Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Natuurlijke transformatie, eiwitexpressie en cryoconservatie van de lacune van de filamenteuze cyanobacterium Phormidium

Published: February 1, 2022 doi: 10.3791/63470
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 2, 3, 3, 1
1Botanical Institute, Karlsruhe Institute of Technology KIT, 2Institute for Biological Interfaces 5 (IBG 5), Karlsruhe Institute of Technology KIT, 3Institut für Technische Mikrobiologie, Hochschule Mannheim

Summary

Phormidium lacuna is een filamenteuze cyanobacterie die werd geïsoleerd uit mariene rotspoelen. Dit artikel beschrijft de isolatie van filamenten uit natuurlijke bronnen, DNA-extractie, genoomsequencing, natuurlijke transformatie, expressie van sfGFP, cryoconservatie en motiliteitsmethoden.

Abstract

Cyanobacteriën zijn de focus van fundamenteel onderzoek en biotechnologische projecten waarin zonne-energie wordt gebruikt voor de productie van biomassa. Phormidium lacuna is een nieuw geïsoleerde filamenteuze cyanobacterie. Dit artikel beschrijft hoe nieuwe filamenteuze cyanobacteriën kunnen worden geïsoleerd uit mariene rotsspoelen. Het beschrijft ook hoe DNA kan worden geëxtraheerd uit filamenten en hoe de genomen kunnen worden gesequenced. Hoewel transformatie is vastgesteld voor veel eencellige soorten, wordt het minder vaak gemeld voor filamenteuze cyanobacteriën. Een vereenvoudigde methode voor de natuurlijke transformatie van P. lacune wordt hier beschreven. P. lacuna is het enige lid van de orde Oscillatoriales waarvoor natuurlijke transformatie is vastgesteld. Dit artikel laat ook zien hoe natuurlijke transformatie wordt gebruikt om superfolder groen fluorescerend eiwit (sfGFP) tot expressie te brengen. Een endogene cpcB-promotor induceerde ongeveer 5 keer sterkere expressie dan cpc560, A2813 of psbA2-promotors van Synechocystis sp. PCC6803. Verder werd een methode voor de cryopreservatie van P. lacuna en Synechocystis sp.CPP 6803 vastgesteld en worden methoden beschreven voor het beoordelen van de beweeglijkheid in een vloeibaar medium en op agar- en plastic oppervlakken.

Introduction

Cyanobacteriën zijn prokaryote organismen die fotosynthese gebruiken als energiebron 1,2. Het onderzoek richt zich steeds meer op cyanobacteriële soorten. Verschillende cyanobacteriën kunnen worden getransformeerd met DNA3. Genen kunnen bij deze soorten worden uitgeschakeld of overexpressie krijgen. De transformatie is echter beperkt tot enkele soorten 4,5,6,7,8,9,10,11, en het kan moeilijk zijn om transformatie vast te stellen in stammen uit kweekcollecties of het wild 8. Stammen van de filamenteuze soort Phormidium lacuna (figuur 1) werden geïsoleerd uit mariene rotsspoelen, waarin omgevingsomstandigheden, zoals zoutconcentraties of temperatuur, in de loop van de tijd fluctueren. Deze filamenteuze cyanobacteriën kunnen worden gebruikt als modelorganismen voor de orde Oscillatoriales12 waartoe ze behoren.

Tijdens proeven met genoverdracht door elektroporatie13,14 werd ontdekt dat P. lacune kan worden getransformeerd door natuurlijke transformatie15. In dit proces wordt DNA op natuurlijke wijze opgenomen door sommige cellen. In vergelijking met andere transformatiemethoden 16,17 heeft natuurlijke transformatie het voordeel dat er geen extra hulpmiddelen nodig zijn die de procedure kunnen bemoeilijken. Elektroporatie vereist bijvoorbeeld de juiste cuvetten, intacte draden en selectie van de juiste spanning. P. lacune is momenteel het enige Oscillatoriales-lid dat vatbaar is voor natuurlijke transformatie. Omdat het oorspronkelijke protocol is gebaseerd op elektroporatieprotocollen, bevatte het nog steeds verschillende wasstappen die mogelijk onnodig zijn. Verschillende benaderingen werden getest om het protocol te vereenvoudigen, wat leidde tot het hier gepresenteerde transformatieprotocol.

De genoomsequentie is essentieel voor verdere moleculaire studies op basis van gen knock-out of overexpressie. Hoewel genoomsequenties binnen korte tijd kunnen worden verkregen met sequencingmachines van de volgende generatie, kan de extractie van DNA moeilijk zijn en afhankelijk van de soort. Bij P. lacune werden verschillende protocollen getest. Vervolgens werd een op gemodificeerde cetyltrimethylammoniumbromide (CTAB) gebaseerde methode vastgesteld, wat resulteerde in een aanvaardbare zuiverheid van DNA en DNA-opbrengsten van elke zuiveringscyclus voor voortgezet werk in het laboratorium. Het genoom van vijf stammen zou met dit protocol gesequenced kunnen worden. De volgende logische transformatiestap was het vaststellen van eiwitexpressie in P. lacune.

De sfGFP die in dit protocol als markereiwit wordt gebruikt, kan met elke fluorescentiemicroscoop worden gedetecteerd. Alle promotors die werden getest, konden worden gebruikt voor P. lacuna sfGFP-expressie. Het toenemende aantal stammen dat voortkomt uit transformatie heeft geleid tot de behoefte aan een methode voor het opslaan van de culturen. Dergelijke methoden zijn vastgesteld voor Escherichia coli en vele andere bacteriën18. In standaardprotocollen worden glycerolculturen bereid, overgebracht in vloeibare stikstof en opgeslagen bij -80 °C. Deze methode vereist slechts een paar stappen en is zeer betrouwbaar voor die soorten waarvoor het is vastgesteld. Het standaardprotocol was niet haalbaar voor P. lacune omdat levende cellen niet in alle gevallen konden worden teruggevonden. Toen glycerol echter na het ontdooien werd verwijderd, overleefden cellen van alle onderzoeken. Eenvoudige methoden worden gepresenteerd voor de analyse van de beweeglijkheid van P. lacune, die kan worden gecombineerd met knock-out mutagenese om type IV pili of de rol van fotoreceptoren te onderzoeken. Deze testen verschillen van die van eencellige cyanobacteriën 19,20,21 en kunnen ook nuttig zijn voor andere Oscillatoria.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Isolatie van de natuurlijke omgeving

OPMERKING: Groene algen, diatomeeën, filamenteuze cyanobacteriën en andere microalgen kunnen worden geïsoleerd. Het protocol kan worden gebruikt voor alle microalgensoorten uit steenpoelen die onder laboratoriumomstandigheden groeien. Filamenteuze cyanobacteriën die behoren tot Oscillatoriales kunnen gemakkelijk worden herkend aan hun beweging en filamenteuze vorm. De soort kan in een semipure toestand worden geïdentificeerd door genoomsequencing of 16S rRNA-sequencing.

  1. Breng vloeibare zeewatermonsters over van mariene rotsspoelen (d.w.z. holtes in de rotsachtige kust) in kolven van 50 ml. Noteer voor elke kolf de exacte plaats of coördinaten van de natuurlijke bron. Filter indien mogelijk de inhoud door netten van 50 μm om de hoeveelheden zoöplankton te verminderen. Bewaar de monsters bij 4 °C totdat ze kunnen worden gesubcultureerd.
  2. Breng 1 ml culturen over op 10 cm petrischalen met 3% bacto-agar in f/2 medium22,23 (zie de tabel met materialen). Bereid tot 20 borden. Kweek onder wit licht van 50 μmol m-2 s-1.
    OPMERKING: Hogere lichtintensiteiten kunnen worden gebruikt voor de teelt. Intensiteit tot 400 μmol m-2 s-1 kan worden gebruikt voor P. lacune, hoewel andere soorten lichtgevoeliger kunnen zijn.
  3. Breng na een week de gewenste cellen over naar verse agarplaten met behulp van een steriele tang. Isoleer de cellen onder een binoculaire microscoop onder steriele omstandigheden. Bewaar de oude agarplaat bij 4 °C totdat er cellen verschijnen en groeien op de nieuwe agarplaat.
  4. Herhaal deze overdrachtsstap elke week om besmetting te elimineren. Gebruik het blote oog voor het detecteren van zware verontreiniging en een microscoop met 400x vergroting voor extra controles op verontreiniging.
  5. Als een monster vrij van besmetting lijkt, test dan op bacteriële of schimmelbesmetting op agarplaten. Breng een fractie van de cultuur met een inentingslus over naar een LB24 agarplaat (10 cm diameter), houd de plaat op kamertemperatuur en controleer op de groei van verontreinigingen gedurende 1-3 dagen.
  6. Als een steriele filamenteuze cyanobacteriële soort wordt verkregen, gebruik deze dan voor verder kweekwerk. Cultiveer P. lacune in vloeistof of op bacto-agar platen. Gebruik kolven van 250 ml met 50 ml f/2 medium of f/2+ medium voor vloeibare kweek.

2. DNA-extractie

OPMERKING: Deze methode wordt toegepast vanaf 25 26

  1. Bereid twee kolven met 50 ml f/2 medium. Ent elk met ~ 1 ml P. lacuna filamenten uit andere groeiende culturen. Bewaar de culturen gedurende 7 dagen of langer onder roeren (horizontale rotatie) bij 50 tpm onder wit licht (50 μmol m-2 s-1) bij 25 °C.
  2. Behandel de kweek met echografie (zie de tabel met materialen) gedurende 2 minuten met volledige energie. Od meten bij 750 nm; controleer of het ~ 0,5 is. Blijf de culturen laten groeien als de OD te laag is.
  3. Verzamel de filamenten met 5.000 × g, 20 min centrifugatie. Verwijder het supernatant. Breng de filamenten met restvloeistof over in de kamer van een French Press27. Stel de druk van de Franse pers in op 20.000 psi en extraheer de cellen.
    OPMERKING: De Franse pers zal alle cellen lyseren en het DNA vrijgeven; sterke schuifkrachten zullen 1.500 bp DNA-fragmenten produceren.
  4. Centrifugeer het monster gedurende 10 minuten bij 10.000 × g en verwijder het supernatant.
  5. Voeg 400 μL lysisbuffer (4 M ureum, 0,1 M Tris/Cl, pH 7,4) en 50 μL proteïnase K (10 mg/ml) toe aan de pellet. Verwarm het monster gedurende 60 minuten tot 55 °C met schudden bij 550 tpm.
  6. Voeg 1 ml DNA-extractiebuffer toe (3% CTAB, 1,4 M NaCl, 10 mM EDTA, 0,1 M Tris/Cl, 1% Sarkosyl, 0,1 M DTT, pH 8) en incubeer gedurende 60 minuten bij 55 °C en 550 tpm. Breng de oplossingen over in centrifugaalbuizen en voeg twee volumes chloroform/isoamylalcohol toe (24/1).
  7. Centrifugeer het monster na het schudden gedurende 5 minuten bij 9.000 × g. Breng de bovenste, waterige fase over in reactieflacons en voeg 1 ml ijskoude ethanol en 50 μl 3 M natriumacetaat toe.
  8. Vortex het monster en plaats het gedurende 1 uur of langer op -20 °C.
  9. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 10.000 × g (4 °C) en gooi het supernatant weg. Was de pellet met 70% ethanol.
  10. Centrifugeer het monster opnieuw. Verwijder het supernatant en droog de pellet een nacht. Los het DNA op in nucleasevrij water. Meet het DNA-spectrum om te controleren of de OD 260 nm/OD 280 nm tussen 1,6 en 1,9 ligt.
  11. Analyseer de grootte van het DNA op een agarose elektroforese gel28.
  12. Sequentieer het genomische DNA door next-generation sequencing gedurende 300 cycli, met een gepaarde instelling en leeslengte van 150 basen (zie de tabellen van materialen).
  13. Voer de montage uit met het juiste computerprogramma; zie het voorbeeld in de tabel met materialen.
  14. Dien het conceptgenoom in bij de RAST-server voor annotatie.
    OPMERKING: Upload DNA-sequenties om binnen enkele minuten volledige annotatie te verkrijgen.

3. Natuurlijke transformatie en GFP-expressie

OPMERKING: Transformatie is gebaseerd op een plasmidevector vermeerderd in E. coli; pGEM-T of pUC19 kan worden gebruikt als backbone vectoren. Kloontechnieken zijn in veel laboratoria gevestigd; zie ook standaardprotocollen28 en de artikelen over transformatievectoren voor P. lacune15,29. Voorbeelden voor vectoren voor sfGFP-expressie worden beschreven in de sectie representatieve resultaten. Details van vier nog niet gepubliceerde vectoren worden verstrekt in Supplemental File 1.

  1. Voer alle stappen uit met steriel materiaal onder steriele laboratoriumomstandigheden (schone bank, steriel glaswerk).
  2. Ent 2 x 50 ml f/2 vloeibaar medium in twee kolven van 250 ml met 2 x 1 ml P. lacunefilamenten uit een loopcultuur. Kweek in wit licht (50 μmol m-2 s-1) onder roeren (horizontale rotatie, 50 rpm) gedurende ~ 5 dagen bij 25 °C.
  3. Bereid ~200 μg van het transformatievector-DNA voor met behulp van een midi-voorbereidingskit (zie de materiaaltabel) volgens de instructies van de fabrikant.
  4. Homogeniseer 100 ml P. lacuna celluspensie (zie de materiaaltabel) bij 10.000 tpm gedurende 3 minuten. Meet OD bij 750 nm (gewenste waarde = 0,35).
  5. Centrifugeer de celsuspensie gedurende 15 minuten bij 6.000 × g. Verwijder het supernatant en suspensie de pellet in 800 μL (totaal volume inclusief restvloeistof en filamenten) van de resterende vloeistof en extra f/2+ medium.
  6. Neem acht f/2+ bacto-agar platen (10 cm diameter) met 120 μg/ml kanamycine. Pipetteer 10 μg DNA in het midden van elke agarplaat. Pipetteer onmiddellijk 100 μL celsuspensie in het midden van elke agarplaat (bovenop het DNA).
  7. Houd de agarplaat zonder deksel op de schone bank om de overtollige vloeistof te laten verdampen. Sluit het bord en kweek het gedurende 2 dagen in wit licht bij 25 °C.
  8. Verdeel de filamenten van elke agarplaat met een inentingslus over verschillende verse f/2+ bacto-agarplaten die 120 μg/ml kanamycine bevatten. Kweek de platen in wit licht bij 25 °C en controleer de culturen regelmatig onder een microscoop.
  9. Identificeer levende, getransformeerde filamenten na 7-28 dagen onder de microscoop. Zoek naar gezonde, groene filamenten (figuur 2) die verschillen van andere filamenten. Als deze groene filamenten kunnen worden geïdentificeerd, ga dan verder met de volgende stap; bewaar het bord anders nog 7 dagen.
  10. Gebruik een tang om deze geïdentificeerde levende filamenten over te brengen in 50 ml vloeibaar f/2+ medium met 250 μg/ml kanamycine. Kweek in wit licht bij 25 °C op een shaker (horizontale rotatie, 50 rpm). Observeer de groei gedurende maximaal vier weken.
  11. Breng de filamenten terug naar agarmedium met 250 μg/ml kanamycine en wacht tot de filamenten groeien. Breng na enkele dagen afzonderlijke filamenten over naar een verse agarplaat met een hogere concentratie kanamycine, bijvoorbeeld 500 μg / ml. Bewaar de originele plaat.
  12. Zorg ervoor dat de filamenten worden vermeerderd in een hoge concentratie kanamycine in vloeibare cultuur of op agar. Verhoog de kanamycineconcentratie opnieuw om de segregatie te versnellen.
    OPMERKING: Getransformeerde P. lacune groeit in maximaal 10.000 μg / ml kanamycine. Andere soorten verdragen zulke hoge concentraties misschien niet.
  13. Als resistente cellen worden gekweekt en breed over een plaat worden verdeeld, test dan de integratie van de insert in het genoom van P. lacune door PCR uit te voeren met buitenste en binnenste primers.
    1. Gebruik primers die zijn ontworpen voor het klonen van de insertie als binnenprimers.
    2. Selecteer voor het ontwerp van de buitenste primers sequenties die 5' en 3' van de voorgestelde insertieplaats zijn op het genoom van P. lacuna maar buiten de insertie.
    3. Gebruik voor PCR-reacties binnenprimers en buitenprimers. Gebruik de resistente stam(en) en het wilde type.
      OPMERKING: Binnenprimers geven aan dat de insert aanwezig is; buitenste primers geven aan dat de insert op de juiste locatie is ingebracht.
  14. Plaats voor elke PCR-reactie ~10 mg van de filamenten direct in de PCR-buizen en voer PCR uit volgens standaardprotocollen24. Als er geen product wordt verkregen, varieert u de gloeitemperatuur en wast u de filamenten met water.
    OPMERKING: Veel verschillende polymerasen kunnen worden gebruikt in PCR. Standaardpolymeerassen, zoals Taq-polymerase, hebben een hoger foutenpercentage dan foutcontrolepolymerasen, die duurder zijn. Deze analytische PCR vereist geen foutcontrolepolymerase. Foutcontrolepolymeerase moet echter worden getest als er geen PCR-product wordt verkregen met een standaardpolymerase.
  15. Analyseer de PCR-producten van de resistente lijn op agarose-elektroforese24.
    1. Vergelijk bandposities met marker en vergelijk het wildtype en de transformator. Zoek bij binnen- en buitenprimers naar een grotere band voor de transformator dan het wildtype (vanwege het inbrengen van de weerstandscassette) of twee banden voor de transformator: een met de grootte van de wild-type band en een grotere. Aangezien het laatste geval wijst op onvolledige segregatie, moet u doorgaan met de teelt met hoge kanamycineconcentraties.
      OPMERKING: Voor meer informatie over PCR en elektroforese, zie15,24 of andere standaardliteratuur.
  16. Voor GFP-expressie: observeer afzonderlijke filamenten met een fluorescentiemicroscoop (zie de tabel met materialen) bij een vergroting van het objectief ingesteld op 40x of 63x. Leg een helder veldtransmissiebeeld en een fluorescentiebeeld vast. Gebruik de volgende instellingen voor GFP: 470 nm bandpass voor excitatie, 525 nm bandpass voor emissie en een 495 nm bundelsplitter, initiële belichtingstijd van 500 ms.
  17. Pas de belichtingstijd aan voor duidelijke fluorescentiesignalen, waarbij verzadigingsintensiteiten worden vermeden. Probeer dezelfde instelling te gebruiken voor alle voorbeelden.
  18. Omdat de wild-type filamenten ook fluorescentie zullen vertonen, kunt u afbeeldingen vastleggen met dezelfde instellingen als hierboven voor deze achtergrondfluorescentie.
    OPMERKING: De spanning die GFP tot expressie brengt, moet een hoger signaal hebben; anders drukt het geen GFP uit.
  19. Bereken en vergelijk op basis van belichtingstijden en de pixelintensiteiten van de fluorescentiebeelden het GFP-gehalte van de verschillende filamenten.

4. Cryoconservatie

OPMERKING: P. lacune en de eencellige cyanobacterie Synechocystis sp. PCC 6803 worden gebruikt. De huidige methode werkt beter voor P. lacune.

  1. Kweek P. lacune of Synechocystissp PCC 6803 gedurende ten minste 10 dagen in respectievelijk 10 ml f/2+ of BG-11 medium onder wit licht (50 μmol m-2 s-1) bij 25 °C onder roeren (horizontale rotaties, 50 tpm).
  2. Homogeniseer de P. lacunecultuur (zie de tabel met materialen) bij 10.000 tpm gedurende 3 minuten of met een echoapparaat (zie de tabel met materialen) gedurende 2 minuten bij volledige energie. Bepaal OD 750 nm van beide culturen om te controleren of de waarde tussen 1 en 7 ligt.
  3. Verzamel de cellen door centrifugeren bij 6.000 × g gedurende 15 minuten. Verwijder het supernatant.
  4. Suspensie van de celkorrel in 800 μL f/2+ of BG-11 medium (eindvolume) en breng over naar een cryovial van 2 ml. Voeg 800 μL van een 50% glyceroloplossing toe aan de celsuspensie. Sluit de injectieflacon en meng door herhaaldelijk om te keren.
  5. Breng het cryoviaal over in vloeibare stikstof en bewaar het in een cryobox in een vriezer van -80 °C. Noteer de positie van de doos in de vriezer en de coördinaten van het monster in de doos.
  6. Voor herstel van de cellen, verwijder de cryoviale en ontdooi de inhoud bij kamertemperatuur. Breng de inhoud over in een reactiebuis van 2 ml.
  7. Was het monster tweemaal. Centrifugeer voor de1e wasbeurt gedurende 5 minuten op 6.000 × g . Verwijder het supernatant en vul de pellet opnieuw op in 2 ml f/2+ of BG-11 medium. Voor de2e wasbeurt, opnieuw centrifugeer bij 6.000 × g gedurende 5 minuten, verwijder het supernatant en suspensieer de pellet in 2 ml f/2+ of BG-11 medium.
  8. Om de integriteit van deze cellen die klaar zijn voor teelt te controleren, brengt u de pellet over naar 9 ml medium en kweekt u ze in wit licht (50 μmol m-2 s-1) onder roeren (55 rpm). Vergelijk de OD 750 nm van de cultuur op de eerste dag en na 1 week.

5. Beweeglijkheid van Phormidium lacune

OPMERKING: Er worden drie verschillende assays beschreven. In alle gevallen wordt dezelfde cultuur gebruikt.

  1. Cultiveer P. lacune in f/2 medium onder horizontaal roeren (50 rpm) in wit licht (50 μmol m-2 s-1) gedurende ~5 dagen totdat de geschatte OD 750 nm 0,35 is. Bewaar het monster bij 4 °C tot gebruik.
  2. Homogeniseer de filamenten (zie de tabel met materialen) bij 10.000 tpm gedurende 3 minuten of met ultrageluid (zie de tabel met materialen) gedurende 1 minuut bij een maximaal vermogen en cyclus van 1. Maatregel OD 750 nm. Indien hoger dan 0,35, verdun de fractie met f/2 medium. Gebruik deze oplossing in motiliteitstests in stap 5.3, 5.4 en 5.5.
  3. Bepaling voor beweging in vloeibaar medium
    1. Voor directe waarneming van de beweeglijkheid brengt u 8 ml medium met P. lacune (vanaf stap 5.2) over in een petrischaaltje van 6 cm. Wacht een paar minuten totdat het monster op kamertemperatuur is. Dek de petrischaal af met cellofaanfolie.
    2. Plaats een microscoopglaasje op de x-y tafel van een standaard microscoop met een camera. Schakel het microscooplicht in. Gebruik idealiter altijd dezelfde elektrische en optische instellingen voor de verlichting. Verplaats een 4x of 10x objectief in het pad van het licht.
    3. Leg de petrischaal bovenop de glijbaan. Pas afzonderlijke filamenten of filamentbundels aan met x-, y- en z-bewegingen van de tafel.
      OPMERKING: Vanwege de driedimensionale opstelling kan slechts een deel van de relevante sectie in beeld zijn. De cellofaanfolie maakt het mogelijk om de focus onbeperkt aan te passen.
    4. Observeer bewegingen van afzonderlijke filamenten of bundels. Zorg ervoor dat de objectieflens de vloeistof niet raakt. Registreer de bewegingen van filamenten met een standaard microscoopcamera (zie Aanvullende video S1).
  4. Test voor beweging op het oppervlak
    1. Voor de observatie van filamentmotiliteit op agaroppervlakken, bereid 6 cm petrischalen met f / 2 bacto-agar. Zorg ervoor dat de agar hoog genoeg is zodat de objectieflens dicht bij het agaroppervlak kan komen. Als alternatief kunt u een ~ 3 mm dikke agarlaag bereiden en de filamenten door de agar opnemen (houd de plaat ondersteboven of gebruik een omgekeerde microscoop).
    2. Pipetteer 0,5 ml van een oplossing met P. lacune (uit stap 5.2) op het bacto-agar oppervlak van een petrischaaltje van 6 cm. Laat de vloeistof het oppervlak binnendringen. Sluit de petrischaal en observeer de beweging van de filamenten op het oppervlak met behulp van een 4x of 10x objectief.
    3. Zorg ervoor dat dezelfde elektrische en optische instellingen van de microscoop worden gebruikt tijdens de opname en in latere opnames.
    4. Leg time-lapse-opnames vast met een oculaire camera en een minicomputersysteem. Zorg ervoor dat het tijdsinterval tussen volgende afbeeldingen 5 s-1 min is. Programmeer het Linux-script van de minicomputer om de time-lapse-opname te regelen. Zie Supplemental File 2 voor een voorbeeldscript en Supplemental Video S2 als voorbeeld.
  5. Test voor fototaxis
    1. Bereid voor fototaxisexperimenten LED-houders (light-emitting diode) voor (hier met een 3D-printer) waarin de geselecteerde 5 mm LED's zijn gemonteerd om een gebied van 20 mm2 van onder naar boven te bestralen (figuur 3). Gebruik indien nodig veel LED-houders parallel en verbind elke LED elektrisch via een weerstand en potentiometer met een instelbare voeding. Meet en pas de LED-intensiteiten aan, afhankelijk van het experiment. Zorg ervoor dat de hele instelling zich in een donkere kamer of een gesloten donkere container bevindt.
    2. Plaats 8 ml van het medium met P. lacune (uit stap 5.2) in een petrischaaltje van 6 cm. Pas de lichtintensiteit van de LED aan. Sluit de petrischaal met het deksel en plaats deze op een LED-houder zodat de LED in het midden van de petrischaal zit.
    3. Leg na de gewenste duur (meestal 2 dagen) een beeld van de petrischaal vast met een smartphonecamera die direct op de positie van de lichtbehandeling is gericht. Gebruik een wit LED-paneel voor bestraling van het monster. Gebruik de handmatige instellingen van de camera; vermijd reflecties van licht; altijd aanpassen om dezelfde afstand tussen de cameralens en het monster te krijgen. Zorg ervoor dat de belichtingsinstellingen een beeld geven dat geschikt is voor latere analyses met ImageJ.
    4. Kwantificeer de diameter van de centrale cirkel van filamenten met behulp van ImageJ-software.
      1. Open ImageJ, klik op Bestand | Open, selecteer het gewenste bestand en klik op Enter.
      2. Selecteer de knop Recht (met een rechte lijn). Druk op de linkermuisknop om een lijn te trekken van het ene uiteinde van de petrischaal naar het andere uiteinde. Zorg ervoor dat de lijn door het midden van de cirkel van filamenten loopt.
      3. Druk op Ctrl-K op het toetsenbord of klik op | analyseren Plotprofiel in het menu AfbeeldingJ. Zoek naar een x-y-venster met pixelintensiteiten uitgezet versus afstand - een 1D-profiel van de petrischaal. Zorg ervoor dat de laagste pixelintensiteit iets boven 0 ligt en de hoogste waarde onder 255.
      4. Schat een gemiddelde waarde voor de pixelintensiteit buiten de cirkel en een andere gemiddelde waarde voor de pixelintensiteit in de cirkel. Schat op de y-positie tussen deze waarden de x-waarden van beide zijden van de cirkel door met de muis op deze posities te wijzen. Noteer beide waarden en bereken het verschil.
      5. Verkrijg de hoogste x-waarde door de muis op de y-as aan de rechterkant te wijzen. Merk op dat deze waarde e de diameter van de petrischaal vertegenwoordigt. Als deze diameter 5 cm is, bereken dan de diameter van de centrale filamentcirkel als d/e × 5 cm.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Volgens de bovengenoemde methoden werden 5 verschillende stammen van P. lacune geïsoleerd uit rotsspoelen en gesequenced (figuur 1 en tabel 1). Alle culturen waren steriel na ~1 jaar subculturering behalve P. lacuna HE10JO. Deze stam is nog steeds besmet met Marivirga atlantica, een mariene bacterie. Tijdens daaropvolgende Helgoland-excursies werden andere filamenteuze cyanobacteriën geïsoleerd uit rotspoelen, die verschillen van P. lacune en moeten worden gekarakteriseerd.

Verschillende DNA-extractie- en zuiveringsmethoden werden getest op P. lacune. De beste resultaten werden verkregen met een geoptimaliseerde CTAB-methode zoals hierboven beschreven. DNA-opbrengsten waren 310 ± 50 μg/ml, OD 260 nm/OD 280 nm was 1,7 ± 0,03 en OD 260 nm/OD 230 nm was 0,78 ± 0,04 (n = 17). Genoomsequencing toonde aan dat het DNA van alle stammen enigszins anders was, zoals verwacht (tabel 1). Kerneiwitsequenties vertoonden een maximaal verschil van 0,04% (tabel 2). Hoewel alle conceptgenomen onvolledig waren, kan men aannemen dat >98% van het genoom van HE10JO30 werd gesequenced. Deze schatting is gebaseerd op het aantal onvolledige open leesframes. Partiële eiwitsequenties konden gemakkelijk worden geïdentificeerd na RAST-annotatie van HE10DO en HE10JO. In HE10JO hadden 60 van de ~4.500 eiwitten een ontbrekende N- of C-terminale sequentie. De genoomsequenties zijn te vinden in het supplement (Aanvullend bestand 3, aanvullend bestand 4, aanvullend bestand 5, aanvullend bestand 6 en aanvullend bestand 7).

Interessant is dat stammen van dezelfde soort werden geïsoleerd van twee eilanden, Helgoland en Giglio. De lineaire afstand tussen beide eilanden is 1.400 km. Er moet een verbinding zijn tussen beide plaatsen, bijvoorbeeld door schepen via zee of, waarschijnlijker, door trekvogels. Veel vogelsoorten zijn te vinden op beide eilanden, en veel van hen zijn trekvogels. De diversiteit binnen P. lacuna stammen van één eiland was groter dan tussen de dichtstbijzijnde Helgoland en Giglio stammen (Tabel 2). Dit duidt op een intense uitwisseling tussen beide plaatsen.

De natuurlijke transformatie werd getest met HE10DO als belangrijkste soort en met HE10JO. Het huidige protocol is eenvoudiger dan het eerder beschreven protocol12 vanwege het verminderde aantal wasstappen en minder overdrachtsstappen na transformatie. Deze nieuwe methode wordt continu toegepast in het laboratorium; ~15 succesvolle transformaties werden bereikt.

De KanR-weerstandscassette werd meestal geïntegreerd in de homologe locatie die werd gedefinieerd door de aangrenzende regio's, zoals aangetoond door PCR met behulp van binnen- en buitenprimers. Zoals de meeste cyanobacteriën is P. lacuna polyploïde. Het kan meer dan 100 chromosomen per cel12 hebben. Een PCR-test met buitenste primers ~ 1 week na de transformatie heeft meestal 2 banden op de elektroforesegel, één met de grootte van de wild-type band en één langzamer migrerende band die het inbrengen van de weerstandscassette aangeeft (figuur 4). De dubbele band geeft aan dat alleen een subfractie van de chromosomen de insertie bevat. Na 4 weken selectie op kanamycine is de segregatie meestal voltooid en verschijnt er slechts één grote PCR-band op gels. In het geval van de transformatie met pMH1 (zie hieronder) was de segregatie echter na meer dan 3 maanden voltooid.

De vectoren pAK1, pAK2, pAK3 en pMH1 werden geconstrueerd voor tests op sfGFP-expressie. In pAK1, pAK2 en pAK3 staat het sfGFP-gen onder controle van respectievelijk de promotors cpc560, A2813 en psbA2. Deze promotors zijn van Synechocystis sp. PCC 6803 of Synechococcus sp. PCC 700231. Voor de constructie van deze vectoren werden de sfGFP promotor- en terminatorsequenties genomen van vectoren die werden gebruikt voor de transformatie van Synechococcus sp. PCC 700231. De relevante sequenties werden geïntegreerd in de homologe chwA (sc_7_37) site van pFN1 (of pFN_7_37_KanR15). De pMH1-expressievector werd geconstrueerd door DNA-synthese met behulp van P. lacunesequenties als sjablonen (Supplemental File 6). De cpcB-cpcA (phycocyanine ß en phycocyanine α) sequenties van P. lacune zijn serieel gerangschikt. Een intergeen gebied van 100 bp scheidt beide coderende regio's. De synthetische sequentie bevatte deze endogene cpcB-cpcA-sequentie en de cpcB-promotor. De sfGFP en KanR cassette wordt geplaatst op slechts 3' van het cpcB stopcodon (5' cpcA). De gehele synthetische sequentie met cpcB promotor, cpcB, sfGFP, KanR, cpcA (5' tot 3') wordt gekloond tot pUC19. Een kaart is weergegeven in figuur 5. Meer details over het klonen van pAK1, pAK2 en pAK3 en de volledige volgorde van pMH1 worden gegeven in Supplemental File 1.

Alle 4 de transformanten (met pAK1, pAK2, pAK3 en pMH1) drukten GFP uit; alle fluorescentieniveaus lagen boven de achtergrondfluorescentie van wildtype filamenten (figuur 6). De pMH1-transformanten met onvolledige segregatie onthulden een GFP-signaal dat zeer variabel was tussen de filamenten. Het fluorescentiesignaal was gelijkmatig verdeeld wanneer de segregatie was voltooid (figuur 6E). De microscoopsignalen van pAK1-, pAK2- en pAK3-transformanten waren vergelijkbaar, maar ~ 5x zwakker dan die van pMH1 (figuur 6E).

De vastgestelde cryoconservatiemethode is gebaseerd op een methode die is vastgesteld voor E. coli. Wanneer 2 wasstappen werden uitgevoerd voor het verwijderen van glycerol na het ontdooien, overleefden 15 van de 15 P. lacunemonsters (tabel 3). Dit protocol kan ook worden gebruikt voor Synechocystis PCC 6803, maar alleen met 2 wasstappen en niet met 1 (tabel 3).

Een ander kenmerk van Oscillatoriales filamenten is hun beweeglijkheid: P. lacunefilamenten bewegen continu op oppervlakken (figuur 7) en in een vloeibaar medium (figuur 8). Beide soorten beweging kunnen gemakkelijk worden bestudeerd in petrischalen zonder of met agarmedium. Time-lapse-opname is vereist omdat beweging op agar traag is. Filamenten bewegen zich naar de lichtkegel als een lichtstraal van onderaf komt (figuur 3). De effecten van lichtintensiteit, golflengte en tijd kunnen eenvoudig worden bestudeerd met een eenvoudige opstelling. De fotoreceptoren van dit effect zijn nog niet duidelijk. Mogelijke kandidaten kunnen worden aangesproken met knock-out mutanten. Het mechanisme dat ten grondslag ligt aan hoe de filamenten het licht vinden, is ook onduidelijk. Voor deze vraag is een infraroodsysteem nodig om de filamenten te registreren tijdens hun beweging van duisternis naar licht.

Figure 1
Figuur 1: Fenrmidium lacune stammen verzameld uit Helgoland en Giglio. Filamenten worden gedurende 11 dagen vermeerderd op f/2 agar in petrischalen van 6 cm. A) stam GI08AO; B) stam GI08IO; C) stam GI09CO; D) stam HE10DO; E) stam HE10JO; (F) stam HE15M2G1. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Phormidium lacuna filamenten 5 weken na transformatie. De sfGFP-expressievector pMH1 werd gebruikt; selectie vond plaats op f/2+ medium met 120 μg/ml kanamycine. De groenachtige filamenten zijn resistent en levend; andere filamenten zijn afgestorven. Schaalbalk = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Fototaxis experiment. Links: LED-houder met 4 rode LED's, aangesloten op een instelbare voeding. Bovenop elke LED bevindt zich een petrischaaltje van 6 cm met 8 ml van een Phormidium lacuna-cultuur. Rechts: Petrischaaltje met P. lacune na 2 dagen op de rode LED (15 μmol m-2 s-1). Afkorting: LED = light-emitting diode. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Integratie en segregatie van insert na transformatie van Phormidium lacune met pAK1. PCR met buitenprimers. De verwachte maten van het product zonder en met insert zijn respectievelijk 2371 en 5016 bp. Linkerrijstrook: markering, rijstroken 1, 2, 3, 4: PCR-producten van filamenten respectievelijk 7 dagen, 11 dagen, 14 dagen en 17 dagen na de isolatie van een resistent filament (4 weken na transformatie). Lane 5: PCR-product van wild-type (van een andere gel). In het 7-daagse monster is de insert aanwezig in een kleine fractie van de chromosomen. Deze fractie neemt toe tot 17 dagen, waar geen wild-type band zichtbaar is, d.w.z. de segregatie is voltooid. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: Vector voor sfGFP-expressie onder controle van endogene cpcB-promotor . Oranje: Phormidium lacuna homologe sequentie, violet/blauw: pUC-19 vector backbone, groen: insert met sfGFP en KanR. Afkortingen: sfGFP = superfolder green fluorescent protein; KanR = kanamycineresistentie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 6
Figuur 6: Expressie van sfGFP in lacune in Phormidum. Fluorescentiebeelden van P. lacune wild-type filamenten (A) en na transformatie met pAK1 (B), pAK2 (C), pAK3 (D) en pMH1 (E). In pMH1 wordt het sfGFP-gen geplaatst op 3' van het phycocyanine ß-gen en wordt daarom aangedreven door de endogene cpcß-promotor ; in de andere gevallen wordt sfGFP aangedreven door cpc560, A2813 of psbA2s promotors van respectievelijk Synechocystis PCC 6803. De fluorescentie-instellingen zijn specifiek voor GFP; alle beelden werden opgenomen met dezelfde integratietijd en optische instellingen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 7
Figuur 7: Samengevoegde afbeelding van Phormidium lacune op agar oppervlak bij 4x vergroting. De eerste afbeelding wordt in het rood weergegeven, de tweede (1 minuut later genomen) in het groen. Let ook op de sporen op de agar. Schaalbalk = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 8
Figuur 8: Samengevoegde afbeelding van Phormidium lacune in vloeibaar medium. Het tijdsinterval tussen beide beelden was 10 s. De eerste afbeelding is in het rood gedrukt; de tweede is in het groen gedrukt. Het vergelijken van beide kleuren toont de beweging binnen 10 s. Schaalbalk = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

zeven He10jo He10do Gi08ao Gi09co He15m2g1
Contigs 104 174 218 102 154
totaal bp 48,19,017 47,88,491 47,78,775 36,69,922 45,98,395

Tabel 1: Phormidium lacuna strains.

Gi09co He10do He10jo He15m2g1
Gi08 42 40 0 42
Gi09co 2 42 0
He10do 40 2
He10jo 42

Tabel 2. Aminozuurverschillen tussen stammen in sequenties van 20 kerneiwitten met 10.876 aminozuren.

Celdichtheid OD 750 nm 1 1 3 3 5 5 7 7
Wast 1 2 1 2 1 2 1 2
Synechocystis Pcc 6803 2/5 5/5 1/4 4/4 0/4 4/4 0/4 3/4
Phormidium lacune He10do 4/4 4/4 4/4 4/4 3/ 4 4/4 3/3 3/3

Tabel 3: Cryoconservatieproeven met Synechocystis PCC 6803 en Phormidium lacuna HE10DO cyanobacteriën. Het eerste getal toont het aantal culturen dat overleefde na het invriezen/ontdooien; het tweede getal toont de totale proeven.

Aanvullende video S1: Beweging van Phormidium lacunefilamenten in vloeibare oplossing, zonder time-lapse. Klik hier om deze video te downloaden.

Aanvullende video S2: Beweging van Phormidium lacuna filamenten op agar oppervlak, met time-lapse. Klik hier om deze video te downloaden.

Aanvullend bestand 1: Klonen van vectoren voor transformatie van Phormidium lacune. Lijst van transformatievectoren; lijst van primers voor klonen; sequentie van pMH1 in gb-formaat. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 2: Shell-scripts (sh) voor Raspberry Pi-minicomputer. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend dossier 3: DNA-sequentie van HE152G1. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend dossier 4: DNA-sequentie van GI08AO. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend dossier 5: DNA-sequentie van GI09CO. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend dossier 6: DNA-sequentie van HE10DO. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend dossier 7: DNA-sequentie van HE10JO. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hoewel veel soorten cyanobacteriën beschikbaar zijn uit kweekcollecties 32,33,34,35,36, is er nog steeds vraag naar nieuwe cyanobacteriën uit het wild omdat deze soorten zijn aangepast aan specifieke eigenschappen. P. lacune werd verzameld uit rotsspoelen en is aangepast aan variaties van zoutconcentraties en temperatuur30. Stammen van deze soort werden gevonden tijdens excursies in 2008, 2009 en 2010. Met de hier beschreven procedure werden 5 stammen van P. lacune geïsoleerd en 4 van deze stammen waren steriel. De stam P. lacuna HE10JO is permanent besmet met de bacterie Marivirga atlantica, een mariene bacterie geïdentificeerd door rRNA en genoomsequencing. Deze bacterie kon niet van de cyanobacterie worden gescheiden ondanks de toepassing van mechanische scheiding, groei bij verschillende temperaturen, behandelingen met antibiotica of chemische behandelingen. Ondanks de vervuiling kan P. lacuna HE10JO op dezelfde manier worden gekweekt als de andere stammen. In latere excursies werden andere leden van Oscillatoriales gevonden, die nog niet in detail zijn geanalyseerd. P. lacune werd niet meer teruggevonden. Het is niet duidelijk waarom P. lacune in de daaropvolgende jaren en op twee verschillende plaatsen werd geïsoleerd, maar later niet werd gevonden. De overvloed ervan is zeker afhankelijk van onvoorspelbare omstandigheden. Temperatuur, zoutconcentraties en anorganische of organische voedingsstoffen zijn zeer variabel in rotsspoelen. Daarom kan de soortensamenstelling in de loop van de tijd op een onvoorspelbare manier fluctueren.

Natuurlijke transformatie wordt vastgesteld voor verschillende cyanobacteriën, meestal eencellige soorten. De filamenteuze P. lacuna is de enige soort van de orde Oscillatoriales waarvoor natuurlijke transformatie is vastgesteld. De transformatie was bijna altijd succesvol met het huidige protocol. Over het algemeen varieert het aantal resistente filamenten na een transformatieproef aanzienlijk en soms mislukt de transformatie, wat resulteert in het verlies van kostbare tijd. Het is daarom raadzaam om meerdere transformatieprojecten parallel uit te voeren. De tijd voor volledige segregatie, meestal 4 weken na isolatie van de resistente stam, kan ook variëren. Omdat er geen garantie is voor volledige segregatie na groei op kanamycine, is het cruciaal om de PCR-tests uit te voeren met behulp van buitenste en binnenste primers.

Elke vector moet 2 x 500-1.000 bp homologe sequenties bevatten, bijvoorbeeld versterkt vanuit de gastheer door PCR en onderbroken door een weerstandscassette (bijvoorbeeld de kanamycinecassette KanR die hier wordt gebruikt)37,38. Voor expressie moeten een promotor, codeersequentie (bijvoorbeeld voor sfGFP39), terminator en weerstandscassette worden gekloond tussen de homologe sequenties. De kloonstrategieën zijn soortspecifiek en afhankelijk van het doel van het experiment.

Deze transformatiemethode zou ook mogelijk kunnen zijn met andere Oscillatoriales-stammen of andere cyanobacteriën: natuurlijke transformatie is gebaseerd op type IV pili, die aanwezig zijn in bijna elk ander cyanobacteriële genoom 3,15,40. Daarom zou de huidige methode nieuwe proeven met andere soorten kunnen stimuleren. Omdat type IV pili ook relevant zijn voor de beweeglijkheid, is het belangrijk om te controleren op omstandigheden waaronder cyanobacteriën beweeglijk zijn.

Geninbrenging is gebaseerd op homologe recombinatie en resulteert in een verstoring van de homologe plaatsen. Daarom wordt transformatie vaak gebruikt voor gen knock-out. De expressie van het ingebrachte gen zal worden geïnduceerd als een actieve promotor en een coderende sequentie worden geïntegreerd in de homologe site. Bij P. lacune was de promotoractiviteit afhankelijk van de soort. De cpc560, A2813 en psbA2 promotors van Synechocystis PCC sp 6803 of Synechococcus sp. PCC 7002 31 en de cpcB promotor van P. lacune kunnen sfGFP expressie stimuleren. Van deze constructen induceerde de endogene cpcB-promotor de sterkste expressie, hoewel het sfGFP-gen zich op 3' van het phycocyanine ß-gen bevindt. Dit duidt op een meer algemeen gebruik van endogene promotors bij cyanobacteriële expressie.

De combinatie van gen knock-out en bewegingsstudies zal licht werpen op moleculaire mechanismen van motiliteit en fototaxis. LED-lichtbronnen kunnen licht leveren voor fototaxisexperimenten. Bijna elke golflengte is beschikbaar en de lichtintensiteit kan worden gemoduleerd door een instelbare voeding en potentiometers. LED-houders kunnen door 3D-printers worden gebouwd om eenvoudig combinaties van verschillende LED's te realiseren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Acknowledgments

Het werk werd ondersteund door het Karlsruher Institute of Technology.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Autoclave 3870 ELV Tuttnauer 3870 ELV
Bacto Agar OttoNorwald 214010
BG-11 Freshwater Solution Sigma Aldrich C3061
BG-11 medium Merck 73816-250ML
Boric acid Merck 10043-35-3 H3BO3
Calcium chloride dihydrate Carl Roth 10035-04-8 CaCl2 · 2 H2O
Cell culture flasks Cellstar with filter screw cap, sterile, 250 mL Greiner 658190
Cell culture flasks Cellstar with filter screw cap, sterile, 50 mL Greiner 601975
Centrifuge LYNX 4000 Thermo Scientific 75006580 and rotor
Centrifuge microstar 17 VWR International N/A for up to 13,000 rpm
Cetyltrimethylammonium Bromide (CTAB) PanReac AppliChem 57-09-0 C19H42BrN
Chloroform : Isoamyl Alcohol 24 : 1 PanReac AppliChem
A1935
Cobalt(II) chloride hexahydrate Merck 7791-13-1 CoCl2 · 6 H2O
Copper(II) sulphate pentahydrate Merck 7758-99-8  CuSO4 · 5 H2O
D(+)-Biotin Carl Roth 58-85-5  C10H16N2O3S
DNA ladder 1 kb New England Biolabs N3232
DNA ladder 100 bp New England Biolabs N3231
Electrical pipetting help accujet-pro S Brand GmbH 26360 for pipetting 1-25 mL
Ethanol VWR 64-17-5 C2H6O
Ethylenediamine tetraacetic acid disodium salt dihydrate Carl Roth 6381-92-6 EDTA-Na2 · 2 H2O
Fluorescence microscope ApoTome Zeiss
Fluorescence microscope Axio Imager 2 Zeiss
French Pressure Cell Press American Instrument Company N/A
Gel documation System Saffe Image Invitrogen
Gelelctrophoresis system Mupid-One/-exu ADVANCED
Glassware, different
Glycerol Carl Roth 56-81-5 C3H8O3
Iron(III) chloride hexahydrate Merck 10025-77-1  FeCl3 · 6 H2O
Kanamycin Sigma-Aldrich 25389-94-0
Kanamycin sulphate Carl Roth 25389-94-0 C18H36N4O11 · H2SO4
Lauroylsarcosine, Sodium Salt (Sarcosyl) Sigma Aldrich 137-16-6 C15H28NO3 · Na
LB Broth (Lennox) Carl Roth X964.4
Light source, fluorescent tube L18W/954 daylight OSRAM cultivation of cyanobacteria
Light source, LED panel XL 6500K 140 W Bloom Star N/A cultivation of cyanobacteria, up to 1,000 µmol m-2 s-1
Magnesium chloride hexahydrate Carl Roth 7791-18-6 MgCl2 · 6 H2O
Manganese(II) chloride tetrahydrate Serva 13446-34-9 MnCl2 · 4 H2O
Microscope DM750 Zeiss
Midi prep plasmid extraction kit NucleoBond Xtra Midi kit Macherey-NAGEL GmbH & Co. KG REF740410.50
Minicomputer Raspberry Pi 4 + Conrad Electronics 2138863-YD for time-lapse recording
Ocular camera EC3 Leica for continuous recording up to 30 s
Ocular camera MikrOkular Full HD Bresser for time-lapse recordings, coupled to Raspberry Pi minicomputer
Petri dishes polystyrole, 100 mm x 20 mm Merck P5606-400EA
Petri dishes polystyrole, 60 mm x 15 mm Merck P5481-500EA
Photometer Nanodrop ND-1000 Peqlab Biotechnologie
Photometer Uvikon XS Goebel Instrumentelle Analytik GmbH
Pipetman 100-1,000 µL Gilson SKU: FA10006M
Pipetman 10-100 µL Gilson SKU: FA10004M
Plastic pipettes 10 mL, sterile Greiner 607107
Plastic tube, sterile, 15 mL Greiner 188271
Plastic tube, sterile, 50 mL Greiner 227261
Potassium bromide Carl Roth 7758-02-3 KBr
Potassium chloride Carl Roth 7447-40-7 KCl
Power supply Statron 3252-1 Statron Gerätetechnik GmbH
Power supply Voltcraft PPS 16005 Conrad Electronics for LED
Proteinase K Promega MC500C from Maxwell 16 miRNA Tissue Kit AS1470
Q5 polymerase New England Biolabs M0491S
Sequencing kit NextSeq 500/550 v2.5 Illumina
Sequencing system NextSeq 550 SY-415-1002 Illumina
Shaker Unimax 2010 Heidolph Instruments for cultivation
Sodium acetate Carl Roth 127-09-3 NaCH3COO
Sodium chloride Carl Roth 7647-14-5 NaCl
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate Carl Roth 10049-21-5 NaH2PO4 · H2O
Sodium fluoride Carl Roth 7681-49-4 NaF
Sodium hydrogen carbonate Carl Roth 144-55-8 NaHCO3
Sodium molybdate dihydrate Serva 10102-40-6 Na2MoO4 · 2 H2O
Sodium nitrate Merck 7631-99-4 NaNO3
Sodium sulphate Carl Roth 7757-82-6 Na2SO4
Strontium chloride hexahydrate Carl Roth 10025-70-4 SrCl2 · 6 H2O
Thiamine hydrochloride Merck 67-03-8 C12H17ClN4OS · HCl
TRIS Carl Roth 77-86-1 C4H11NO3
Ultrasonic device UP100H with sonotrode MS3 Hielscher Ultrasound Technology UP100H
Ultraturrax Silent Crusher M Heidolph Instruments homogenizer
Urea Carl Roth 57-13-6 CH4N2O
Vitamin B12 Sigma 68-19-9 C63H88CoN14O14P
Vitamin solution 0.3 µM thiamin-HCl, 2.1 nM biotin, 0.37 nM cyanocobalamin
Water Stills, Water treatment VEOLIA water technologies ELGA_21001
Zinc sulphate heptahydrate Sigma 7446-20-0 ZnSO4 · 7 H2O
software, URL
gatb-minia program for DNA assembly https://github.com/GATB/gatb-minia-pipeline makes large scaffolds from short DNA reads, Linux based
ImageJ software for immage processing (pixel intensities, circle diameter)
RAST annotation server https://rast.nmpdr.org input: genome DNA sequence, detects open reading frames, lists protein sequences and their functions
Culture media
Artificial seawater 0.41 M NaCl , 53 mM MgCl2,28 mM Na2SO4, 10 mM CaCl2 , 9 mM  KCl , 2.4 mM NaHCO3 ,0.84 mM KBr, 0.49 mM H3BO3, 90 µM SrCl2, 72 µM NaF
f/2 -liquid medium artificial seawater, 0.1 % (v/v) trace element solution, 0.05 % (v/v) vitamin solution, 0.88 mM NaNO3, 36 µM NaH2PO4 
f/2+ liquid medium f/2-medium, with 10 times increased NaNO3 and NaH2PO4 (0.88 mM NaNO3, 36 µM NaH2PO4
f/2+-agar 3 % (w/v) bacto agar, artificial seawater, 0.1 % (v/v) trace element solution, 0.05 % (v/v) vitamin solution ,8.8 mM NaNO3, 0.36 mM NaH2PO4
f/2-agar 3 % (w/v) bacto agar, artificial seawater, 0.1 % (v/v) trace element solution, 0.05 % (v/v) vitamin solution ,0.88 mM NaNO3, 36 µM NaH2PO4
Trace element solution 0.36 mM NaH2PO4, 12 µM Na2EDTA, 39 nM CuSO4, 26 nM Na2MoO4 , 77 nM ZnSO4, 42 nM CoCl2, 0.91 µM MnCl2
Vitamin solution 0.3 µM thiamin-HCl, 2.1 nM biotin, 0.37 nM cyanocobalamin

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brasil, B., de Siqueira, F. G., Salum, T. F. C., Zanette, C. M., Spier, M. R. Microalgae and cyanobacteria as enzyme biofactories. Algal Research-Biomass Biofuels and Bioproducts. 25, 76-89 (2017).
  2. Gundolf, R., Oberleitner, S., Richter, J. Evaluation of New Genetic Toolkits and Their Role for Ethanol Production in Cyanobacteria. Energies. 12 (18), 3515 (2019).
  3. Wendt, K. E., Pakrasi, H. B. Genomics approaches to deciphering natural transformation in cyanobacteria. Frontiers in Microbiology. 10, 1259 (2019).
  4. Tandeau de Marsac, N., et al. A new approach for molecular cloning in cyanobacteria: cloning of an Anacystis nidulans met gene using a Tn901-induced mutant. Gene. 20 (1), 111-119 (1982).
  5. Porter, R. D. Transformation in cyanobacteria. Critical Reviews in Microbiology. 13 (2), 111-132 (1986).
  6. Joset, F. Transformation in Synechocystis PCC 6714 and 6803: preparation of chromosomal DNA. Methods in Enzymology. 167, 712-714 (1988).
  7. Tsinoremas, N. F., Kutach, A. K., Strayer, C. A., Golden, S. S. Efficient gene transfer in Synechococcus sp strains PCC-7942 and PCC-6301 by interspecies conjugation and chromosomal recombination. Journal of Bacteriology. 176 (21), 6764-6768 (1994).
  8. Matsunaga, T., Takeyama, H. Genetic engineering in marine cyanobacteria. Journal of Applied Phycology. 7 (1), 77-84 (1995).
  9. Frigaard, N. U., Sakuragi, Y., Bryant, D. A. Gene inactivation in the cyanobacterium Synechococcus sp. PCC 7002 and the green sulfur bacterium Chlorobium tepidum using in vitro-made DNA constructs and natural transformation. Methods in Molecular Biology. 274, 325-340 (2004).
  10. Iwai, M., Katoh, H., Katayama, M., Ikeuchi, M. Improved genetic transformation of the thermophilic cyanobacterium, Thermosynechococcus elongatus BP-1. Plant and Cell Physiology. 45 (2), 171-175 (2004).
  11. Vioque, A. Transformation of cyanobacteria. Transgenic Microalgae as Green Cell. Leon, R., Galvan, A., Fernandez, E. , Springer. 12-22 (2007).
  12. Nies, F., Mielke, M., Pochert, J., Lamparter, T. Natural transformation of the filamentous cyanobacterium Phormidium lacuna. Plos One. 15 (6), 0234440 (2020).
  13. Ravindran, C. R. M., Suguna, S., Shanmugasundaram, S. Electroporation as a tool to transfer the plasmid pRL489 in Oscillatoria MKU 277. Journal of Microbiological Methods. 66 (1), 174-176 (2006).
  14. El Semary, N. A. Optimized electroporation-induced transformation in Microcystis aeruginosa PCC7806. Biotechnologie Agronomie Societe et Environnement. 14 (1), 149-152 (2010).
  15. Nies, F., Mielke, M., Pochert, J., Lamparter, T. Natural transformation of the filamentous cyanobacterium Phormidium lacuna. PLoS One. 15 (6), 0234440 (2020).
  16. Sode, K., Tatara, M., Takeyama, H., Burgess, J. G., Matsunaga, T. Conjugative gene-transfer in marine cyanobacteria - Synechococcus Sp, Synechocystis Sp and Pseudanabaena Sp. Applied Microbiology and Biotechnology. 37 (3), 369-373 (1992).
  17. Stucken, K., Ilhan, J., Roettger, M., Dagan, T., Martin, W. F. Transformation and conjugal transfer of foreign gGenes into the filamentous multicellular cyanobacteria (Subsection V) Fischerella and Chlorogloeopsis. Current Microbiology. 65 (5), 552-560 (2012).
  18. Bellali, S., Khalil, J. B., Fontanini, A., Raoult, D., Lagier, J. C. A new protectant medium preserving bacterial viability after freeze drying. Microbiological Research. 236, 126454 (2020).
  19. Wallner, T., Pedroza, L., Voigt, K., Kaever, V., Wilde, A. The cyanobacterial phytochrome 2 regulates the expression of motility-related genes through the second messenger cyclic di-GMP. Photochemical & Photobiological Sciences. 19 (5), 631-643 (2020).
  20. Wilde, A., Fiedler, B., Borner, T. The cyanobacterial phytochrome Cph2 inhibits phototaxis towards blue light. Molecular Microbiology. 44 (4), 981-988 (2002).
  21. Bhaya, D., Takahashi, A., Grossman, A. R. Light regulation of type IV pilus-dependent motility by chemosensor-like elements in Synechocystis PCC6803. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (13), 7540-7545 (2001).
  22. Guillard, R. R., Ryther, J. H. Studies of marine planktonic diatoms. I. Cyclotella nana Hustedt, and Detonula confervacea (cleve) Gran. Canadian Journal of Microbiology. 8, 229-239 (1962).
  23. Kester, D. R., Duedall, I. W., Connors, D. N., Pytkowicz, R. M. Preparation of artificial seawater. Limnology and Oceanography. 12 (1), 176-179 (1967).
  24. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning. A Laboratory Manual. 3rd edition. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).
  25. Cold Spring Harbor Protocols. CTAB DNA extraction buffer. Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (3), (2009).
  26. Singh, S. P., Rastogi, R. P., Häder, D. -P., Sinha, R. P. An improved method for genomic DNA extraction from cyanobacteria. World Journal of Microbiology & Biotechnology. 27, 1225-1230 (2011).
  27. French, C. S., Milner, H. W. Disintegration of bacteria and small particles by high-pressure extrusion. Methods in Enzymology. 1, 64-67 (1955).
  28. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning, a laboratory manual. 2nd ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).
  29. Lamparter, T., et al. The involvement of type IV pili and phytochrome in gliding motility, lateral motility and phototaxis of the cyanobacterium Phormidium lacuna. bioRxiv. , (2021).
  30. Nies, F., et al. Characterization of Phormidium lacuna strains from the North Sea and the Mediterranean Sea for biotechnological applications. Process Biochemistry. 59, 194-206 (2017).
  31. Kachel, B., Mack, M. Engineering of Synechococcus sp. strain PCC 7002 for the photoautotrophic production of light-sensitive riboflavin (vitamin B2). Metabolic Engineering. 62, 275-286 (2020).
  32. Lukavsky, J., Cepak, V., Komarek, J., Kasparkova, M., Takacova, M. Catalogue of algal and cyanobacterial strains of culture collection of autotrophic organisms at Trebon. Algological Studies. 63, 59-112 (1992).
  33. Philbrick, J. B., Diner, B. A., Zilinskas, B. A. Construction and characterization of cyanobacterial mutants lacking the manganese-stabilizing polypeptide of photosystem-ii. Journal of Biological Chemistry. 266 (20), 13370-13376 (1991).
  34. Pinevich, A. V., Veprritskii, A. A., Gromov, B. V., Krautvald, K., Titova, N. N. Cellular and cultural properties and characterization of the pigment in Nostoc sp, a cyanobacterium unusually rich in c-phycoerythrin. Microbiology. 63 (5), 481-485 (1994).
  35. Schlosser, U. G., Friedl, T. Additions to the culture collection of algae at Gottingen since 1997. Nova Hedwigia. 71 (1-2), 243-262 (2000).
  36. Takano, H., Arai, T., Hirano, M., Matsunaga, T. Effects of intensity and quality of light on phycocyanin production by a marine cyanobacterium Synechococcus sp. 042902. Applied Microbiology and Biotechnology. 43 (6), 1014-1018 (1995).
  37. Carrer, H., Hockenberry, T. N., Svab, Z., Maliga, P. Kanamycin resistance as a selectable marker for plastid transformation in tobacco. Molecular and General Genetics: MGG. 241 (1-2), 49-56 (1993).
  38. Kaulen, H., Schell, J., Kreuzaler, F. Light-induced expression of the chimeric chalcone synthase-NptII gene in tobacco cells. EMBO Journal. 5 (1), 1-8 (1986).
  39. Cotlet, M., Goodwin, P. M., Waldo, G. S., Werner, J. H. A comparison of the fluorescence dynamics of single molecules of a green fluorescent protein: One- versus two-photon excitation. Chemphyschem. 7 (1), 250-260 (2006).
  40. Taton, A., et al. The circadian clock and darkness control natural competence in cyanobacteria. Nature Communications. 11 (1), 1688 (2020).

Tags

Biologie Nummer 180
Natuurlijke transformatie, eiwitexpressie en cryoconservatie van de lacune van de filamenteuze cyanobacterium <em>Phormidium</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Weber, N., Hofmeister, M., Wunsch,… More

Weber, N., Hofmeister, M., Wunsch, N., Kohler, A., Kaster, A. K., Vollmers, J., Kachel, B., Mack, M., Lamparter, T. Natural Transformation, Protein Expression, and Cryoconservation of the Filamentous Cyanobacterium Phormidium lacuna. J. Vis. Exp. (180), e63470, doi:10.3791/63470 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter