Summary
Phormidium lacuna 是一种从海洋岩石池中分离出来的丝状蓝藻。本文介绍了从天然来源中分离细丝，DNA提取，基因组测序，自然转化，sfGFP表达，冷冻保存和运动性方法。
Abstract
蓝藻是基础研究和生物技术项目的重点，其中太阳能用于生物质生产。 Phormidium lacuna 是一种新分离的丝状蓝藻。本文描述了如何从海洋岩石池中分离出新的丝状蓝藻。它还描述了如何从细丝中提取DNA以及如何对基因组进行测序。虽然许多单细胞物种的转化已经建立，但丝状蓝藻的报道较少。这里描述了一种简化的 P. lacuna 自然转化方法。 P. lacuna 是Oscillatoriales目中唯一建立自然转化的成员。本文还展示了如何使用自然转化来表达超折叠绿色荧光蛋白（sfGFP）。内源性 cpcB 启动子诱导的表达强度约为 cpc560、 A2813 或 psbA2 启动 子的 5 倍。此外，建立了冷冻保存 P. lacuna 和 Synechocystis sp.CPP 6803的方法，并描述了评估液体介质中以及琼脂和塑料表面上的运动性的方法。
Introduction
蓝藻是利用光合作用作为能量来源的原核生物1，2。研究越来越关注蓝藻物种。几种蓝藻可以用DNA3转化。基因可以在这些物种中被敲除或过度表达。然而，转化仅限于少数物种4，5，6，7，8，9，10，11，并且很难在培养品或野生8的品系中建立转化。从海洋岩石池中分离出丝状物种 Phormidium lacuna 的菌株（图1），其中环境条件（例如盐浓度或温度）随时间波动。这些丝状蓝藻可以用作它们所属的Oscillatoriales12 目模式生物。
在试验测试通过电穿孔13，14进行基因转移时，发现 P. lacuna 可以通过自然转化15转化。在这个过程中，DNA被一些细胞自然吸收。与其他转化方法16，17相比，自然转化的优点是不需要可能使过程复杂化的附加工具。例如，电穿孔需要适当的比色皿，完整的电线和选择适当的电压。 P. lacuna 是目前唯一易受自然转化影响的振荡器成员。由于原始方案基于电穿孔方案，因此它仍然包括几个可能不必要的洗涤步骤。测试了不同的方法来简化协议，从而产生了这里介绍的转换协议。
基因组序列对于基于基因敲除或过表达的进一步分子研究至关重要。虽然基因组序列可以在短时间内用下一代测序机获得，但DNA的提取可能很困难，并且取决于物种。对于 P. lacuna，测试了几种方案。然后建立了基于改良的十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）的方法，从而产生了每个纯化循环的DNA纯度和DNA产量的可接受纯度，以便在实验室中继续工作。可以使用该协议对五种菌株的基因组进行测序。下一个合乎逻辑的转化步骤是在 P. lacuna中建立蛋白质表达。
在该协议中用作标记蛋白的sfGFP可以用任何荧光显微镜检测。所有测试的启动子都可用于 P. lacuna sfGFP表达。转化产生的菌株数量不断增加，导致需要一种储存培养物的方法。这些方法已针对 大肠杆菌 和许多其他细菌18建立。在标准方案中，制备甘油培养物，在液氮中转移，并在-80°C下储存。 这种方法只需要几个步骤，对于那些建立它的物种来说非常可靠。标准方案对于 P. lacuna 是不可行的，因为活细胞不能在所有情况下都恢复。然而，当甘油在解冻后被除去时，所有试验的细胞都存活了下来。提出了用于分析 P. lacuna运动性的简单方法，其可以与敲除诱变相结合以研究IV型舂毛或光感受器的作用。这些测定与单细胞蓝藻19，20，21 的测定不同，并且也可用于其他Oscillatoria。
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Protocol
1. 与自然环境隔绝
注意：可以分离绿藻，硅藻，丝状蓝藻和其他微藻。该方案可用于在实验室条件下生长的岩池中的任何微藻物种。属于Oscillatoriales的丝状蓝藻可以通过其运动和丝状形状轻松识别。该物种可以通过基因组测序或16S rRNA测序在半纯状态下鉴定。
- 将来自海洋岩石池（即岩石海岸的空腔）的液态海水样品转移到50 mL烧瓶中。对于每个烧瓶，请注意自然来源的确切位置或坐标。如果可能，通过50μm的网过滤内容物以减少浮游动物的数量。将样品储存在4°C，直到可以传代培养。
- 将1 mL培养物转移到含有3%bacto-agar的10cm培养皿中，在f / 2培养基22，23中（参见材料表）。准备多达 20 个盘子。在50μmol m-2 s-1的白光下培养。
注意：更高的光强度可用于培养。强度高达400μmol m-2 s-1 可用于 P. lacuna，尽管其他物种可能更感光。 - 一周后，使用无菌镊子将所需细胞转移到新鲜的琼脂平板上。在无菌条件下在双目显微镜下分离细胞。将旧的琼脂平板储存在4°C，直到细胞出现并在新的琼脂平板上生长。
- 每周重复此转移步骤以消除污染。使用肉眼检测严重污染，使用400倍放大倍率的显微镜进行额外污染检查。
- 如果样品似乎没有污染，请在琼脂平板上测试细菌或真菌污染。将带有接种环的一小部分培养物转移到LB24 琼脂平板（直径10厘米）上，将板保持在室温下，并在1-3天内检查污染物的生长。
- 如果获得无菌丝状蓝藻种类，则将其用于进一步的培养工作。在液体或杆菌琼脂平板上培养 P. 使用 250 mL 烧瓶和 50 mL f/2 培养基或 f/2+ 培养基进行液体培养。
2. DNA提取
注意：从 25 到26 采用此方法
- 用50 mL f / 2培养基准备两个烧瓶。每个接种约1mL来自其他生长培养物的P. lacuna细丝。在25°C的白光（50μmol m-2 s-1）下以50rpm搅拌（水平旋转）保持培养物7天或更长时间。
- 用超声波（见 材料表）全能量处理培养物2分钟。在750nm处测量OD;检查以确保它是 ~0.5。如果OD太低，继续培养培养物。
- 将细丝收集5，000× g，离心20分钟。取出上清液。将带有残留液体的细丝转移到法国压榨机27的腔室中。将法式压榨机的压力设置为20，000 psi并提取细胞。
注意：法国媒体将裂解所有细胞并释放DNA;强大的剪切力将产生1，500 bp的DNA片段。 - 将样品在10，000× g 下离心10分钟，并除去上清液。
- 向沉淀中加入400μL裂解缓冲液（4M尿素，0.1M Tris / Cl，pH 7.4）和50μL蛋白酶K（10mg / mL）。将样品加热至55°C60分钟，以550rpm振荡。
- 加入1mL DNA提取缓冲液（3%CTAB，1.4M NaCl，10mM EDTA，0.1M Tris / Cl，1%Sarkosyl，0.1 M DTT，pH 8），并在55°C和550rpm下孵育60分钟。将溶液转移到离心管中，并加入两体积的氯仿/异戊醇（24/1）。
- 摇动后，将样品在9，000× g下离心5分钟。将上层水相转移到反应小瓶中，加入1mL冰冷乙醇和50μL3M乙酸钠。
- 涡旋样品并将其置于-20°C下1小时或更长时间。
- 在10，000× g （4°C）下离心5分钟，弃去上清液。用70%乙醇洗涤沉淀。
- 再次离心样品。除去上清液并干燥沉淀过夜。将DNA溶解在无核酸酶的水中。测量DNA光谱以检查OD 260 nm / OD 280 nm是否在1.6和1.9之间。
- 分析琼脂糖电泳凝胶28上DNA的大小。
- 通过下一代测序对基因组DNA进行300个周期的测序，配对端设置和150个碱基的读取长度（参见 材料表）。
- 使用适当的计算机程序执行组装;请参阅 材料表中给出的示例。
- 将基因组草案提交给RAST服务器进行注释。
注意：上传DNA序列以在几分钟内获得完整的注释。
3. 自然转化和GFP表达
注意：转化基于在 大肠杆菌中繁殖的质粒载体;pGEM-T或pUC19可用作骨干载体。克隆技术在许多实验室中建立;另见标准方案28 和关于 P. lacuna15，29的转化载体的文章。代表性结果部分介绍了 sfGFP 表达载体的示例。补充 文件 1 中提供了四个尚未发表的载体的详细信息。
- 在无菌实验室条件（洁净工作台，无菌玻璃器皿）下使用无菌材料执行所有步骤。
- 在两个 250 mL 烧瓶中接种 2 x 50 mL f/2 液体培养基，其中含有来自运行培养物的 2 x 1 mL 乳酸乳 杆菌丝。在白光（50μmol m-2 s-1）下在搅拌（水平旋转，50rpm）下在25°C下培养〜5天。
- 根据制造商的说明，使用midi制备试剂盒（参见 材料表）制备约200μg转化载体DNA。
- 以10，000rpm匀浆100mL 腔室P. 细胞悬浮液（参见 材料表）3分钟。在750nm处测量OD（所需值= 0.35）。
- 将细胞悬浮液以6，000× g离心15分钟。除去上清液，并将沉淀悬浮在剩余液体和附加f / 2 + 培养基的800μL（包括残留液体和细丝的总体积）中。
- 取八个含有120μg/mL卡那霉素的f / 2 + 杆菌琼脂平板（直径10厘米）。将10μgDNA移液到每个琼脂平板的中间。立即将100μL细胞悬浮液移液到每个琼脂板的中间（在DNA的顶部）。
- 将琼脂板放在干净的工作台上，不要盖上盖子，以使多余的液体蒸发。关闭板并在25°C的白光下培养2天。
- 将每个琼脂平板的细丝与接种环分布到几个含有120μg/ mL卡那霉素的新鲜f / 2 + bacto-agar平板上。在25°C的白光下培养板，并在显微镜下定期检查培养物。
- 在显微镜下7-28天后识别活的，转化的细丝。寻找与其他灯丝不同的健康绿色细丝（图2）。如果可以识别这些绿丝，请继续下一步;否则，将盘子再保存7天。
- 使用镊子将这些已鉴定的活丝转移到50 mL液体f / 2 + 培养基中，其中含有250μg/ mL卡那霉素。在25°C的白光下在振荡器上培养（水平旋转，50rpm）。观察生长长达四周。
- 将细丝转移回含有250μg/ mL卡那霉素的琼脂培养基中，并等待细丝生长。几天后，将单丝转移到具有较高浓度卡那霉素的新鲜琼脂平板中，例如500μg/ mL。保留原版。
- 确保细丝在液体培养物或琼脂中以高浓度的卡那霉素繁殖。再次增加卡那霉素浓度以加速分离。
注意：转化的 P. lacuna 在高达10，000μg/ mL卡那霉素中生长。其他物种可能无法忍受如此高的浓度。 - 如果抗性细胞在平板上广泛生长和分布，则通过用外部和内部引物进行PCR来测试插入片段与 P. lacuna 基因组的整合。
- 使用专为克隆插入物而设计的引物作为内引物。
- 对于外部引物的设计，选择在 P. lacuna 基因组上提出的插入位点的5'和3'的序列，但在插入之外。
- 对于PCR反应，使用内引物和外引物。使用抗性菌株和野生型。
注意：内部引物表示插入物存在;外部引物显示插入物插入正确的位点。
- 对于每个PCR反应，将〜10mg细丝直接置于PCR管中，并根据标准方案24进行PCR。如果没有获得产品，请改变退火温度并用水清洗长丝。
注意：许多不同的聚合酶可用于PCR。标准聚合酶，如Taq聚合酶，比错误检查聚合酶具有更高的错误率，后者更昂贵。这种分析PCR不需要任何错误检查聚合酶。然而，如果没有使用标准聚合酶获得PCR产物，则应测试错误检查聚合酶。 - 分析琼脂糖电泳上抗性系的PCR产物24.
- 使用标记比较条带位置，并比较野生类型和转化子。对于内引物 和 外引物，为转化剂寻找比野生型更大的条带（由于插入了电阻盒）或为转化体寻找两条带：一条具有野生型条带的大小，另一条较大的条带。由于后一种情况表明不完全分离，因此继续以高浓度的卡那霉素进行培养。
注：有关PCR和电泳的更多详细信息，请参见15，24 或其他标准文献。
- 使用标记比较条带位置，并比较野生类型和转化子。对于内引物 和 外引物，为转化剂寻找比野生型更大的条带（由于插入了电阻盒）或为转化体寻找两条带：一条具有野生型条带的大小，另一条较大的条带。由于后一种情况表明不完全分离，因此继续以高浓度的卡那霉素进行培养。
- 对于GFP表达：用荧光显微镜（参见 材料表）以设定为40x或63x的物镜的放大倍率观察单丝。捕获明场透射图像和荧光图像。对 GFP 使用以下设置：用于激发的 470 nm 带通、用于发射的 525 nm 带通和 495 nm 分束器，初始曝光时间为 500 ms。
- 调整曝光时间以获得清晰的荧光信号，避免饱和强度。尝试对所有样本使用相同的设置。
- 由于野生型灯丝也会显示荧光，因此使用与此背景荧光的上述设置相同的设置捕获图像。
注意：表达GFP的菌株必须具有更高的信号;否则，它不是表示GFP。 - 根据荧光图像的曝光时间和像素强度，计算和比较不同灯丝的GFP含量。
4. 低温保存
注： P. lacuna 和单细胞蓝藻 Synechocystis sp.使用PCC 6803。本方法对 P. lacuna更有效。
- 分别在10 mL f / 2 +或BG-11培养基中培养P. lacuna或Synechocystissp PCC 6803至少10天，在25°C的白光（50μmol m-2 s-1）下搅拌（水平旋转，50rpm）。
- 将 P. lacuna 培养物（见 材料表）以10，000rpm匀浆3分钟或用超声装置（参见 材料表）全能匀浆2分钟。确定任一培养物的OD 750 nm，以检查该值是否在1和7之间。
- 通过以6，000× g 离心15分钟收集细胞。取出上清液。
- 将细胞沉淀悬浮在800μLf / 2 + 或BG-11培养基（最终体积）中，并转移到2mL冷冻管中。向细胞悬浮液中加入800μL50%甘油溶液。关闭小瓶并通过反复倒置混合。
- 将冷冻管转移到液氮中，并将其储存在-80°C冰箱中的冷冻箱中。注意盒子在冰箱内的位置以及盒子内样品的坐标。
- 为了恢复细胞，取出冷冻管并在室温下解冻内容物。将内容物转移到2 mL反应管中。
- 将样品洗涤两次。对于第1次 洗涤，以6，000× g 离心5分钟。除去上清液，并将沉淀重悬于2 mL f / 2 + 或BG-11培养基中。对于第2次 洗涤，以6，000× g 下最近离心5分钟，除去上清液，并将沉淀悬浮在2mL f / 2 + 或BG-11培养基中。
- 为了检查这些准备培养的细胞的完整性，将沉淀转移到9mL培养基中，并在搅拌（55rpm）下在白光（50μmol m-2 s-1）下培养它们。比较第一天和1周后培养物的OD 750nm。
5. 滞留菌的运动性
注意：将描述三种不同的测定。在所有情况下都使用相同的区域性。
- 在白光（50μmol m-2 s-1）下水平搅拌（50 rpm）在f / 2培养基中培养P. lacuna约5天，直到估计的OD 750nm为0.35。将样品储存在4°C直至使用。
- 以10，000rpm或超声（见材料表）将细丝（见材料表）均质化3分钟，最大功率和循环为1。测量外径 750 纳米。如果高于0.35，用f / 2培养基稀释馏分。在步骤5.3，5.4和5.5中的动力测定中使用该溶液。
- 液体介质中运动的测定
- 为了直接观察运动性，将8mL含有 P. lacuna 的培养基（从步骤5.2开始）转移到6厘米的培养皿中。等待几分钟，直到样品达到室温。用玻璃纸箔覆盖培养皿。
- 将显微镜载玻片放在带相机的标准显微镜的x-y台上。打开显微镜灯。理想情况下，始终使用相同的电气和光学设置进行照明。将 4 倍或 10 倍物镜移动到光的路径中。
- 将培养皿放在载玻片的顶部。通过表格的 x、y 和 z 运动调整单根细丝或细丝束。
注：由于三维布局，只有相关部分的一部分可以聚焦。玻璃纸箔允许不受限制地调整焦点。 - 观察单丝或束的运动。确保物镜不接触液体。用标准显微镜相机记录灯丝的运动（参见 补充视频S1）。
- 表面运动检测
- 为了观察琼脂表面的细丝运动，用f / 2 bacto-agar准备6厘米培养皿。确保琼脂足够高，以便物镜接近琼脂表面。或者，准备约3毫米厚的琼脂层，并通过琼脂记录细丝（保持板倒置或使用倒置显微镜）。
- 移液0.5mL含有 P. lacuna （来自步骤5.2）的溶液在6cm培养皿的杆菌琼脂表面上。让液体进入表面。关闭培养皿，并使用4x或10x物镜观察表面上细丝的运动。
- 确保在整个记录过程中和随后的记录中使用相同的显微镜的电气和光学设置。
- 使用目视摄像头和小型计算机系统捕获延时记录。确保后续图像之间的时间间隔为5 s-1分钟。对小型计算机的Linux脚本进行编程以控制延时记录。有关示例脚本，请参阅 补充文件 2 ，以示例形式参阅 补充视频 S2 。
- 光敏测定
- 对于光出租车实验，准备发光二极管（LED）支架（此处为3D打印机），其中安装选定的5 mm LED以从下方到上方照射20 mm2 的区域（图3）。如果需要，可以并联使用多个 LED 灯座，通过电阻器和电位计将每个 LED 电连接到可调电源。根据实验测量和调整 LED 强度。确保整个设置位于暗室或封闭的黑暗容器中。
- 将8mL含有 P. lacuna （来自步骤5.2）的培养基放入6厘米的培养皿中。调整 LED 的光强度。用盖子关闭培养皿并将其放在LED支架上，使LED位于培养皿的中心。
- 在所需的时间（通常为2天）之后，用智能手机相机直接瞄准光处理的位置捕获培养皿的图像。使用白色LED面板照射试样。使用相机的手动设置;避免光线反射;始终进行调整以获得相机镜头和标本之间的相同距离。确保曝光设置提供适合以后使用 ImageJ 进行分析的图像。
- 使用ImageJ软件量化灯丝中心圆的直径。
- 打开图像J，单击 文件|打开，选择所需的文件，然后单击 Enter。
- 选择“ 直线 ”按钮（带直线）。按鼠标左键从培养皿的一端到另一端绘制一条线。确保线穿过细丝圆的中心。
- 按键盘上的 Ctrl-K 或单击“ 分析|在 ImageJ 菜单中打印配置文件。寻找一个x-y窗口，其中绘制了像素强度与距离 - 培养皿的一维轮廓。确保最低像素强度略高于 0，最大值低于 255。
- 估计圆圈外像素强度的平均值和圆圈中像素强度的另一个平均值。在这些值之间的 y- 位置，通过用鼠标指向这些位置来估计圆两侧的 x 值。记下这两个值并计算差值。
- 通过将鼠标指向右侧的 y 轴来获得最高的 x 值。请注意，此值 e 表示培养皿的直径。如果此直径为 5 cm，则将 中心灯丝圆的直径 计算为 d/e × 5 cm。
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Representative Results
按照上述方法，从岩池中分离出5种不同的 P. lacuna 菌株并测序（图1 和 表1）。除 P. lacuna HE10JO外，所有培养物在传代培养约1年后均无菌。该菌株仍然受到海洋细菌 Marivirga atlantica的污染。在随后的黑尔戈兰岛游览中，从岩石池中分离出其他丝状蓝藻，这些蓝藻与 P. lacuna 不同，需要表征。
对几种DNA提取和纯化方法进行了 P. lacuna测试。如上所述，使用优化的CTAB方法获得最佳结果。DNA产量为310±50 μg/mL，OD 260 nm/OD 280 nm为1.7 ±0.03，OD 260 nm/OD 230 nm为0.78 ±0.04（n = 17）。基因组测序显示，所有菌株的DNA均略有不同，正如预期的那样（表1）。核心蛋白序列显示的最大差异为0.04%（表2）。虽然所有的基因组草案都是不完整的，但人们可以假设HE10JO30 的基因组>98%是测序的。此估计值基于不完整的开放阅读框的数量。在HE10DO和HE10JO的RAST注释后可以很容易地鉴定部分蛋白质序列。在HE10JO中，约4，500种蛋白质中有60种蛋白质缺失了N端或C端序列。基因组序列可以在补充文件（补充文件3，补充文件4，补充文件5，补充文件6 和 补充文件7）中找到。
有趣的是，从黑尔戈兰岛和吉廖岛这两个岛屿上分离出同一物种的菌株。两个岛屿之间的线性距离为1，400公里。这两个地方之间必须有联系，例如，通过海洋的船只，或者更有可能的是，通过候鸟。在这两个岛屿上都可以找到许多鸟类，其中许多是候鸟。一个岛屿的 P. lacuna 菌株的多样性大于最接近的黑尔戈兰和Giglio菌株之间的多样性（表2）。这表明两地之间的激烈交流。
使用HE10DO作为主要菌株和HE10JO测试了自然转化。本方案比前面描述的方案12 更直接，因为洗涤步骤的数量减少，转化后的转移步骤更少。这种新方法在实验室中不断使用;成功实现了约15次转型。
KanR电阻盒通常被集成到由相邻区域定义的同源位点中，如使用内部和外部引物的PCR所示。像大多数蓝藻一样， P. lacuna 是多倍体。它可以有超过100条染色体每细胞12。在转化后约1周使用外部引物进行的PCR测试通常在电泳凝胶上有2个条带，一个具有野生型条带的大小，另一个具有较慢的迁移条带，表明插入了电阻盒（图4）。双波段表示只有染色体的亚部分包含插入。在选择卡那霉素 4 周后，分离通常完全，凝胶上仅出现一个大的 PCR 条带。然而，在用pMH1转化的情况下（见下文），分离在3个多月后完成。
构建载体pAK1、pAK2、pAK3和pMH1，用于sfGFP表达测试。在pAK1，pAK2和pAK3中，sfGFP基因分别处于cpc560，A2813和psbA2启动子的控制之下。这些启动子来自Synechocystis sp. PCC 6803或Synechoococcus sp. PCC 700231。为了构建这些载体，从用于Synechoococcus sp. PCC 700231转化的载体中提取sfGFP启动子和终止子序列。将相关序列整合到pFN1的同源chwA（sc_7_37）位点（或pFN_7_37_KanR15）中。pMH1表达载体是使用P. lacuna序列作为模板通过DNA合成构建的（补充文件6）。将CpcB-cpcA（藻蓝蛋白β和藻蓝蛋白α）序列序列。 100 bp的基因间区将两个编码区分开。合成序列包含该内源性cpcB-cpcA序列和cpcB启动子。sfGFP和KanR盒仅放置在cpcB终止密码子（cpcA的5'）的3'处。将具有cpcB启动子，cpcB，sfGFP，KanR，cpcA（5'至3'）的整个合成序列克隆到pUC19中。图 5 显示了一个映射。有关 pAK1、pAK2 和 pAK3 的克隆以及 pMH1 的完整序列的更多详细信息，请参见补充文件 1。
所有4个转化子（pAK1，pAK2，pAK3和pMH1）均表达GFP;所有荧光水平均高于野生型细丝的背景荧光（图6）。具有不完全分离的pMH1转化子揭示了细丝之间非常可变的GFP信号。当分离完成时，荧光信号均匀分布（图6E）。pAK1，pAK2和pAK3转化子的显微镜信号相似，但比pMH1弱约5倍（图6E）。
已建立的冷冻保存方法基于为 大肠杆菌建立的方法。当在解冻后进行2个洗涤步骤以去除甘油时，15个 P. lacuna 样品中有15个存活下来（表3）。该方案也可用于 Synechocystis PCC 6803，但只能使用2个洗涤步骤，而不能使用1个（表3）。
振荡丝的另一个特征是它们的运动性： P. lacuna 细丝在表面（图7）和液体介质中连续移动（图8）。这两种运动都可以在没有琼脂培养基或用琼脂培养基的培养皿中轻松研究。延时记录是必需的，因为琼脂上的运动速度很慢。如果光束来自下方，灯丝会向光锥移动（图3）。光强度，波长和时间的影响可以通过简单的设置轻松研究。这种效应的光感受器尚不清楚。可能的候选者可以通过敲除突变体来解决。细丝如何找到光的机制也不清楚。对于这个问题，需要一个红外系统来记录细丝从黑暗到光明的运动过程。
图1：从黑尔戈兰岛和吉格里奥收集的 Phormidium lacuna 菌株。 细丝在6厘米培养皿中的f / 2琼脂上繁殖11天。（一）菌株GI08AO;（B） 菌株 GI08IO;（三）菌株GI09CO;（四）应变HE10DO;（五）菌株HE10JO;（六）菌株HE15M2G1。 请点击此处查看此图的大图。
图2：转化后5周的 Phormidium lacuna 细丝。 使用sfGFP表达载体pMH1;选择发生在f / 2 + 培养基上，含120μg/ mL卡那霉素。绿色的细丝是抵抗和活的;其他细丝已经死亡。比例尺 = 100 μm。 请点击此处查看此图的放大版本。
图3：光出租车实验。左：带 4 个红色 LED 的 LED 支架，连接到一个可调节的电源。在每个LED的顶部，有一个6厘米的培养皿，带有8毫升的Phormidium lacuna培养物。右：在红色LED（15μmol m-2 s-1）上放置2天后具有P. lacum的培养皿。简称：LED=发光二极管。请点击此处查看此图的大图。
图4： Phormidium腔隙 与pAK1转化后插入物的整合和分离。 使用外部引物进行 PCR。不带嵌件和带嵌件的产品的预期尺寸分别为2371和5016 bp。左泳道：标记物，泳道1，2，3，4：PCR产物的丝分别在分离耐药丝后7天，11天，14天和17天（转化后4周）。泳道5：野生型PCR产物（来自不同凝胶）。在7天样品中，插入物存在于染色体的一小部分中。该分数增加至17天，其中没有野生型条带可见，即分离完成。 请点击此处查看此图的大图。
图5：内源性 cpcB 启动子控制下sfGFP表达的载体。 橙色： Phormidium lacuna 同源序列，紫色/蓝色：pUC-19载体骨架，绿色：插入sfGFP和KanR。缩写：sfGFP =超级折叠绿色荧光蛋白;KanR = 卡那霉素耐药性。 请点击此处查看此图的大图。
图6：sfGFP在Phormidum腔隙中的表达。空白疟原虫野生型细丝（A）的荧光图像以及与pAK1（B），pAK2（C），pAK3（D）和pMH1（E）的转化后。在pMH1中，sfGFP基因位于藻蓝蛋白β基因的3'处，因此由内源性cpcß启动子驱动;在其他情况下，sfGFP分别由来自Synechocystis PCC 6803的cpc560，A2813或psbA2启动子驱动。荧光设置是针对GFP的;所有图像均使用相同的积分时间和光学设置进行记录。请点击此处查看此图的大图。
图7：琼脂表面以4倍放大倍率合并的 Phormidium空白 图像。 第一张图片以红色显示，第二幅（1分钟后拍摄）以绿色显示。还要注意琼脂上的痕迹。比例尺 = 100 μm。 请点击此处查看此图的放大版本。
图8：液体介质中 Phormidium lacuna 的合并图像。 两幅图像之间的时间间隔为10秒。第一个图像以红色打印;第二个以绿色打印。比较两种颜色可显示 10 秒内的运动。比例尺 = 100 μm。 请点击此处查看此图的放大版本。
| 应变 | HE10JO | HE10多 | GI08AO | GI09CO | HE15M2G1 |
| 重叠群 | 104 | 174 | 218 | 102 | 154 |
| 总产值 | 48,19,017 | 47,88,491 | 47,78,775 | 36,69,922 | 45,98,395 |
表1： Phormidium lacuna 菌株。
| 吉09CO | HE10多 | HE10JO | HE15M2G1 | |
| 吉08AO | 42 | 40 | 0 | 42 |
| 吉09CO | 2 | 42 | 0 | |
| HE10多 | 40 | 2 | ||
| HE10JO | 42 |
表 2.菌株在20种核心蛋白和10，876个氨基酸的序列中的氨基酸差异。
| 电池密度 OD 750 nm | 1 | 1 | 3 | 3 | 5 | 5 | 7 | 7 |
| 洗 | 1 | 2 | 1 | 2 | 1 | 2 | 1 | 2 |
| 粘胞藻 PCC 6803 | 2/5 | 5/5 | 1/4 | 4/4 | 0/4 | 4/4 | 0/4 | 3/4 |
| 镨空隙 HE10多 | 4/4 | 4/4 | 4/4 | 4/4 | 3/ 4 | 4/4 | 3/3 | 3/3 |
表3：集 胞藻 PCC 6803和 Phormidium lacuna HE10DO蓝藻的 冷冻保存试验。第一个数字显示冷冻/解冻后存活的培养物数量;第二个数字显示试验总数。
补充视频 S1：液态溶液中腔隙性长丝的移动，无延时。请单击此处下载此视频。
补充视频S2：磷酰胺腔隙丝在琼脂表面的运动，延时。请点击这里下载此视频。
补充文件1：克隆载体以转化 Phormidium lacuna。 转换向量列表;用于克隆的引物清单;gb 格式的 pMH1 序列。 请点击此处下载此文件。
补充文件 2：树莓派小型计算机的 Shell 脚本 （sh）。请点击此处下载此文件。
补充文件3：HE152G1的DNA序列。 请点击此处下载此文件。
补充文件4：GI08AO的DNA序列。请点击此处下载此文件。
补充文件5：GI09CO的DNA序列。请点击此处下载此文件。
补充文件6：HE10DO的DNA序列。请点击此处下载此文件。
补充文件7：HE10JO的DNA序列。请点击此处下载此文件。
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Discussion
尽管许多蓝藻菌株可从培养物32，33，34，35，36中获得，但由于这些物种适应特定特性，因此仍需要来自野生的新蓝藻。从岩池中收集 P. lacuna ，并适应盐浓度和温度30的变化。该物种的菌株在2008年，2009年和2010年的短途旅行中被发现。通过这里描述的程序，分离出5株 P. lacuna ，其中4种菌株是无菌的。 菌株P. lacuna HE10JO被 大西洋Marivirga细菌永久污染，Marivirga atlantica是一种通过rRNA和基因组测序鉴定的海洋细菌。尽管应用了机械分离，在不同温度下生长，抗生素处理或化学处理，但该细菌无法与蓝藻分离。尽管有污染， 但P. lacuna HE10JO可以与其他菌株相似地培养。在后来的短途旅行中，发现了Oscillatoriales的其他成员，但尚未对其进行详细分析。 P. lacuna 再次没有被发现。目前尚不清楚为什么 P. lacuna 在随后的几年和两个不同的地方被分离出来，但后来没有发现。它的丰富性当然取决于不可预测的条件。温度，盐浓度以及无机或有机养分在岩石池中变化很大。因此，物种组成可能以不可预测的方式随时间波动。
自然转化是针对不同的蓝藻建立的，主要是单细胞物种。丝状 P. lacuna 是振荡目中唯一已经建立自然转化的物种。使用目前的协议，这种转变几乎总是成功的。一般来说，转化试验后抗性细丝的数量差异很大，有时转化失败，导致宝贵的时间损失。因此，建议并行执行多个转换项目。完全分离的时间，通常在分离耐药菌株后4周，也可能有所不同。由于卡那霉素生长后无法保证完全分离，因此使用外部和内部引物进行PCR测试至关重要。
每个载体必须包含2 x 500-1，000 bp同源序列，例如，通过PCR从宿主扩增并被耐药盒中断（例如，此处使用的卡那霉素盒KanR）37，38。对于表达，启动子、编码序列（例如，对于sfGFP39）、终止子和电阻盒必须在同源序列之间克隆。克隆策略是针对物种的，取决于实验的目的。
这种转化方法可以在其他振荡杆菌菌株或其他蓝藻中实现：自然转化基于IV型针状细胞，其几乎存在于所有其他蓝藻基因组3，15，40中。因此，本方法可以刺激对其他物种的新试验。由于 IV 型针状细胞也与运动有关，因此检查蓝藻运动的条件非常重要。
基因插入基于同源重组，导致同源位点的破坏。因此，转化通常用于基因敲除。如果将活性启动子和编码序列整合到同源位点中，则将诱导插入基因的表达。在P. lacuna中，启动子活性取决于物种。Synechocystis PCC sp 6803或Synechooccc sp. PCC 7002 31的cpc560，A2813和psbA2启动子以及P. lacuna的cpcB启动子可以驱动sfGFP的表达。在这些构建体中，内源性cpcB启动子诱导最强的表达，尽管sfGFP基因位于藻蓝蛋白ß基因的3'。这表明内源性启动子在蓝藻表达中的更普遍使用。
基因敲除和运动研究的结合将揭示运动和光诱的分子机制。LED光源可以为光敏实验提供光。几乎任何波长都可用，光强度可以通过可调节的电源和电位计进行调制。LED支架可以通过3D打印机构建，以轻松实现不同LED的组合。
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Disclosures
作者没有利益冲突需要披露。
Acknowledgments
这项工作得到了卡尔斯鲁厄理工学院的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Autoclave 3870 ELV | Tuttnauer | 3870 ELV | |
| Bacto Agar | OttoNorwald | 214010 | |
| BG-11 Freshwater Solution | Sigma Aldrich | C3061 | |
| BG-11 medium | Merck | 73816-250ML | |
| Boric acid | Merck | 10043-35-3 | H3BO3 |
| Calcium chloride dihydrate | Carl Roth | 10035-04-8 | CaCl2 · 2 H2O |
| Cell culture flasks Cellstar with filter screw cap, sterile, 250 mL | Greiner | 658190 | |
| Cell culture flasks Cellstar with filter screw cap, sterile, 50 mL | Greiner | 601975 | |
| Centrifuge LYNX 4000 | Thermo Scientific | 75006580 | and rotor |
| Centrifuge microstar 17 | VWR International | N/A | for up to 13,000 rpm |
| Cetyltrimethylammonium Bromide (CTAB) | PanReac AppliChem | 57-09-0 | C19H42BrN |
| Chloroform : Isoamyl Alcohol 24 : 1 | PanReac AppliChem | A1935 |
|
| Cobalt(II) chloride hexahydrate | Merck | 7791-13-1 | CoCl2 · 6 H2O |
| Copper(II) sulphate pentahydrate | Merck | 7758-99-8 | CuSO4 · 5 H2O |
| D(+)-Biotin | Carl Roth | 58-85-5 | C10H16N2O3S |
| DNA ladder 1 kb | New England Biolabs | N3232 | |
| DNA ladder 100 bp | New England Biolabs | N3231 | |
| Electrical pipetting help accujet-pro S | Brand GmbH | 26360 | for pipetting 1-25 mL |
| Ethanol | VWR | 64-17-5 | C2H6O |
| Ethylenediamine tetraacetic acid disodium salt dihydrate | Carl Roth | 6381-92-6 | EDTA-Na2 · 2 H2O |
| Fluorescence microscope ApoTome | Zeiss | ||
| Fluorescence microscope Axio Imager 2 | Zeiss | ||
| French Pressure Cell Press | American Instrument Company | N/A | |
| Gel documation System Saffe Image | Invitrogen | ||
| Gelelctrophoresis system Mupid-One/-exu | ADVANCED | ||
| Glassware, different | |||
| Glycerol | Carl Roth | 56-81-5 | C3H8O3 |
| Iron(III) chloride hexahydrate | Merck | 10025-77-1 | FeCl3 · 6 H2O |
| Kanamycin | Sigma-Aldrich | 25389-94-0 | |
| Kanamycin sulphate | Carl Roth | 25389-94-0 | C18H36N4O11 · H2SO4 |
| Lauroylsarcosine, Sodium Salt (Sarcosyl) | Sigma Aldrich | 137-16-6 | C15H28NO3 · Na |
| LB Broth (Lennox) | Carl Roth | X964.4 | |
| Light source, fluorescent tube L18W/954 daylight | OSRAM | cultivation of cyanobacteria | |
| Light source, LED panel XL 6500K 140 W | Bloom Star | N/A | cultivation of cyanobacteria, up to 1,000 µmol m-2 s-1 |
| Magnesium chloride hexahydrate | Carl Roth | 7791-18-6 | MgCl2 · 6 H2O |
| Manganese(II) chloride tetrahydrate | Serva | 13446-34-9 | MnCl2 · 4 H2O |
| Microscope DM750 | Zeiss | ||
| Midi prep plasmid extraction kit NucleoBond Xtra Midi kit | Macherey-NAGEL GmbH & Co. KG | REF740410.50 | |
| Minicomputer Raspberry Pi 4 + | Conrad Electronics | 2138863-YD | for time-lapse recording |
| Ocular camera EC3 | Leica | for continuous recording up to 30 s | |
| Ocular camera MikrOkular Full HD | Bresser | for time-lapse recordings, coupled to Raspberry Pi minicomputer | |
| Petri dishes polystyrole, 100 mm x 20 mm | Merck | P5606-400EA | |
| Petri dishes polystyrole, 60 mm x 15 mm | Merck | P5481-500EA | |
| Photometer Nanodrop ND-1000 | Peqlab Biotechnologie | ||
| Photometer Uvikon XS | Goebel Instrumentelle Analytik GmbH | ||
| Pipetman 100-1,000 µL | Gilson | SKU: FA10006M | |
| Pipetman 10-100 µL | Gilson | SKU: FA10004M | |
| Plastic pipettes 10 mL, sterile | Greiner | 607107 | |
| Plastic tube, sterile, 15 mL | Greiner | 188271 | |
| Plastic tube, sterile, 50 mL | Greiner | 227261 | |
| Potassium bromide | Carl Roth | 7758-02-3 | KBr |
| Potassium chloride | Carl Roth | 7447-40-7 | KCl |
| Power supply Statron 3252-1 | Statron Gerätetechnik GmbH | ||
| Power supply Voltcraft PPS 16005 | Conrad Electronics | for LED | |
| Proteinase K | Promega | MC500C | from Maxwell 16 miRNA Tissue Kit AS1470 |
| Q5 polymerase | New England Biolabs | M0491S | |
| Sequencing kit NextSeq 500/550 v2.5 | Illumina | ||
| Sequencing system NextSeq 550 SY-415-1002 | Illumina | ||
| Shaker Unimax 2010 | Heidolph Instruments | for cultivation | |
| Sodium acetate | Carl Roth | 127-09-3 | NaCH3COO |
| Sodium chloride | Carl Roth | 7647-14-5 | NaCl |
| Sodium dihydrogen phosphate monohydrate | Carl Roth | 10049-21-5 | NaH2PO4 · H2O |
| Sodium fluoride | Carl Roth | 7681-49-4 | NaF |
| Sodium hydrogen carbonate | Carl Roth | 144-55-8 | NaHCO3 |
| Sodium molybdate dihydrate | Serva | 10102-40-6 | Na2MoO4 · 2 H2O |
| Sodium nitrate | Merck | 7631-99-4 | NaNO3 |
| Sodium sulphate | Carl Roth | 7757-82-6 | Na2SO4 |
| Strontium chloride hexahydrate | Carl Roth | 10025-70-4 | SrCl2 · 6 H2O |
| Thiamine hydrochloride | Merck | 67-03-8 | C12H17ClN4OS · HCl |
| TRIS | Carl Roth | 77-86-1 | C4H11NO3 |
| Ultrasonic device UP100H with sonotrode MS3 | Hielscher Ultrasound Technology | UP100H | |
| Ultraturrax Silent Crusher M | Heidolph Instruments | homogenizer | |
| Urea | Carl Roth | 57-13-6 | CH4N2O |
| Vitamin B12 | Sigma | 68-19-9 | C63H88CoN14O14P |
| Vitamin solution | 0.3 µM thiamin-HCl, 2.1 nM biotin, 0.37 nM cyanocobalamin | ||
| Water Stills, Water treatment | VEOLIA water technologies | ELGA_21001 | |
| Zinc sulphate heptahydrate | Sigma | 7446-20-0 | ZnSO4 · 7 H2O |
| software, URL | |||
| gatb-minia program for DNA assembly | https://github.com/GATB/gatb-minia-pipeline | makes large scaffolds from short DNA reads, Linux based | |
| ImageJ | software for immage processing (pixel intensities, circle diameter) | ||
| RAST annotation server | https://rast.nmpdr.org | input: genome DNA sequence, detects open reading frames, lists protein sequences and their functions | |
| Culture media | |||
| Artificial seawater | 0.41 M NaCl , 53 mM MgCl2,28 mM Na2SO4, 10 mM CaCl2 , 9 mM KCl , 2.4 mM NaHCO3 ,0.84 mM KBr, 0.49 mM H3BO3, 90 µM SrCl2, 72 µM NaF | ||
| f/2 -liquid medium | artificial seawater, 0.1 % (v/v) trace element solution, 0.05 % (v/v) vitamin solution, 0.88 mM NaNO3, 36 µM NaH2PO4 | ||
| f/2+ liquid medium | f/2-medium, with 10 times increased NaNO3 and NaH2PO4 (0.88 mM NaNO3, 36 µM NaH2PO4 | ||
| f/2+-agar | 3 % (w/v) bacto agar, artificial seawater, 0.1 % (v/v) trace element solution, 0.05 % (v/v) vitamin solution ,8.8 mM NaNO3, 0.36 mM NaH2PO4 | ||
| f/2-agar | 3 % (w/v) bacto agar, artificial seawater, 0.1 % (v/v) trace element solution, 0.05 % (v/v) vitamin solution ,0.88 mM NaNO3, 36 µM NaH2PO4 | ||
| Trace element solution | 0.36 mM NaH2PO4, 12 µM Na2EDTA, 39 nM CuSO4, 26 nM Na2MoO4 , 77 nM ZnSO4, 42 nM CoCl2, 0.91 µM MnCl2 | ||
| Vitamin solution | 0.3 µM thiamin-HCl, 2.1 nM biotin, 0.37 nM cyanocobalamin |
References
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