Summary
Phormidium lacuna 는 해양 암석에서 분리 된 필라멘트 성 시아 노 박테리움입니다. 이 기사에서는 천연 공급원으로부터의 필라멘트의 분리, DNA 추출, 게놈 시퀀싱, 자연 변형, sfGFP의 발현, 냉동 보존 및 운동성 방법에 대해 설명합니다.
Abstract
시아 노 박테리아는 태양 에너지가 바이오 매스 생산에 사용되는 기본 연구 및 생명 공학 프로젝트의 초점입니다. Phormidium lacuna는 새로 분리 된 필라멘트 성 시아 노박테리움입니다. 이 논문은 새로운 필라멘트 시아 노 박테리아가 해양 암석에서 어떻게 분리 될 수 있는지 설명합니다. 또한 필라멘트에서 DNA를 추출하는 방법과 게놈을 시퀀싱하는 방법을 설명합니다. 많은 단세포 종에 대해 형질전환이 확립되지만, 필라멘트성 시아노박테리아에 대해서는 덜 빈번하게 보고된다. P. lacuna의 자연 변형을위한 단순화 된 방법이 여기에 설명되어 있습니다. P. lacuna는 자연 변형이 확립 된 Oscillatoriales 주문의 유일한 구성원입니다. 이 논문은 또한 자연 변형이 수퍼 폴더 녹색 형광 단백질 (sfGFP)을 발현하는 데 어떻게 사용되는지를 보여줍니다. 내인성 cpcB 프로모터는 Synechocystis sp. PCC6803으로부터의 cpc560, A2813, 또는 psbA2 프로모터보다 약 5배 더 강한 발현을 유도하였다. 또한, P. lacuna 및 Synechocystis sp.CPP 6803의 동결보존을 위한 방법이 확립되었고, 액체 매질 및 한천 및 플라스틱 표면에서의 운동성을 평가하는 방법이 기재되어 있다.
Introduction
시아노박테리아는 광합성을 에너지원으로 활용하는 원핵생물이다1,2. 연구는 시아 노 박테리아 종에 점점 더 초점을 맞추고 있습니다. 몇몇 시아노박테리아는 DNA3으로 형질전환될 수 있다. 유전자는 이들 종에서 녹아웃되거나 과발현될 수 있다. 그러나, 형질전환은몇몇 종 4,5,6,7,8,9,10,11 로 제한되며, 배양 수집 또는 야생 8로부터의 균주에서 형질전환을 확립하는 것은 어려울 수 있다. 필라멘트 종 Phormidium lacuna (그림 1)의 균주는 염 농도 또는 온도와 같은 환경 조건이 시간이 지남에 따라 변동하는 해양 암석 풀에서 분리되었습니다. 이 필라멘트 시아 노 박테리아는 그들이 속한 Oscillatoriales12 순서에 대한 모델 유기체로 사용될 수 있습니다.
전기천공에 의한 유전자 전달을 시험하는 시험 동안 13,14는 P. lacuna가 자연 형질전환(15)에 의해 형질전환될 수 있다는 것을 발견하였다. 이 과정에서 DNA는 일부 세포에 의해 자연적으로 흡수됩니다. 변환16,17의 다른 방법과 비교할 때, 자연 변환은 절차를 복잡하게 만들 수있는 추가 도구가 필요하지 않다는 장점이 있습니다. 예를 들어, 전기 천공에는 적절한 큐벳, 손상되지 않은 와이어 및 적절한 전압의 선택이 필요합니다. P. lacuna는 현재 자연 변형에 취약한 유일한 Oscillatoriales 회원입니다. 원래 프로토콜은 전기 천공 프로토콜을 기반으로하기 때문에 여전히 불필요 할 수있는 몇 가지 세척 단계가 포함되어 있습니다. 프로토콜을 단순화하기 위해 다양한 접근 방식을 테스트하여 여기에 제시된 변환 프로토콜로 이어졌습니다.
게놈 서열은 유전자 녹아웃 또는 과발현에 기초한 추가 분자 연구에 필수적이다. 게놈 서열은 단기간 내에 차세대 시퀀싱 기계로 얻을 수 있지만, DNA의 추출은 어려울 수 있으며 종에 따라 다릅니다. P. lacuna를 사용하면 몇 가지 프로토콜이 테스트되었습니다. 그런 다음 변형된 세틸트리메틸암모늄 브로마이드(CTAB) 기반 방법이 확립되어 실험실에서 계속 작업하기 위해 각 정제주기의 DNA 순도 및 DNA 수율을 수용할 수 있게 되었습니다. 다섯 균주의 게놈은 이 프로토콜로 시퀀싱될 수 있었다. 다음 논리적 형질전환 단계는 P. lacuna에서 단백질 발현을 확립하는 것이었다.
이 프로토콜에서 마커 단백질로서 사용된 sfGFP는 임의의 형광 현미경으로 검출될 수 있다. 시험된 모든 프로모터는 P. lacuna sfGFP 발현을 위해 사용될 수 있었다. 형질전환으로부터 발생하는 균주의 수가 증가함에 따라 배양물을 저장하는 방법이 필요하게 되었다. 이러한 방법은 에스케리치아 콜라이 및 다른 많은 박테리아(18)에 대해 확립된다. 표준 프로토콜에서, 글리세롤 배양물을 제조하고, 액체 질소로 옮기고, -80°C에서 저장한다. 이 방법은 몇 단계 만 거치면 되며 확립 된 종에 대해 매우 신뢰할 수 있습니다. P. lacuna에 대한 표준 프로토콜은 살아있는 세포가 모든 경우에 회복 될 수 없었기 때문에 실현 가능하지 않았습니다. 그러나 해동 후 글리세롤을 제거했을 때 모든 시험의 세포는 생존했습니다. P. lacuna의 운동성 분석을 위해 간단한 방법이 제시되며, 이는 IV 형 필리 또는 광수용체의 역할을 조사하기 위해 녹아웃 돌연변이 유발과 결합 될 수 있습니다. 이들 검정은 단세포 시아노박테리아19,20,21의 분석과 다르며 또한 다른 오실라토리아에 유용할 수 있다.
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Protocol
1. 자연 환경으로부터의 격리
참고 : 녹조류, 규조류, 사상 시아 노 박테리아 및 기타 미세 조류를 분리 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 실험실 조건에서 자라는 암석 풀의 모든 미세 조류 종에 사용할 수 있습니다. Oscillatoriales에 속하는 필라멘트 시아 노 박테리아는 움직임과 필라멘트 모양으로 쉽게 인식 할 수 있습니다. 상기 종은 게놈 시퀀싱 또는 16S rRNA 시퀀싱에 의해 반순수 상태로 확인될 수 있다.
- 해양 암석 수영장 (즉, 바위가 많은 해안의 충치)에서 액체 해수 샘플을 50 mL 플라스크로 옮깁니다. 각 플라스크에 대해 천연 소스의 정확한 장소 또는 좌표를 기록하십시오. 가능하다면 50 μm 그물을 통해 내용물을 여과하여 동물 플랑크톤의 양을 줄입니다. 샘플을 계대배양할 수 있을 때까지 4°C에서 보관한다.
- 1 mL 배양물을 f /2 배지 22,23에 3% 박토-한천을 함유하는 10 cm 페트리 접시에 옮긴다(물자 표 참조). 최대 20 개의 플레이트를 준비하십시오. 50 μmol m-2 s-1의 백색광 하에서 재배하십시오.
참고 : 재배에 더 높은 광도를 사용할 수 있습니다. P. lacuna에는 최대 400 μmol m-2 s-1의 강도를 사용할 수 있지만 다른 종은 빛에 더 민감 할 수 있습니다. - 일주일 후, 멸균 포셉을 사용하여 원하는 세포를 신선한 한천 플레이트로 옮깁니다. 세포를 멸균 조건 하에서 쌍안경 현미경으로 분리한다. 세포가 나타날 때까지 오래된 한천 플레이트를 4°C에서 보관하고 새로운 한천 플레이트 상에서 성장시킨다.
- 오염을 제거하기 위해 매주이 전송 단계를 반복하십시오. 육안으로 심한 오염을 감지하고 400x 배율의 현미경을 사용하여 오염을 추가로 검사하십시오.
- 샘플에 오염이없는 것처럼 보이면 한천 플레이트에서 박테리아 또는 곰팡이 오염을 테스트하십시오. 접종 루프를 갖는 배양물의 분획을 LB24 한천 플레이트 (직경 10 cm)로 옮기고, 플레이트를 실온에서 유지하고, 1-3일에 걸쳐 오염물질의 성장을 체크한다.
- 멸균 된 필라멘트 시아 노 박테리아 종을 얻으면 추가 배양 작업에 사용하십시오. P. lacuna를 액체 또는 박토 한천 접시에 재배하십시오. 250 mL 플라스크에 50 mL의 f/2 배지 또는 f/2+ 배지를 액체 배양에 사용하십시오.
2. DNA 추출
참고: 이 방법은 25 26에서 채택되었습니다.
- 50mL의 f/2 배지로 두 개의 플라스크를 준비합니다. 다른 성장하는 배양물에서 ∼1 mL의 P. lacuna 필라멘트로 각각을 접종한다. 배양물을 25°C에서 백색광 (50 μmol m-2s-1) 하에 50 rpm에서 교반 (수평 회전) 하에 7일 이상 동안 유지하였다.
- 문화를 초음파 ( 재료 표 참조)로 2 분 동안 전체 에너지로 치료하십시오. 750 nm에서 OD를 측정하고; ~ 0.5인지 확인하십시오. OD가 너무 낮은 경우 배양물을 계속 성장시킨다.
- 필라멘트를 5,000 × g, 20분 원심분리하여 수집한다. 상층액을 제거하십시오. 잔류 액체가 있는 필라멘트를 프렌치 프레스27의 챔버로 옮깁니다. 프렌치 프레스의 압력을 20,000 psi로 설정하고 세포를 추출하십시오.
참고 : 프랑스 언론은 모든 세포를 용해시키고 DNA를 방출합니다. 강한 전단력은 1,500 bp DNA 단편을 생성합니다. - 샘플을 10,000 × g 에서 10분 동안 원심분리하고 상층액을 제거하였다.
- 400 μL의 용해 완충액 (4 M 우레아, 0.1 M Tris/Cl, pH 7.4) 및 50 μL의 프로테이나제 K (10 mg/mL)를 펠렛에 첨가한다. 샘플을 550 rpm에서 진탕하면서 60분 동안 55°C로 가열한다.
- 1 mL의 DNA 추출 완충액 (3% CTAB, 1.4 M NaCl, 10 mM EDTA, 0.1 M Tris/Cl, 1% 사르코실, 0.1 M DTT, pH 8)을 첨가하고, 55°C 및 550 rpm에서 60분 동안 인큐베이션한다. 용액을 원심분리 튜브로 옮기고 두 부피의 클로로포름 / 이소 아밀 알코올 (24/1)을 첨가하십시오.
- 진탕 후, 샘플을 9,000 × g에서 5분 동안 원심분리한다. 상부, 수성상을 반응 바이알 내로 옮기고 1 mL의 빙냉 에탄올 및 50 μL의 3 M 아세트산나트륨을 첨가한다.
- 샘플을 볼텍스하고 -20°C에서 1시간 이상 동안 둔다.
- 10,000 × g (4°C)에서 5분 동안 원심분리하여 상층액을 버린다. 펠렛을 70% 에탄올로 세척한다.
- 샘플을 다시 원심분리한다. 상청액을 제거하고 펠렛을 밤새 건조시킨다. DNA를 뉴클레아제가없는 물에 녹입니다. DNA 스펙트럼을 측정하여 OD 260 nm/OD 280 nm가 1.6과 1.9 사이인지 확인합니다.
- DNA의 크기를 아가로스 전기영동 겔(28) 상에서 분석한다.
- 게놈 DNA를 300 사이클 동안 차세대 시퀀싱에 의해 서열화하고, 쌍으로 묶인 말단 설정 및 150 염기의 판독 길이를 갖는다 ( 자료의 표 참조).
- 적절한 컴퓨터 프로그램으로 조립을 수행하는 단계; 재료 표에 주어진 예를 참조하십시오.
- 주석을 위해 초안 게놈을 RAST 서버에 제출하십시오.
참고: DNA 서열을 업로드하여 몇 분 안에 완전한 주석을 얻을 수 있습니다.
3. 자연 형질전환 및 GFP 발현
참고: 형질전환은 대장균에서 전파된 플라스미드 벡터에 기초한다; pGEM-T 또는 pUC19는 백본 벡터로서 사용될 수 있다. 복제 기술은 많은 실험실에서 확립됩니다. 또한 표준 프로토콜 28 및 P. lacuna15,29에 대한 변환 벡터에 대한 기사를 참조하십시오. sfGFP 발현을 위한 벡터에 대한 예는 대표적인 결과 섹션에 기재되어 있다. 아직 게시되지 않은 네 개의 벡터에 대한 자세한 내용은 보충 파일 1에 제공됩니다.
- 멸균 실험실 조건 (깨끗한 벤치, 멸균 유리 제품)에서 멸균 물질을 사용하여 모든 단계를 수행하십시오.
- 실행 중인 배양물로부터 2 x 1 mL의 P. lacuna 필라멘트와 함께 2개의 250 mL 플라스크에 f/2 액체 배지 2 x 50 mL를 접종한다. 25°C에서 ∼5일 동안 교반(수평 회전, 50 rpm) 하에 백색광(50 μmol m-2s-1)에서 재배한다.
- 제조업체의 지침에 따라 미디 준비 키트 ( 재료 표 참조)를 사용하여 ~ 200 μg의 형질전환 벡터 DNA를 준비하십시오.
- 100 mL의 P. lacuna 세포 현탁액 ( 물질 표 참조)을 10,000 rpm에서 3분 동안 균질화한다. 750nm에서 OD를 측정합니다(원하는 값 = 0.35).
- 세포 현탁액을 6,000 × g에서 15분 동안 원심분리한다. 상청액을 제거하고, 펠렛을 잔여 액체 및 추가 f/2+ 매질의 800 μL(잔류 액체 및 필라멘트를 포함하는 총 부피)에 현탁시킨다.
- 120 μg/mL 카나마이신이 들어있는 여덟 개의 f/2+ 박토-한천 플레이트(직경 10cm)를 복용하십시오. 10 μg의 DNA를 각 한천 플레이트의 중앙에 피펫한다. 즉시 100 μL의 세포 현탁액을 각 한천 플레이트의 중간(DNA 상부)에 피펫팅한다.
- 여분의 액체가 증발 할 수 있도록 깨끗한 벤치에 뚜껑이없는 한천 판을 유지하십시오. 플레이트를 닫고 25°C에서 2일 동안 백색광에서 배양한다.
- 접종 루프가 있는 각 한천 플레이트의 필라멘트를 120 μg/mL 카나마이신을 함유하는 여러 개의 신선한 f/2+ 박토-한천 플레이트에 분배하십시오. 플레이트를 25°C에서 백색광으로 재배하고 배양물을 현미경으로 정기적으로 점검한다.
- 현미경으로 7-28 일 후에 살아있는 변형 된 필라멘트를 확인하십시오. 다른 필라멘트와 다른 건강한 녹색 필라멘트(그림 2)를 찾습니다. 이러한 녹색 필라멘트가 확인될 수 있는 경우, 다음 단계를 계속하십시오; 그렇지 않으면 접시를 7 일 동안 더 보관하십시오.
- 포셉을 사용하여 확인된 살아있는 필라멘트를 250μg/mL 카나마이신이 있는 50mL의 액체 f/2+ 배지로 옮깁니다. 쉐이커(수평 회전, 50 rpm) 상에서 25°C의 백색광에서 재배한다. 최대 네 주 동안 성장을 관찰하십시오.
- 필라멘트를 250 μg/mL 카나마이신을 함유하는 한천 배지로 다시 옮기고 필라멘트가 자랄 때까지 기다립니다. 며칠 후, 단일 필라멘트를 카나마이신 농도가 더 높은 신선한 한천 플레이트로 옮깁니다(예: 500 μg/mL). 원래 접시를 보관하십시오.
- 필라멘트가 액체 배양 또는 한천에서 고농도의 카나마이신으로 전파되는지 확인하십시오. 카나마이신 농도를 다시 높여 분리 속도를 높입니다.
참고: 형질전환된 P. lacuna는 최대 10,000 μg/mL 카나마이신에서 자랍니다. 다른 종들은 그러한 높은 농도를 용납하지 않을 수도 있습니다. - 내성 세포가 성장하여 플레이트 위에 광범위하게 분포하는 경우, 외부 및 내부 프라이머로 PCR을 수행하여 P. lacuna 의 게놈 내로의 삽입물의 통합을 시험한다.
- 삽입물의 클로닝을 위해 설계된 프라이머를 내부 프라이머로서 사용한다.
- 외부 프라이머의 설계를 위해, P. lacuna 의 게놈 상에 제안된 삽입 부위의 5' 및 3'이지만 삽입 외부에 있는 서열을 선택한다.
- PCR 반응의 경우 내부 프라이머와 외부 프라이머를 사용하십시오. 내성 균주와 야생형을 사용하십시오.
참고: 내부 프라이머는 삽입물이 존재함을 나타냅니다. 외부 프라이머는 삽입물이 정확한 유전자좌에 삽입되었음을 보여준다.
- 각 PCR 반응에 대해 ∼10mg의 필라멘트를 PCR 튜브에 직접 넣고 표준 프로토콜24에 따라 PCR을 수행합니다. 제품이 얻어지지 않으면 어닐링 온도를 변화시키고 필라멘트를 물로 씻으십시오.
참고: 많은 다른 중합 효소는 PCR에서 사용될 수 있습니다. Taq 중합효소와 같은 표준 중합효소는 오류 검사 중합효소보다 오류율이 높으며, 이는 더 비쌉니다. 이 분석 PCR에는 오류 검사 중합효소가 필요하지 않습니다. 그러나 오류 검사 중합효소는 표준 중합효소로 PCR 산물을 얻을 수 없는 경우 검사해야 합니다. - 저항성 라인의 PCR 산물을 아가로스 전기영동24 상에서 분석한다.
- 마커와 밴드 위치를 비교하고 야생형과 변형체를 비교합니다. 내부 및 외부 프라이머를 사용하여 야생형보다 형질전환체에 대한 더 큰 밴드(저항 카세트의 삽입으로 인해) 또는 형질전환체에 대한 두 개의 밴드를 찾으십시오: 하나는 야생형 밴드의 크기와 더 큰 밴드입니다. 후자의 경우는 불완전한 분리를 나타내므로 높은 카나 마이신 농도로 재배를 계속하십시오.
참고: PCR 및 전기영동에 대한 자세한 내용은15,24 또는 기타 표준 문헌을 참조하십시오.
- 마커와 밴드 위치를 비교하고 야생형과 변형체를 비교합니다. 내부 및 외부 프라이머를 사용하여 야생형보다 형질전환체에 대한 더 큰 밴드(저항 카세트의 삽입으로 인해) 또는 형질전환체에 대한 두 개의 밴드를 찾으십시오: 하나는 야생형 밴드의 크기와 더 큰 밴드입니다. 후자의 경우는 불완전한 분리를 나타내므로 높은 카나 마이신 농도로 재배를 계속하십시오.
- GFP 발현의 경우: 40x 또는 63x로 설정된 목표물의 배율에서 형광 현미경( 물질의 표 참조)으로 단일 필라멘트를 관찰한다. 밝은 필드 전송 이미지와 형광 이미지를 캡처합니다. GFP에 대해 다음과 같은 설정을 사용하십시오: 여기를 위한 470nm 대역 통과, 방출을 위한 525nm 대역 통과, 495nm 빔 스플리터, 500ms의 초기 노출 시간.
- 포화 강도를 피하면서 투명한 형광 신호를 위해 노출 시간을 조정하십시오. 모든 샘플에 대해 동일한 설정을 사용해 보십시오.
- 야생형 필라멘트도 형광을 표시하므로, 이 배경 형광에 대해 위와 동일한 설정으로 이미지를 캡처합니다.
참고: GFP를 발현하는 균주는 더 높은 신호를 가져야 합니다. 그렇지 않으면, GFP를 발현하지 않는다. - 형광 이미지의 노출 시간 및 픽셀 강도에 기초하여, 상이한 필라멘트의 GFP 함량을 계산하고 비교한다.
4. 냉동 보존
참고: P. lacuna 및 단세포 시아노박테리움 Synechocystis sp. PCC(6803)가 사용된다. 현재의 방법은 P. lacuna에게 더 잘 작동합니다.
- P. lacuna 또는 Synechocystissp PCC 6803을 각각 f/2+ 또는 BG-11 배지 10 mL에서 적어도 10일 동안 교반(수평 회전, 50 rpm) 하에 25°C에서 백색광(50 μmol m-2 s-1) 하에 배양한다.
- P. lacuna 배양물을 10,000 rpm에서 3분 동안 또는 초음파 장치(재료 표 참조)로 전체 에너지에서 2분 동안 균질화한다. 어느 한 배양물의 OD750 nm를 확인하여 값이 1과 7 사이인지 여부를 확인한다.
- 세포를 6,000 × g 에서 15분 동안 원심분리하여 수집한다. 상층액을 제거하십시오.
- 세포 펠렛을 800 μL의 f/2+ 또는 BG-11 배지 (최종 부피)에 현탁시키고 2 mL 동결로 옮긴다. 800 μL의 50% 글리세롤 용액을 세포 현탁액에 첨가한다. 바이알을 닫고 반복 반전으로 혼합하십시오.
- 동결을 액체 질소로 옮기고 이를 -80°C 냉동고의 냉동 박스에 보관한다. 냉동실 내의 상자의 위치와 상자 내의 샘플의 좌표를 기록하십시오.
- 세포의 회복을 위해, 냉동 장치를 꺼내고 실온에서 내용물을 해동하십시오. 내용물을 2 mL 반응 튜브로 옮긴다.
- 샘플을 두 번 씻으십시오. 1차 세척을 위해, 6,000 × g 에서 5분 동안 원심분리한다. 상청액을 제거하고, 펠렛을 f/2+ 또는 BG-11 배지 2 mL에 재현탁시킨다. 2차 세척을 위해, 6,000 × g 에서 5분 동안 원심분리하고, 상층액을 제거하고, 펠릿을 f/2+ 또는 BG-11 배지 2 mL에 현탁시킨다.
- 배양 준비가 된 이들 세포의 완전성을 확인하기 위해, 펠렛을 9 mL의 배지로 옮기고 교반 (55 rpm) 하에 백색광 (50 μmol m-2 s-1)에서 배양한다. 배양 첫날과 1주일 후의 OD750 nm를 비교하였다.
5. 포미듐 라쿠나의 운동성
참고: 세 가지 상이한 분석이 설명될 것이다. 모든 경우에 동일한 문화권이 사용됩니다.
- 추정된 OD750 nm가 0.35가 될 때까지 백색광(50 μmol m-2 s-1)에서 수평 교반(50 rpm) 하에 f/2 배지에서 P. lacuna를 경작한다. 샘플을 사용할 때까지 4°C에서 보관한다.
- 필라멘트를 10,000 rpm에서 3 분 동안 또는 초음파 (재료 표 참조)로 1 분 동안 최대 전력 및 사이클 1 분 동안 균질화하십시오 (재료 표 참조). OD 750 nm를 측정한다. 0.35 이상이면 분획을 f / 2 배지로 희석하십시오. 이 용액을 단계 5.3, 5.4 및 5.5의 운동성 검정에 사용하십시오.
- 액체 매질에서의 이동에 대한 분석
- 운동성의 직접적인 관찰을 위해, P. lacuna 를 함유하는 배지 8 mL (단계 5.2로부터)를 6 cm 페트리 접시에 옮긴다. 샘플이 실온에 도달할 때까지 몇 분 정도 기다립니다. 페트리 접시를 셀로판 호일로 덮으십시오.
- 현미경 슬라이드를 카메라로 표준 현미경의 xy 테이블에 놓습니다. 현미경 조명을 켭니다. 이상적으로는 항상 조명에 동일한 전기 및 광학 설정을 사용하십시오. 4x 또는 10x 목표를 빛의 경로로 옮깁니다.
- 페트리 접시를 슬라이드 위에 놓습니다. 단일 필라멘트 또는 필라멘트 번들을 테이블의 x, y 및 z 움직임으로 조정합니다.
참고 : 입체 배열로 인해 관련 섹션의 일부만 초점을 맞출 수 있습니다. 셀로판 호일은 제한없이 초점을 조정할 수 있습니다. - 단일 필라멘트 또는 번들의 움직임을 관찰하십시오. 대물 렌즈가 액체에 닿지 않는지 확인하십시오. 표준 현미경 카메라로 필라멘트의 움직임을 기록하십시오 ( 보충 비디오 S1 참조).
- 표면에서의 움직임에 대한 분석
- 한천 표면에서 필라멘트 운동성을 관찰하려면 f / 2 박토 한천으로 6cm 페트리 접시를 준비하십시오. 한천이 대물 렌즈가 한천 표면에 가까워 질 수있을만큼 충분히 높은지 확인하십시오. 또는 ~ 3mm 두께의 한천 층을 준비하고 한천을 통해 필라멘트를 기록하십시오 (플레이트를 거꾸로 유지하거나 거꾸로 현미경을 사용하십시오).
- 피펫 0.5 mL의 P. lacuna를 함유하는 용액 (단계 5.2로부터)을 6 cm 페트리 디쉬의 박토-한천 표면 상에 도말하였다. 액체가 표면에 들어가도록하십시오. 페트리 접시를 닫고 4x 또는 10x 목표를 사용하여 표면에서 필라멘트의 움직임을 관찰하십시오.
- 현미경의 동일한 전기 및 광학 설정이 기록 및 후속 녹음 전반에 걸쳐 사용되는지 확인하십시오.
- 안구 카메라와 미니컴퓨터 시스템을 사용하여 타임랩스 녹화를 캡처합니다. 후속 이미지 사이의 시간 간격이 5초-1분인지 확인합니다. 미니컴퓨터의 Linux 스크립트를 프로그래밍하여 타임랩스 기록을 제어합니다. 예제 로 보충 파일 2의 예제 스크립트와 보충 비디오 S2 를 참조하십시오.
- 광택시에 대한 분석
- 포토택시 실험을 위해 선택한 5mm LED가 장착된 발광 다이오드(LED) 홀더(여기서는 3D 프린터 사용)를 준비하여 아래에서 위로20mm2 의 영역을 조사합니다(그림 3). 필요한 경우 많은 LED 홀더를 병렬로 사용하여 저항기와 전위차계를 통해 각 LED를 조정 가능한 전원 공급 장치에 전기적으로 연결합니다. 실험에 따라 LED 강도를 측정하고 조정합니다. 전체 설정이 어두운 방이나 닫힌 어두운 컨테이너에 있는지 확인하십시오.
- P. lacuna를 함유하는 배지 8 mL(단계 5.2로부터)를 6 cm 페트리 디쉬에 넣는다. LED의 광도를 조정합니다. 뚜껑이 있는 페트리 접시를 닫고 LED 홀더에 올려 놓고 LED가 페트리 접시의 중앙에 오도록 합니다.
- 원하는 기간 (일반적으로 2 일) 후에 광선 처리의 위치를 직접 겨냥한 스마트 폰 카메라로 Petri 접시의 이미지를 캡처하십시오. 시편의 조사를 위해 흰색 LED 패널을 사용하십시오. 카메라의 수동 설정을 사용하십시오. 빛의 반사를 피하십시오; 항상 카메라 렌즈와 시편 사이의 동일한 거리를 갖도록 조정하십시오. 노출 설정이 ImageJ를 사용한 이후 분석에 적합한 이미지를 제공하는지 확인합니다.
- ImageJ 소프트웨어를 사용하여 필라멘트의 중앙 원의 직경을 정량화합니다.
- ImageJ를 열고 파일 |를 클릭하십시오. 열고 원하는 파일을 선택한 다음 Enter 키를 클릭합니다.
- 직선 단추( 직선 포함)를 선택합니다. 마우스 왼쪽 버튼을 눌러 페트리 접시의 한쪽 끝에서 반대쪽 끝으로 선을 그립니다. 선이 필라멘트 원의 중심을 통과하는지 확인하십시오.
- 키보드에서 Ctrl-K 를 누르거나 | 분석을 클릭합니다. ImageJ 메뉴의 플롯 프로파일입니다. 페트리 접시의 1D 프로파일과 비교하여 픽셀 강도가 그려진 xy 창을 찾습니다. 가장 낮은 픽셀 강도가 0보다 약간 높고 가장 높은 값이 255보다 작은지 확인하십시오.
- 원 외부의 픽셀 강도에 대한 평균값과 원의 픽셀 강도에 대한 또 다른 평균값을 추정합니다. 이 값 사이의 y- 위치에서 이러한 위치에서 마우스를 가리켜 원의 양쪽의 x-값을 추정합니다. 두 값을 모두 기록하고 차이를 계산합니다.
- 마우스를 오른쪽의 y축으로 향하게 하여 가장 높은 x-값을 얻습니다. 이 값 e는 페트리 접시의 직경을 나타냅니다. 이 지름이 5cm이면 중앙 필라멘트 원의 지름을 d/e × 5cm로 계산합니다.
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Representative Results
상기 언급된 방법에 따라, P. lacuna 의 5개의 상이한 균주를 락풀로부터 분리하고 서열화하였다(도 1 및 표 1). 모든 배양물은 P. lacuna HE10JO를 제외한 계대 배양의 ∼1년 후에 멸균되었다. 이 균주는 여전히 해양 박테리아 인 Marivirga atlantica로 오염되어 있습니다. 후속 헬고랜드 여행 동안, 다른 필라멘트 시아 노 박테리아는 P. lacuna 와 다르며 특성화되어야하는 암석 웅덩이에서 분리되었습니다.
몇몇 DNA 추출 및 정제 방법을 P. lacuna에 대해 시험하였다. 최상의 결과는 전술한 바와 같이 최적화된 CTAB 방법으로 얻어졌다. DNA 수율은 310 ± 50 μg/mL, OD260 nm/OD280 nm는 1.7 ± 0.03, OD260 nm/OD230 nm는 0.78 ± 0.04 (n=17)이었다. 게놈 시퀀싱은 모든 균주의 DNA가 예상한 바와 같이 약간 상이하다는 것을 보여주었다(표 1). 코어 단백질 서열은 0.04%의 최대 차이를 보였다(표 2). 비록 모든 초안 게놈이 불완전했지만, HE10JO30 의 게놈의 >98%가 서열화되었다고 가정할 수 있다. 이 추정은 불완전한 열린 판독 프레임의 수를 기반으로 합니다. 부분 단백질 서열은 HE10DO 및 HE10JO의 RAST 주석 후에 용이하게 확인될 수 있었다. HE10JO에서, ~4,500개 중 60개의 단백질은 N- 또는 C-말단 서열이 누락되었다. 게놈 서열은 보충 파일 (보충 파일 3, 보충 파일 4, 보충 파일 5, 보충 파일 6 및 보충 파일 7)에서 찾을 수 있습니다.
흥미롭게도, 같은 종의 균주는 헬고랜드와 길리오라는 두 섬에서 분리되었다. 두 섬 사이의 선형 거리는 1,400km입니다. 예를 들어, 바다를 통한 선박 또는 철새에 의한 두 장소 사이의 연결이 있어야합니다. 많은 조류 종은 두 섬에서 모두 발견 될 수 있으며, 그 중 많은 종은 철새입니다. 한 섬의 P. lacuna 균주 내의 다양성은 가장 가까운 헬고랜드와 Giglio 균주 사이의 다양성보다 컸다(표 2). 이것은 두 장소 사이의 강렬한 교환을 나타냅니다.
자연 형질전환을 주요 균주로 HE10DO와 HE10JO로 시험하였다. 본 프로토콜은 앞서 기술 한 프로토콜보다 더 간단한데, 이는 세척 단계의 수가 감소하고 변형 후 전달 단계가 적기 때문이다. 이 새로운 방법은 실험실에서 지속적으로 사용됩니다. ~ 15 개의 성공적인 변형이 달성되었습니다.
KanR 내성 카세트는 일반적으로 내부 및 외부 프라이머를 사용한 PCR에 의해 나타낸 바와 같이 인접 영역에 의해 정의된 상동성 부위 내로 통합되었다. 대부분의 시아 노 박테리아와 마찬가지로 P. lacuna는 폴리 플로이드입니다. 그것은 세포 당 100 개 이상의 염색체를 가질 수 있습니다12. 형질전환 후 ∼1주일 후에 외부 프라이머를 사용한 PCR 테스트는 전형적으로 전기영동 겔 상에 2개의 밴드를 가지며, 하나는 야생형 밴드의 크기를 가지며 하나는 저항 카세트의 삽입을 나타내는 느린 이동 밴드이다(그림 4). 이중 밴드는 염색체의 하위 분획 만이 삽입을 포함한다는 것을 나타냅니다. 카나마이신에 대한 선택 4주 후, 분리는 보통 완료되며, 겔에 하나의 큰 PCR 밴드만 나타난다. 그러나, pMH1로 형질전환된 경우(아래 참조), 분리는 3개월 이상 후에 완료되었다.
벡터 pAK1, pAK2, pAK3 및 pMH1을 sfGFP 발현에 대한 시험을 위해 구축하였다. pAK1, pAK2 및 pAK3에서, sfGFP 유전자는 각각 cpc560, A2813 및 psbA2 프로모터의 제어 하에 있다. 이들 프로모터는 Synechocystis sp. PCC 6803 또는 Synechococcus sp. PCC 700231로부터 유래한다. 이들 벡터의 구축을 위해, sfGFP 프로모터 및 터미네이터 서열을 시네코코커스 sp. PCC 700231의 형질전환에 사용된 벡터로부터 취하였다. 관련 서열을 pFN1의 상동성 chwA (sc_7_37) 부위 내로 통합하였다 (또는 pFN_7_37_KanR15). pMH1 발현 벡터는 P. lacuna 서열을 주형으로 사용하는 DNA 합성에 의해 구축되었다 (보충 파일 6). P. lacuna의 cpcB-cpcA (phycocyanin ß 및 phycocyanin α) 서열이 연속적으로 배열됩니다. 100 bp 인터제닉 영역은 두 코딩 영역을 모두 분리한다. 합성 서열은 이러한 내인성 cpcB-cpcA 서열 및 cpcB 프로모터를 함유하였다. sfGFP 및 KanR 카세트는 cpcB 정지 코돈(cpcA의 5')의 단지 3'에 배치된다. 전체 합성 서열을 cpcB 프로모터, cpcB, sfGFP, KanR, cpcA (5' 내지 3')로 pUC19 내로 클로닝한다. 지도는 그림 5에 나와 있습니다. pAK1, pAK2 및 pAK3의 복제 및 pMH1의 전체 시퀀스에 대한 자세한 내용은 보충 파일 1에 나와 있습니다.
모든 4개의 형질전환체(pAK1, pAK2, pAK3 및 pMH1 포함)는 GFP를 발현하고; 모든 형광 수준은 야생형 필라멘트의 배경 형광 이상이었다(도 6). 불완전한 분리를 갖는 pMH1 형질전환체는 필라멘트 사이에 매우 가변적인 GFP 신호를 드러냈다. 형광 신호는 분리가 완료되었을 때 고르게 분포되었다(도 6E). pAK1, pAK2 및 pAK3 형질전환체의 현미경 신호는 유사했지만 pMH1보다 ~5배 더 약했다(그림 6E).
확립 된 냉동 보존 방법은 대장균에 대해 확립 된 방법을 기반으로합니다. 해동 후 글리세롤 제거를 위해 2개의 세척 단계를 수행하였을 때, 15 개의 P. lacuna 샘플 중 15개가 생존하였다(표 3). 이 프로토콜 은 Synechocystis PCC 6803에도 사용할 수 있지만 1이 아닌 2 개의 세척 단계 만 사용할 수 있습니다 (표 3).
Oscillatoriales 필라멘트의 또 다른 특징은 운동성입니다 : P. lacuna 필라멘트는 표면 (그림 7)과 액체 매체 (그림 8)에서 지속적으로 움직입니다. 두 종류의 움직임 모두 한천 매체가 없거나 한천 매체가없는 페트리 요리에서 쉽게 연구 할 수 있습니다. 한천에서의 움직임이 느리기 때문에 타임랩스 기록이 필요합니다. 필라멘트는 광선이 아래에서 오는 경우 라이트 콘을 향해 움직입니다(그림 3). 빛의 강도, 파장 및 시간의 효과는 간단한 설정으로 쉽게 연구 할 수 있습니다. 이 효과의 광수용체는 아직 명확하지 않다. 가능한 후보는 녹아웃 돌연변이체로 해결할 수 있습니다. 필라멘트가 빛을 찾는 방법의 기본 메커니즘 또한 불분명하다. 이 질문의 경우, 적외선 시스템은 어둠에서 빛으로 이동하는 동안 필라멘트를 기록해야합니다.
그림 1: 헬고랜드와 길리오에서 채취한 포미듐 라쿠나의 균주. 필라멘트는 6cm 페트리 접시의 f / 2 한천에서 11 일 동안 전파됩니다. (a) 균주 GI08AO; (b) 균주 GI08IO; (c) 균주 GI09CO; (d) 균주 HE10DO; (e) 균주 HE10JO; (f) 균주 HE15M2G1. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 포미듐 라쿠나 필라 멘트는 형질전환 5주 후. sfGFP 발현 벡터 pMH1을 사용하였고; 선택은 120 μg/mL 카나마이신을 가진 f/2+ 배지에서 발생하였다. 녹색 필라멘트는 저항력이 있고 살아 있습니다. 다른 필라멘트가 죽었다. 배율 막대 = 100μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 포토택시 실험. 왼쪽: 조정 가능한 전원 공급 장치에 연결된 4개의 빨간색 LED가 있는 LED 홀더입니다. 각 LED 위에는 8mL의 포르미듐 라쿠나 배양물이 들어있는 6cm 페트리 접시가 있습니다. 오른쪽: 빨간색 LED (15 μmol m-2 s-1)에서 2 일 후에 P. lacuna와 함께 페트리 접시. 약어: LED = 발광 다이오드. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: Phormidium lacuna 와 pAK1의 형질전환 후 삽입물의 통합 및 분리. 외부 프라이머를 사용한 PCR입니다. 삽입이 없거나 삽입되지 않은 제품의 예상 크기는 각각 2371 및 5016bp입니다. 좌측 레인: 마커, 레인 1, 2, 3, 4: 필라멘트의 PCR 산물을 각각 7일, 11일, 14일, 및 17일 후에 내성 필라멘트의 단리(형질전환 4주)한다. 레인 5: 야생형의 PCR 산물 (상이한 겔로부터). 7일 샘플에서, 삽입물은 염색체의 작은 분획에 존재한다. 이 분율은 야생형 밴드가 보이지 않는 17일까지 증가하며, 즉, 분리가 완료된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 5: 내인성 cpcB 프로모터의 조절하에서의 sfGFP 발현을 위한 벡터. 오렌지: 포미듐 라쿠나 상동성 서열, 보라색/파란색: pUC-19 벡터 백본, 녹색: sfGFP 및 KanR로 삽입합니다. 약어: sfGFP = 슈퍼폴더 녹색 형광 단백질; KanR = 카나마이신 내성. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 6: 포미둠 라쿠나에서의 sfGFP의 발현. P. lacuna 야생형 필라멘트(A) 및 pAK1(B), pAK2(C), pAK3(D) 및 pMH1(E)로 형질전환한 후의 형광 이미지. pMH1에서, sfGFP 유전자는 피코시아닌 ß 유전자의 3'에 배치되고, 따라서 내인성 cpcß 프로모터에 의해 구동되고; 다른 경우에, sfGFP는 각각 Synechocystis PCC 6803으로부터의 cpc560, A2813, 또는 psbA2s 프로모터에 의해 구동된다. 형광 설정은 GFP에 특이적이며; 모든 이미지는 동일한 통합 시간 및 광학 설정으로 기록되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: 4x 배율로 한천 표면에 있는 Phormidium lacuna 의 병합된 이미지. 첫 번째 이미지는 빨간색으로, 두 번째 이미지는 녹색으로 표시됩니다 (1 분 후에 촬영). 한천의 흔적도 주목하십시오. 배율 막대 = 100μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 8: 액체 매질에서 Phormidium lacuna 의 병합된 이미지. 두 이미지 사이의 시간 간격은 10초였다. 첫 번째 이미지는 빨간색으로 인쇄됩니다. 두 번째는 녹색으로 인쇄됩니다. 두 색상을 비교하면 10 초 이내의 움직임을 알 수 있습니다. 배율 막대 = 100μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 거르다 | HE10JO | HE10도 | GI08AO | GI09CO | HE15M2G1 |
| 컨티그 | 104 | 174 | 218 | 102 | 154 |
| 총 bp | 48,19,017 | 47,88,491 | 47,78,775 | 36,69,922 | 45,98,395 |
표 1: 포미듐 라쿠나 균주.
| Gi09CO | HE10도 | HE10JO | HE15M2G1 | |
| Gi08AO | 42 | 40 | 0 | 42 |
| Gi09CO | 2 | 42 | 0 | |
| HE10도 | 40 | 2 | ||
| HE10JO | 42 |
표 2. 10,876개의 아미노산을 갖는 20개의 코어 단백질의 서열에서 균주 간의 아미노산 차이.
| 세포 밀도 OD 750 nm | 1 | 1 | 3 | 3 | 5 | 5 | 7 | 7 |
| 세척 | 1 | 2 | 1 | 2 | 1 | 2 | 1 | 2 |
| 시네코시스티스 PCC 6803 | 2/5 | 5/5 | 1/4 | 4/4 | 0/4 | 4/4 | 0/4 | 3/4 |
| 포미듐 라쿠나 HE10도 | 4/4 | 4/4 | 4/4 | 4/4 | 3/ 4 | 4/4 | 3/3 | 3/3 |
표 3: Synechocystis PCC 6803 및 Phormidium lacuna HE10DO 시아노박테리아를 이용한 Cryoconservation 시험. 첫 번째 숫자는 동결 / 해동 후 생존 한 문화의 수를 보여줍니다. 두 번째 숫자는 총 시행 횟수를 보여줍니다.
보충 비디오 S1 : 시간 경과없이 액체 용액에서 Phormidium lacuna 필라멘트의 움직임. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 비디오 S2 : 시간 경과와 함께 한천 표면에서 Phormidium lacuna 필라멘트의 움직임. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 1 : Phormidium lacuna 의 변형을위한 벡터 복제. 변환 벡터의 목록; 클로닝을 위한 프라이머 리스트; gb 형식의 pMH1 시퀀스. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 2 : 라즈베리 파이 미니 컴퓨터를위한 쉘 스크립트 (sh). 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 3 : HE152G1의 DNA 서열. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 4 : GI08AO의 DNA 서열. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 5 : GI09CO의 DNA 서열. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 6 : HE10DO의 DNA 서열. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 7 : HE10JO의 DNA 서열. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
시아노박테리아의 많은 균주가 배양 컬렉션32,33,34,35,36으로부터 이용가능하지만, 이들 종들이 특정 특성에 적응하기 때문에 야생으로부터 새로운 시아노박테리아에 대한 요구가 여전히 존재한다. P. lacuna는 암석 풀에서 수집되었으며 소금 농도 및 온도30의 변화에 적응됩니다. 이 종의 균주는 2008, 2009 및 2010의 여행 중에 발견되었습니다. 여기에 설명 된 절차에 따라 P. lacuna의 5 균주가 분리되었고,이 균주 중 4 개는 멸균되었습니다. 균주 P. lacuna HE10JO는 rRNA 및 게놈 시퀀싱에 의해 확인된 해양 박테리아인 마리비르가 아틀란티카 박테리아로 영구적으로 오염된다. 이 박테리아는 기계적 분리, 다른 온도에서의 성장, 항생제 처리 또는 화학적 처리의 적용에도 불구하고 시아 노 박테리움에서 분리 될 수 없었습니다. 오염에도 불구하고, P. lacuna HE10JO는 다른 균주와 유사하게 재배될 수 있다. 이후의 여행에서 Oscillatoriales의 다른 구성원이 발견되었지만 아직 자세히 분석되지 않았습니다. P. lacuna는 다시 발견되지 않았다. P. lacuna가 이후 몇 년 동안 고립 된 이유와 두 개의 다른 장소에서 격리되었지만 나중에 발견되지 않은 이유는 분명하지 않습니다. 그것의 풍부함은 확실히 예측할 수없는 조건에 달려 있습니다. 온도, 소금 농도 및 무기 또는 유기 영양소는 암석에서 매우 다양합니다. 따라서 종 조성은 예측할 수없는 방식으로 시간이 지남에 따라 변동 될 수 있습니다.
자연 변형은 다른 시아 노 박테리아, 주로 단세포 종에 대해 확립됩니다. 필라멘트 P. lacuna 는 자연 변형이 확립 된 Oscillatoriales 순서의 유일한 종입니다. 변환은 거의 항상 현재의 프로토콜로 성공적이었습니다. 일반적으로 변형 시험 후 내성 필라멘트의 수는 상당히 다양하며 때로는 변형이 실패하여 귀중한 시간을 잃어 버리기도합니다. 따라서 여러 변환 프로젝트를 병렬로 수행하는 것이 좋습니다. 내성 균주의 분리 후 보통 4 주 후에 완전한 분리를위한 시간도 다를 수 있습니다. 카나마이신에서 성장한 후 완전한 분리를 보장하지 않기 때문에, 외부 및 내부 프라이머를 사용하여 PCR 검사를 수행하는 것이 중요합니다.
모든 벡터는 2 x 500-1,000 bp 상동성 서열, 예를 들어, PCR에 의해 숙주로부터 증폭되고 내성 카세트(예를 들어, 여기에 사용된 카나마이신 카세트 KanR)37,38에 의해 중단되어야 한다. 발현을 위해, 프로모터, 코딩 서열 (예를 들어, sfGFP39의 경우), 터미네이터, 및 내성 카세트는 상동성 서열 사이에 클로닝되어야 한다. 복제 전략은 종에 따라 다르며 실험의 목적에 따라 다릅니다.
이 형질전환 방법은 다른 Oscillatoriales 균주 또는 다른 시아노박테리아에서도 가능할 수 있다: 자연 형질전환은 거의 모든 다른 시아노박테리아 게놈 3,15,40에 존재하는 IV 타입 필리에 기초한다. 따라서 현재의 방법은 다른 종과의 새로운 시험을 자극 할 수 있습니다. IV 형 필리는 운동성과 관련이 있기 때문에 시아 노 박테리아가 운동성이있는 조건을 확인하는 것이 중요합니다.
유전자 삽입은 상동성 재조합에 기초하며, 상동성 부위의 붕괴를 초래한다. 따라서, 형질전환은 종종 유전자 녹아웃에 사용된다. 삽입된 유전자의 발현은 활성 프로모터 및 코딩 서열이 상동성 부위로 통합되는 경우 유도될 것이다. P. lacuna에서, 프로모터 활성은 종에 의존적이었다. 시네코시스티스 PCC sp 6803 또는 시네코코커스 sp. PCC 7002 31 및 P. lacuna의 cpcB 프로모터의 cpc560, A2813, 및 psbA2 프로모터는 sfGFP 발현을 구동할 수 있었다. 이들 구축물 중에서, 내인성 cpcB 프로모터는 sfGFP 유전자가 피코시아닌 ß 유전자의 3'에 위치하지만, 가장 강한 발현을 유도하였다. 이는 시아노박테리아 발현에서 내인성 프로모터의 보다 일반적인 사용을 나타낸다.
유전자 녹아웃과 모션 연구의 조합은 운동성과 광택시의 분자 메커니즘에 빛을 비출 것입니다. LED 광원은 광택시 실험에 빛을 제공할 수 있습니다. 거의 모든 파장을 사용할 수 있으며 조정 가능한 전원 공급 장치 및 전위차계로 광도를 조정할 수 있습니다. LED 홀더는 3D 프린터로 제작하여 다양한 LED의 조합을 쉽게 실현할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 작업은 Karlsruher Institute of Technology의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Autoclave 3870 ELV | Tuttnauer | 3870 ELV | |
| Bacto Agar | OttoNorwald | 214010 | |
| BG-11 Freshwater Solution | Sigma Aldrich | C3061 | |
| BG-11 medium | Merck | 73816-250ML | |
| Boric acid | Merck | 10043-35-3 | H3BO3 |
| Calcium chloride dihydrate | Carl Roth | 10035-04-8 | CaCl2 · 2 H2O |
| Cell culture flasks Cellstar with filter screw cap, sterile, 250 mL | Greiner | 658190 | |
| Cell culture flasks Cellstar with filter screw cap, sterile, 50 mL | Greiner | 601975 | |
| Centrifuge LYNX 4000 | Thermo Scientific | 75006580 | and rotor |
| Centrifuge microstar 17 | VWR International | N/A | for up to 13,000 rpm |
| Cetyltrimethylammonium Bromide (CTAB) | PanReac AppliChem | 57-09-0 | C19H42BrN |
| Chloroform : Isoamyl Alcohol 24 : 1 | PanReac AppliChem | A1935 |
|
| Cobalt(II) chloride hexahydrate | Merck | 7791-13-1 | CoCl2 · 6 H2O |
| Copper(II) sulphate pentahydrate | Merck | 7758-99-8 | CuSO4 · 5 H2O |
| D(+)-Biotin | Carl Roth | 58-85-5 | C10H16N2O3S |
| DNA ladder 1 kb | New England Biolabs | N3232 | |
| DNA ladder 100 bp | New England Biolabs | N3231 | |
| Electrical pipetting help accujet-pro S | Brand GmbH | 26360 | for pipetting 1-25 mL |
| Ethanol | VWR | 64-17-5 | C2H6O |
| Ethylenediamine tetraacetic acid disodium salt dihydrate | Carl Roth | 6381-92-6 | EDTA-Na2 · 2 H2O |
| Fluorescence microscope ApoTome | Zeiss | ||
| Fluorescence microscope Axio Imager 2 | Zeiss | ||
| French Pressure Cell Press | American Instrument Company | N/A | |
| Gel documation System Saffe Image | Invitrogen | ||
| Gelelctrophoresis system Mupid-One/-exu | ADVANCED | ||
| Glassware, different | |||
| Glycerol | Carl Roth | 56-81-5 | C3H8O3 |
| Iron(III) chloride hexahydrate | Merck | 10025-77-1 | FeCl3 · 6 H2O |
| Kanamycin | Sigma-Aldrich | 25389-94-0 | |
| Kanamycin sulphate | Carl Roth | 25389-94-0 | C18H36N4O11 · H2SO4 |
| Lauroylsarcosine, Sodium Salt (Sarcosyl) | Sigma Aldrich | 137-16-6 | C15H28NO3 · Na |
| LB Broth (Lennox) | Carl Roth | X964.4 | |
| Light source, fluorescent tube L18W/954 daylight | OSRAM | cultivation of cyanobacteria | |
| Light source, LED panel XL 6500K 140 W | Bloom Star | N/A | cultivation of cyanobacteria, up to 1,000 µmol m-2 s-1 |
| Magnesium chloride hexahydrate | Carl Roth | 7791-18-6 | MgCl2 · 6 H2O |
| Manganese(II) chloride tetrahydrate | Serva | 13446-34-9 | MnCl2 · 4 H2O |
| Microscope DM750 | Zeiss | ||
| Midi prep plasmid extraction kit NucleoBond Xtra Midi kit | Macherey-NAGEL GmbH & Co. KG | REF740410.50 | |
| Minicomputer Raspberry Pi 4 + | Conrad Electronics | 2138863-YD | for time-lapse recording |
| Ocular camera EC3 | Leica | for continuous recording up to 30 s | |
| Ocular camera MikrOkular Full HD | Bresser | for time-lapse recordings, coupled to Raspberry Pi minicomputer | |
| Petri dishes polystyrole, 100 mm x 20 mm | Merck | P5606-400EA | |
| Petri dishes polystyrole, 60 mm x 15 mm | Merck | P5481-500EA | |
| Photometer Nanodrop ND-1000 | Peqlab Biotechnologie | ||
| Photometer Uvikon XS | Goebel Instrumentelle Analytik GmbH | ||
| Pipetman 100-1,000 µL | Gilson | SKU: FA10006M | |
| Pipetman 10-100 µL | Gilson | SKU: FA10004M | |
| Plastic pipettes 10 mL, sterile | Greiner | 607107 | |
| Plastic tube, sterile, 15 mL | Greiner | 188271 | |
| Plastic tube, sterile, 50 mL | Greiner | 227261 | |
| Potassium bromide | Carl Roth | 7758-02-3 | KBr |
| Potassium chloride | Carl Roth | 7447-40-7 | KCl |
| Power supply Statron 3252-1 | Statron Gerätetechnik GmbH | ||
| Power supply Voltcraft PPS 16005 | Conrad Electronics | for LED | |
| Proteinase K | Promega | MC500C | from Maxwell 16 miRNA Tissue Kit AS1470 |
| Q5 polymerase | New England Biolabs | M0491S | |
| Sequencing kit NextSeq 500/550 v2.5 | Illumina | ||
| Sequencing system NextSeq 550 SY-415-1002 | Illumina | ||
| Shaker Unimax 2010 | Heidolph Instruments | for cultivation | |
| Sodium acetate | Carl Roth | 127-09-3 | NaCH3COO |
| Sodium chloride | Carl Roth | 7647-14-5 | NaCl |
| Sodium dihydrogen phosphate monohydrate | Carl Roth | 10049-21-5 | NaH2PO4 · H2O |
| Sodium fluoride | Carl Roth | 7681-49-4 | NaF |
| Sodium hydrogen carbonate | Carl Roth | 144-55-8 | NaHCO3 |
| Sodium molybdate dihydrate | Serva | 10102-40-6 | Na2MoO4 · 2 H2O |
| Sodium nitrate | Merck | 7631-99-4 | NaNO3 |
| Sodium sulphate | Carl Roth | 7757-82-6 | Na2SO4 |
| Strontium chloride hexahydrate | Carl Roth | 10025-70-4 | SrCl2 · 6 H2O |
| Thiamine hydrochloride | Merck | 67-03-8 | C12H17ClN4OS · HCl |
| TRIS | Carl Roth | 77-86-1 | C4H11NO3 |
| Ultrasonic device UP100H with sonotrode MS3 | Hielscher Ultrasound Technology | UP100H | |
| Ultraturrax Silent Crusher M | Heidolph Instruments | homogenizer | |
| Urea | Carl Roth | 57-13-6 | CH4N2O |
| Vitamin B12 | Sigma | 68-19-9 | C63H88CoN14O14P |
| Vitamin solution | 0.3 µM thiamin-HCl, 2.1 nM biotin, 0.37 nM cyanocobalamin | ||
| Water Stills, Water treatment | VEOLIA water technologies | ELGA_21001 | |
| Zinc sulphate heptahydrate | Sigma | 7446-20-0 | ZnSO4 · 7 H2O |
| software, URL | |||
| gatb-minia program for DNA assembly | https://github.com/GATB/gatb-minia-pipeline | makes large scaffolds from short DNA reads, Linux based | |
| ImageJ | software for immage processing (pixel intensities, circle diameter) | ||
| RAST annotation server | https://rast.nmpdr.org | input: genome DNA sequence, detects open reading frames, lists protein sequences and their functions | |
| Culture media | |||
| Artificial seawater | 0.41 M NaCl , 53 mM MgCl2,28 mM Na2SO4, 10 mM CaCl2 , 9 mM KCl , 2.4 mM NaHCO3 ,0.84 mM KBr, 0.49 mM H3BO3, 90 µM SrCl2, 72 µM NaF | ||
| f/2 -liquid medium | artificial seawater, 0.1 % (v/v) trace element solution, 0.05 % (v/v) vitamin solution, 0.88 mM NaNO3, 36 µM NaH2PO4 | ||
| f/2+ liquid medium | f/2-medium, with 10 times increased NaNO3 and NaH2PO4 (0.88 mM NaNO3, 36 µM NaH2PO4 | ||
| f/2+-agar | 3 % (w/v) bacto agar, artificial seawater, 0.1 % (v/v) trace element solution, 0.05 % (v/v) vitamin solution ,8.8 mM NaNO3, 0.36 mM NaH2PO4 | ||
| f/2-agar | 3 % (w/v) bacto agar, artificial seawater, 0.1 % (v/v) trace element solution, 0.05 % (v/v) vitamin solution ,0.88 mM NaNO3, 36 µM NaH2PO4 | ||
| Trace element solution | 0.36 mM NaH2PO4, 12 µM Na2EDTA, 39 nM CuSO4, 26 nM Na2MoO4 , 77 nM ZnSO4, 42 nM CoCl2, 0.91 µM MnCl2 | ||
| Vitamin solution | 0.3 µM thiamin-HCl, 2.1 nM biotin, 0.37 nM cyanocobalamin |
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