستخراج الحمض النووي ، وتسلسل الجينوم ، والتحول الطبيعي ، والتعبير عن sfGFP ، والحفظ بالتبريد ، وطرق الحركة.

Abstract

البكتيريا الزرقاء هي محور البحوث الأساسية ومشاريع التكنولوجيا الحيوية التي تستخدم فيها الطاقة الشمسية لإنتاج الكتلة الحيوية. ثغرة Phormidium هي بكتيريا زرقاء خيطية معزولة حديثا. تصف هذه الورقة كيف يمكن عزل البكتيريا الزرقاء الخيطية الجديدة من برك الصخور البحرية. كما يصف كيف يمكن استخراج الحمض النووي من الخيوط وكيف يمكن تسلسل الجينومات. على الرغم من أن التحول قد تم تأسيسه للعديد من الأنواع أحادية الخلية ، إلا أنه يتم الإبلاغ عنه بشكل أقل تواترا للبكتيريا الزرقاء الخيطية. يتم وصف طريقة مبسطة للتحول الطبيعي ل P. lacuna هنا. P. lacuna هو العضو الوحيد في ترتيب الذبذبات الذي تم إنشاء التحول الطبيعي له. توضح هذه الورقة أيضا كيفية استخدام التحول الطبيعي للتعبير عن بروتين الفلورسنت الأخضر فائق المجلد (sfGFP). قام مروج cpcB داخلي المنشأ بتحفيز تعبير أقوى بنحو 5 مرات من مروجي cpc560 أو A2813 أو psbA2 من Synechocystis sp. PCC6803. علاوة على ذلك ، تم إنشاء طريقة للحفظ بالتبريد ل P. lacuna و Synechocystis sp.CPP 6803 ، وتم وصف طرق لتقييم الحركة في وسط سائل وعلى الأسطح الخضراء والبلاستيكية.

Introduction

البكتيريا الزرقاء هي كائنات بدائية النواة تستخدم التمثيل الضوئي كمصدر للطاقة 1,2. تركز الأبحاث بشكل متزايد على أنواع البكتيريا الزرقاء. يمكن تحويل العديد من البكتيريا الزرقاء باستخدام الحمض النووي3. يمكن إخراج الجينات أو المبالغة في التعبير عنها في هذه الأنواع. ومع ذلك ، يقتصر التحول على عدد قليل من الأنواع4،5،6،7،8،9،10،11 ، وقد يكون من الصعب إنشاء تحول في السلالات من مجموعات الاستزراع أوالبرية 8. تم عزل سلالات الأنواع الخيطية Phormidium gapuna (الشكل 1) من برك الصخور البحرية ، حيث تتقلب الظروف البيئية ، مثل تركيزات الملح أو درجة الحرارة ، بمرور الوقت. يمكن استخدام هذه البكتيريا الزرقاء الخيطية ككائنات حية نموذجية لترتيب Oscillatoriales12 الذي تنتمي إليه.

خلال التجارب التي تختبر نقل الجينات عن طريق الكهربية13,14 ، وجد أن P. ثغرة يمكن تحويلها عن طريق التحول الطبيعي 15. في هذه العملية ، يتم تناول الحمض النووي بشكل طبيعي من قبل بعض الخلايا. بالمقارنة مع طرق التحول الأخرى16,17 ، يتمتع التحول الطبيعي بميزة عدم الحاجة إلى أدوات إضافية يمكن أن تعقد الإجراء. على سبيل المثال ، يتطلب الكهربية الكافيت المناسب ، والأسلاك السليمة ، واختيار الجهد المناسب. P. ثغرة هي حاليا العضو الوحيد في الذبذبات المعرضة للتحول الطبيعي. نظرا لأن البروتوكول الأصلي يعتمد على بروتوكولات الكهربية ، فإنه لا يزال يتضمن العديد من خطوات الغسيل التي قد تكون غير ضرورية. تم اختبار مناهج مختلفة لتبسيط البروتوكول ، مما أدى إلى بروتوكول التحويل المعروض هنا.

تسلسل الجينوم ضروري لمزيد من الدراسات الجزيئية القائمة على الضربة القاضية الجينية أو الإفراط في التعبير. على الرغم من أنه يمكن الحصول على تسلسل الجينوم باستخدام آلات تسلسل الجيل التالي في غضون فترات قصيرة ، إلا أن استخراج الحمض النووي قد يكون صعبا ويعتمد على الأنواع. مع P. ثغرة ، تم اختبار العديد من البروتوكولات. ثم أنشئت طريقة معدلة قائمة على بروميد الأمونيوم ثلاثي ميثيل سيتيل (CTAB)، مما أدى إلى نقاء مقبول للحمض النووي وإنتاج الحمض النووي لكل دورة تنقية لمواصلة العمل في المختبر. يمكن تسلسل جينوم خمس سلالات باستخدام هذا البروتوكول. كانت خطوة التحول المنطقي التالية هي إنشاء تعبير البروتين في P. ثغرة.

يمكن الكشف عن sfGFP المستخدم كبروتين علامة في هذا البروتوكول باستخدام أي مجهر فلوري. يمكن استخدام جميع المروجين الذين تم اختبارهم لتعبير P. lacuna sfGFP. أدى العدد المتزايد من السلالات الناشئة عن التحول إلى الحاجة إلى طريقة لتخزين الثقافات. يتم إنشاء هذه الطرق للإشريكية القولونية والعديد من البكتيريا الأخرى18. في البروتوكولات القياسية ، يتم إعداد مزارع الجلسرين ، ونقلها في النيتروجين السائل ، وتخزينها عند -80 درجة مئوية. لا تتطلب هذه الطريقة سوى بضع خطوات وهي موثوقة للغاية لتلك الأنواع التي تم تأسيسها من أجلها. ولم يكن البروتوكول الموحد ممكنا بالنسبة للثغرة المتصورة لأن الخلايا الحية لا يمكن استردادها في جميع الحالات. ومع ذلك ، عندما تمت إزالة الجلسرين بعد ذوبان الجليد ، نجت خلايا جميع التجارب. يتم تقديم طرق بسيطة لتحليل حركية P. ثغرة ، والتي يمكن دمجها مع طفرات الضربة القاضية للتحقيق في النوع الرابع pili أو دور المستقبلات الضوئية. تختلف هذه الفحوصات عن تلك الخاصة بالبكتيريا الزرقاء أحادية الخلية19،20،21 ويمكن أن تكون مفيدة أيضا للذبذبات الأخرى.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. العزلة عن البيئة الطبيعية

ملاحظة: يمكن عزل الطحالب الخضراء والدياتومات والبكتيريا الزرقاء الخيطية والطحالب الدقيقة الأخرى. يمكن استخدام البروتوكول لأي نوع من أنواع الطحالب الدقيقة من برك الصخور التي تنمو تحت ظروف المختبر. يمكن التعرف بسهولة على البكتيريا الزرقاء الخيطية التي تنتمي إلى الذبذبات من خلال حركتها وشكلها الخيطي. يمكن تحديد الأنواع في حالة شبه نقية عن طريق تسلسل الجينوم أو تسلسل 16S rRNA.

  1. نقل عينات مياه البحر السائلة من برك الصخور البحرية (أي التجاويف في الساحل الصخري) إلى قوارير سعة 50 مل. لكل قارورة ، لاحظ المكان أو الإحداثيات الدقيقة للمصدر الطبيعي. إذا كان ذلك ممكنا ، قم بتصفية المحتوى من خلال شبكات 50 ميكرومتر لتقليل كميات العوالق الحيوانية. قم بتخزين العينات عند 4 درجات مئوية حتى يمكن زراعتها الفرعية.
  2. انقل مزارع 1 مل إلى أطباق بتري 10 سم تحتوي على 3٪ باكتو-أجار في f/2 متوسطة 22,23 (انظر جدول المواد). قم بإعداد ما يصل إلى 20 لوحة. تزرع تحت ضوء أبيض من 50 ميكرومول m-2 s-1.
    ملاحظة: يمكن استخدام كثافة ضوء أعلى للزراعة. يمكن استخدام كثافة تصل إلى 400 ميكرومول m-2 s-1 ل P. ثغرة ، على الرغم من أن الأنواع الأخرى قد تكون أكثر حساسية للضوء.
  3. بعد أسبوع واحد ، انقل الخلايا المطلوبة إلى ألواح أجار طازجة باستخدام ملقط معقم. عزل الخلايا تحت المجهر ثنائي المنظار تحت ظروف معقمة. قم بتخزين لوحة الأجار القديمة عند 4 درجات مئوية حتى تظهر الخلايا وتنمو على لوحة الأجار الجديدة.
  4. كرر خطوة النقل هذه كل أسبوع للقضاء على التلوث. استخدم العين المجردة للكشف عن التلوث الثقيل والمجهر مع تكبير 400x لإجراء فحوصات إضافية للتلوث.
  5. إذا بدت العينة خالية من التلوث، فاختبر التلوث البكتيري أو الفطري على ألواح الأجار. انقل جزءا صغيرا من المستنبتة مع حلقة تلقيح إلى صفيحة أجارLB 24 (قطرها 10 سم) ، واحتفظ باللوحة في درجة حرارة الغرفة ، وتحقق من نمو الملوثات على مدار 1-3 أيام.
  6. إذا تم الحصول على أنواع من البكتيريا الزرقاء الخيطية المعقمة ، فاستخدمها لمزيد من أعمال الاستزراع. زراعة P. ثغرة في السائل أو على لوحات باكتو أجار. استخدم قوارير سعة 250 مل مع 50 مل من f/2 متوسطة أو f/2+ متوسطة للزراعة السائلة.

2. استخراج الحمض النووي

ملاحظة: تعتمد هذه الطريقة من 25 26 

  1. تحضير قارورتين مع 50 مل من f/2 المتوسطة. تطعيم كل منها مع ~ 1 مل من خيوط P. ثغرة من الثقافات النامية الأخرى. حافظ على الثقافات لمدة 7 أيام أو أكثر تحت الإثارة (الدوران الأفقي) عند 50 دورة في الدقيقة تحت الضوء الأبيض (50 ميكرومول m-2 s-1) عند 25 درجة مئوية.
  2. عالج الثقافة بالموجات فوق الصوتية (انظر جدول المواد) لمدة 2 دقيقة بكامل الطاقة. قياس OD عند 750 نانومتر ؛ تحقق للتأكد من أنه ~ 0.5. استمر في تنمية الثقافات إذا كان OD منخفضا جدا.
  3. اجمع الخيوط بواسطة 5000 × جم ، 20 دقيقة من الطرد المركزي. إزالة supernatant. انقل الخيوط مع السائل المتبقي إلى غرفة الصحافة الفرنسية27. اضبط ضغط الصحافة الفرنسية على 20000 رطل لكل بوصة مربعة واستخرج الخلايا.
    ملاحظة: ستقوم الصحافة الفرنسية بتحليل جميع الخلايا وإطلاق الحمض النووي. ستنتج قوى القص القوية شظايا الحمض النووي 1500 نقطة أساس.
  4. قم بالطرد المركزي للعينة لمدة 10 دقائق عند 10000 × جم وقم بإزالة السوبرنات.
  5. أضف 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحلل (4 M urea ، 0.1 M Tris / Cl ، الرقم الهيدروجيني 7.4) و 50 ميكرولتر من بروتين K (10 mg / mL) إلى الكرية. سخني العينة إلى 55 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة مع الاهتزاز عند 550 دورة في الدقيقة.
  6. أضف 1 مل من المخزن المؤقت لاستخراج الحمض النووي (3٪ CTAB ، 1.4 M NaCl ، 10 mM EDTA ، 0.1 M Tris / Cl ، 1٪ Sarkosyl ، 0.1 M DTT ، الرقم الهيدروجيني 8) واحتضن لمدة 60 دقيقة عند 55 درجة مئوية و 550 دورة في الدقيقة. نقل المحاليل إلى أنابيب الطرد المركزي ، وإضافة مجلدين من الكلوروفورم / إيزواميلكحول (24/1).
  7. بعد الاهتزاز ، قم بالطرد المركزي للعينة لمدة 5 دقائق عند 9000 × جم. انقل المرحلة المائية العلوية إلى قوارير تفاعل وأضف 1 مل من الإيثانول البارد المثلج و 50 ميكرولتر من خلات الصوديوم 3 م.
  8. دوامة العينة ووضعها في -20 درجة مئوية لمدة 1 ساعة أو أكثر.
  9. جهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 10000 × جم (4 درجات مئوية) وتخلص من السوبرنات. اغسل الكريات بالإيثانول بنسبة 70٪.
  10. الطرد المركزي للعينة مرة أخرى. إزالة supernatant وتجفيف الكريات بين عشية وضحاها. إذابة الحمض النووي في الماء الخالي من النوكليز. قم بقياس طيف الحمض النووي للتحقق مما إذا كان OD 260 nm / OD 280 nm يتراوح بين 1.6 و 1.9.
  11. تحليل حجم الحمض النووي على هلام الرحلان الكهربائي agarose28.
  12. تسلسل الحمض النووي الجينومي عن طريق تسلسل الجيل التالي لمدة 300 دورة، مع إعداد نهاية مقترنة وقراءة طول 150 قاعدة (انظر جداول المواد).
  13. إجراء التجميع باستخدام برنامج الكمبيوتر المناسب ؛ انظر المثال الوارد في جدول المواد.
  14. أرسل مسودة الجينوم إلى خادم RAST للتعليق التوضيحي.
    ملاحظة: قم بتحميل تسلسلات الحمض النووي للحصول على تعليق توضيحي كامل في غضون بضع دقائق.

3. التحول الطبيعي والتعبير GFP

ملاحظة: يعتمد التحول على متجه بلازميد منتشر في الإشريكية القولونية. يمكن استخدام pGEM-T أو pUC19 كناقلات العمود الفقري. وتوجد تقنيات الاستنساخ في العديد من المختبرات؛ انظر أيضا البروتوكولات القياسية28 والمقالات المتعلقة بناقلات التحويل ل P. ثغرة15,29. يتم وصف أمثلة للمتجهات لتعبير sfGFP في قسم النتائج التمثيلية. وترد تفاصيل أربعة متجهات لم تنشر بعد في الملف التكميلي 1.

  1. نفذ جميع الخطوات باستخدام مواد معقمة تحت ظروف مختبرية معقمة (مقعد نظيف ، أواني زجاجية معقمة).
  2. قم بتلقيح 2 × 50 مل من الوسط السائل f/2 في قارورتين سعة 250 مل مع 2 × 1 مل من خيوط P. gapuna من ثقافة الجري. تزرع في الضوء الأبيض (50 ميكرومول m-2 s-1) تحت الإثارة (الدوران الأفقي ، 50 دورة في الدقيقة) لمدة 5 أيام تقريبا عند 25 درجة مئوية.
  3. قم بإعداد ~ 200 ميكروغرام من الحمض النووي لمتجه التحويل باستخدام مجموعة إعداد midi (انظر جدول المواد) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
  4. قم بتجانس 100 مل من تعليق خلية P. lacuna (انظر جدول المواد) عند 10000 دورة في الدقيقة لمدة 3 دقائق. قياس OD عند 750 نانومتر (القيمة المطلوبة = 0.35).
  5. جهاز الطرد المركزي لنظام تعليق الخلية لمدة 15 دقيقة عند 6000 × جم. قم بإزالة السوبرناتانت ، الكريات في 800 ميكرولتر (الحجم الإجمالي بما في ذلك السائل المتبقي والشعيرات) من السائل المتبقي ووسط f / 2 + الإضافي.
  6. خذ ثمانية ألواح f/2+ bacto-agar (قطرها 10 سم) تحتوي على 120 ميكروغرام / مل كاناميسين. ماصة 10 ميكروغرام من الحمض النووي في منتصف كل لوحة أجار. ماصة على الفور 100 ميكرولتر من تعليق الخلايا في منتصف كل لوحة أجار (على رأس الحمض النووي).
  7. احتفظ بلوحة الأجار بدون غطاء على المقعد النظيف للسماح للسائل الزائد بالتبخر. أغلق اللوحة وازرعها في ضوء أبيض عند 25 درجة مئوية لمدة يومين.
  8. قم بتوزيع خيوط كل صفيحة أجار مع حلقة تلقيح على عدة ألواح f/2+ bacto-agar طازجة تحتوي على 120 ميكروغرام / مل كاناميسين. قم بزراعة الألواح في الضوء الأبيض عند 25 درجة مئوية وتحقق من الثقافات بانتظام تحت المجهر.
  9. تحديد الخيوط الحية المحولة بعد 7-28 يوما تحت المجهر. ابحث عن خيوط خضراء صحية (الشكل 2) تختلف عن الخيوط الأخرى. إذا كان من الممكن تحديد هذه الخيوط الخضراء ، فتابع الخطوة التالية ؛ خلاف ذلك ، احتفظ باللوحة لمدة 7 أيام أخرى.
  10. استخدم الملقط لنقل هذه الخيوط الحية المحددة إلى 50 مل من السائل f/2+ الوسط مع 250 ميكروغرام / مل كاناميسين. تزرع في ضوء أبيض عند 25 درجة مئوية على شاكر (دوران أفقي ، 50 دورة في الدقيقة). راقب النمو لمدة تصل إلى أربعة أسابيع.
  11. انقل الخيوط مرة أخرى إلى وسط أجار يحتوي على 250 ميكروغرام / مل كاناميسين وانتظر حتى تنمو الخيوط. بعد عدة أيام ، انقل خيوط مفردة إلى صفيحة أجار طازجة بتركيز أعلى من الكاناميسين ، على سبيل المثال ، 500 ميكروغرام / مل. احتفظ باللوحة الأصلية.
  12. تأكد من نشر الخيوط بتركيز عال من الكاناميسين في الثقافة السائلة أو على الأجار. زيادة تركيز الكاناميسين مرة أخرى لتسريع الفصل.
    ملاحظة: تنمو الثغرة P. المحولة في ما يصل إلى 10000 ميكروغرام / مل كاناميسين. قد لا تتسامح الأنواع الأخرى مع مثل هذه التركيزات العالية.
  13. إذا نمت الخلايا المقاومة ووزعت على نطاق واسع على صفيحة ، فاختبر تكامل الإدراج في جينوم P. lacuna عن طريق إجراء PCR مع الاشعال الخارجي والداخلي.
    1. استخدم الاشعال التي تم تصميمها لاستنساخ الإدخال كاشعال داخلي.
    2. لتصميم الاشعال الخارجية ، حدد التسلسلات التي هي 5 ' و 3' من موقع الإدراج المقترح على جينوم P. ثغرة ولكن خارج الإدراج.
    3. بالنسبة لتفاعلات PCR ، استخدم الاشعال الداخلي والاشعال الخارجي. استخدم السلالة (السلالات) المقاومة والنوع البري.
      ملاحظة: تشير الاشعال الداخلية إلى أن الإدراج موجود؛ تظهر الاشعال الخارجية أن الإدراج يتم إدخاله في الموقع الصحيح.
  14. لكل تفاعل PCR ، ضع ~ 10 ملغ من الخيوط مباشرة في أنابيب PCR وقم بإجراء PCR وفقا للبروتوكولات القياسية24. إذا لم يتم الحصول على منتج ، فقم بتغيير درجة حرارة التلدين وغسل الخيوط بالماء.
    ملاحظة: يمكن استخدام العديد من البوليميراز المختلفة في تفاعل البوليميراز المتسلسل. البوليميراز القياسية ، مثل بوليميراز Taq ، لديها معدل خطأ أعلى من البوليميراز التحقق من الأخطاء ، والتي هي أكثر تكلفة. لا يتطلب تفاعل البوليميراز المتسلسل التحليلي هذا أي بوليميراز للتحقق من الأخطاء. ومع ذلك ، يجب اختبار البوليميراز الذي يتحقق من الأخطاء إذا لم يتم الحصول على منتج PCR باستخدام بوليميراز قياسي.
  15. تحليل منتجات PCR للخط المقاوم على الرحلان الكهربائي agarose24.
    1. قارن مواضع النطاق مع العلامة وقارن النوع البري والمحول. باستخدام الاشعال الداخلية والخارجية ، ابحث عن نطاق أكبر للمحول من النوع البري (بسبب إدخال كاسيت المقاومة) أو نطاقين للمحول: واحد بحجم النطاق البري وواحد أكبر. وبما أن الحالة الأخيرة تشير إلى الفصل غير المكتمل، استمر في الزراعة بتركيزات عالية من الكانامايسين.
      ملاحظة: لمزيد من التفاصيل حول تفاعل البوليميراز المتسلسل والرحلان الكهربائي، راجع15,24 أو غيرها من الأدبيات القياسية.
  16. بالنسبة لتعبير GFP: راقب الخيوط المفردة باستخدام مجهر التألق (انظر جدول المواد) عند تكبير الهدف المحدد عند 40x أو 63x. التقط صورة انتقال ساطعة وصورة تألق. استخدم الإعدادات التالية ل GFP: ممر النطاق الترددي 470 نانومتر للإثارة، وممر النطاق الترددي 525 نانومتر للانبعاثات، وفاصل شعاع 495 نانومتر، وقت التعرض الأولي 500 مللي ثانية.
  17. اضبط وقت التعرض للحصول على إشارات تألق واضحة ، وتجنب شدة التشبع. حاول استخدام نفس الإعداد لجميع العينات.
  18. نظرا لأن الخيوط من النوع البري ستعرض أيضا التألق ، فقم بالتقاط الصور بنفس الإعدادات المذكورة أعلاه لهذا التألق في الخلفية.
    ملاحظة: يجب أن يكون للسلالة التي تعبر عن GFP إشارة أعلى ؛ خلاف ذلك ، فإنه لا يعبر عن GFP.
  19. استنادا إلى أوقات التعرض وكثافة البكسل لصور التألق ، قم بحساب ومقارنة محتوى GFP للخيوط المختلفة.

4. الحفظ بالتبريد

ملاحظة: P. ثغرة والبكتيريا الزرقاء وحيدة الخلية Synechocystis sp. يتم استخدام PCC 6803. الطريقة الحالية تعمل بشكل أفضل مع P. ثغرة.

  1. زرع P. ثغرة أو Synechocystissp PCC 6803 لمدة 10 أيام على الأقل في 10 مل من f/2+ أو BG-11 المتوسطة ، على التوالي ، تحت الضوء الأبيض (50 ميكرومول m-2 s-1) عند 25 درجة مئوية تحت الإثارة (الدوران الأفقي ، 50 دورة في الدقيقة).
  2. قم بتجانس ثقافة P. gapuna (انظر جدول المواد) عند 10000 دورة في الدقيقة لمدة 3 دقائق أو باستخدام جهاز الموجات فوق الصوتية (انظر جدول المواد) لمدة 2 دقيقة بكامل الطاقة. حدد OD 750 نانومتر لأي من الثقافتين للتحقق مما إذا كانت القيمة بين 1 و 7.
  3. جمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي في 6000 × غرام لمدة 15 دقيقة. إزالة supernatant.
  4. حبيبة الخلية في 800 ميكرولتر من f/2+ أو BG-11 متوسطة (الحجم النهائي) ونقلها إلى 2 مل من التبريد. أضف 800 ميكرولتر من محلول الجلسرين بنسبة 50٪ إلى تعليق الخلية. أغلق القارورة واخلطها عن طريق الانعكاس المتكرر.
  5. انقل المبرد إلى النيتروجين السائل وخزنه في صندوق تبريد في ثلاجة -80 درجة مئوية. لاحظ موضع الصندوق داخل الفريزر وإحداثيات العينة داخل الصندوق.
  6. لاستعادة الخلايا ، أخرج المبرد وقم بإذابة المحتويات في درجة حرارة الغرفة. انقل المحتويات إلى أنبوب تفاعل 2 مل.
  7. اغسل العينة مرتين. بالنسبة للغسيل1 ، يتم إجراء جهاز طرد مركزي عند 6000 × جم لمدة 5 دقائق. قم بإزالة السوبرناتانت ، وأعد تعليق الكريات في 2 مل من f/2+ أو BG-11 المتوسط. بالنسبة للغسيلالثاني ، أعد الطرد المركزي عند 6000 × جم لمدة 5 دقائق ، وقم بإزالة السوبرناتانت ، الكريات في 2 مل من f / 2 + أو BG-11 المتوسطة.
  8. للتحقق من سلامة هذه الخلايا الجاهزة للزراعة ، انقل الكريات إلى 9 مل من الوسط وزرعها في الضوء الأبيض (50 ميكرومول m-2 s-1) تحت الإثارة (55 دورة في الدقيقة). قارن OD 750 نانومتر من الثقافة في اليوم الأول وبعد أسبوع 1.

5. حركية ثغرة الفيرميديوم

ملاحظة: سيتم وصف ثلاثة اختبارات مختلفة. يتم استخدام نفس الثقافة في جميع الحالات.

  1. زرع P. ثغرة في f/2 وسط تحت التحريض الأفقي (50 دورة في الدقيقة) في الضوء الأبيض (50 ميكرومول m-2 s-1) لمدة 5 أيام تقريبا حتى OD 750 نانومتر المقدر هو 0.35. تخزين العينة في 4 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  2. قم بتجانس الخيوط (انظر جدول المواد) عند 10000 دورة في الدقيقة لمدة 3 دقائق أو باستخدام الموجات فوق الصوتية (انظر جدول المواد) لمدة دقيقة واحدة عند أقصى طاقة ودورة 1. قياس OD 750 نانومتر. إذا كان أعلى من 0.35 ، فقم بتخفيف الكسر باستخدام f / 2 متوسط. استخدم هذا الحل في مقايسات الحركة في الخطوات 5.3 و5.4 و5.5.
  3. فحص الحركة في الوسط السائل
    1. للمراقبة المباشرة للحركية ، انقل 8 مل من الوسط الذي يحتوي على P. gapuna (من الخطوة 5.2) إلى طبق بتري 6 سم. انتظر بضع دقائق حتى تصل العينة إلى درجة حرارة الغرفة. غطي طبق بتري بورق السيلوفان.
    2. ضع شريحة مجهر على طاولة x-y الخاصة بالمجهر القياسي باستخدام كاميرا. قم بتشغيل ضوء المجهر. من الناحية المثالية ، استخدم دائما نفس الإعدادات الكهربائية والبصرية للإضاءة. انقل هدفا 4x أو 10x إلى مسار الضوء.
    3. ضع طبق بتري فوق الشريحة. اضبط الخيوط المفردة أو حزم الخيوط بواسطة حركات x و y و z للجدول.
      ملاحظة: نظرا للترتيب ثلاثي الأبعاد ، يمكن التركيز فقط على جزء من القسم ذي الصلة. تسمح رقائق السيلوفان بضبط التركيز دون قيود.
    4. راقب حركات الخيوط أو الحزم المفردة. تأكد من أن العدسة الموضوعية لا تلمس السائل. سجل حركات الخيوط باستخدام كاميرا مجهر قياسية (انظر الفيديو التكميلي S1).
  4. فحص الحركة على السطح
    1. لمراقبة حركة الخيوط على أسطح الأجار ، قم بإعداد أطباق بتري 6 سم مع f/2 bacto-agar. تأكد من أن الأجار مرتفع بما يكفي للعدسة الموضوعية للاقتراب من سطح الأجار. بدلا من ذلك ، قم بإعداد طبقة أجار بسماكة ~ 3 مم وسجل الخيوط من خلال الأجار (احتفظ باللوحة رأسا على عقب أو استخدم مجهرا مقلوبا).
    2. ماصة 0.5 مل من محلول يحتوي على P. ثغرة (من الخطوة 5.2) على سطح باكتو أجار لطبق بتري 6 سم. اسمح للسائل بدخول السطح. أغلق طبق بتري وراقب حركة الخيوط على السطح باستخدام هدف 4x أو 10x.
    3. تأكد من استخدام نفس الإعدادات الكهربائية والبصرية للمجهر طوال التسجيل وفي التسجيلات اللاحقة.
    4. التقط تسجيلات بفاصل زمني باستخدام كاميرا العين ونظام الكمبيوتر الصغير. تأكد من أن الفاصل الزمني بين الصور اللاحقة هو 5 s-1 دقيقة. قم ببرمجة البرنامج النصي Linux للكمبيوتر الصغير للتحكم في تسجيل الفاصل الزمني. راجع الملف التكميلي 2 للحصول على مثال على البرنامج النصي والفيديو التكميلي S2 كمثال.
  5. فحص التاكسي الضوئي
    1. بالنسبة لتجارب التاكسي الضوئي ، قم بإعداد حاملات الصمام الثنائي الباعث للضوء (LED) (هنا ، باستخدام طابعة ثلاثية الأبعاد) حيث يتم تركيب مصابيح LED المحددة مقاس 5 مم لتشعيع مساحة 20 مم2 من الأسفل إلى الأعلى (الشكل 3). إذا لزم الأمر ، استخدم العديد من حاملات LED بالتوازي ، وقم بتوصيل كل LED كهربائيا من خلال مقاوم ومقياس جهد بمصدر طاقة قابل للتعديل. قياس وضبط كثافة LED ، اعتمادا على التجربة. تأكد من أن الإعداد بأكمله في غرفة مظلمة أو حاوية مظلمة مغلقة.
    2. ضع 8 مل من الوسط الذي يحتوي على P. gapuna (من الخطوة 5.2) في طبق بتري 6 سم. اضبط شدة الضوء لمؤشر LED. أغلق طبق بتري بالغطاء وضعه على حامل LED بحيث يكون LED في وسط طبق Petri.
    3. بعد المدة المطلوبة (عادة 2 أيام) ، التقط صورة لطبق Petri باستخدام كاميرا هاتف ذكي تستهدف مباشرة موضع المعالجة الخفيفة. استخدم لوحة LED بيضاء لتشعيع العينة. استخدم الإعدادات اليدوية للكاميرا ؛ تجنب انعكاسات الضوء. اضبط دائما للحصول على نفس المسافة بين عدسة الكاميرا والعينة. تأكد من أن إعدادات التعريض الضوئي تعطي صورة مناسبة للتحليلات اللاحقة باستخدام ImageJ.
    4. حدد قطر الدائرة المركزية للخيوط باستخدام برنامج ImageJ.
      1. افتح ImageJ، انقر على ملف | فتح، وحدد الملف المطلوب، وانقر فوق Enter.
      2. حدد الزر مستقيم (بخط مستقيم ). اضغط على زر الماوس الأيسر لرسم خط من أحد طرفي طبق بتري إلى الطرف الآخر. تأكد من أن الخط يمر عبر مركز دائرة الخيوط.
      3. اضغط على Ctrl-K على لوحة المفاتيح أو انقر فوق تحليل | رسم ملف التعريف في قائمة ImageJ. ابحث عن نافذة x-y مع كثافة بكسل مرسومة مقابل المسافة - ملف تعريف 1D لطبق Petri. تأكد من أن أقل كثافة بكسل أعلى قليلا من 0 وأعلى قيمة أقل من 255.
      4. تقدير قيمة متوسطة لكثافة البيكسل خارج الدائرة وقيمة متوسطة أخرى لكثافة البيكسل في الدائرة. عند الموضع y بين هذه القيم، قم بتقدير قيم x لجانبي الدائرة عن طريق الإشارة بالماوس إلى هذه المراكز. لاحظ كلا القيمتين واحسب الفرق.
      5. احصل على أعلى قيمة x عن طريق توجيه الماوس إلى المحور y على اليمين. لاحظ أن هذه القيمة e تمثل قطر طبق بتري. إذا كان هذا القطر 5 سم، فاحسب قطر دائرة الخيوط المركزية على أنه d/e × 5 سم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وباتباع الطرق المذكورة أعلاه، عزلت 5 سلالات مختلفة من الثغرة المتصورة من برك الصخور وتسلسلت (الشكل 1 والجدول 1). كانت جميع الثقافات عقيمة بعد ~ 1 سنة من الزراعة الفرعية باستثناء P. lacuna HE10JO. لا تزال هذه السلالة ملوثة بماريفيرغا أتلانتيك ، وهي بكتيريا بحرية. خلال رحلات هيلغولاند اللاحقة ، تم عزل البكتيريا الزرقاء الخيطية الأخرى من برك الصخور ، والتي تختلف عن P. ثغرة وتحتاج إلى توصيف.

تم اختبار العديد من طرق استخراج الحمض النووي وتنقيته بحثا عن P. ثغرة. تم الحصول على أفضل النتائج باستخدام طريقة CTAB المحسنة كما هو موضح أعلاه. وكانت غلة الحمض النووي 310 ± 50 ميكروغرام/مل، وأودو 260 نانومتر/OD 280 نانومتر 1.7 ± 0.03، وOD 260 نانومتر/OD 230 نانومتر 0.78 ± 0.04 (ن = 17). أظهر تسلسل الجينوم أن الحمض النووي لجميع السلالات كان مختلفا قليلا ، كما هو متوقع (الجدول 1). أظهرت تسلسلات البروتين الأساسية فرقا أقصى قدره 0.04٪ (الجدول 2). على الرغم من أن جميع مسودات الجينوم كانت غير مكتملة ، يمكن للمرء أن يفترض أن >98٪ من جينوم HE10JO30 تم تسلسله. يعتمد هذا التقدير على عدد إطارات القراءة المفتوحة غير المكتملة. يمكن بسهولة تحديد تسلسلات البروتين الجزئية بعد التعليق التوضيحي ل RAST ل HE10DO و HE10JO. في HE10JO ، كان لدى 60 بروتينا من أصل ~ 4,500 تسلسل N- أو C-terminal مفقود. يمكن العثور على تسلسلات الجينوم في الملحق (الملف التكميلي 3 والملف التكميلي 4 والملف التكميلي 5 والملف التكميلي 6 والملف التكميلي 7).

ومن المثير للاهتمام ، تم عزل سلالات من نفس النوع من جزيرتين ، هيلغولاند وجيجليو. المسافة الخطية بين الجزيرتين هي 1400 كم. يجب أن يكون هناك رابط بين كلا المكانين ، على سبيل المثال ، عن طريق السفن عبر البحر أو ، على الأرجح ، عن طريق الطيور المهاجرة. يمكن العثور على العديد من أنواع الطيور في كلتا الجزيرتين ، والعديد منها طيور مهاجرة. وكان التنوع داخل سلالات P. lacuna في جزيرة واحدة أكبر مما كان عليه بين أقرب سلالات هيلغولاند وجيليو (الجدول 2). هذا يشير إلى تبادل مكثف بين كلا المكانين.

تم اختبار التحول الطبيعي مع HE10DO كسلالة رئيسية ومع HE10JO. البروتوكول الحالي أكثر وضوحا من البروتوكول الموصوف سابقا12 بسبب انخفاض عدد خطوات الغسيل وخطوات النقل الأقل بعد التحول. وتستخدم هذه الطريقة الجديدة باستمرار في المختبر؛ ~ تم تحقيق 15 تحولا ناجحا.

عادة ما يتم دمج كاسيت مقاومة KanR في الموقع المتماثل الذي تحدده المناطق المجاورة ، كما هو موضح في PCR باستخدام الاشعال الداخلي والخارجي. مثل معظم البكتيريا الزرقاء ، P. ثغرة هي polyploid. يمكن أن يكون لديها أكثر من 100 كروموسوم لكل خلية12. عادة ما يحتوي اختبار PCR مع الاشعال الخارجي ~ 1 أسبوع بعد التحول على نطاقين على هلام الرحلان الكهربائي ، أحدهما بحجم النطاق البري ونطاق هجرة أبطأ يشير إلى إدخال كاسيت المقاومة (الشكل 4). يشير النطاق المزدوج إلى أن جزءا فرعيا فقط من الكروموسومات يحتوي على الإدراج. بعد 4 أسابيع من الاختيار على الكاناميسين ، عادة ما يكتمل الفصل ، ويظهر شريط PCR كبير واحد فقط على المواد الهلامية. ومع ذلك ، في حالة التحول مع pMH1 (انظر أدناه) ، اكتمل الفصل بعد أكثر من 3 أشهر.

تم إنشاء المتجهات pAK1 و pAK2 و pAK3 و pMH1 للاختبارات على تعبير sfGFP. في pAK1 و pAK2 و pAK3 ، يخضع جين sfGFP لسيطرة المروجين cpc560 و A2813 و psbA2 ، على التوالي. هؤلاء المروجون هم من Synechocystis sp. PCC 6803 أو Synechococcus sp. PCC 700231. لبناء هذه المتجهات ، تم أخذ تسلسلات المروج والمنهي sfGFP من المتجهات المستخدمة لتحويل Synechococcus sp. PCC 700231. تم دمج التسلسلات ذات الصلة في موقع chwA (sc_7_37) المتماثل ل pFN1 (أو pFN_7_37_KanR15). تم إنشاء متجه التعبير pMH1 عن طريق تخليق الحمض النووي باستخدام تسلسلات P. gapuna كقوالب (الملف التكميلي 6). يتم ترتيب تسلسل cpcB-cpcA (phycocyanin ß و phycocyanin α) من P. ثغرة بشكل متسلسل. تفصل المنطقة بين الجينات 100 نقطة أساس بين منطقتي الترميز. يحتوي التسلسل الاصطناعي على تسلسل cpcB-cpcA الداخلي المنشأ ومروج cpcB. يتم وضع كاسيت sfGFP و KanR فقط 3 أقدام من كودون إيقاف cpcB (5 أقدام من cpcA). يتم استنساخ التسلسل الاصطناعي بأكمله مع مروج cpcB ، cpcB ، sfGFP ، KanR ، cpcA (من 5 إلى 3 بوصات) إلى pUC19. تظهر خريطة في الشكل 5. ويرد مزيد من التفاصيل حول استنساخ pAK1 و pAK2 و pAK3 والتسلسل الكامل ل pMH1 في الملف التكميلي 1.

جميع المحولات الأربعة (مع pAK1 و pAK2 و pAK3 و pMH1) عبرت عن GFP ؛ كانت جميع مستويات التألق أعلى من التألق الخلفي للخيوط البرية (الشكل 6). كشفت محولات pMH1 ذات الفصل غير الكامل عن إشارة GFP كانت متغيرة للغاية بين الخيوط. تم توزيع إشارة التألق بالتساوي عند اكتمال الفصل (الشكل 6E). كانت إشارات المجهر لمحولات pAK1 و pAK2 و pAK3 متشابهة ولكنها أضعف بمقدار 5 أضعاف من إشارات pMH1 (الشكل 6E).

تعتمد طريقة الحفظ بالتبريد المعمول بها على طريقة تم إنشاؤها للإشريكية القولونية. عندما تم تنفيذ خطوتي غسيل لإزالة الجلسرين بعد ذوبان الجليد ، نجت 15 من أصل 15 عينة من P. gapuna (الجدول 3). يمكن أيضا استخدام هذا البروتوكول ل Synechocystis PCC 6803 ، ولكن فقط مع خطوتي غسيل وليس مع 1 (الجدول 3).

ميزة أخرى لخيوط التذبذب هي حركتها: تتحرك خيوط P. gapuna باستمرار على الأسطح (الشكل 7) وفي وسط سائل (الشكل 8). يمكن دراسة كلا النوعين من الحركة بسهولة في أطباق بتري بدون أو مع وسط أجار. مطلوب تسجيل الفاصل الزمني لأن الحركة على أجار بطيئة. تتحرك الخيوط نحو مخروط الضوء إذا كان شعاع الضوء يأتي من الأسفل (الشكل 3). يمكن دراسة آثار شدة الضوء والطول الموجي والوقت بسهولة من خلال إعداد بسيط. المستقبلات الضوئية لهذا التأثير ليست واضحة بعد. يمكن التعامل مع المرشحين المحتملين باستخدام الطفرات بالضربة القاضية. الآلية الكامنة وراء كيفية عثور الخيوط على الضوء غير واضحة أيضا. لهذا السؤال ، هناك حاجة إلى نظام الأشعة تحت الحمراء لتسجيل الخيوط أثناء حركتها من الظلام إلى الضوء.

Figure 1
الشكل 1: سلالات من ثغرة Phormidium التي تم جمعها من Helgoland و Giglio. يتم نشر الخيوط لمدة 11 يوما على f/2 agar في أطباق بتري 6 سم. (أ) سلالة GI08AO؛ (ب) سلالة GI08IO؛ (ج) سلالة GI09CO؛ (د) سلالة HE10DO؛ (ه) سلالة HE10JO؛ (F) سلالة HE15M2G1. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: خيوط ثغرة Phormidium بعد 5 أسابيع من التحول. تم استخدام متجه التعبير sfGFP pMH1 ؛ حدث الاختيار على f / 2 + الوسط مع 120 ميكروغرام / مل كاناميسين. الخيوط الخضراء مقاومة وحية. وقد ماتت خيوط أخرى. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: تجربة التاكسي الضوئي. على اليسار: حامل LED مع 4 مصابيح LED حمراء ، متصلة بمصدر طاقة قابل للتعديل. علاوة على كل مصباح LED ، يوجد طبق بتري بطول 6 سم مع 8 مل من ثقافة ثغرة Phormidium. على اليمين: طبق بتري مع P. ثغرة بعد يومين على LED الأحمر (15 ميكرومول m-2 s-1). اختصار: LED = الصمام الثنائي الباعث للضوء. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: تكامل وفصل الإدراج بعد تحويل ثغرة Phormidium مع pAK1. PCR مع الاشعال الخارجي. الأحجام المتوقعة للمنتج بدون ومع إدراج هي 2371 و 5016 نقطة أساس ، على التوالي. المسار الأيسر: علامة ، الممرات 1 ، 2 ، 3 ، 4: منتجات PCR من خيوط 7 أيام ، 11 يوما ، 14 يوما ، و 17 يوما بعد عزل خيوط مقاومة (4 أسابيع بعد التحول) ، على التوالي. حارة 5: PCR المنتج من النوع البري (من هلام مختلف). في عينة 7 أيام ، يكون الإدراج موجودا في جزء صغير من الكروموسومات. يزداد هذا الكسر حتى 17 يوما ، حيث لا يوجد نطاق من النوع البري مرئي ، أي أن الفصل كامل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: متجه لتعبير sfGFP تحت سيطرة مروج cpcB الداخلي. البرتقالي: تسلسل متجانس Phormidium ، البنفسجي / الأزرق: pUC-19 متجه العمود الفقري ، الأخضر: إدراج مع sfGFP و KanR. الاختصارات: sfGFP = بروتين الفلورسنت الأخضر الفائق المجلد. KanR = مقاومة الكانامايسين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: التعبير عن sfGFP في ثغرة Phormidum. صور فلورية لخيوط P. lacuna من النوع البري (A) وبعد التحول باستخدام pAK1 (B) و pAK2 (C) و pAK3 (D) و pMH1 (E). في pMH1 ، يتم وضع جين sfGFP 3' من جين phycocyanin ß وبالتالي يقوده مروج cpcß الداخلي ؛ في الحالات الأخرى ، يتم تشغيل sfGFP بواسطة cpc560 أو A2813 أو psbA2s المروجين من Synechocystis PCC 6803 ، على التوالي. إعدادات التألق خاصة ب GFP. تم تسجيل جميع الصور بنفس وقت التكامل والإعدادات البصرية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 7
الشكل 7: صورة مدمجة لثغرة Phormidium على سطح أجار عند تكبير 4x. يتم تقديم الصورة الأولى باللون الأحمر ، والثانية (تم التقاطها بعد 1 دقيقة) باللون الأخضر. لاحظ أيضا الآثار الموجودة على الأجار. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 8
الشكل 8: صورة مدمجة لثغرة الفيرميديوم في الوسط السائل . كان الفاصل الزمني بين كلتا الصورتين 10 ثوان. تتم طباعة الصورة الأولى باللون الأحمر. والثاني مطبوع باللون الأخضر. تظهر مقارنة كلا اللونين الحركة في غضون 10 ثوان. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

وتر HE10JO HE10DO GI08AO GI09CO HE15M2G1
كونتيجس 104 174 218 102 154
إجمالي نقطة أساس 48,19,017 47,88,491 47,78,775 36,69,922 45,98,395

الجدول 1: سلالات ثغرة الفيرميديوم.

Gi09CO HE10DO HE10JO HE15M2G1
Gi08AO 42 40 0 42
Gi09CO 2 42 0
HE10DO 40 2
HE10JO 42

الجدول 2. اختلافات الأحماض الأمينية بين السلالات في تسلسل من 20 بروتينا أساسيا مع 10876 من الأحماض الأمينية.

كثافة الخلية OD 750 نانومتر 1 1 3 3 5 5 7 7
يغسل 1 2 1 2 1 2 1 2
المتبرعمة الكيسية PCC 6803 2/5 5/5 1/4 4/4 0/4 4/4 0/4 3/4
ثغرة الفيرميديوم HE10DO 4/4 4/4 4/4 4/4 3/ 4 4/4 3/3 3/3

الجدول 3: تجارب الحفظ بالتبريد مع Synechocystis PCC 6803 و Phormidium lacuna HE10DO البكتيريا الزرقاء. يوضح الرقم الأول عدد الثقافات التي نجت بعد التجمد / الذوبان. ويعرض الرقم الثاني مجموع التجارب.

فيديو تكميلي S1: حركة خيوط ثغرة Phormidium في محلول سائل ، دون فاصل زمني.

فيديو تكميلي S2: حركة خيوط ثغرة Phormidium على سطح الأجار ، مع فاصل زمني.

الملف التكميلي 1: استنساخ المتجهات لتحويل ثغرة الفيرميديوم. قائمة متجهات التحويل ؛ قائمة الاشعال للاستنساخ ؛ تسلسل pMH1 بتنسيق gb. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 2: البرامج النصية ل Shell (sh) للكمبيوتر الصغير Raspberry Pi. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 3: تسلسل الحمض النووي ل HE152G1. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 4: تسلسل الحمض النووي ل GI08AO. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 5: تسلسل الحمض النووي ل GI09CO. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 6: تسلسل الحمض النووي ل HE10DO. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 7: تسلسل الحمض النووي ل HE10JO. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

على الرغم من أن العديد من سلالات البكتيريا الزرقاء متوفرة من مجموعات الاستزراع32،33،34،35،36 ، لا يزال هناك طلب على البكتيريا الزرقاء الجديدة من البرية لأن هذه الأنواع تتكيف مع خصائص محددة. تم جمع P. ثغرة من برك الصخور ويتم تكييفها مع الاختلافات في تركيزات الملح ودرجة الحرارة30. تم العثور على سلالات من هذا النوع خلال الرحلات في 2008 و 2009 و 2010. مع الإجراء الموصوف هنا ، تم عزل 5 سلالات من P. gapuna ، وكانت 4 من هذه السلالات معقمة. السلالة P. lacuna HE10JO ملوثة بشكل دائم ببكتيريا Marivirga atlantica ، وهي بكتيريا بحرية تم تحديدها بواسطة rRNA وتسلسل الجينوم. لا يمكن فصل هذه البكتيريا عن البكتيريا الزرقاء على الرغم من تطبيق الفصل الميكانيكي أو النمو في درجات حرارة مختلفة أو العلاجات بالمضادات الحيوية أو العلاجات الكيميائية. على الرغم من التلوث ، يمكن زراعة P. lacuna HE10JO على غرار السلالات الأخرى. في الرحلات اللاحقة ، تم العثور على أعضاء آخرين من Oscillatoriales ، والتي لم يتم تحليلها بعد بالتفصيل. لم يتم العثور على P. ثغرة مرة أخرى. ليس من الواضح لماذا تم عزل P. lacuna في السنوات اللاحقة ومكانين مختلفين ولكن لم يتم العثور عليهما لاحقا. ومن المؤكد أن وفرتها تعتمد على ظروف لا يمكن التنبؤ بها. درجة الحرارة وتركيزات الملح والمغذيات غير العضوية أو العضوية متغيرة للغاية في أحواض الصخور. لذلك ، يمكن أن يتقلب تكوين الأنواع بمرور الوقت بطريقة لا يمكن التنبؤ بها.

يتم تأسيس التحول الطبيعي لمختلف البكتيريا الزرقاء ، ومعظمها من الأنواع أحادية الخلية. الثغرة P . الخيطية هي النوع الوحيد من ترتيب الذبذبات التي تم إنشاء التحول الطبيعي لها. كان التحول ناجحا دائما تقريبا مع البروتوكول الحالي. بشكل عام ، تختلف أعداد الخيوط المقاومة بعد تجربة التحول اختلافا كبيرا ، وأحيانا يفشل التحول ، مما يؤدي إلى فقدان الوقت الثمين. لذلك من المستحسن تنفيذ العديد من مشاريع التحول بالتوازي. يمكن أن يختلف وقت الفصل الكامل ، عادة بعد 4 أسابيع من عزل السلالة المقاومة ، أيضا. نظرا لعدم وجود ضمان للفصل الكامل بعد النمو على الكاناميسين ، فمن الأهمية بمكان إجراء اختبارات PCR باستخدام الاشعال الخارجي والداخلي.

يجب أن يحتوي كل متجه على تسلسلات متماثلة 2 × 500-1000 نقطة أساس ، على سبيل المثال ، يتم تضخيمها من المضيف بواسطة PCR ومقاطعتها بواسطة كاسيت مقاومة (على سبيل المثال ، كاسيت kanamycin KanR المستخدم هنا)37,38. بالنسبة للتعبير ، يجب استنساخ المروج وتسلسل الترميز (على سبيل المثال ، ل sfGFP39) والمنهي وكاسيت المقاومة بين التسلسلات المتماثلة. استراتيجيات الاستنساخ خاصة بالأنواع وتعتمد على الهدف من التجربة.

يمكن أن تكون طريقة التحول هذه ممكنة مع سلالات التذبذب الأخرى أو البكتيريا الزرقاء الأخرى أيضا: يعتمد التحول الطبيعي على النوع الرابع pili ، الموجود في كل جينوم البكتيريا الزرقاء الآخر تقريبا 3,15,40. لذلك ، يمكن للطريقة الحالية أن تحفز تجارب جديدة مع الأنواع الأخرى. نظرا لأن النوع الرابع من البيلي مناسب أيضا للحركة ، فمن المهم التحقق من الظروف التي تكون فيها البكتيريا الزرقاء متحركة.

يعتمد إدخال الجينات على إعادة التركيب المتماثلة ويؤدي إلى تعطيل المواقع المتماثلة. لذلك ، غالبا ما يستخدم التحول للضربة القاضية للجينات. سيتم تحفيز التعبير عن الجين المدرج إذا تم دمج مروج نشط وتسلسل ترميز في الموقع المتماثل. في P. ثغرة ، كان نشاط المروج يعتمد على الأنواع. يمكن لمروجي cpc560 و A2813 و psbA2 ل Synechocystis PCC sp 6803 أو Synechococcus sp. PCC 7002 31 ومروج cpcB ل P. gapuna أن يدفعوا تعبير sfGFP. من بين هذه التركيبات ، قام مروج cpcB الداخلي بتحفيز أقوى تعبير ، على الرغم من أن جين sfGFP يقع على بعد 3 'من جين phycocyanin ß. هذا يشير إلى استخدام أكثر عمومية للمروجين الداخليين في التعبير عن البكتيريا الزرقاء.

سيلقي الجمع بين دراسات الضربة القاضية الجينية والحركة الضوء على الآليات الجزيئية للحركة والتاكسي الضوئي. يمكن أن توفر مصادر ضوء LED ضوءا لتجارب التاكسي الضوئي. يتوفر أي طول موجي تقريبا ، ويمكن تعديل شدة الضوء بواسطة مصدر طاقة قابل للتعديل ومقاييس الجهد. يمكن بناء حاملات LED بواسطة طابعات 3D لتحقيق مجموعات من مصابيح LED المختلفة بسهولة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

Acknowledgments

تم دعم العمل من قبل معهد كارلسروهر للتكنولوجيا.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Autoclave 3870 ELV Tuttnauer 3870 ELV
Bacto Agar OttoNorwald 214010
BG-11 Freshwater Solution Sigma Aldrich C3061
BG-11 medium Merck 73816-250ML
Boric acid Merck 10043-35-3 H3BO3
Calcium chloride dihydrate Carl Roth 10035-04-8 CaCl2 · 2 H2O
Cell culture flasks Cellstar with filter screw cap, sterile, 250 mL Greiner 658190
Cell culture flasks Cellstar with filter screw cap, sterile, 50 mL Greiner 601975
Centrifuge LYNX 4000 Thermo Scientific 75006580 and rotor
Centrifuge microstar 17 VWR International N/A for up to 13,000 rpm
Cetyltrimethylammonium Bromide (CTAB) PanReac AppliChem 57-09-0 C19H42BrN
Chloroform : Isoamyl Alcohol 24 : 1 PanReac AppliChem
A1935
Cobalt(II) chloride hexahydrate Merck 7791-13-1 CoCl2 · 6 H2O
Copper(II) sulphate pentahydrate Merck 7758-99-8  CuSO4 · 5 H2O
D(+)-Biotin Carl Roth 58-85-5  C10H16N2O3S
DNA ladder 1 kb New England Biolabs N3232
DNA ladder 100 bp New England Biolabs N3231
Electrical pipetting help accujet-pro S Brand GmbH 26360 for pipetting 1-25 mL
Ethanol VWR 64-17-5 C2H6O
Ethylenediamine tetraacetic acid disodium salt dihydrate Carl Roth 6381-92-6 EDTA-Na2 · 2 H2O
Fluorescence microscope ApoTome Zeiss
Fluorescence microscope Axio Imager 2 Zeiss
French Pressure Cell Press American Instrument Company N/A
Gel documation System Saffe Image Invitrogen
Gelelctrophoresis system Mupid-One/-exu ADVANCED
Glassware, different
Glycerol Carl Roth 56-81-5 C3H8O3
Iron(III) chloride hexahydrate Merck 10025-77-1  FeCl3 · 6 H2O
Kanamycin Sigma-Aldrich 25389-94-0
Kanamycin sulphate Carl Roth 25389-94-0 C18H36N4O11 · H2SO4
Lauroylsarcosine, Sodium Salt (Sarcosyl) Sigma Aldrich 137-16-6 C15H28NO3 · Na
LB Broth (Lennox) Carl Roth X964.4
Light source, fluorescent tube L18W/954 daylight OSRAM cultivation of cyanobacteria
Light source, LED panel XL 6500K 140 W Bloom Star N/A cultivation of cyanobacteria, up to 1,000 µmol m-2 s-1
Magnesium chloride hexahydrate Carl Roth 7791-18-6 MgCl2 · 6 H2O
Manganese(II) chloride tetrahydrate Serva 13446-34-9 MnCl2 · 4 H2O
Microscope DM750 Zeiss
Midi prep plasmid extraction kit NucleoBond Xtra Midi kit Macherey-NAGEL GmbH & Co. KG REF740410.50
Minicomputer Raspberry Pi 4 + Conrad Electronics 2138863-YD for time-lapse recording
Ocular camera EC3 Leica for continuous recording up to 30 s
Ocular camera MikrOkular Full HD Bresser for time-lapse recordings, coupled to Raspberry Pi minicomputer
Petri dishes polystyrole, 100 mm x 20 mm Merck P5606-400EA
Petri dishes polystyrole, 60 mm x 15 mm Merck P5481-500EA
Photometer Nanodrop ND-1000 Peqlab Biotechnologie
Photometer Uvikon XS Goebel Instrumentelle Analytik GmbH
Pipetman 100-1,000 µL Gilson SKU: FA10006M
Pipetman 10-100 µL Gilson SKU: FA10004M
Plastic pipettes 10 mL, sterile Greiner 607107
Plastic tube, sterile, 15 mL Greiner 188271
Plastic tube, sterile, 50 mL Greiner 227261
Potassium bromide Carl Roth 7758-02-3 KBr
Potassium chloride Carl Roth 7447-40-7 KCl
Power supply Statron 3252-1 Statron Gerätetechnik GmbH
Power supply Voltcraft PPS 16005 Conrad Electronics for LED
Proteinase K Promega MC500C from Maxwell 16 miRNA Tissue Kit AS1470
Q5 polymerase New England Biolabs M0491S
Sequencing kit NextSeq 500/550 v2.5 Illumina
Sequencing system NextSeq 550 SY-415-1002 Illumina
Shaker Unimax 2010 Heidolph Instruments for cultivation
Sodium acetate Carl Roth 127-09-3 NaCH3COO
Sodium chloride Carl Roth 7647-14-5 NaCl
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate Carl Roth 10049-21-5 NaH2PO4 · H2O
Sodium fluoride Carl Roth 7681-49-4 NaF
Sodium hydrogen carbonate Carl Roth 144-55-8 NaHCO3
Sodium molybdate dihydrate Serva 10102-40-6 Na2MoO4 · 2 H2O
Sodium nitrate Merck 7631-99-4 NaNO3
Sodium sulphate Carl Roth 7757-82-6 Na2SO4
Strontium chloride hexahydrate Carl Roth 10025-70-4 SrCl2 · 6 H2O
Thiamine hydrochloride Merck 67-03-8 C12H17ClN4OS · HCl
TRIS Carl Roth 77-86-1 C4H11NO3
Ultrasonic device UP100H with sonotrode MS3 Hielscher Ultrasound Technology UP100H
Ultraturrax Silent Crusher M Heidolph Instruments homogenizer
Urea Carl Roth 57-13-6 CH4N2O
Vitamin B12 Sigma 68-19-9 C63H88CoN14O14P
Vitamin solution 0.3 µM thiamin-HCl, 2.1 nM biotin, 0.37 nM cyanocobalamin
Water Stills, Water treatment VEOLIA water technologies ELGA_21001
Zinc sulphate heptahydrate Sigma 7446-20-0 ZnSO4 · 7 H2O
software, URL
gatb-minia program for DNA assembly https://github.com/GATB/gatb-minia-pipeline makes large scaffolds from short DNA reads, Linux based
ImageJ software for immage processing (pixel intensities, circle diameter)
RAST annotation server https://rast.nmpdr.org input: genome DNA sequence, detects open reading frames, lists protein sequences and their functions
Culture media
Artificial seawater 0.41 M NaCl , 53 mM MgCl2,28 mM Na2SO4, 10 mM CaCl2 , 9 mM  KCl , 2.4 mM NaHCO3 ,0.84 mM KBr, 0.49 mM H3BO3, 90 µM SrCl2, 72 µM NaF
f/2 -liquid medium artificial seawater, 0.1 % (v/v) trace element solution, 0.05 % (v/v) vitamin solution, 0.88 mM NaNO3, 36 µM NaH2PO4 
f/2+ liquid medium f/2-medium, with 10 times increased NaNO3 and NaH2PO4 (0.88 mM NaNO3, 36 µM NaH2PO4
f/2+-agar 3 % (w/v) bacto agar, artificial seawater, 0.1 % (v/v) trace element solution, 0.05 % (v/v) vitamin solution ,8.8 mM NaNO3, 0.36 mM NaH2PO4
f/2-agar 3 % (w/v) bacto agar, artificial seawater, 0.1 % (v/v) trace element solution, 0.05 % (v/v) vitamin solution ,0.88 mM NaNO3, 36 µM NaH2PO4
Trace element solution 0.36 mM NaH2PO4, 12 µM Na2EDTA, 39 nM CuSO4, 26 nM Na2MoO4 , 77 nM ZnSO4, 42 nM CoCl2, 0.91 µM MnCl2
Vitamin solution 0.3 µM thiamin-HCl, 2.1 nM biotin, 0.37 nM cyanocobalamin

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brasil, B., de Siqueira, F. G., Salum, T. F. C., Zanette, C. M., Spier, M. R. Microalgae and cyanobacteria as enzyme biofactories. Algal Research-Biomass Biofuels and Bioproducts. 25, 76-89 (2017).
  2. Gundolf, R., Oberleitner, S., Richter, J. Evaluation of New Genetic Toolkits and Their Role for Ethanol Production in Cyanobacteria. Energies. 12 (18), 3515 (2019).
  3. Wendt, K. E., Pakrasi, H. B. Genomics approaches to deciphering natural transformation in cyanobacteria. Frontiers in Microbiology. 10, 1259 (2019).
  4. Tandeau de Marsac, N., et al. A new approach for molecular cloning in cyanobacteria: cloning of an Anacystis nidulans met gene using a Tn901-induced mutant. Gene. 20 (1), 111-119 (1982).
  5. Porter, R. D. Transformation in cyanobacteria. Critical Reviews in Microbiology. 13 (2), 111-132 (1986).
  6. Joset, F. Transformation in Synechocystis PCC 6714 and 6803: preparation of chromosomal DNA. Methods in Enzymology. 167, 712-714 (1988).
  7. Tsinoremas, N. F., Kutach, A. K., Strayer, C. A., Golden, S. S. Efficient gene transfer in Synechococcus sp strains PCC-7942 and PCC-6301 by interspecies conjugation and chromosomal recombination. Journal of Bacteriology. 176 (21), 6764-6768 (1994).
  8. Matsunaga, T., Takeyama, H. Genetic engineering in marine cyanobacteria. Journal of Applied Phycology. 7 (1), 77-84 (1995).
  9. Frigaard, N. U., Sakuragi, Y., Bryant, D. A. Gene inactivation in the cyanobacterium Synechococcus sp. PCC 7002 and the green sulfur bacterium Chlorobium tepidum using in vitro-made DNA constructs and natural transformation. Methods in Molecular Biology. 274, 325-340 (2004).
  10. Iwai, M., Katoh, H., Katayama, M., Ikeuchi, M. Improved genetic transformation of the thermophilic cyanobacterium, Thermosynechococcus elongatus BP-1. Plant and Cell Physiology. 45 (2), 171-175 (2004).
  11. Vioque, A. Transformation of cyanobacteria. Transgenic Microalgae as Green Cell. Leon, R., Galvan, A., Fernandez, E. , Springer. 12-22 (2007).
  12. Nies, F., Mielke, M., Pochert, J., Lamparter, T. Natural transformation of the filamentous cyanobacterium Phormidium lacuna. Plos One. 15 (6), 0234440 (2020).
  13. Ravindran, C. R. M., Suguna, S., Shanmugasundaram, S. Electroporation as a tool to transfer the plasmid pRL489 in Oscillatoria MKU 277. Journal of Microbiological Methods. 66 (1), 174-176 (2006).
  14. El Semary, N. A. Optimized electroporation-induced transformation in Microcystis aeruginosa PCC7806. Biotechnologie Agronomie Societe et Environnement. 14 (1), 149-152 (2010).
  15. Nies, F., Mielke, M., Pochert, J., Lamparter, T. Natural transformation of the filamentous cyanobacterium Phormidium lacuna. PLoS One. 15 (6), 0234440 (2020).
  16. Sode, K., Tatara, M., Takeyama, H., Burgess, J. G., Matsunaga, T. Conjugative gene-transfer in marine cyanobacteria - Synechococcus Sp, Synechocystis Sp and Pseudanabaena Sp. Applied Microbiology and Biotechnology. 37 (3), 369-373 (1992).
  17. Stucken, K., Ilhan, J., Roettger, M., Dagan, T., Martin, W. F. Transformation and conjugal transfer of foreign gGenes into the filamentous multicellular cyanobacteria (Subsection V) Fischerella and Chlorogloeopsis. Current Microbiology. 65 (5), 552-560 (2012).
  18. Bellali, S., Khalil, J. B., Fontanini, A., Raoult, D., Lagier, J. C. A new protectant medium preserving bacterial viability after freeze drying. Microbiological Research. 236, 126454 (2020).
  19. Wallner, T., Pedroza, L., Voigt, K., Kaever, V., Wilde, A. The cyanobacterial phytochrome 2 regulates the expression of motility-related genes through the second messenger cyclic di-GMP. Photochemical & Photobiological Sciences. 19 (5), 631-643 (2020).
  20. Wilde, A., Fiedler, B., Borner, T. The cyanobacterial phytochrome Cph2 inhibits phototaxis towards blue light. Molecular Microbiology. 44 (4), 981-988 (2002).
  21. Bhaya, D., Takahashi, A., Grossman, A. R. Light regulation of type IV pilus-dependent motility by chemosensor-like elements in Synechocystis PCC6803. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (13), 7540-7545 (2001).
  22. Guillard, R. R., Ryther, J. H. Studies of marine planktonic diatoms. I. Cyclotella nana Hustedt, and Detonula confervacea (cleve) Gran. Canadian Journal of Microbiology. 8, 229-239 (1962).
  23. Kester, D. R., Duedall, I. W., Connors, D. N., Pytkowicz, R. M. Preparation of artificial seawater. Limnology and Oceanography. 12 (1), 176-179 (1967).
  24. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning. A Laboratory Manual. 3rd edition. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).
  25. Cold Spring Harbor Protocols. CTAB DNA extraction buffer. Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (3), (2009).
  26. Singh, S. P., Rastogi, R. P., Häder, D. -P., Sinha, R. P. An improved method for genomic DNA extraction from cyanobacteria. World Journal of Microbiology & Biotechnology. 27, 1225-1230 (2011).
  27. French, C. S., Milner, H. W. Disintegration of bacteria and small particles by high-pressure extrusion. Methods in Enzymology. 1, 64-67 (1955).
  28. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning, a laboratory manual. 2nd ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).
  29. Lamparter, T., et al. The involvement of type IV pili and phytochrome in gliding motility, lateral motility and phototaxis of the cyanobacterium Phormidium lacuna. bioRxiv. , (2021).
  30. Nies, F., et al. Characterization of Phormidium lacuna strains from the North Sea and the Mediterranean Sea for biotechnological applications. Process Biochemistry. 59, 194-206 (2017).
  31. Kachel, B., Mack, M. Engineering of Synechococcus sp. strain PCC 7002 for the photoautotrophic production of light-sensitive riboflavin (vitamin B2). Metabolic Engineering. 62, 275-286 (2020).
  32. Lukavsky, J., Cepak, V., Komarek, J., Kasparkova, M., Takacova, M. Catalogue of algal and cyanobacterial strains of culture collection of autotrophic organisms at Trebon. Algological Studies. 63, 59-112 (1992).
  33. Philbrick, J. B., Diner, B. A., Zilinskas, B. A. Construction and characterization of cyanobacterial mutants lacking the manganese-stabilizing polypeptide of photosystem-ii. Journal of Biological Chemistry. 266 (20), 13370-13376 (1991).
  34. Pinevich, A. V., Veprritskii, A. A., Gromov, B. V., Krautvald, K., Titova, N. N. Cellular and cultural properties and characterization of the pigment in Nostoc sp, a cyanobacterium unusually rich in c-phycoerythrin. Microbiology. 63 (5), 481-485 (1994).
  35. Schlosser, U. G., Friedl, T. Additions to the culture collection of algae at Gottingen since 1997. Nova Hedwigia. 71 (1-2), 243-262 (2000).
  36. Takano, H., Arai, T., Hirano, M., Matsunaga, T. Effects of intensity and quality of light on phycocyanin production by a marine cyanobacterium Synechococcus sp. 042902. Applied Microbiology and Biotechnology. 43 (6), 1014-1018 (1995).
  37. Carrer, H., Hockenberry, T. N., Svab, Z., Maliga, P. Kanamycin resistance as a selectable marker for plastid transformation in tobacco. Molecular and General Genetics: MGG. 241 (1-2), 49-56 (1993).
  38. Kaulen, H., Schell, J., Kreuzaler, F. Light-induced expression of the chimeric chalcone synthase-NptII gene in tobacco cells. EMBO Journal. 5 (1), 1-8 (1986).
  39. Cotlet, M., Goodwin, P. M., Waldo, G. S., Werner, J. H. A comparison of the fluorescence dynamics of single molecules of a green fluorescent protein: One- versus two-photon excitation. Chemphyschem. 7 (1), 250-260 (2006).
  40. Taton, A., et al. The circadian clock and darkness control natural competence in cyanobacteria. Nature Communications. 11 (1), 1688 (2020).

Tags

علم الأحياء ، العدد 180 ،
التحول الطبيعي، والتعبير عن البروتين، والحفظ بالتبريد <em>لثغرة البكتيريا الزرقاء الخيطية الفيرميديوم</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Weber, N., Hofmeister, M., Wunsch,… More

Weber, N., Hofmeister, M., Wunsch, N., Kohler, A., Kaster, A. K., Vollmers, J., Kachel, B., Mack, M., Lamparter, T. Natural Transformation, Protein Expression, and Cryoconservation of the Filamentous Cyanobacterium Phormidium lacuna. J. Vis. Exp. (180), e63470, doi:10.3791/63470 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter