Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Naturlig transformation, proteinekspression og kryokonservering af den filamentøse cyanobakterie Phormidium lacuna

Published: February 1, 2022 doi: 10.3791/63470
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 2, 3, 3, 1
1Botanical Institute, Karlsruhe Institute of Technology KIT, 2Institute for Biological Interfaces 5 (IBG 5), Karlsruhe Institute of Technology KIT, 3Institut für Technische Mikrobiologie, Hochschule Mannheim

Summary

Phormidium lacuna er en trådformede cyanobakterie, der blev isoleret fra marine rockpools. Denne artikel beskriver isolering af filamenter fra naturlige kilder, DNA-ekstraktion, genomsekventering, naturlig transformation, ekspression af sfGFP, kryokonservering og motilitetsmetoder.

Abstract

Cyanobakterier er i fokus for grundforskning og bioteknologiske projekter, hvor solenergi udnyttes til biomasseproduktion. Phormidium lacuna er en nyligt isoleret trådformede cyanobakterie. Dette papir beskriver, hvordan nye trådformede cyanobakterier kan isoleres fra marine rockpools. Den beskriver også, hvordan DNA kan ekstraheres fra filamenter, og hvordan genomerne kan sekventeres. Selvom transformation er etableret for mange encellede arter, rapporteres det sjældnere for trådformede cyanobakterier. En forenklet metode til den naturlige transformation af P. lacuna er beskrevet her. P. lacuna er det eneste medlem af ordenen Oscillatoriales, for hvilken naturlig transformation er etableret. Dette papir viser også, hvordan naturlig transformation bruges til at udtrykke superfolder grønt fluorescerende protein (sfGFP). En endogen cpcB-promotor inducerede ca. 5 gange stærkere ekspression end cpc560, A2813 eller psbA2-promotorer fra Synechocystis sp. PCC6803. Endvidere blev der etableret en metode til kryopræservering af P. lacuna og Synechocystis sp.CPP 6803, og metoder til vurdering af bevægelighed i et flydende medium og på agar- og plastoverflader beskrives.

Introduction

Cyanobakterier er prokaryote organismer, der bruger fotosyntese som energikilde 1,2. Forskningen er i stigende grad fokuseret på cyanobakterielle arter. Flere cyanobakterier kan transformeres med DNA3. Gener kan slås ud eller overudtrykkes i disse arter. Transformationen er dog begrænset til nogle få arter 4,5,6,7,8,9,10,11, og det kan være svært at etablere transformation i stammer fra kultursamlinger eller det vilde8. Stammer af den trådformede art Phormidium lacuna (figur 1) blev isoleret fra marine klippebassiner, hvor miljøforholdene, såsom saltkoncentrationer eller temperatur, svinger over tid. Disse trådformede cyanobakterier kan anvendes som modelorganismer for den rækkefølge Oscillatoriales12, som de tilhører.

Under forsøg, der testede genoverførsel ved elektroporation13,14, blev det konstateret, at P. lacuna kan transformeres ved naturlig transformation15. I denne proces optager DNA naturligt af nogle celler. Sammenlignet med andre transformationsmetoder16,17 har naturlig transformation den fordel, at den ikke kræver yderligere værktøjer, der kan komplicere proceduren. For eksempel kræver elektroporation korrekte kuvetter, intakte ledninger og valg af den korrekte spænding. P. lacuna er i øjeblikket det eneste Oscillatoriales-medlem, der er modtageligt for naturlig transformation. Fordi den oprindelige protokol er baseret på elektroporationsprotokoller, indeholdt den stadig flere vasketrin, der kunne være unødvendige. Forskellige tilgange blev testet for at forenkle protokollen, hvilket førte til transformationsprotokollen, der præsenteres her.

Genomsekvensen er afgørende for yderligere molekylære undersøgelser baseret på genknockout eller overekspression. Selvom genomsekvenser kan opnås med næste generations sekventeringsmaskiner inden for korte perioder, kan ekstraktionen af DNA være vanskelig og afhænger af arten. Med P. lacuna blev flere protokoller testet. En modificeret cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB)-baseret metode blev derefter etableret, hvilket resulterede i acceptabel renhed af DNA- og DNA-udbytter af hver oprensningscyklus til fortsat arbejde i laboratoriet. Genomet af fem stammer kunne sekventeres med denne protokol. Det næste logiske transformationstrin var at etablere proteinekspression i P. lacuna.

SfGFP'en, der anvendes som markørprotein i denne protokol, kan detekteres med ethvert fluorescensmikroskop. Alle promotorer, der blev testet, kunne bruges til P. lacuna sfGFP-udtryk. Det stigende antal stammer, der opstår som følge af transformation, har resulteret i behovet for en metode til opbevaring af kulturerne. Sådanne metoder er etableret for Escherichia coli og mange andre bakterier18. I standardprotokoller fremstilles glycerolkulturer, overføres i flydende nitrogen og opbevares ved -80 °C. Denne metode kræver kun få trin og er yderst pålidelig for de arter, for hvilke den er etableret. Standardprotokollen var ikke mulig for P. lacuna, fordi levende celler ikke kunne genvindes i alle tilfælde. Men da glycerol blev fjernet efter optøning, overlevede celler fra alle forsøg. Enkle metoder præsenteres til analyse af bevægelighed af P. lacuna, som kan kombineres med knockout mutagenese for at undersøge type IV pili eller fotoreceptorernes rolle. Disse assays er forskellige fra dem af encellede cyanobakterier 19,20,21 og kan også være nyttige for andre Oscillatoria.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Isolering fra det naturlige miljø

BEMÆRK: Grønalger, kiselalger, trådformede cyanobakterier og andre mikroalger kan isoleres. Protokollen kan bruges til alle mikroalgaarter fra rockpools, der vokser under laboratorieforhold. Filamentøse cyanobakterier, der tilhører Oscillatoriales, kan let genkendes af deres bevægelse og trådform. Arten kan identificeres i en semipur tilstand ved genomsekventering eller 16S rRNA-sekventering.

  1. Overfør flydende havvandsprøver fra marine klippebassiner (dvs. hulrum i klippekysten) til 50 ml kolber. For hver kolbe noteres det eller de nøjagtige steder eller koordinater for den naturlige kilde. Filtrer om muligt indholdet gennem 50 μm net for at reducere mængden af zooplankton. Prøverne opbevares ved 4 °C, indtil de kan subkultureres.
  2. Overfør 1 ml kulturer til 10 cm petriskåle indeholdende 3% bacto-agar i f/2 medium22,23 (se materialetabellen). Forbered op til 20 plader. Dyrk under hvidt lys på 50 μmol m-2 s-1.
    BEMÆRK: Højere lysintensiteter kan anvendes til dyrkning. Intensitet op til 400 μmol m-2 s-1 kan bruges til P. lacuna, selvom andre arter kan være mere lysfølsomme.
  3. Efter en uge overføres de ønskede celler til friske agarplader ved hjælp af sterile tang. Isoler cellerne under et kikkertmikroskop under sterile forhold. Opbevar den gamle agarplade ved 4 °C, indtil cellerne dukker op og vokser på den nye agarplade.
  4. Gentag dette overførselstrin hver uge for at eliminere forurening. Brug det blotte øje til at detektere kraftig forurening og et mikroskop med 400x forstørrelse til yderligere kontrol for forurening.
  5. Hvis en prøve synes fri for kontaminering, skal du teste for bakteriel eller svampekontaminering på agarplader. Overfør en brøkdel af kulturen med en podningssløjfe til en LB24 agarplade (10 cm diameter), hold pladen ved stuetemperatur og kontroller for vækst af forurenende stoffer over 1-3 dage.
  6. Hvis der opnås en steril trådformede cyanobakterielle arter, skal du bruge den til yderligere kulturarbejde. Dyrk P. lacuna i væske eller på bacto-agar plader. Brug 250 ml kolber med 50 ml f/2 medium eller f/2+ medium til flydende kultur.

2. DNA-ekstraktion

BEMÆRK: Denne metode er vedtaget fra 25 26

  1. To kolber fremstilles med 50 ml f/2 medium. Inokuler hver med ~ 1 ml P. lacuna filamenter fra andre voksende kulturer. Kulturerne opbevares i 7 dage eller længere under omrøring (vandret rotation) ved 50 o /min under hvidt lys (50 μmol m-2 s-1) ved 25 °C.
  2. Behandl kulturen med ultralyd (se materialetabellen) i 2 minutter med fuld energi. Mål OD ved 750 nm; kontroller for at sikre, at det er ~ 0,5. Fortsæt med at dyrke kulturerne, hvis OD er for lav.
  3. Saml filamenterne med 5.000 × g, 20 min centrifugering. Fjern supernatanten. Overfør filamenterne med resterende væske til kammeret i en stempelkande27. Indstil trykket fra stempelkansen til 20.000 psi og ekstraher cellerne.
    BEMÆRK: Den franske presse vil lyse alle cellerne og frigive DNA'et; stærke forskydningskræfter vil producere 1.500 bp DNA-fragmenter.
  4. Centrifugering af prøven i 10 minutter ved 10.000 × g og fjern supernatanten.
  5. Der tilsættes 400 μL lysisbuffer (4 M urinstof, 0,1 M Tris/Cl, pH 7,4) og 50 μL proteinase K (10 mg/ml) til pelleten. Prøven opvarmes til 55 °C i 60 minutter med omrystning ved 550 o/min.
  6. Tilsæt 1 ml DNA-ekstraktionsbuffer (3 % CTAB, 1,4 M NaCl, 10 mM EDTA, 0,1 M Tris/Cl, 1 % Sarkosyl, 0,1 M DTT, pH 8) og inkuber i 60 minutter ved 55 °C og 550 o/min. Overfør opløsningerne til centrifugeringsrør, og tilsæt to volumener chloroform/isoamylalkohol (24/1).
  7. Efter omrystning centrifugeres prøven i 5 minutter ved 9.000 × g. Overfør den øvre, vandige fase til reaktionshætteglas, og tilsæt 1 ml iskold ethanol og 50 μL 3 M natriumacetat.
  8. Hvirvel prøven og anbring den ved -20 °C i 1 time eller længere.
  9. Centrifugering i 5 minutter ved 10.000 × g (4 °C) og kassér supernatanten. Vask pillen med 70% ethanol.
  10. Centrifugering af prøven igen. Fjern supernatanten og tør pillen natten over. Opløs DNA'et i nukleasefrit vand. Mål DNA-spektret for at kontrollere, om OD 260 nm / OD 280 nm er mellem 1,6 og 1,9.
  11. Analyser størrelsen af DNA'et på en agaroseelektroforesegel28.
  12. Sekvens det genomiske DNA ved næste generations sekventering i 300 cyklusser med en parret endeindstilling og læselængde på 150 baser (se materialetabellerne).
  13. Udfør samlingen med det relevante computerprogram; se eksemplet i materialetabellen.
  14. Indsend udkastet til genomet til RAST-serveren til anmærkning.
    BEMÆRK: Upload DNA-sekvenser for at få fuldstændig kommentar inden for få minutter.

3. Naturlig transformation og GFP-udtryk

BEMÆRK: Transformation er baseret på en plasmidvektor, der formeres i E. coli; pGEM-T eller pUC19 kan anvendes som rygradsvektorer. Kloningsteknikker er etableret i mange laboratorier; se også standardprotokol28 og artiklerne om transformationsvektorer for P. lacuna15,29. Eksempler på vektorer til sfGFP-udtryk er beskrevet i afsnittet med repræsentative resultater. Nærmere oplysninger om fire endnu ikke offentliggjorte vektorer findes i Supplerende fil 1.

  1. Udfør alle trin ved hjælp af sterilt materiale under sterile laboratorieforhold (ren bænk, sterilt glasvarer).
  2. Inokuler 2 x 50 ml f/2 flydende medium i to 250 ml kolber med 2 x 1 ml P. lacunafilamenter fra en løbende kultur. Dyrk i hvidt lys (50 μmol m-2 s-1) under omrøring (vandret rotation, 50 o / min) i ~ 5 dage ved 25 ° C.
  3. Forbered ~ 200 μg af transformationsvektor-DNA'et ved hjælp af et midi prep-kit (se materialetabellen) i henhold til producentens anvisninger.
  4. Homogeniser 100 ml P. lacunacellesuspension (se materialetabellen) ved 10.000 o / min i 3 minutter. Mål OD ved 750 nm (ønsket værdi = 0,35).
  5. Centrifugering af cellesuspensionen i 15 minutter ved 6.000 × g. Fjern supernatanten, og suspender pelleten i 800 μL (totalvolumen inklusive resterende væske og filamenter) af den resterende væske og yderligere f/2+ medium.
  6. Tag otte f/2+ bacto-agar plader (10 cm diameter) indeholdende 120 μg/ml kanamycin. Pipette 10 μg DNA ind i midten af hver agarplade. Umiddelbart pipette 100 μL cellesuspension ind i midten af hver agarplade (oven på DNA'et).
  7. Opbevar agarpladen uden låg på den rene bænk for at lade overskydende væske fordampe. Luk pladen og dyrk den i hvidt lys ved 25 °C i 2 dage.
  8. Fordel filamenterne på hver agarplade med en podningssløjfe på flere friske f/2+ bacto-agarplader indeholdende 120 μg/ml kanamycin. Dyrk pladerne i hvidt lys ved 25 °C og kontroller kulturerne regelmæssigt under et mikroskop.
  9. Identificer levende, transformerede filamenter efter 7-28 dage under mikroskopet. Kig efter sunde, grønne filamenter (figur 2), der adskiller sig fra andre filamenter. Hvis disse grønne filamenter kan identificeres, skal du fortsætte med det næste trin; Ellers skal du holde pladen i yderligere 7 dage.
  10. Brug tang til at overføre disse identificerede levende filamenter til 50 ml flydende f/2+ medium med 250 μg/ml kanamycin. Dyrk i hvidt lys ved 25 °C på en ryster (vandret rotation, 50 o/min). Overhold væksten i op til fire uger.
  11. Overfør filamenterne tilbage til agarmediet indeholdende 250 μg/ml kanamycin, og vent på, at filamenterne vokser. Efter flere dage overføres enkeltfilamenter til en frisk agarplade med en højere koncentration af kanamycin, f.eks. 500 μg/ml. Opbevar den originale plade.
  12. Sørg for, at filamenterne formeres i en høj koncentration af kanamycin i flydende kultur eller på agar. Forøg kanamycinkoncentrationen igen for at fremskynde adskillelsen.
    BEMÆRK: Transformeret P. lacuna vokser i op til 10.000 μg / ml kanamycin. Andre arter tolererer muligvis ikke så høje koncentrationer.
  13. Hvis resistente celler dyrkes og fordeles bredt over en plade, testes integrationen af indsatsen i genomet af P. lacuna ved at udføre PCR med ydre og indre primere.
    1. Brug primere, der er designet til kloning af indsættelsen som indre primere.
    2. Til design af de ydre primere skal du vælge sekvenser, der er 5' og 3' af det foreslåede indsættelsessted på genomet af P. lacuna , men uden for indsættelsen.
    3. Til PCR-reaktioner skal du bruge indre primere og ydre primere. Brug den eller de resistente stammer og den vilde type.
      BEMÆRK: Indvendige primere angiver, at indsatsen er til stede; ydre primere viser, at indsatsen er indsat på det korrekte sted.
  14. For hver PCR-reaktion placeres ~10 mg af filamenterne direkte i PCR-rørene og udføres PCR i henhold til standardprotokollerne24. Hvis der ikke opnås noget produkt, skal du variere udglødningstemperaturen og vaske filamenterne med vand.
    BEMÆRK: Mange forskellige polymeraser kan anvendes i PCR. Standardpolymeraser, såsom Taq-polymerase, har en højere fejlrate end fejlkontrolpolymeraser, som er dyrere. Denne analytiske PCR kræver ingen fejlkontrolpolymerase. Fejlkontrolpolymerase bør dog testes, hvis der ikke opnås noget PCR-produkt med en standardpolymerase.
  15. Analyser PCR-produkterne fra den resistente linje på agaroseelektroforese24.
    1. Sammenlign båndpositioner med markør og sammenlign vildtypen og transformeringsmidlet. Med indre og ydre primere skal du kigge efter et større bånd til transformeringsmidlet end den vilde type (på grund af indsættelsen af modstandskassetten) eller to bånd til transformanten: et med størrelsen på vildtypebåndet og et større. Da sidstnævnte tilfælde indikerer ufuldstændig adskillelse, skal du fortsætte dyrkningen med høje kanamycinkoncentrationer.
      BEMÆRK: For flere detaljer om PCR og elektroforese, se 15,24 eller anden standardlitteratur.
  16. For GFP-ekspression: Observer enkelte filamenter med et fluorescensmikroskop (se materialetabellen) ved en forstørrelse af det mål, der er sat til 40x eller 63x. Tag et lysfelttransmissionsbillede og et fluorescensbillede. Brug følgende indstillinger for GFP: 470 nm båndpas til excitation, 525 nm båndpas til emission og en 495 nm strålesplitter, indledende eksponeringstid på 500 ms.
  17. Juster eksponeringstiden for klare fluorescenssignaler, og undgå mættende intensiteter. Prøv at bruge den samme indstilling for alle prøver.
  18. Da vildtypefilamenterne også viser fluorescens, skal du tage billeder med de samme indstillinger som ovenfor for denne baggrundsfluorescens.
    BEMÆRK: Den belastning, der udtrykker GFP, skal have et højere signal; ellers udtrykker det ikke GFP.
  19. Baseret på eksponeringstider og pixelintensiteterne for fluorescensbillederne beregnes og sammenlignes GFP-indholdet i de forskellige filamenter.

4. Kryokonservation

BEMÆRK: P. lacuna og den encellede cyanobakterie Synechocystis sp. PCC 6803 anvendes. Den nuværende metode fungerer bedre for P. lacuna.

  1. Dyrk P. lacuna eller Synechocystissp PCC 6803 i mindst 10 dage i henholdsvis 10 ml f/2+ eller BG-11 medium under hvidt lys (50 μmol m-2 s-1) ved 25 °C under omrøring (vandrette rotationer, 50 omdr./min.).
  2. Homogeniser P. lacunakulturen (se materialetabellen) ved 10.000 o / min i 3 minutter eller med en ultralydsenhed (se materialetabellen) i 2 minutter ved fuld energi. Bestem OD 750 nm af begge kulturer for at kontrollere, om værdien er mellem 1 og 7.
  3. Opsaml cellerne ved centrifugering ved 6.000 × g i 15 min. Fjern supernatanten.
  4. Suspender cellepillen i 800 μL f/ 2+ eller BG-11 medium (slutvolumen) og overfør til en 2 ml kryovial. Tilsæt 800 μL af en 50% glycerolopløsning til cellesuspensionen. Luk hætteglasset og bland ved gentagen invertering.
  5. Overfør kryovialet til flydende nitrogen og opbevar det i en kryobox i en -80 °C fryser. Bemærk kassens placering i fryseren og koordinaterne for prøven i kassen.
  6. Til genopretning af cellerne skal du tage kryovialet ud og optø indholdet ved stuetemperatur. Overfør indholdet til et 2 ml reaktionsrør.
  7. Vask prøven to gange. Til 1. vask, centrifuge ved 6.000 × g i 5 min. Fjern supernatanten, og ophænd pelleten igen i 2 ml f/2+ eller BG-11 medium. Til 2. vask skal du recentrifugere ved 6.000 × g i 5 minutter, fjerne supernatanten og suspendere pillen i 2 ml f/2+ eller BG-11 medium.
  8. For at kontrollere integriteten af disse celler, der er klar til dyrkning, skal du overføre pillen til 9 ml medium og dyrke dem i hvidt lys (50 μmol m-2 s-1) under omrøring (55 o / min). Sammenlign OD 750 nm af kulturen på den første dag og efter 1 uge.

5. Motilitet af Phormidium lacuna

BEMÆRK: Tre forskellige assays vil blive beskrevet. Den samme kultur anvendes i alle tilfælde.

  1. Dyrk P. lacuna i f/2 medium under vandret omrøring (50 o / min) i hvidt lys (50 μmol m-2 s-1) i ~ 5 dage, indtil den estimerede OD 750 nm er 0,35. Prøven opbevares ved 4 °C indtil brug.
  2. Homogeniser filamenterne (se materialetabellen) ved 10.000 o / min i 3 minutter eller med ultralyd (se materialetabellen) i 1 minut ved maksimal effekt og cyklus på 1. Mål OD 750 nm. Hvis den er over 0,35, fortyndes fraktionen med f/2 medium. Brug denne opløsning i motilitetsanalyser i trin 5.3, 5.4 og 5.5.
  3. Assay til bevægelse i flydende medium
    1. Til direkte observation af bevægelighed overføres 8 ml medium indeholdende P. lacuna (fra trin 5.2) til en 6 cm petriskål. Vent et par minutter, indtil prøven når stuetemperatur. Dæk petriskålen med cellofanfolie.
    2. Placer et mikroskop dias på x-y bordet i et standard mikroskop med et kamera. Tænd for mikroskoplyset. Ideelt set skal du altid bruge de samme elektriske og optiske indstillinger til belysningen. Flyt et 4x eller 10x mål ind i lysets bane.
    3. Placer petriskålen oven på diaset. Juster enkelte filamenter eller filamentbundter med x-, y- og z-bevægelser på bordet.
      BEMÆRK: På grund af det tredimensionelle arrangement kan kun en del af det relevante afsnit være i fokus. Cellofanfolien gør det muligt at justere fokus uden begrænsning.
    4. Overhold bevægelser af enkeltfilamenter eller bundter. Sørg for, at objektivlinsen ikke rører væsken. Optag filamenternes bevægelser med et standardmikroskopkamera (se Supplerende video S1).
  4. Assay til bevægelse på overfladen
    1. Til observation af filamentmotilitet på agaroverflader skal du forberede 6 cm petriskåle med f/2 bacto-agar. Sørg for, at agaren er høj nok til, at objektivlinsen kan komme tæt på agaroverfladen. Alternativt kan du forberede et ~ 3 mm tykt agarlag og registrere filamenterne gennem agaren (hold pladen på hovedet eller brug et omvendt mikroskop).
    2. Pipette 0,5 ml af en opløsning indeholdende P. lacuna (fra trin 5.2) på bacto-agaroverfladen af en 6 cm petriskål. Lad væsken komme ind i overfladen. Luk petriskålen og observer filamenternes bevægelse på overfladen ved hjælp af et 4x eller 10x mål.
    3. Sørg for, at de samme elektriske og optiske indstillinger af mikroskopet bruges under hele optagelsen og i efterfølgende optagelser.
    4. Optag timelapse-optagelser ved hjælp af et okulært kamera og minicomputersystem. Sørg for, at tidsintervallet mellem efterfølgende billeder er 5 s-1 min. Programmér minicomputerens Linux-script til at styre timelapse-optagelsen. Se Supplerende fil 2 for et eksempelscript og Supplerende video S2 som et eksempel.
  5. Assay til fototaxis
    1. Til fototaxis-eksperimenter skal du forberede lysdiodeholdere (LED) (her med en 3D-printer), hvor de valgte 5 mm lysdioder er monteret for at bestråle et område på 20 mm2 nedenunder til oven (figur 3). Brug om nødvendigt mange LED-holdere parallelt, tilslut hver LED elektrisk gennem en modstand og potentiometer til en justerbar strømforsyning. Mål og juster LED-intensiteterne, afhængigt af eksperimentet. Sørg for, at hele indstillingen er i et mørkt rum eller en lukket mørk beholder.
    2. 8 ml af mediet indeholdende P. lacuna (fra trin 5.2) anbringes i en 6 cm petriskål. Juster LED'ens lysintensitet. Luk petriskålen med låget, og læg den på en LED-holder, så LED'en er i midten af petriskålen.
    3. Efter den ønskede varighed (typisk 2 dage) skal du tage et billede af petriskålen med et smartphone-kamera rettet direkte mod lysbehandlingens position. Brug et hvidt LED-panel til bestråling af prøven. Brug kameraets manuelle indstillinger; undgå refleksioner af lys; Juster altid for at få den samme afstand mellem kameralinsen og prøven. Sørg for, at eksponeringsindstillingerne giver et billede, der er egnet til senere analyser ved hjælp af ImageJ.
    4. Kvantificer diameteren af den centrale cirkel af filamenter ved hjælp af ImageJ-software.
      1. Åbn ImageJ, klik på File | Åbn, vælg den ønskede fil, og klik på Enter.
      2. Vælg knappen Lige (med en lige linje). Tryk på venstre museknap for at tegne en linje fra den ene ende af petriskålen til den modsatte ende. Sørg for, at linjen passerer gennem midten af cirklen af filamenter.
      3. Tryk på Ctrl-K på tastaturet, eller klik på Analysér | Plotprofil i menuen ImageJ. Kig efter et x-y-vindue med pixelintensiteter plottet versus afstand - en 1D-profil af petriskålen. Sørg for, at den laveste pixelintensitet er lidt over 0 og den højeste værdi under 255.
      4. Anslå en gennemsnitsværdi for pixelintensiteten uden for cirklen og en anden gennemsnitsværdi for pixelintensiteten i cirklen. Ved y-positionen mellem disse værdier estimeres x-værdierne på begge sider af cirklen ved at pege med musen på disse positioner. Bemærk begge værdier og beregn forskellen.
      5. Opnå den højeste x-værdi ved at pege musen mod y-aksen til højre. Bemærk, at denne værdi e repræsenterer diameteren af petriskålen. Hvis denne diameter er 5 cm, beregnes diameteren af den centrale filamentcirkel som d/e × 5 cm.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Efter ovennævnte metoder blev 5 forskellige stammer af P. lacuna isoleret fra rockpools og sekventeret (figur 1 og tabel 1). Alle kulturer var sterile efter ~ 1 års subkulturering undtagen P. lacuna HE10JO. Denne stamme er stadig forurenet med Marivirga atlantica, en marine bakterie. Under efterfølgende Helgoland-udflugter blev andre trådformede cyanobakterier isoleret fra klippebassiner, som er forskellige fra P. lacuna og skal karakteriseres.

Flere DNA-ekstraktions- og oprensningsmetoder blev testet for P. lacuna. De bedste resultater blev opnået med en optimeret CTAB-metode som beskrevet ovenfor. DNA-udbyttet var 310 ± 50 μg/ml, OD 260 nm/OD 280 nm var 1,7 ± 0,03, og OD 260 nm/OD 230 nm var 0,78 ± 0,04 (n = 17). Genomsekventering viste, at DNA'et fra alle stammer var lidt anderledes som forventet (tabel 1). Kerneproteinsekvenser viste en maksimal forskel på 0,04 % (tabel 2). Selvom alle udkast til genomer var ufuldstændige, kan man antage, at >98% af genomet af HE10JO30 blev sekventeret. Dette skøn er baseret på antallet af ufuldstændige åbne læserammer. Delvise proteinsekvenser kunne let identificeres efter RAST-annotation af HE10DO og HE10JO. I HE10JO havde 60 proteiner ud af ~ 4.500 en manglende N- eller C-terminal sekvens. Genomsekvenserne findes i tillægget (Supplerende fil 3, Supplerende fil 4, Supplerende fil 5, Supplerende fil 6 og Supplerende fil 7).

Interessant nok blev stammer af samme art isoleret fra to øer, Helgoland og Giglio. Den lineære afstand mellem begge øer er 1.400 km. Der skal være en sammenhæng mellem begge steder, f.eks. ved skibe via havet eller, mere sandsynligt, ved trækfugle. Mange fuglearter findes på begge øer, og mange af dem er trækfugle. Mangfoldigheden inden for P. lacunastammer på en ø var større end mellem de nærmeste Helgoland- og Giglio-stammer (tabel 2). Dette indikerer en intens udveksling mellem begge steder.

Den naturlige transformation blev testet med HE10DO som den største stamme og med HE10JO. Den nuværende protokol er mere ligetil end den protokol, der blev beskrevet tidligere12 på grund af det reducerede antal vasketrin og færre overførselstrin efter transformation. Denne nye metode anvendes løbende i laboratoriet; ~ 15 vellykkede transformationer blev opnået.

KanR-modstandskassetten blev normalt integreret i det homologe sted defineret af de tilstødende regioner, som vist ved PCR ved hjælp af indre og ydre primere. Som de fleste cyanobakterier er P. lacuna polyploid. Det kan have mere end 100 kromosomer pr. Celle12. En PCR-test med ydre primere ~ 1 uge efter transformationen har typisk 2 bånd på elektroforesegelen, et med størrelsen på vildtypebåndet og et langsommere migrerende bånd, der indikerer indsættelsen af modstandskassetten (figur 4). Dobbeltbåndet indikerer, at kun en subfraktion af kromosomerne indeholder indsættelsen. Efter 4 ugers udvælgelse på kanamycin er adskillelsen normalt komplet, og kun et stort PCR-bånd vises på geler. I tilfælde af transformationen med pMH1 (se nedenfor) var segregeringen imidlertid fuldstændig efter mere end 3 måneder.

Vektorerne pAK1, pAK2, pAK3 og pMH1 blev konstrueret til test af sfGFP-ekspression. I pAK1, pAK2 og pAK3 er sfGFP-genet under kontrol af henholdsvis cpc560-, A2813- og psbA2-promotorerne. Disse promotorer er fra Synechocystis sp. PCC 6803 eller Synechococcus sp. PCC 700231. Til konstruktion af disse vektorer blev sfGFP-promotor- og terminatorsekvenserne taget fra vektorer, der blev anvendt til transformation af Synechococcus sp. PCC 700231. De relevante sekvenser blev integreret i det homologe chwA(sc_7_37) sted for pFN1 (eller pFN_7_37_KanR15). PMH1-ekspressionsvektoren blev konstrueret ved DNA-syntese ved hjælp af P. lacuna-sekvenser som skabeloner (Supplerende fil 6). CpcB-cpcA (phycocyanin ß og phycocyanin α) sekvenser af P. lacuna er serielt arrangeret. En 100 bp intergen region adskiller begge kodende regioner. Den syntetiske sekvens indeholdt denne endogene cpcB-cpcA-sekvens og cpcB-promotoren. SFGFP- og KanR-kassetten placeres kun 3' af cpcB-stopkodonen (5' cpcA). Hele den syntetiske sekvens med cpcB-promotor, cpcB, sfGFP, KanR, cpcA (5' til 3') klones til pUC19. Et kort er vist i figur 5. Flere detaljer om kloning af pAK1, pAK2 og pAK3 og den komplette sekvens af pMH1 findes i Supplerende fil 1.

Alle 4 transformanter (med pAK1, pAK2, pAK3 og pMH1) udtrykte GFP; alle fluorescensniveauer var over baggrundsfluorescensen af vildtypefilamenter (figur 6). PMH1-transformanterne med ufuldstændig adskillelse afslørede et GFP-signal, der var meget variabelt mellem filamenterne. Fluorescenssignalet blev jævnt fordelt, når adskillelsen var fuldstændig (figur 6E). Mikroskopsignalerne for pAK1-, pAK2- og pAK3-transformanter var ens, men ~5x svagere end pMH1 (figur 6E).

Den etablerede kryokonserveringsmetode er baseret på en metode, der blev etableret for E. coli. Når der blev udført 2 vasketrin til fjernelse af glycerol efter optøning, overlevede 15 ud af 15 P. lacunaprøver (tabel 3). Denne protokol kan også bruges til Synechocystis PCC 6803, men kun med 2 vasketrin og ikke med 1 (tabel 3).

Et andet træk ved Oscillatoriales filamenter er deres bevægelighed: P. lacuna filamenter bevæger sig kontinuerligt på overflader (figur 7) og i et flydende medium (figur 8). Begge former for bevægelse kan let studeres i petriskåle uden eller med agarmedium. Time-lapse-optagelse er påkrævet, fordi bevægelsen på agar er langsom. Filamenter bevæger sig mod lyskeglen, hvis en lysstråle kommer nedefra (figur 3). Virkningerne af lysintensitet, bølgelængde og tid kan let studeres med en simpel opsætning. Fotoreceptorerne af denne effekt er endnu ikke klare. Mulige kandidater kan behandles med knockout-mutanter. Mekanismen bag, hvordan filamenterne finder lyset, er også uklar. Til dette spørgsmål kræves et infrarødt system til at registrere filamenterne under deres bevægelse fra mørke til lys.

Figure 1
Figur 1: Stammer af Phormidium lacuna indsamlet fra Helgoland og Giglio. Filamenter formeres i 11 dage på f/2 agar i 6 cm petriskåle. A) stamme GI08AO B) stamme GI08IO C) stamme GI09CO D) stamme HE10DO E) stamme HE10JO F) stamme HE15M2G1. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Phormidium lacuna filamenter 5 uger efter transformation. sfGFP-ekspressionsvektoren pMH1 blev anvendt; selektion fandt sted på f/2+ medium med 120 μg/ml kanamycin. De grønlige filamenter er modstandsdygtige og levende; andre filamenter er døde. Skalabjælke = 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Fototaxis eksperiment. Til venstre: LED-holder med 4 røde lysdioder, tilsluttet en justerbar strømforsyning. Oven på hver LED er der en 6 cm petriskål med 8 ml af en Phormidium lacuna kultur. Til højre: Petriskål med P. lacuna efter 2 dage på den røde LED (15 μmol m-2 s-1). Forkortelse: LED = lysemitterende diode. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Integration og adskillelse af indsats efter transformation af Phormidium lacuna med pAK1. PCR med ydre primere. De forventede størrelser af produktet uden og med indsats er henholdsvis 2371 og 5016 bp. Venstre bane: markør, bane 1, 2, 3, 4: PCR-produkter af filamenter henholdsvis 7 dage, 11 dage, 14 dage og 17 dage efter isolering af et resistent filament (4 uger efter transformation). Bane 5: PCR-produkt af vildtype (fra en anden gel). I 7-dages prøven er indsatsen til stede i en lille brøkdel af kromosomerne. Denne brøkdel øges indtil 17 dage, hvor der ikke er noget vildtypebånd synligt, dvs. adskillelsen er fuldstændig. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Vektor for sfGFP-ekspression under kontrol af endogen cpcB-promotor . Orange: Phormidium lacuna homolog sekvens, violet/blå: pUC-19 vektor rygrad, grøn: indsæt med sfGFP og KanR. Forkortelser: sfGFP = superfolder grønt fluorescerende protein; KanR = kanamycinresistens. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 6
Figur 6: Ekspression af sfGFP i Phormidum lacuna. Fluorescensbilleder af P. lacuna vildtypefilamenter (A) og efter transformation med pAK1 (B), pAK2 (C), pAK3 (D) og pMH1 (E). I pMH1 placeres sfGFP-genet 3' af phycocyanin ß-genet og drives derfor af den endogene cpcß-promotor ; i de andre tilfælde drives sfGFP af henholdsvis cpc560, A2813 eller psbA2s promotorer fra Synechocystis PCC 6803. Fluorescensindstillingerne er specifikke for GFP; alle billeder blev optaget med samme integrationstid og optiske indstillinger. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 7
Figur 7: Flettet billede af Phormidium lacuna på agaroverfladen ved 4x forstørrelse. Det første billede er præsenteret i rødt, det andet (taget 1 minut senere) i grønt. Bemærk også sporene på agaren. Skalabjælke = 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 8
Figur 8: Flettet billede af Phormidium lacuna i flydende medium. Tidsintervallet mellem begge billeder var 10 s. Det første billede er trykt med rødt; den anden er trykt med grønt. Sammenligning af begge farver viser bevægelsen inden for 10 s. Skalabjælke = 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

stamme HE10JO HE10DO GI08AO GI09CO HE15M2G1
Contigs 104 174 218 102 154
samlet bp 48,19,017 47,88,491 47,78,775 36,69,922 45,98,395

Tabel 1: Phormidium lacuna stammer.

Gi09CO HE10DO HE10JO HE15M2G1
Gi08AO 42 40 0 42
Gi09CO 2 42 0
HE10DO 40 2
HE10JO 42

Tabel 2. Aminosyreforskelle mellem stammer i sekvenser af 20 kerneproteiner med 10.876 aminosyrer.

Celletæthed OD 750 nm 1 1 3 3 5 5 7 7
Vasker 1 2 1 2 1 2 1 2
Synechocystis Svendborg, Svendborg 2/5 5/5 1/4 4/4 0/4 4/4 0/4 3/4
Phormidium lacuna HE10DO 4/4 4/4 4/4 4/4 3/ 4 4/4 3/3 3/3

Tabel 3: Cryoconservation forsøg med Synechocystis PCC 6803 og Phormidium lacuna HE10DO cyanobakterier. Det første tal viser antallet af kulturer, der overlevede efter frysning / optøning; det andet tal viser de samlede forsøg.

Supplerende video S1: Bevægelse af Phormidium lacuna filamenter i flydende opløsning, uden time-lapse. Klik her for at downloade denne video.

Supplerende video S2: Bevægelse af Phormidium lacuna filamenter på agar overflade, med time-lapse. Klik her for at downloade denne video.

Supplerende fil 1: Kloning af vektorer til transformation af Phormidium lacuna. Liste over transformationsvektorer; liste over primere til kloning; sekvens af pMH1 i gb-format. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 2: Shell-scripts (sh) til Raspberry Pi minicomputer. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 3: DNA-sekvens af HE152G1. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 4: DNA-sekvens af GI08AO. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 5: DNA-sekvens af GI09CO. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 6: DNA-sekvens af HE10DO. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 7: DNA-sekvens af HE10JO. Klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Selvom mange stammer af cyanobakterier er tilgængelige fra kultursamlinger 32,33,34,35,36, er der stadig efterspørgsel efter nye cyanobakterier fra naturen, fordi disse arter er tilpasset specifikke egenskaber. P. lacuna blev indsamlet fra rockpools og er tilpasset variationer i saltkoncentrationer og temperatur30. Stammer af denne art blev fundet under udflugter i 2008, 2009 og 2010. Med den her beskrevne procedure blev 5 stammer af P. lacuna isoleret, og 4 af disse stammer var sterile. Stammen P. lacuna HE10JO er permanent forurenet med bakterien Marivirga atlantica, en havbakterie identificeret ved rRNA og genomsekventering. Denne bakterie kunne ikke adskilles fra cyanobakterien på trods af anvendelsen af mekanisk adskillelse, vækst ved forskellige temperaturer, behandlinger med antibiotika eller kemiske behandlinger. På trods af forureningen kan P. lacuna HE10JO dyrkes svarende til de andre stammer. I senere udflugter blev der fundet andre medlemmer af Oscillatoriales, som endnu ikke er analyseret detaljeret. P. lacuna blev ikke fundet igen. Det er ikke klart, hvorfor P. lacuna blev isoleret i de efterfølgende år og to forskellige steder, men ikke fundet senere. Dens overflod er bestemt afhængig af uforudsigelige forhold. Temperatur, saltkoncentrationer og uorganiske eller organiske næringsstoffer er meget varierende i rockpools. Derfor kan artssammensætningen svinge over tid på en uforudsigelig måde.

Naturlig transformation er etableret for forskellige cyanobakterier, for det meste encellede arter. Den trådformede P. lacuna er den eneste art af ordenen Oscillatoriales, for hvilken der er etableret naturlig transformation. Transformationen var næsten altid vellykket med den nuværende protokol. Generelt varierer antallet af resistente filamenter efter et transformationsforsøg betydeligt, og nogle gange mislykkes transformationen, hvilket resulterer i tab af værdifuld tid. Det er derfor tilrådeligt at gennemføre flere transformationsprojekter parallelt. Tiden for fuldstændig adskillelse, normalt 4 uger efter isolering af den resistente stamme, kan også variere. Fordi der ikke er nogen garanti for fuldstændig adskillelse efter vækst på kanamycin, er det afgørende at udføre PCR-testene ved hjælp af ydre og indre primere.

Hver vektor skal indeholde 2 x 500-1.000 bp homologe sekvenser, f.eks. forstærket fra værten ved PCR og afbrudt af en modstandskassette (f.eks. kanamycinkassetten KanR, der anvendes her)37,38. Til ekspression skal en promotor, kodningssekvens (f.eks. for sfGFP39), terminator og modstandskassette klones mellem de homologe sekvenser. Kloningsstrategierne er artsspecifikke og afhænger af forsøgets formål.

Denne transformationsmetode kunne også være mulig med andre Oscillatoriales-stammer eller andre cyanobakterier: Naturlig transformation er baseret på type IV pili, som er til stede i næsten alle andre cyanobakterielle genomer 3,15,40. Derfor kan den nuværende metode stimulere nye forsøg med andre arter. Fordi type IV pili også er relevant for bevægelighed, er det vigtigt at kontrollere for betingelser, hvorunder cyanobakterier er bevægelige.

Genindsættelse er baseret på homolog rekombination og resulterer i en forstyrrelse af de homologe steder. Derfor bruges transformation ofte til gen knockout. Ekspressionen af det indsatte gen vil blive induceret, hvis en aktiv promotor og en kodende sekvens integreres i det homologe sted. I P. lacuna var promotoraktiviteten afhængig af arten. Cpc560-, A2813- og psbA2-promotorerne af Synechocystis PCC sp 6803 eller Synechococcus sp. PCC 7002 31 og cpcB-promotoren af P. lacuna kunne drive sfGFP-ekspression . Af disse konstruktioner inducerede den endogene cpcB-promotor det stærkeste udtryk, selvom sfGFP-genet er placeret 3' af phycocyanin ß-genet. Dette indikerer en mere generel anvendelse af endogene promotorer i cyanobakteriel ekspression.

Kombinationen af genknockout og bevægelsesstudier vil kaste lys over molekylære mekanismer for bevægelighed og fototaxis. LED-lyskilder kan give lys til fototaxis-eksperimenter. Næsten enhver bølgelængde er tilgængelig, og lysintensiteten kan moduleres af en justerbar strømforsyning og potentiometre. LED-holdere kan bygges af 3D-printere for nemt at realisere kombinationer af forskellige lysdioder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.

Acknowledgments

Arbejdet blev støttet af Karlsruher Institute of Technology.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Autoclave 3870 ELV Tuttnauer 3870 ELV
Bacto Agar OttoNorwald 214010
BG-11 Freshwater Solution Sigma Aldrich C3061
BG-11 medium Merck 73816-250ML
Boric acid Merck 10043-35-3 H3BO3
Calcium chloride dihydrate Carl Roth 10035-04-8 CaCl2 · 2 H2O
Cell culture flasks Cellstar with filter screw cap, sterile, 250 mL Greiner 658190
Cell culture flasks Cellstar with filter screw cap, sterile, 50 mL Greiner 601975
Centrifuge LYNX 4000 Thermo Scientific 75006580 and rotor
Centrifuge microstar 17 VWR International N/A for up to 13,000 rpm
Cetyltrimethylammonium Bromide (CTAB) PanReac AppliChem 57-09-0 C19H42BrN
Chloroform : Isoamyl Alcohol 24 : 1 PanReac AppliChem
A1935
Cobalt(II) chloride hexahydrate Merck 7791-13-1 CoCl2 · 6 H2O
Copper(II) sulphate pentahydrate Merck 7758-99-8  CuSO4 · 5 H2O
D(+)-Biotin Carl Roth 58-85-5  C10H16N2O3S
DNA ladder 1 kb New England Biolabs N3232
DNA ladder 100 bp New England Biolabs N3231
Electrical pipetting help accujet-pro S Brand GmbH 26360 for pipetting 1-25 mL
Ethanol VWR 64-17-5 C2H6O
Ethylenediamine tetraacetic acid disodium salt dihydrate Carl Roth 6381-92-6 EDTA-Na2 · 2 H2O
Fluorescence microscope ApoTome Zeiss
Fluorescence microscope Axio Imager 2 Zeiss
French Pressure Cell Press American Instrument Company N/A
Gel documation System Saffe Image Invitrogen
Gelelctrophoresis system Mupid-One/-exu ADVANCED
Glassware, different
Glycerol Carl Roth 56-81-5 C3H8O3
Iron(III) chloride hexahydrate Merck 10025-77-1  FeCl3 · 6 H2O
Kanamycin Sigma-Aldrich 25389-94-0
Kanamycin sulphate Carl Roth 25389-94-0 C18H36N4O11 · H2SO4
Lauroylsarcosine, Sodium Salt (Sarcosyl) Sigma Aldrich 137-16-6 C15H28NO3 · Na
LB Broth (Lennox) Carl Roth X964.4
Light source, fluorescent tube L18W/954 daylight OSRAM cultivation of cyanobacteria
Light source, LED panel XL 6500K 140 W Bloom Star N/A cultivation of cyanobacteria, up to 1,000 µmol m-2 s-1
Magnesium chloride hexahydrate Carl Roth 7791-18-6 MgCl2 · 6 H2O
Manganese(II) chloride tetrahydrate Serva 13446-34-9 MnCl2 · 4 H2O
Microscope DM750 Zeiss
Midi prep plasmid extraction kit NucleoBond Xtra Midi kit Macherey-NAGEL GmbH & Co. KG REF740410.50
Minicomputer Raspberry Pi 4 + Conrad Electronics 2138863-YD for time-lapse recording
Ocular camera EC3 Leica for continuous recording up to 30 s
Ocular camera MikrOkular Full HD Bresser for time-lapse recordings, coupled to Raspberry Pi minicomputer
Petri dishes polystyrole, 100 mm x 20 mm Merck P5606-400EA
Petri dishes polystyrole, 60 mm x 15 mm Merck P5481-500EA
Photometer Nanodrop ND-1000 Peqlab Biotechnologie
Photometer Uvikon XS Goebel Instrumentelle Analytik GmbH
Pipetman 100-1,000 µL Gilson SKU: FA10006M
Pipetman 10-100 µL Gilson SKU: FA10004M
Plastic pipettes 10 mL, sterile Greiner 607107
Plastic tube, sterile, 15 mL Greiner 188271
Plastic tube, sterile, 50 mL Greiner 227261
Potassium bromide Carl Roth 7758-02-3 KBr
Potassium chloride Carl Roth 7447-40-7 KCl
Power supply Statron 3252-1 Statron Gerätetechnik GmbH
Power supply Voltcraft PPS 16005 Conrad Electronics for LED
Proteinase K Promega MC500C from Maxwell 16 miRNA Tissue Kit AS1470
Q5 polymerase New England Biolabs M0491S
Sequencing kit NextSeq 500/550 v2.5 Illumina
Sequencing system NextSeq 550 SY-415-1002 Illumina
Shaker Unimax 2010 Heidolph Instruments for cultivation
Sodium acetate Carl Roth 127-09-3 NaCH3COO
Sodium chloride Carl Roth 7647-14-5 NaCl
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate Carl Roth 10049-21-5 NaH2PO4 · H2O
Sodium fluoride Carl Roth 7681-49-4 NaF
Sodium hydrogen carbonate Carl Roth 144-55-8 NaHCO3
Sodium molybdate dihydrate Serva 10102-40-6 Na2MoO4 · 2 H2O
Sodium nitrate Merck 7631-99-4 NaNO3
Sodium sulphate Carl Roth 7757-82-6 Na2SO4
Strontium chloride hexahydrate Carl Roth 10025-70-4 SrCl2 · 6 H2O
Thiamine hydrochloride Merck 67-03-8 C12H17ClN4OS · HCl
TRIS Carl Roth 77-86-1 C4H11NO3
Ultrasonic device UP100H with sonotrode MS3 Hielscher Ultrasound Technology UP100H
Ultraturrax Silent Crusher M Heidolph Instruments homogenizer
Urea Carl Roth 57-13-6 CH4N2O
Vitamin B12 Sigma 68-19-9 C63H88CoN14O14P
Vitamin solution 0.3 µM thiamin-HCl, 2.1 nM biotin, 0.37 nM cyanocobalamin
Water Stills, Water treatment VEOLIA water technologies ELGA_21001
Zinc sulphate heptahydrate Sigma 7446-20-0 ZnSO4 · 7 H2O
software, URL
gatb-minia program for DNA assembly https://github.com/GATB/gatb-minia-pipeline makes large scaffolds from short DNA reads, Linux based
ImageJ software for immage processing (pixel intensities, circle diameter)
RAST annotation server https://rast.nmpdr.org input: genome DNA sequence, detects open reading frames, lists protein sequences and their functions
Culture media
Artificial seawater 0.41 M NaCl , 53 mM MgCl2,28 mM Na2SO4, 10 mM CaCl2 , 9 mM  KCl , 2.4 mM NaHCO3 ,0.84 mM KBr, 0.49 mM H3BO3, 90 µM SrCl2, 72 µM NaF
f/2 -liquid medium artificial seawater, 0.1 % (v/v) trace element solution, 0.05 % (v/v) vitamin solution, 0.88 mM NaNO3, 36 µM NaH2PO4 
f/2+ liquid medium f/2-medium, with 10 times increased NaNO3 and NaH2PO4 (0.88 mM NaNO3, 36 µM NaH2PO4
f/2+-agar 3 % (w/v) bacto agar, artificial seawater, 0.1 % (v/v) trace element solution, 0.05 % (v/v) vitamin solution ,8.8 mM NaNO3, 0.36 mM NaH2PO4
f/2-agar 3 % (w/v) bacto agar, artificial seawater, 0.1 % (v/v) trace element solution, 0.05 % (v/v) vitamin solution ,0.88 mM NaNO3, 36 µM NaH2PO4
Trace element solution 0.36 mM NaH2PO4, 12 µM Na2EDTA, 39 nM CuSO4, 26 nM Na2MoO4 , 77 nM ZnSO4, 42 nM CoCl2, 0.91 µM MnCl2
Vitamin solution 0.3 µM thiamin-HCl, 2.1 nM biotin, 0.37 nM cyanocobalamin

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brasil, B., de Siqueira, F. G., Salum, T. F. C., Zanette, C. M., Spier, M. R. Microalgae and cyanobacteria as enzyme biofactories. Algal Research-Biomass Biofuels and Bioproducts. 25, 76-89 (2017).
  2. Gundolf, R., Oberleitner, S., Richter, J. Evaluation of New Genetic Toolkits and Their Role for Ethanol Production in Cyanobacteria. Energies. 12 (18), 3515 (2019).
  3. Wendt, K. E., Pakrasi, H. B. Genomics approaches to deciphering natural transformation in cyanobacteria. Frontiers in Microbiology. 10, 1259 (2019).
  4. Tandeau de Marsac, N., et al. A new approach for molecular cloning in cyanobacteria: cloning of an Anacystis nidulans met gene using a Tn901-induced mutant. Gene. 20 (1), 111-119 (1982).
  5. Porter, R. D. Transformation in cyanobacteria. Critical Reviews in Microbiology. 13 (2), 111-132 (1986).
  6. Joset, F. Transformation in Synechocystis PCC 6714 and 6803: preparation of chromosomal DNA. Methods in Enzymology. 167, 712-714 (1988).
  7. Tsinoremas, N. F., Kutach, A. K., Strayer, C. A., Golden, S. S. Efficient gene transfer in Synechococcus sp strains PCC-7942 and PCC-6301 by interspecies conjugation and chromosomal recombination. Journal of Bacteriology. 176 (21), 6764-6768 (1994).
  8. Matsunaga, T., Takeyama, H. Genetic engineering in marine cyanobacteria. Journal of Applied Phycology. 7 (1), 77-84 (1995).
  9. Frigaard, N. U., Sakuragi, Y., Bryant, D. A. Gene inactivation in the cyanobacterium Synechococcus sp. PCC 7002 and the green sulfur bacterium Chlorobium tepidum using in vitro-made DNA constructs and natural transformation. Methods in Molecular Biology. 274, 325-340 (2004).
  10. Iwai, M., Katoh, H., Katayama, M., Ikeuchi, M. Improved genetic transformation of the thermophilic cyanobacterium, Thermosynechococcus elongatus BP-1. Plant and Cell Physiology. 45 (2), 171-175 (2004).
  11. Vioque, A. Transformation of cyanobacteria. Transgenic Microalgae as Green Cell. Leon, R., Galvan, A., Fernandez, E. , Springer. 12-22 (2007).
  12. Nies, F., Mielke, M., Pochert, J., Lamparter, T. Natural transformation of the filamentous cyanobacterium Phormidium lacuna. Plos One. 15 (6), 0234440 (2020).
  13. Ravindran, C. R. M., Suguna, S., Shanmugasundaram, S. Electroporation as a tool to transfer the plasmid pRL489 in Oscillatoria MKU 277. Journal of Microbiological Methods. 66 (1), 174-176 (2006).
  14. El Semary, N. A. Optimized electroporation-induced transformation in Microcystis aeruginosa PCC7806. Biotechnologie Agronomie Societe et Environnement. 14 (1), 149-152 (2010).
  15. Nies, F., Mielke, M., Pochert, J., Lamparter, T. Natural transformation of the filamentous cyanobacterium Phormidium lacuna. PLoS One. 15 (6), 0234440 (2020).
  16. Sode, K., Tatara, M., Takeyama, H., Burgess, J. G., Matsunaga, T. Conjugative gene-transfer in marine cyanobacteria - Synechococcus Sp, Synechocystis Sp and Pseudanabaena Sp. Applied Microbiology and Biotechnology. 37 (3), 369-373 (1992).
  17. Stucken, K., Ilhan, J., Roettger, M., Dagan, T., Martin, W. F. Transformation and conjugal transfer of foreign gGenes into the filamentous multicellular cyanobacteria (Subsection V) Fischerella and Chlorogloeopsis. Current Microbiology. 65 (5), 552-560 (2012).
  18. Bellali, S., Khalil, J. B., Fontanini, A., Raoult, D., Lagier, J. C. A new protectant medium preserving bacterial viability after freeze drying. Microbiological Research. 236, 126454 (2020).
  19. Wallner, T., Pedroza, L., Voigt, K., Kaever, V., Wilde, A. The cyanobacterial phytochrome 2 regulates the expression of motility-related genes through the second messenger cyclic di-GMP. Photochemical & Photobiological Sciences. 19 (5), 631-643 (2020).
  20. Wilde, A., Fiedler, B., Borner, T. The cyanobacterial phytochrome Cph2 inhibits phototaxis towards blue light. Molecular Microbiology. 44 (4), 981-988 (2002).
  21. Bhaya, D., Takahashi, A., Grossman, A. R. Light regulation of type IV pilus-dependent motility by chemosensor-like elements in Synechocystis PCC6803. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (13), 7540-7545 (2001).
  22. Guillard, R. R., Ryther, J. H. Studies of marine planktonic diatoms. I. Cyclotella nana Hustedt, and Detonula confervacea (cleve) Gran. Canadian Journal of Microbiology. 8, 229-239 (1962).
  23. Kester, D. R., Duedall, I. W., Connors, D. N., Pytkowicz, R. M. Preparation of artificial seawater. Limnology and Oceanography. 12 (1), 176-179 (1967).
  24. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning. A Laboratory Manual. 3rd edition. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).
  25. Cold Spring Harbor Protocols. CTAB DNA extraction buffer. Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (3), (2009).
  26. Singh, S. P., Rastogi, R. P., Häder, D. -P., Sinha, R. P. An improved method for genomic DNA extraction from cyanobacteria. World Journal of Microbiology & Biotechnology. 27, 1225-1230 (2011).
  27. French, C. S., Milner, H. W. Disintegration of bacteria and small particles by high-pressure extrusion. Methods in Enzymology. 1, 64-67 (1955).
  28. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning, a laboratory manual. 2nd ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).
  29. Lamparter, T., et al. The involvement of type IV pili and phytochrome in gliding motility, lateral motility and phototaxis of the cyanobacterium Phormidium lacuna. bioRxiv. , (2021).
  30. Nies, F., et al. Characterization of Phormidium lacuna strains from the North Sea and the Mediterranean Sea for biotechnological applications. Process Biochemistry. 59, 194-206 (2017).
  31. Kachel, B., Mack, M. Engineering of Synechococcus sp. strain PCC 7002 for the photoautotrophic production of light-sensitive riboflavin (vitamin B2). Metabolic Engineering. 62, 275-286 (2020).
  32. Lukavsky, J., Cepak, V., Komarek, J., Kasparkova, M., Takacova, M. Catalogue of algal and cyanobacterial strains of culture collection of autotrophic organisms at Trebon. Algological Studies. 63, 59-112 (1992).
  33. Philbrick, J. B., Diner, B. A., Zilinskas, B. A. Construction and characterization of cyanobacterial mutants lacking the manganese-stabilizing polypeptide of photosystem-ii. Journal of Biological Chemistry. 266 (20), 13370-13376 (1991).
  34. Pinevich, A. V., Veprritskii, A. A., Gromov, B. V., Krautvald, K., Titova, N. N. Cellular and cultural properties and characterization of the pigment in Nostoc sp, a cyanobacterium unusually rich in c-phycoerythrin. Microbiology. 63 (5), 481-485 (1994).
  35. Schlosser, U. G., Friedl, T. Additions to the culture collection of algae at Gottingen since 1997. Nova Hedwigia. 71 (1-2), 243-262 (2000).
  36. Takano, H., Arai, T., Hirano, M., Matsunaga, T. Effects of intensity and quality of light on phycocyanin production by a marine cyanobacterium Synechococcus sp. 042902. Applied Microbiology and Biotechnology. 43 (6), 1014-1018 (1995).
  37. Carrer, H., Hockenberry, T. N., Svab, Z., Maliga, P. Kanamycin resistance as a selectable marker for plastid transformation in tobacco. Molecular and General Genetics: MGG. 241 (1-2), 49-56 (1993).
  38. Kaulen, H., Schell, J., Kreuzaler, F. Light-induced expression of the chimeric chalcone synthase-NptII gene in tobacco cells. EMBO Journal. 5 (1), 1-8 (1986).
  39. Cotlet, M., Goodwin, P. M., Waldo, G. S., Werner, J. H. A comparison of the fluorescence dynamics of single molecules of a green fluorescent protein: One- versus two-photon excitation. Chemphyschem. 7 (1), 250-260 (2006).
  40. Taton, A., et al. The circadian clock and darkness control natural competence in cyanobacteria. Nature Communications. 11 (1), 1688 (2020).

Tags

Biologi udgave 180
Naturlig transformation, proteinekspression og kryokonservering af den filamentøse cyanobakterie <em>Phormidium lacuna</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Weber, N., Hofmeister, M., Wunsch,… More

Weber, N., Hofmeister, M., Wunsch, N., Kohler, A., Kaster, A. K., Vollmers, J., Kachel, B., Mack, M., Lamparter, T. Natural Transformation, Protein Expression, and Cryoconservation of the Filamentous Cyanobacterium Phormidium lacuna. J. Vis. Exp. (180), e63470, doi:10.3791/63470 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter