Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Естественная трансформация, экспрессия белка и криоконсервация нитевидной цианобактерии Phormidium lacuna

Published: February 1, 2022 doi: 10.3791/63470
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 2, 3, 3, 1
1Botanical Institute, Karlsruhe Institute of Technology KIT, 2Institute for Biological Interfaces 5 (IBG 5), Karlsruhe Institute of Technology KIT, 3Institut für Technische Mikrobiologie, Hochschule Mannheim

Summary

Phormidium lacuna представляет собой нитевидную цианобактерию, которая была выделена из морских скальных бассейнов. В данной статье описывается выделение нитей из природных источников, экстракция ДНК, секвенирование генома, естественная трансформация, экспрессия sfGFP, криоконсервация и методы подвижности.

Abstract

Цианобактерии находятся в центре внимания фундаментальных исследований и биотехнологических проектов, в которых солнечная энергия используется для производства биомассы. Phormidium lacuna представляет собой недавно выделенную нитевидную цианобактерию. В этой статье описывается, как новые нитевидные цианобактерии могут быть выделены из морских скальных бассейнов. В нем также описывается, как ДНК может быть извлечена из нитей и как геномы могут быть секвенированы. Хотя трансформация устанавливается для многих одноклеточных видов, она реже регистрируется для нитевидных цианобактерий. Здесь описан упрощенный метод естественного превращения P. lacuna. P. lacuna является единственным членом отряда Oscillatoriales, для которого установлена естественная трансформация. В этой статье также показано, как естественная трансформация используется для экспрессии суперпапки зеленого флуоресцентного белка (sfGFP). Эндогенный промотор cpcB индуцировал примерно в 5 раз более сильную экспрессию, чем промоторы cpc560, A2813 или psbA2 от Synechocystis sp. PCC6803. Далее установлен способ криоконсервации P. lacuna и Synechocystis sp.CPP 6803, описаны методы оценки подвижности в жидкой среде и на агаровой и пластической поверхностях.

Introduction

Цианобактерии являются прокариотическими организмами, которые используют фотосинтез в качестве источника энергии 1,2. Исследования все больше фокусируются на видах цианобактерий. Несколько цианобактерий могут быть преобразованы с помощью ДНК3. Гены могут быть выбиты или переэкспрессированы у этих видов. Тем не менее, трансформация ограничена несколькими видами 4,5,6,7,8,9,10,11, и может быть трудно установить трансформацию в штаммах из коллекций культур или диких8. Штаммы нитевидных видов Phormidium lacuna (рисунок 1) были выделены из морских скальных бассейнов, в которых условия окружающей среды, такие как концентрации соли или температура, колеблются с течением времени. Эти нитчатые цианобактерии могут быть использованы в качестве модельных организмов для отряда Oscillatoriales12, к которому они принадлежат.

В ходе испытаний, тестирующих перенос генов электропорацией13,14, было установлено, что P. lacuna может быть преобразована естественной трансформацией15. В этом процессе ДНК естественным образом поглощается некоторыми клетками. По сравнению с другими методами преобразования 16,17, естественное преобразование имеет то преимущество, что не требует дополнительных инструментов, которые могли бы усложнить процедуру. Например, электропорация требует правильных кювет, неповрежденных проводов и выбора правильного напряжения. P. lacuna в настоящее время является единственным членом Oscillatoriales, восприимчивым к естественной трансформации. Поскольку оригинальный протокол основан на протоколах электропорации, он по-прежнему включал в себя несколько этапов промывки, которые могут быть ненужными. Различные подходы были протестированы для упрощения протокола, что привело к протоколу преобразования, представленному здесь.

Последовательность генома необходима для дальнейших молекулярных исследований, основанных на нокауте гена или сверхэкспрессии. Хотя последовательности генома могут быть получены с помощью машин секвенирования следующего поколения в течение коротких периодов времени, извлечение ДНК может быть затруднено и зависит от вида. С P. lacuna было протестировано несколько протоколов. Затем был установлен модифицированный метод на основе цетилтриметиламммония бромида (CTAB), что привело к приемлемой чистоте ДНК и выходам ДНК каждого цикла очистки для продолжения работы в лаборатории. Геном пяти штаммов может быть секвенирован с помощью этого протокола. Следующим логическим этапом трансформации было установление экспрессии белка в P. lacuna.

SfGFP, используемый в качестве маркерного белка в этом протоколе, может быть обнаружен с помощью любого флуоресцентного микроскопа. Все промоторы, которые были протестированы, могут быть использованы для экспрессии P. lacuna sfGFP. Увеличение числа штаммов, возникающих в результате трансформации, привело к необходимости метода хранения культур. Такие методы установлены для кишечной палочки и многих других бактерий18. В стандартных протоколах глицериновые культуры готовят, переносят в жидкий азот и хранят при -80 °C. Этот метод требует всего нескольких шагов и является высоконадежным для тех видов, для которых он установлен. Стандартный протокол был неосуществим для P. lacuna, поскольку живые клетки не могли быть восстановлены во всех случаях. Однако, когда глицерин был удален после оттаивания, клетки всех испытаний выжили. Представлены простые методы анализа подвижности P. lacuna, которые можно комбинировать с нокаутным мутагенезом для исследования пили IV типа или роли фоторецепторов. Эти анализы отличаются от анализов одноклеточных цианобактерий 19,20,21 и также могут быть полезны для других Осцилляторий.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Изоляция от природной среды

ПРИМЕЧАНИЕ: Зеленые водоросли, диатомовые водоросли, нитчатые цианобактерии и другие микроводоросли могут быть выделены. Протокол может быть использован для любых видов микроводорослей из скальных бассейнов, растущих в лабораторных условиях. Нитевидные цианобактерии, принадлежащие к Oscillatoriales, можно легко узнать по их движению и нитевидной форме. Вид может быть идентифицирован в получистом состоянии путем секвенирования генома или секвенирования 16S рРНК.

  1. Передавайте образцы жидкой морской воды из морских скальных бассейнов (т.е. полостей на скалистом побережье) в колбы по 50 мл. Для каждой колбы обратите внимание на точное место или координаты природного источника. Если возможно, отфильтруйте содержимое через сети 50 мкм, чтобы уменьшить количество зоопланктона. Храните образцы при температуре 4 °C до тех пор, пока они не станут субкультурными.
  2. Переложить 1 мл культур на 10 см чашки Петри, содержащие 3% бакто-агара в f/2 среде22,23 (см. Таблицу материалов). Подготовьте до 20 тарелок. Культивируют при белом свете 50 мкмоль м-2 с-1.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для выращивания может использоваться более высокая интенсивность света. Интенсивность до 400 мкмоль m-2 s-1 может быть использована для P. lacuna, хотя другие виды могут быть более светочувствительными.
  3. Через неделю перенесите нужные клетки на свежие агаровые пластины с помощью стерильных щипцов. Изолируйте клетки под бинокулярным микроскопом в стерильных условиях. Храните старую агаровую пластину при 4 °C до тех пор, пока клетки не появятся и не вырастут на новой агаровой пластине.
  4. Повторяйте этот шаг переноса каждую неделю, чтобы устранить загрязнение. Используйте невооруженный глаз для обнаружения сильного загрязнения и микроскоп с 400-кратным увеличением для дополнительных проверок на загрязнение.
  5. Если образец кажется свободным от загрязнения, проверьте бактериальное или грибковое загрязнение на агаровых пластинах. Переложите часть культуры с помощью прививочной петли на агаровую пластину LB24 (диаметром 10 см), держите пластину при комнатной температуре и проверяйте рост загрязнений в течение 1-3 дней.
  6. Если получен стерильный нитевидный вид цианобактерий, используют его для дальнейшей культуральной работы. Культивировать P. lacuna в жидкости или на бакто-агаровых пластинах. Используйте колбы объемом 250 мл с 50 мл среды f/2 или среды f/2+ для жидкой культуры.

2. Извлечение ДНК

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод принят из 25 26

  1. Приготовьте две колбы с 50 мл среды f/2. Инокулируют каждый ~ 1 мл нитей P. lacuna из других растущих культур. Хранить культуры в течение 7 дней или дольше при перемешивании (горизонтальном вращении) при 50 об/мин при белом свете (50 мкмоль м-2 с-1) при 25 °C.
  2. Обработайте культуру ультразвуком (см. Таблицу материалов) в течение 2 мин с полной энергией. Измерение OD при 750 нм; Проверьте, чтобы он был ~0,5. Продолжайте выращивать культуры, если ОД слишком низкая.
  3. Соберите нити накаливания по 5000 × г, центрифугирование 20 мин. Удалите супернатант. Перенесите нити с остаточной жидкостью в камеру френч-пресса27. Установите давление френч-пресса на 20 000 фунтов на квадратный дюйм и извлеките ячейки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Французская пресса будет лизировать все клетки и высвобождать ДНК; сильные силы сдвига будут производить 1 500 фрагментов ДНК bp.
  4. Центрифугируйте образец в течение 10 мин при 10 000 × г и удалите супернатант.
  5. Добавьте к грануле 400 мкл лизизного буфера (4 М мочевины, 0,1 М Трис/Cl, рН 7,4) и 50 мкл протеиназы К (10 мг/мл). Нагревайте образец до 55 °C в течение 60 мин с встряхиванием при 550 об/мин.
  6. Добавьте 1 мл буфера экстракции ДНК (3% CTAB, 1,4 M NaCl, 10 мМ ЭДТА, 0,1 М Трис/Cl, 1% Саркозил, 0,1 М DTT, рН 8) и инкубируйте в течение 60 мин при 55 °C и 550 об/мин. Переложите растворы в центрифугирующие трубки и добавьте два объема хлороформа/изоамилового спирта (24/1).
  7. После встряхивания центрифугируют образец в течение 5 мин при 9000 × г. Переведите верхнюю, водную фазу во флаконы реакции и добавьте 1 мл ледяного этанола и 50 мкл 3 М ацетата натрия.
  8. Вихрьте образец и поместите его при -20 °C в течение 1 ч или дольше.
  9. Центрифугу в течение 5 мин при 10 000 × г (4 °C) и выбросьте супернатант. Промыть гранулу 70% этанолом.
  10. Снова центрифугируйте образец. Удалите супернатант и высушите гранулы в течение ночи. Растворите ДНК в воде, свободной от нуклеаз. Измерьте спектр ДНК, чтобы проверить, находится ли OD 260 нм / OD 280 нм между 1,6 и 1,9.
  11. Проанализируйте размер ДНК на агарозном электрофорезном геле28.
  12. Секвенировать геномную ДНК путем секвенирования следующего поколения в течение 300 циклов с парной настройкой и длиной считывания 150 оснований (см. Таблицы материалов).
  13. Выполнить сборку с помощью соответствующей компьютерной программы; см. пример, приведенный в Таблице материалов.
  14. Отправьте проект генома на сервер RAST для аннотации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Загрузите последовательности ДНК, чтобы получить полную аннотацию в течение нескольких минут.

3. Естественная трансформация и выражение GFP

ПРИМЕЧАНИЕ: Трансформация основана на плазмидном векторе, распространяемом в E. coli; pGEM-T или pUC19 могут использоваться в качестве магистральных векторов. Методы клонирования внедрены во многих лабораториях; см. также стандартные протоколы28 и статьи о векторах трансформации для P. lacuna15,29. Примеры векторов для выражения sfGFP описаны в разделе репрезентативных результатов. Подробная информация о четырех еще не опубликованных векторах приведена в дополнительном файле 1.

  1. Выполняйте все этапы с использованием стерильного материала в стерильных лабораторных условиях (чистый стенд, стерильная стеклянная посуда).
  2. Инокулировать 2 х 50 мл жидкой среды f/2 в две колбы по 250 мл 2 х 1 мл нитей P. lacuna из бегущей культуры. Культивируют в белом свете (50 мкмоль м-2 с-1) при перемешивании (горизонтальное вращение, 50 об/мин) в течение ~5 суток при 25 °C.
  3. Подготовьте ~200 мкг ДНК вектора трансформации с помощью набора midi prep (см. Таблицу материалов) в соответствии с инструкциями производителя.
  4. Гомогенизировать 100 мл суспензии клеток P. lacuna (см. Таблицу материалов) при 10 000 об/мин в течение 3 мин. Измерьте OD при 750 нм (желаемое значение = 0,35).
  5. Центрифугируют клеточную суспензию в течение 15 мин при 6000 × г. Удалите супернатант и суспендируйте гранулу в 800 мкл (общий объем, включая остаточную жидкость и нити) оставшейся жидкости и дополнительной среды f/2+ .
  6. Возьмите восемь f/2+ бакто-агаровых пластин (диаметр 10 см), содержащих 120 мкг/мл канамицина. Пипетка 10 мкг ДНК в середину каждой агаровой пластины. Сразу же пипетка 100 мкл клеточной суспензии попадает в середину каждой агаровой пластины (поверх ДНК).
  7. Держите агаровую пластину без крышки на чистой скамье, чтобы дать лишней жидкости испариться. Закройте тарелку и культивируйте ее при белом свете при 25 °C в течение 2 дней.
  8. Распределите нити каждой агаровой пластины с помощью петли инокуляции на несколько свежих f/2+ бакто-агаровых пластин, содержащих 120 мкг/мл канамицина. Культивируйте пластины в белом свете при 25 °C и регулярно проверяйте культуры под микроскопом.
  9. Выявляют живые, трансформированные нити через 7-28 дней под микроскопом. Ищите здоровые зеленые нити (рисунок 2), которые отличаются от других нитей. Если эти зеленые нити могут быть идентифицированы, перейдите к следующему шагу; в противном случае держите тарелку еще 7 дней.
  10. Используйте щипцы для переноса этих идентифицированных живых нитей в 50 мл жидкой среды f/2+ с 250 мкг/мл канамицина. Культивируйте в белом свете при 25 °C на шейкере (горизонтальное вращение, 50 об/мин). Наблюдайте за ростом до четырех недель.
  11. Перенесите нити обратно в агаровую среду, содержащую 250 мкг/мл канамицина, и дождитесь роста нитей. Через несколько дней переносят одиночные нити на свежую агаровую пластину с более высокой концентрацией канамицина, например, 500 мкг/мл. Сохраните оригинальную пластину.
  12. Убедитесь, что нити размножаются в высокой концентрации канамицина в жидкой культуре или на агаре. Снова увеличьте концентрацию канамицина, чтобы ускорить сегрегацию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Трансформированная P. lacuna вырастает до 10 000 мкг/мл канамицина. Другие виды могут не переносить такие высокие концентрации.
  13. Если резистентные клетки выращиваются и широко распределяются по пластине, протестируйте интеграцию вставки в геном P. lacuna , выполнив ПЦР с внешними и внутренними праймерами.
    1. Используйте грунтовки, которые были предназначены для клонирования вставки в качестве внутренних грунтовок.
    2. Для проектирования внешних праймеров выбирают последовательности, которые составляют 5' и 3' предполагаемого места вставки в геноме P. lacuna , но вне вставки.
    3. Для реакций ПЦР используйте внутренние праймеры и наружные праймеры. Используйте устойчивые штаммы и дикий тип.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Внутренние грунтовки указывают на то, что вставка присутствует; внешние грунтовки показывают, что вставка вставлена в правильный локус.
  14. Для каждой реакции ПЦР поместите ~ 10 мг нитей непосредственно в пробирки ПЦР и выполните ПЦР в соответствии со стандартными протоколами24. Если продукт не получен, измените температуру отжига и промойте нити водой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В ПЦР может быть использовано много различных полимераз. Стандартные полимеразы, такие как Taq-полимераза, имеют более высокую частоту ошибок, чем полимеразы, проверяющие ошибки, которые стоят дороже. Эта аналитическая ПЦР не требует какой-либо полимеразы с проверкой ошибок. Тем не менее, полимераза, проверяющая ошибки, должна быть проверена, если продукт ПЦР не получен со стандартной полимеразой.
  15. Анализ продуктов ПЦР резистентной линии на агарозномэлектрофорезе 24.
    1. Сравните положения полосы с маркером и сравните дикий тип и трансформант. С внутренней и внешней грунтовками ищите большую полосу для трансформанта, чем дикий тип (из-за вставки кассеты сопротивления) или две полосы для трансформанта: одну с размером полосы дикого типа и большую. Поскольку последний случай указывает на неполную сегрегацию, продолжают культивирование с высокими концентрациями канамицина.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения более подробной информации о ПЦР и электрофорезе см.15,24 или другую стандартную литературу.
  16. Для экспрессии GFP: наблюдать одиночные нити с помощью флуоресцентного микроскопа (см. Таблицу материалов) при увеличении поставленной цели в 40x или 63x. Захват изображения яркого поля и флуоресцентного изображения. Используйте следующие настройки для GFP: полоса пропускания 470 нм для возбуждения, полоса пропускания 525 нм для излучения и разветвитель пучка 495 нм, начальное время экспозиции 500 мс.
  17. Отрегулируйте время экспозиции для четких флуоресцентных сигналов, избегая интенсивности насыщения. Попробуйте использовать один и тот же параметр для всех примеров.
  18. Поскольку нити дикого типа также будут отображать флуоресценцию, захватывайте изображения с теми же настройками, что и выше для этой фоновой флуоресценции.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Штамм, экспрессирующий GFP, должен иметь более высокий сигнал; в противном случае он не выражает GFP.
  19. Основываясь на времени экспозиции и интенсивности пикселей флуоресцентных изображений, рассчитайте и сравните содержание GFP в различных нитях.

4. Криоконсервация

ПРИМЕЧАНИЕ: P. lacuna и одноклеточные цианобактерии Synechocystis sp. Используются PCC 6803. Настоящий метод лучше работает для P. lacuna.

  1. Культивируют P. lacuna или Synechocystissp PCC 6803 в течение не менее 10 дней в 10 мл среды f/2+ или BG-11, соответственно, при белом свете (50 мкмоль m-2 s-1) при 25 °C при перемешивании (горизонтальные вращения, 50 об/мин).
  2. Гомогенизировать культуру P. lacuna (см. Таблицу материалов) при 10 000 об/мин в течение 3 мин или ультразвуковым аппаратом (см. Таблицу материалов) в течение 2 мин при полной энергии. Определите OD 750 нм любого языка и региональных параметров, чтобы проверить, находится ли значение в диапазоне от 1 до 7.
  3. Собирают клетки центрифугированием при 6000 × г в течение 15 мин. Удалите супернатант.
  4. Суспендировать ячейку гранулы в 800 мкл среды f/2+ или BG-11 (конечный объем) и перевести в криовиал 2 мл. Добавьте 800 мкл 50% раствора глицерина в клеточную суспензию. Закройте флакон и перемешайте путем повторного инвертирования.
  5. Переведите криовиал в жидкий азот и храните его в криобоксе в морозильной камере при температуре -80 °C. Обратите внимание на положение коробки внутри морозильной камеры и координаты образца внутри коробки.
  6. Для восстановления клеток выньте криовиальную и разморозьте содержимое при комнатной температуре. Перенесите содержимое в реакционную трубку объемом 2 мл.
  7. Дважды вымойте образец. Для1-й промывки центрифугу на 6000 × г в течение 5 мин. Удалите супернатант и повторно суспендируйте гранулу в 2 мл среды f/2+ или BG-11. Для2-й промывки рестрифугируют при 6000 × г в течение 5 мин, удаляют надосадочное вещество и суспендируют гранулу в 2 мл среды f/2+ или BG-11.
  8. Чтобы проверить целостность этих клеток, готовых к культивированию, перекладывают гранулы в 9 мл среды и культивируют их в белом свете (50 мкмоль м-2 с-1) при перемешивании (55 об/мин). Сравните OD 750 нм культуры в первый день и через 1 неделю.

5. Подвижность лакуны Phormidium

ПРИМЕЧАНИЕ: Будут описаны три различных анализа. Во всех случаях используется один и тот же язык и региональные параметры.

  1. Культивируют P. lacuna в среде f/2 при горизонтальном перемешивании (50 об/мин) в белом свете (50 мкмоль m-2 s-1) в течение ~5 дней, пока расчетный OD 750 нм не составит 0,35. Храните образец при температуре 4 °C до использования.
  2. Гомогенизировать нити накаливания (см. Таблицу материалов) при 10 000 об/мин в течение 3 мин или ультразвуком (см. Таблицу материалов) в течение 1 мин при максимальной мощности и цикле 1. Измерение OD 750 нм. Если выше 0,35, разбавьте фракцию средой f/2. Используйте это решение в анализах подвижности на шагах 5.3, 5.4 и 5.5.
  3. Анализ на движение в жидкой среде
    1. Для непосредственного наблюдения за подвижностью переложите 8 мл среды, содержащей P. lacuna (со стадии 5.2), в чашку Петри 6 см. Подождите несколько минут, пока образец не достигнет комнатной температуры. Накройте чашку Петри целлофановой фольгой.
    2. Поместите слайд микроскопа на стол x-y стандартного микроскопа с камерой. Включите свет микроскопа. В идеале всегда используйте одни и те же электрические и оптические настройки для освещения. Переместите 4-кратный или 10-кратный объектив на траекторию света.
    3. Поместите чашку Петри на горку. Отрегулируйте одиночные нити или пучки нитей по движениям x, y и z стола.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за трехмерного расположения только часть соответствующего раздела может быть в фокусе. Целлофановая фольга позволяет регулировать фокус без ограничений.
    4. Наблюдайте за движениями одиночных нитей или пучков. Убедитесь, что объектив не касается жидкости. Записывайте движения нитей с помощью стандартной камеры микроскопа (см. Дополнительное видео S1).
  4. Анализ на движение по поверхности
    1. Для наблюдения подвижности нитей на поверхностях агара готовят чашки Петри 6 см с f/2 бакто-агаром. Убедитесь, что агар достаточно высок, чтобы объектив приблизился к поверхности агара. В качестве альтернативы, подготовьте слой агара толщиной ~ 3 мм и запишите нити через агар (держите пластину вверх ногами или используйте перевернутый микроскоп).
    2. Пипетка 0,5 мл раствора, содержащего P. lacuna (из стадии 5.2) на бактоагаровую поверхность чашки Петри размером 6 см. Позвольте жидкости проникнуть на поверхность. Закройте чашку Петри и наблюдайте за движением нитей на поверхности с помощью объектива 4x или 10x.
    3. Убедитесь, что одни и те же электрические и оптические настройки микроскопа используются на протяжении всей записи и в последующих записях.
    4. Снимайте покадровые записи с помощью глазной камеры и миникомпьютерной системы. Убедитесь, что временной интервал между последующими изображениями составляет 5 с-1 мин. Запрограммируйте Linux-скрипт миникомпьютера для управления покадровой записью. См. Дополнительный файл 2 для примера сценария и Дополнительное видео S2 в качестве примера.
  5. Анализ на фототаксис
    1. Для экспериментов с фототаксисом подготовьте светодиодные (LED) держатели (здесь, с помощью 3D-принтера), в которые смонтированы выбранные 5 мм светодиоды для облучения площади 20мм2 снизу вверх (рисунок 3). При необходимости используйте несколько светодиодных держателей параллельно, подключая каждый светодиод электрически через резистор и потенциометр к регулируемому источнику питания. Измерьте и отрегулируйте интенсивность светодиодов в зависимости от эксперимента. Убедитесь, что вся обстановка находится в темной комнате или закрытом темном контейнере.
    2. Поместите 8 мл среды, содержащей P. lacuna (из стадии 5.2), в чашку Петри 6 см. Отрегулируйте интенсивность света светодиода. Закройте чашку Петри крышкой и поместите ее на светодиодный держатель так, чтобы светодиод находился в центре чашки Петри.
    3. По истечении желаемой продолжительности (обычно 2 дня) сделайте снимок чашки Петри с помощью камеры смартфона, направленной непосредственно на положение световой обработки. Используйте белую светодиодную панель для облучения образца. Используйте ручные настройки камеры; избегать отражений света; всегда корректируйте, чтобы получить одинаковое расстояние между объективом камеры и образцом. Убедитесь, что настройки экспозиции дают изображение, пригодное для последующего анализа с помощью ImageJ.
    4. Количественно оцените диаметр центрального круга нитей с помощью программного обеспечения ImageJ.
      1. Откройте ImageJ, нажмите на файл | Откройте, выберите нужный файл и нажмите кнопку Ввод.
      2. Нажмите кнопку Прямая (с прямой линией). Нажмите левую кнопку мыши, чтобы провести линию от одного конца чашки Петри до противоположного конца. Убедитесь, что линия проходит через центр круга нитей.
      3. Нажмите Ctrl+K на клавиатуре или нажмите кнопку Анализировать | Профиль печати в меню ImageJ. Найдите окно x-y с интенсивностью пикселей по сравнению с расстоянием - 1D-профиль чашки Петри. Убедитесь, что самая низкая интенсивность пикселей немного выше 0, а самое высокое значение ниже 255.
      4. Оцените среднее значение интенсивности пикселей за пределами круга и другое среднее значение интенсивности пикселей в круге. В положении y между этими значениями оцените значения x обеих сторон круга, наведя указатель мыши на эти позиции. Запишите оба значения и рассчитайте разницу.
      5. Получите наибольшее значение x, наведя указатель мыши на ось Y справа. Обратите внимание, что это значение e представляет диаметр чашки Петри. Если этот диаметр составляет 5 см, рассчитайте диаметр центрального круга нити накала как d/e × 5 см.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Следуя вышеупомянутым методам, 5 различных штаммов P. lacuna были выделены из скальных бассейнов и секвенированы (рисунок 1 и таблица 1). Все культуры были стерильными после ~ 1 года субкультуры, за исключением P. lacuna HE10JO. Этот штамм все еще загрязнен Marivirga atlantica, морской бактерией. Во время последующих экскурсий по Гельголанду из скальных бассейнов были выделены другие нитевидные цианобактерии, которые отличаются от P. lacuna и нуждаются в характеристике.

Несколько методов экстракции и очистки ДНК были протестированы на P. lacuna. Наилучшие результаты были получены с помощью оптимизированного метода CTAB, как описано выше. Выход ДНК составлял 310 ± 50 мкг/мл, OD 260 нм/OD 280 нм составлял 1,7 ± 0,03, а OD 260 нм/OD 230 нм составлял 0,78 ± 0,04 (n = 17). Секвенирование генома показало, что ДНК всех штаммов немного отличалась, как и ожидалось (таблица 1). Основные белковые последовательности показали максимальную разницу в 0,04% (таблица 2). Хотя все черновые геномы были неполными, можно предположить, что >98% генома HE10JO30 был секвенирован. Эта оценка основана на количестве неполных открытых кадров считывания. Частичные белковые последовательности могут быть легко идентифицированы после аннотации RAST HE10DO и HE10JO. В HE10JO 60 белков из ~4,500 имели отсутствующую N- или C-концевую последовательность. Последовательности генома можно найти в дополнении (Дополнительный файл 3, Дополнительный файл 4, Дополнительный файл 5, Дополнительный файл 6 и Дополнительный файл 7).

Интересно, что штаммы одного и того же вида были выделены с двух островов, Гельголанда и Джильо. Линейное расстояние между обоими островами составляет 1 400 км. Между обоими местами должна быть связь, например, судами по морю или, что более вероятно, перелетными птицами. Многие виды птиц можно найти на обоих островах, и многие из них являются перелетными птицами. Разнообразие в пределах штаммов P. lacuna одного острова было больше, чем между ближайшими штаммами Гельголанда и Джильо (таблица 2). Это указывает на интенсивный обмен между обоими местами.

Естественное превращение было протестировано с HE10DO в качестве основного штамма и с HE10JO. Настоящий протокол является более простым, чем протокол, описанный ранее12 , из-за уменьшенного количества этапов промывки и меньшего количества этапов передачи после преобразования. Этот новый метод постоянно используется в лаборатории; было достигнуто ~15 успешных преобразований.

Кассету сопротивления KanR обычно интегрировали в гомологичный участок, определенный соседними областями, как показано ПЦР с использованием внутренних и наружных праймеров. Как и большинство цианобактерий, P. lacuna является полиплоидной. Он может иметь более 100 хромосом на клетку12. ПЦР-тест с наружными праймерами ~ через 1 неделю после трансформации обычно имеет 2 полосы на геле электрофореза, одну с размером полосы дикого типа и одну более медленную мигрирующую полосу, которая указывает на вставку кассеты сопротивления (рисунок 4). Двойная полоса указывает на то, что только субфракция хромосом содержит вставку. После 4 недель отбора на канамицине сегрегация обычно полная, и на гелях появляется только одна большая полоса ПЦР. Однако в случае трансформации с pMH1 (см. ниже) сегрегация была завершена более чем через 3 месяца.

Векторы pAK1, pAK2, pAK3 и pMH1 были построены для тестов на экспрессию sfGFP. В pAK1, pAK2 и pAK3 ген sfGFP находится под контролем промоторов cpc560, A2813 и psbA2 соответственно. Эти промоутеры от Synechocystis sp. PCC 6803 или Synechococcus sp. PCC 700231. Для построения этих векторов промоторные и терминаторные последовательности sfGFP были взяты из векторов, используемых для преобразования Synechococcus sp. PCC 700231. Соответствующие последовательности интегрировали в гомологичный chwA (sc_7_37) сайт pFN1 (или pFN_7_37_KanR15). Вектор экспрессии pMH1 был построен путем синтеза ДНК с использованием последовательностей P. lacuna в качестве шаблонов (Дополнительный файл 6). Последовательности cpcB-cpcA (фикоцианин ß и фикоцианин α) P. lacuna последовательно расположены. Межгенная область 100 bp разделяет обе кодирующие области. Синтетическая последовательность содержала эту эндогенную последовательность cpcB-cpcA и промотор cpcB. Кассета sfGFP и KanR размещается всего в 3' кодона остановки cpcB (5' cpcA). Вся синтетическая последовательность с промотором cpcB, cpcB, sfGFP, KanR, cpcA (от 5' до 3') клонируется в pUC19. Карта показана на рисунке 5. Более подробная информация о клонировании pAK1, pAK2 и pAK3 и полной последовательности pMH1 приведена в дополнительном файле 1.

Все 4 трансформанта (с pAK1, pAK2, pAK3 и pMH1) экспрессируют GFP; все уровни флуоресценции были выше фоновой флуоресценции нитей дикого типа (рисунок 6). Трансфоранты pMH1 с неполной сегрегацией выявили сигнал GFP, который был очень изменчив между нитями. Флуоресцентный сигнал распределялся равномерно, когда сегрегация была завершена (рисунок 6E). Сигналы микроскопа трансформантов pAK1, pAK2 и pAK3 были похожи, но ~5 раз слабее, чем у pMH1 (рисунок 6E).

Установленный метод криоконсервации основан на методе, который был установлен для E. coli. Когда были выполнены 2 шага промывки для удаления глицерина после оттаивания, 15 из 15 образцов P. lacuna выжили (таблица 3). Этот протокол также может быть использован для Synechocystis PCC 6803, но только с 2 шагами стирки, а не с 1 (таблица 3).

Еще одной особенностью нитей Oscillatoriales является их подвижность: нити P. lacuna непрерывно перемещаются по поверхностям (рисунок 7) и в жидкой среде (рисунок 8). Оба вида движения могут быть легко изучены в чашках Петри без или с агаровой средой. Покадровая запись необходима, потому что движение на агаре медленное. Нити накала движутся к световому конусу, если световой луч идет снизу (рисунок 3). Влияние интенсивности света, длины волны и времени можно легко изучить с помощью простой настройки. Фоторецепторы этого эффекта пока не ясны. Возможные кандидаты могут быть адресованы нокаутирующими мутантами. Механизм, лежащий в основе того, как нити находят свет, также неясен. Для этого вопроса требуется инфракрасная система для записи нитей во время их движения от тьмы к свету.

Figure 1
Рисунок 1: Штаммы лакуны Phormidium, собранные у Гельголанда и Джильо. Нити размножают в течение 11 дней на f/2 агаре в чашках Петри по 6 см. (А) штамм GI08AO; (B) штамм GI08IO; (C) штамм GI09CO; (D) штамм HE10DO; (E) штамм HE10JO; (F) штамм HE15M2G1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Нити лакуна Phormidium через 5 недель после трансформации. Использован вектор выражения sfGFP pMH1; отбор происходил на среде f/2+ со 120 мкг/мл канамицина. Зеленоватые нити устойчивы и живы; другие нити погибли. Шкала = 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Эксперимент с фототаксисом. Слева: светодиодный держатель с 4 красными светодиодами, подключенный к регулируемому источнику питания. Поверх каждого светодиода есть чашка Петри 6 см с 8 мл культуры лакуны Phormidium . Справа: чашка Петри с лакуной P. через 2 дня на красном светодиоде (15 мкмоль м-2 с-1). Аббревиатура: LED = светодиод. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Интеграция и сегрегация вставки после трансформации лакуна Phormidium с pAK1. ПЦР с наружными праймерами. Ожидаемые размеры изделия без и со вставкой составляют 2371 и 5016 bp соответственно. Левая полоса: маркер, полосы 1, 2, 3, 4: продукты ПЦР нитей через 7 дней, 11 дней, 14 дней и 17 дней после выделения резистентной нити накаливания (через 4 недели после трансформации) соответственно. Направление 5: ПЦР-препарат дикого типа (из другого геля). В 7-дневном образце вставка присутствует в небольшой части хромосом. Эта доля увеличивается до 17 дней, когда не видна полоса дикого типа, т. е. сегрегация полна. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Вектор для экспрессии sfGFP под контролем эндогенного промотора cpcB . Оранжевый: гомологичная последовательность лакуна Phormidium , фиолетовый/синий: векторная основа pUC-19, зеленый: вставка с sfGFP и KanR. Сокращения: sfGFP = суперпапка зеленого флуоресцентного белка; KanR = резистентность к канамицину. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 6
Рисунок 6: Экспрессия sfGFP в лакуне Phormidum. Флуоресцентные изображения нитей дикого типа P. lacuna (A) и после трансформации с pAK1 (B), pAK2 (C), pAK3 (D) и pMH1 (E). В pMH1 ген sfGFP помещается в 3' гена фикоцианина ß и, следовательно, управляется эндогенным промотором cpcß ; в других случаях sfGFP управляется промоторами cpc560, A2813 или psbA2s от Synechocystis PCC 6803 соответственно. Настройки флуоресценции специфичны для GFP; все изображения были записаны с одинаковым временем интеграции и оптическими настройками. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 7
Рисунок 7: Объединенное изображение лакуна Phormidium на поверхности агара при 4-кратном увеличении. Первое изображение представлено красным цветом, второе (сделанное через 1 мин) зеленым. Обратите внимание также на следы на агаре. Шкала = 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 8
Рисунок 8: Объединенное изображение лакуна Phormidium в жидкой среде. Временной интервал между обоими изображениями составлял 10 с. Первое изображение напечатано красным цветом; второй напечатан зеленым цветом. Сравнение обоих цветов показывает движение в течение 10 с. Шкала = 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

напряжение ХЕ10ДЖО ХЕ10ДО ГИ08АО ГИ09КО ХЕ15М2Г1
Контигс 104 174 218 102 154
общий bp 48,19,017 47,88,491 47,78,775 36,69,922 45,98,395

Таблица 1: Штаммы лакуна Phormidium.

Ги09КО ХЕ10ДО ХЕ10ДЖО ХЕ15М2Г1
Ги08АО 42 40 0 42
Ги09КО 2 42 0
ХЕ10ДО 40 2
ХЕ10ДЖО 42

Таблица 2. Аминокислотные различия между штаммами в последовательностях из 20 основных белков с 10 876 аминокислотами.

Плотность ячеек OD 750 нм 1 1 3 3 5 5 7 7
Моет 1 2 1 2 1 2 1 2
Синехоцистис PCC 6803 2/5 5/5 1/4 4/4 0/4 4/4 0/4 3/4
Лакуния формидия ХЕ10ДО 4/4 4/4 4/4 4/4 3/ 4 4/4 3/3 3/3

Таблица 3: Испытания криоконсервации с Synechocystis PCC 6803 и Phormidium lacuna HE10DO цианобактериями. Первое число показывает количество культур, которые выжили после замерзания/оттаивания; второе число показывает общее количество судебных процессов.

Дополнительное видео S1: Перемещение нитей лакуны Phormidium в жидком растворе без замедленной съемки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.

Дополнительное видео S2: Перемещение нитей лакуна Phormidium на поверхности агара с покадровой съемкой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.

Дополнительный файл 1: Клонирование векторов для преобразования лакуна Phormidium. Список векторов преобразования; перечень грунтовок для клонирования; последовательность pMH1 в формате gb. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 2: Скрипты оболочки (sh) для миникомпьютера Raspberry Pi. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 3: Последовательность ДНК HE152G1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 4: Последовательность ДНК GI08AO. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 5: Последовательность ДНК GI09CO. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 6: Последовательность ДНК HE10DO. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 7: Последовательность ДНК HE10JO. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Хотя многие штаммы цианобактерий доступны из коллекций культур 32,33,34,35,36, все еще существует спрос на новые цианобактерии из дикой природы, потому что эти виды адаптированы к конкретным свойствам. P. lacuna была собрана из скальных бассейнов и адаптирована к изменениям концентрации соли и температуры30. Штаммы этого вида были обнаружены во время экскурсий в 2008, 2009 и 2010 годах. С помощью процедуры, описанной здесь, были выделены 5 штаммов P. lacuna, и 4 из этих штаммов были стерильными. Штамм P. lacuna HE10JO постоянно загрязнен бактерией Marivirga atlantica, морской бактерией, идентифицированной с помощью рРНК и секвенирования генома. Эта бактерия не может быть отделена от цианобактерии, несмотря на применение механического разделения, рост при разных температурах, лечение антибиотиками или химическую обработку. Несмотря на загрязнение, P. lacuna HE10JO можно культивировать аналогично другим штаммам. В более поздних экскурсиях были найдены и другие представители Осцилляториалов, которые до сих пор подробно не проанализированы. P. lacuna больше не была найдена. Неясно, почему P. lacuna была выделена в последующие годы и в двух разных местах, но не найдена позже. Его изобилие, безусловно, зависит от непредсказуемых условий. Температура, концентрация соли и неорганические или органические питательные вещества сильно варьируются в каменных бассейнах. Поэтому видовой состав может колебаться с течением времени непредсказуемым образом.

Естественная трансформация устанавливается для различных цианобактерий, в основном одноклеточных видов. Нитевидная P. lacuna является единственным видом отряда Oscillatoriales, для которого установлена естественная трансформация. Преобразование почти всегда было успешным с нынешним протоколом. В целом, количество устойчивых нитей после испытания трансформации значительно варьируется, и иногда трансформация терпит неудачу, что приводит к потере драгоценного времени. Поэтому целесообразно выполнять несколько проектов трансформации параллельно. Время полной сегрегации, обычно через 4 недели после выделения резистентного штамма, также может варьироваться. Поскольку нет гарантии полной сегрегации после роста на канамицине, крайне важно выполнять ПЦР-тесты с использованием наружных и внутренних праймеров.

Каждый вектор должен содержать 2 x 500-1000 bp гомологичных последовательностей, например, усиленных от хозяина ПЦР и прерванных кассетой сопротивления (например, канамициновой кассетой KanR, используемой здесь)37,38. Для выражения между гомологичными последовательностями должны быть клонированы промотор, кодирующая последовательность (например, для sfGFP39), терминатор и кассета сопротивления. Стратегии клонирования являются видоспецифичными и зависят от цели эксперимента.

Этот метод трансформации может быть возможен с другими штаммами Oscillatoriales или другими цианобактериями: естественная трансформация основана на пили iv типа, которые присутствуют почти в каждом другом геноме цианобактерий 3,15,40. Таким образом, настоящий метод может стимулировать новые испытания с другими видами. Поскольку пили iv типа также имеют отношение к моторике, важно проверить наличие условий, при которых цианобактерии подвижны.

Введение генов основано на гомологичной рекомбинации и приводит к нарушению гомологичных участков. Поэтому трансформация часто используется для нокаута генов. Экспрессия вставленного гена будет индуцирована, если активный промотор и кодирующая последовательность интегрированы в гомологичный сайт. У P. lacuna промоторная активность зависела от вида. Промоторы cpc560, A2813 и psbA2 Synechocystis PCC sp 6803 или Synechococcus sp. PCC 7002 31 и промотор cpcB P. lacuna могут стимулировать экспрессию sfGFP . Из этих конструкций эндогенный промотор cpcB индуцировал самую сильную экспрессию, хотя ген sfGFP расположен в 3' гена фикоцианина ß. Это указывает на более общее использование эндогенных промоторов в экспрессии цианобактерий.

Сочетание исследований нокаута генов и движения прольет свет на молекулярные механизмы подвижности и фототаксиса. Светодиодные источники света могут обеспечить свет для экспериментов с фототаксисом. Доступна практически любая длина волны, а интенсивность света может модулироваться регулируемым источником питания и потенциометрами. Светодиодные держатели могут быть изготовлены с помощью 3D-принтеров, чтобы легко реализовать комбинации различных светодиодов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.

Acknowledgments

Работа была поддержана Технологическим институтом Карлсруэ.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Autoclave 3870 ELV Tuttnauer 3870 ELV
Bacto Agar OttoNorwald 214010
BG-11 Freshwater Solution Sigma Aldrich C3061
BG-11 medium Merck 73816-250ML
Boric acid Merck 10043-35-3 H3BO3
Calcium chloride dihydrate Carl Roth 10035-04-8 CaCl2 · 2 H2O
Cell culture flasks Cellstar with filter screw cap, sterile, 250 mL Greiner 658190
Cell culture flasks Cellstar with filter screw cap, sterile, 50 mL Greiner 601975
Centrifuge LYNX 4000 Thermo Scientific 75006580 and rotor
Centrifuge microstar 17 VWR International N/A for up to 13,000 rpm
Cetyltrimethylammonium Bromide (CTAB) PanReac AppliChem 57-09-0 C19H42BrN
Chloroform : Isoamyl Alcohol 24 : 1 PanReac AppliChem
A1935
Cobalt(II) chloride hexahydrate Merck 7791-13-1 CoCl2 · 6 H2O
Copper(II) sulphate pentahydrate Merck 7758-99-8  CuSO4 · 5 H2O
D(+)-Biotin Carl Roth 58-85-5  C10H16N2O3S
DNA ladder 1 kb New England Biolabs N3232
DNA ladder 100 bp New England Biolabs N3231
Electrical pipetting help accujet-pro S Brand GmbH 26360 for pipetting 1-25 mL
Ethanol VWR 64-17-5 C2H6O
Ethylenediamine tetraacetic acid disodium salt dihydrate Carl Roth 6381-92-6 EDTA-Na2 · 2 H2O
Fluorescence microscope ApoTome Zeiss
Fluorescence microscope Axio Imager 2 Zeiss
French Pressure Cell Press American Instrument Company N/A
Gel documation System Saffe Image Invitrogen
Gelelctrophoresis system Mupid-One/-exu ADVANCED
Glassware, different
Glycerol Carl Roth 56-81-5 C3H8O3
Iron(III) chloride hexahydrate Merck 10025-77-1  FeCl3 · 6 H2O
Kanamycin Sigma-Aldrich 25389-94-0
Kanamycin sulphate Carl Roth 25389-94-0 C18H36N4O11 · H2SO4
Lauroylsarcosine, Sodium Salt (Sarcosyl) Sigma Aldrich 137-16-6 C15H28NO3 · Na
LB Broth (Lennox) Carl Roth X964.4
Light source, fluorescent tube L18W/954 daylight OSRAM cultivation of cyanobacteria
Light source, LED panel XL 6500K 140 W Bloom Star N/A cultivation of cyanobacteria, up to 1,000 µmol m-2 s-1
Magnesium chloride hexahydrate Carl Roth 7791-18-6 MgCl2 · 6 H2O
Manganese(II) chloride tetrahydrate Serva 13446-34-9 MnCl2 · 4 H2O
Microscope DM750 Zeiss
Midi prep plasmid extraction kit NucleoBond Xtra Midi kit Macherey-NAGEL GmbH & Co. KG REF740410.50
Minicomputer Raspberry Pi 4 + Conrad Electronics 2138863-YD for time-lapse recording
Ocular camera EC3 Leica for continuous recording up to 30 s
Ocular camera MikrOkular Full HD Bresser for time-lapse recordings, coupled to Raspberry Pi minicomputer
Petri dishes polystyrole, 100 mm x 20 mm Merck P5606-400EA
Petri dishes polystyrole, 60 mm x 15 mm Merck P5481-500EA
Photometer Nanodrop ND-1000 Peqlab Biotechnologie
Photometer Uvikon XS Goebel Instrumentelle Analytik GmbH
Pipetman 100-1,000 µL Gilson SKU: FA10006M
Pipetman 10-100 µL Gilson SKU: FA10004M
Plastic pipettes 10 mL, sterile Greiner 607107
Plastic tube, sterile, 15 mL Greiner 188271
Plastic tube, sterile, 50 mL Greiner 227261
Potassium bromide Carl Roth 7758-02-3 KBr
Potassium chloride Carl Roth 7447-40-7 KCl
Power supply Statron 3252-1 Statron Gerätetechnik GmbH
Power supply Voltcraft PPS 16005 Conrad Electronics for LED
Proteinase K Promega MC500C from Maxwell 16 miRNA Tissue Kit AS1470
Q5 polymerase New England Biolabs M0491S
Sequencing kit NextSeq 500/550 v2.5 Illumina
Sequencing system NextSeq 550 SY-415-1002 Illumina
Shaker Unimax 2010 Heidolph Instruments for cultivation
Sodium acetate Carl Roth 127-09-3 NaCH3COO
Sodium chloride Carl Roth 7647-14-5 NaCl
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate Carl Roth 10049-21-5 NaH2PO4 · H2O
Sodium fluoride Carl Roth 7681-49-4 NaF
Sodium hydrogen carbonate Carl Roth 144-55-8 NaHCO3
Sodium molybdate dihydrate Serva 10102-40-6 Na2MoO4 · 2 H2O
Sodium nitrate Merck 7631-99-4 NaNO3
Sodium sulphate Carl Roth 7757-82-6 Na2SO4
Strontium chloride hexahydrate Carl Roth 10025-70-4 SrCl2 · 6 H2O
Thiamine hydrochloride Merck 67-03-8 C12H17ClN4OS · HCl
TRIS Carl Roth 77-86-1 C4H11NO3
Ultrasonic device UP100H with sonotrode MS3 Hielscher Ultrasound Technology UP100H
Ultraturrax Silent Crusher M Heidolph Instruments homogenizer
Urea Carl Roth 57-13-6 CH4N2O
Vitamin B12 Sigma 68-19-9 C63H88CoN14O14P
Vitamin solution 0.3 µM thiamin-HCl, 2.1 nM biotin, 0.37 nM cyanocobalamin
Water Stills, Water treatment VEOLIA water technologies ELGA_21001
Zinc sulphate heptahydrate Sigma 7446-20-0 ZnSO4 · 7 H2O
software, URL
gatb-minia program for DNA assembly https://github.com/GATB/gatb-minia-pipeline makes large scaffolds from short DNA reads, Linux based
ImageJ software for immage processing (pixel intensities, circle diameter)
RAST annotation server https://rast.nmpdr.org input: genome DNA sequence, detects open reading frames, lists protein sequences and their functions
Culture media
Artificial seawater 0.41 M NaCl , 53 mM MgCl2,28 mM Na2SO4, 10 mM CaCl2 , 9 mM  KCl , 2.4 mM NaHCO3 ,0.84 mM KBr, 0.49 mM H3BO3, 90 µM SrCl2, 72 µM NaF
f/2 -liquid medium artificial seawater, 0.1 % (v/v) trace element solution, 0.05 % (v/v) vitamin solution, 0.88 mM NaNO3, 36 µM NaH2PO4 
f/2+ liquid medium f/2-medium, with 10 times increased NaNO3 and NaH2PO4 (0.88 mM NaNO3, 36 µM NaH2PO4
f/2+-agar 3 % (w/v) bacto agar, artificial seawater, 0.1 % (v/v) trace element solution, 0.05 % (v/v) vitamin solution ,8.8 mM NaNO3, 0.36 mM NaH2PO4
f/2-agar 3 % (w/v) bacto agar, artificial seawater, 0.1 % (v/v) trace element solution, 0.05 % (v/v) vitamin solution ,0.88 mM NaNO3, 36 µM NaH2PO4
Trace element solution 0.36 mM NaH2PO4, 12 µM Na2EDTA, 39 nM CuSO4, 26 nM Na2MoO4 , 77 nM ZnSO4, 42 nM CoCl2, 0.91 µM MnCl2
Vitamin solution 0.3 µM thiamin-HCl, 2.1 nM biotin, 0.37 nM cyanocobalamin

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brasil, B., de Siqueira, F. G., Salum, T. F. C., Zanette, C. M., Spier, M. R. Microalgae and cyanobacteria as enzyme biofactories. Algal Research-Biomass Biofuels and Bioproducts. 25, 76-89 (2017).
  2. Gundolf, R., Oberleitner, S., Richter, J. Evaluation of New Genetic Toolkits and Their Role for Ethanol Production in Cyanobacteria. Energies. 12 (18), 3515 (2019).
  3. Wendt, K. E., Pakrasi, H. B. Genomics approaches to deciphering natural transformation in cyanobacteria. Frontiers in Microbiology. 10, 1259 (2019).
  4. Tandeau de Marsac, N., et al. A new approach for molecular cloning in cyanobacteria: cloning of an Anacystis nidulans met gene using a Tn901-induced mutant. Gene. 20 (1), 111-119 (1982).
  5. Porter, R. D. Transformation in cyanobacteria. Critical Reviews in Microbiology. 13 (2), 111-132 (1986).
  6. Joset, F. Transformation in Synechocystis PCC 6714 and 6803: preparation of chromosomal DNA. Methods in Enzymology. 167, 712-714 (1988).
  7. Tsinoremas, N. F., Kutach, A. K., Strayer, C. A., Golden, S. S. Efficient gene transfer in Synechococcus sp strains PCC-7942 and PCC-6301 by interspecies conjugation and chromosomal recombination. Journal of Bacteriology. 176 (21), 6764-6768 (1994).
  8. Matsunaga, T., Takeyama, H. Genetic engineering in marine cyanobacteria. Journal of Applied Phycology. 7 (1), 77-84 (1995).
  9. Frigaard, N. U., Sakuragi, Y., Bryant, D. A. Gene inactivation in the cyanobacterium Synechococcus sp. PCC 7002 and the green sulfur bacterium Chlorobium tepidum using in vitro-made DNA constructs and natural transformation. Methods in Molecular Biology. 274, 325-340 (2004).
  10. Iwai, M., Katoh, H., Katayama, M., Ikeuchi, M. Improved genetic transformation of the thermophilic cyanobacterium, Thermosynechococcus elongatus BP-1. Plant and Cell Physiology. 45 (2), 171-175 (2004).
  11. Vioque, A. Transformation of cyanobacteria. Transgenic Microalgae as Green Cell. Leon, R., Galvan, A., Fernandez, E. , Springer. 12-22 (2007).
  12. Nies, F., Mielke, M., Pochert, J., Lamparter, T. Natural transformation of the filamentous cyanobacterium Phormidium lacuna. Plos One. 15 (6), 0234440 (2020).
  13. Ravindran, C. R. M., Suguna, S., Shanmugasundaram, S. Electroporation as a tool to transfer the plasmid pRL489 in Oscillatoria MKU 277. Journal of Microbiological Methods. 66 (1), 174-176 (2006).
  14. El Semary, N. A. Optimized electroporation-induced transformation in Microcystis aeruginosa PCC7806. Biotechnologie Agronomie Societe et Environnement. 14 (1), 149-152 (2010).
  15. Nies, F., Mielke, M., Pochert, J., Lamparter, T. Natural transformation of the filamentous cyanobacterium Phormidium lacuna. PLoS One. 15 (6), 0234440 (2020).
  16. Sode, K., Tatara, M., Takeyama, H., Burgess, J. G., Matsunaga, T. Conjugative gene-transfer in marine cyanobacteria - Synechococcus Sp, Synechocystis Sp and Pseudanabaena Sp. Applied Microbiology and Biotechnology. 37 (3), 369-373 (1992).
  17. Stucken, K., Ilhan, J., Roettger, M., Dagan, T., Martin, W. F. Transformation and conjugal transfer of foreign gGenes into the filamentous multicellular cyanobacteria (Subsection V) Fischerella and Chlorogloeopsis. Current Microbiology. 65 (5), 552-560 (2012).
  18. Bellali, S., Khalil, J. B., Fontanini, A., Raoult, D., Lagier, J. C. A new protectant medium preserving bacterial viability after freeze drying. Microbiological Research. 236, 126454 (2020).
  19. Wallner, T., Pedroza, L., Voigt, K., Kaever, V., Wilde, A. The cyanobacterial phytochrome 2 regulates the expression of motility-related genes through the second messenger cyclic di-GMP. Photochemical & Photobiological Sciences. 19 (5), 631-643 (2020).
  20. Wilde, A., Fiedler, B., Borner, T. The cyanobacterial phytochrome Cph2 inhibits phototaxis towards blue light. Molecular Microbiology. 44 (4), 981-988 (2002).
  21. Bhaya, D., Takahashi, A., Grossman, A. R. Light regulation of type IV pilus-dependent motility by chemosensor-like elements in Synechocystis PCC6803. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (13), 7540-7545 (2001).
  22. Guillard, R. R., Ryther, J. H. Studies of marine planktonic diatoms. I. Cyclotella nana Hustedt, and Detonula confervacea (cleve) Gran. Canadian Journal of Microbiology. 8, 229-239 (1962).
  23. Kester, D. R., Duedall, I. W., Connors, D. N., Pytkowicz, R. M. Preparation of artificial seawater. Limnology and Oceanography. 12 (1), 176-179 (1967).
  24. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning. A Laboratory Manual. 3rd edition. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).
  25. Cold Spring Harbor Protocols. CTAB DNA extraction buffer. Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (3), (2009).
  26. Singh, S. P., Rastogi, R. P., Häder, D. -P., Sinha, R. P. An improved method for genomic DNA extraction from cyanobacteria. World Journal of Microbiology & Biotechnology. 27, 1225-1230 (2011).
  27. French, C. S., Milner, H. W. Disintegration of bacteria and small particles by high-pressure extrusion. Methods in Enzymology. 1, 64-67 (1955).
  28. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning, a laboratory manual. 2nd ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).
  29. Lamparter, T., et al. The involvement of type IV pili and phytochrome in gliding motility, lateral motility and phototaxis of the cyanobacterium Phormidium lacuna. bioRxiv. , (2021).
  30. Nies, F., et al. Characterization of Phormidium lacuna strains from the North Sea and the Mediterranean Sea for biotechnological applications. Process Biochemistry. 59, 194-206 (2017).
  31. Kachel, B., Mack, M. Engineering of Synechococcus sp. strain PCC 7002 for the photoautotrophic production of light-sensitive riboflavin (vitamin B2). Metabolic Engineering. 62, 275-286 (2020).
  32. Lukavsky, J., Cepak, V., Komarek, J., Kasparkova, M., Takacova, M. Catalogue of algal and cyanobacterial strains of culture collection of autotrophic organisms at Trebon. Algological Studies. 63, 59-112 (1992).
  33. Philbrick, J. B., Diner, B. A., Zilinskas, B. A. Construction and characterization of cyanobacterial mutants lacking the manganese-stabilizing polypeptide of photosystem-ii. Journal of Biological Chemistry. 266 (20), 13370-13376 (1991).
  34. Pinevich, A. V., Veprritskii, A. A., Gromov, B. V., Krautvald, K., Titova, N. N. Cellular and cultural properties and characterization of the pigment in Nostoc sp, a cyanobacterium unusually rich in c-phycoerythrin. Microbiology. 63 (5), 481-485 (1994).
  35. Schlosser, U. G., Friedl, T. Additions to the culture collection of algae at Gottingen since 1997. Nova Hedwigia. 71 (1-2), 243-262 (2000).
  36. Takano, H., Arai, T., Hirano, M., Matsunaga, T. Effects of intensity and quality of light on phycocyanin production by a marine cyanobacterium Synechococcus sp. 042902. Applied Microbiology and Biotechnology. 43 (6), 1014-1018 (1995).
  37. Carrer, H., Hockenberry, T. N., Svab, Z., Maliga, P. Kanamycin resistance as a selectable marker for plastid transformation in tobacco. Molecular and General Genetics: MGG. 241 (1-2), 49-56 (1993).
  38. Kaulen, H., Schell, J., Kreuzaler, F. Light-induced expression of the chimeric chalcone synthase-NptII gene in tobacco cells. EMBO Journal. 5 (1), 1-8 (1986).
  39. Cotlet, M., Goodwin, P. M., Waldo, G. S., Werner, J. H. A comparison of the fluorescence dynamics of single molecules of a green fluorescent protein: One- versus two-photon excitation. Chemphyschem. 7 (1), 250-260 (2006).
  40. Taton, A., et al. The circadian clock and darkness control natural competence in cyanobacteria. Nature Communications. 11 (1), 1688 (2020).

Tags

Биология выпуск 180
Естественная трансформация, экспрессия белка и криоконсервация нитевидной цианобактерии <em>Phormidium lacuna</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Weber, N., Hofmeister, M., Wunsch,… More

Weber, N., Hofmeister, M., Wunsch, N., Kohler, A., Kaster, A. K., Vollmers, J., Kachel, B., Mack, M., Lamparter, T. Natural Transformation, Protein Expression, and Cryoconservation of the Filamentous Cyanobacterium Phormidium lacuna. J. Vis. Exp. (180), e63470, doi:10.3791/63470 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter