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Biology

प्राकृतिक परिवर्तन, प्रोटीन अभिव्यक्ति, और फिलामेंटस साइनोबैक्टीरियम Phormidium lacuna के क्रायोकन्जर्वेक्षण

Published: February 1, 2022 doi: 10.3791/63470
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 2, 3, 3, 1
1Botanical Institute, Karlsruhe Institute of Technology KIT, 2Institute for Biological Interfaces 5 (IBG 5), Karlsruhe Institute of Technology KIT, 3Institut für Technische Mikrobiologie, Hochschule Mannheim

Summary

Phormidium lacuna एक फिलामेंटस साइनोबैक्टीरियम है जिसे समुद्री रॉकपूल से अलग किया गया था। यह आलेख प्राकृतिक स्रोतों, डीएनए निष्कर्षण, जीनोम अनुक्रमण, प्राकृतिक परिवर्तन, sfGFP की अभिव्यक्ति, क्रायोकंजर्वेशन और गतिशीलता विधियों से फिलामेंट्स के अलगाव का वर्णन करता है।

Abstract

साइनोबैक्टीरिया बुनियादी अनुसंधान और जैव प्रौद्योगिकी परियोजनाओं का ध्यान केंद्रित कर रहे हैं जिसमें सौर ऊर्जा बायोमास उत्पादन के लिए उपयोग किया जाता है। Phormidium lacuna एक नव पृथक फिलामेंटस साइनोबैक्टीरियम है। यह पेपर बताता है कि कैसे नए फिलामेंटस साइनोबैक्टीरिया को समुद्री रॉकपूल से अलग किया जा सकता है। यह भी वर्णन करता है कि फिलामेंट्स से डीएनए कैसे निकाला जा सकता है और जीनोम को कैसे अनुक्रमित किया जा सकता है। यद्यपि परिवर्तन कई एकल-कोशिका वाली प्रजातियों के लिए स्थापित किया गया है, यह फिलामेंटस साइनोबैक्टीरिया के लिए कम बार रिपोर्ट किया जाता है। पी. लाकुना के प्राकृतिक परिवर्तन के लिए एक सरलीकृत विधि का वर्णन यहां किया गया है। P. lacuna आदेश Oscillatoriales का एकमात्र सदस्य है जिसके लिए प्राकृतिक परिवर्तन स्थापित किया गया है। यह पेपर यह भी दिखाता है कि सुपरफ़ोल्डर ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (sfGFP) को व्यक्त करने के लिए प्राकृतिक परिवर्तन का उपयोग कैसे किया जाता है। एक अंतर्जात cpcB प्रमोटर cpc560, A2813, या Synechocystis sp. PCC6803 से psbA2 प्रमोटरों की तुलना में लगभग 5 गुना मजबूत अभिव्यक्ति प्रेरित। इसके अलावा, पी. लाकुना और सिनेकोसिस्टिस एसपी.CPP 6803 के क्रायोप्रिजर्वेशन के लिए एक विधि स्थापित की गई थी, और तरल माध्यम में और आगर और प्लास्टिक की सतहों पर गतिशीलता का आकलन करने के तरीकों का वर्णन किया गया है।

Introduction

सायनोबैक्टीरिया प्रोकैरियोटिक जीव हैं जो प्रकाश संश्लेषण का उपयोग ऊर्जा स्रोत 1,2 के रूप में करते हैं। अनुसंधान तेजी से साइनोबैक्टीरिया प्रजातियों पर केंद्रित है। कई साइनोबैक्टीरिया को डीएनए 3 के साथ परिवर्तित किया जा सकताहै। जीन को इन प्रजातियों में खटखटाया या अतिरंजित किया जा सकता है। हालांकि, परिवर्तन कुछ प्रजातियों 4,5,6,7,8,9,10,11 तक सीमित है, और संस्कृति संग्रह या जंगली8 से उपभेदों में परिवर्तन स्थापित करना मुश्किल हो सकता है। फिलामेंटस प्रजातियों के उपभेदों Phormidium lacuna (चित्रा 1) को समुद्री रॉकपूल से अलग किया गया था, जिसमें पर्यावरणीय स्थितियों, जैसे नमक सांद्रता या तापमान, समय के साथ उतार-चढ़ाव करते हैं। इन फिलामेंटस साइनोबैक्टीरिया का उपयोग मॉडल जीवों के रूप में किया जा सकता है, जो ऑसिलेटरियल्स12 के क्रम के लिए होता है जिससे वे संबंधित हैं।

इलेक्ट्रोपोरेशन13,14 द्वारा जीन हस्तांतरण का परीक्षण करने के परीक्षण के दौरान यह पाया गया कि पी. लैकुना को प्राकृतिक परिवर्तन15 द्वारा परिवर्तित किया जा सकता है। इस प्रक्रिया में, डीएनए को कुछ कोशिकाओं द्वारा स्वाभाविक रूप से लिया जाता है। 16,17 परिवर्तन के अन्य तरीकों की तुलना में, प्राकृतिक परिवर्तन में अतिरिक्त उपकरणों की आवश्यकता नहीं होने का लाभ है जो प्रक्रिया को जटिल बना सकते हैं। उदाहरण के लिए, इलेक्ट्रोपोरेशन के लिए उचित क्यूवेट, बरकरार तारों और उचित वोल्टेज के चयन की आवश्यकता होती है। P. lacuna वर्तमान में प्राकृतिक परिवर्तन के लिए अतिसंवेदनशील एकमात्र Oscillatoriales सदस्य है। चूंकि मूल प्रोटोकॉल इलेक्ट्रोपोरेशन प्रोटोकॉल पर आधारित है, इसलिए इसमें अभी भी कई वॉशिंग चरण शामिल हैं जो अनावश्यक हो सकते हैं। प्रोटोकॉल को सरल बनाने के लिए विभिन्न दृष्टिकोणों का परीक्षण किया गया था, जिससे यहां प्रस्तुत परिवर्तन प्रोटोकॉल होता है।

जीनोम अनुक्रम जीन नॉकआउट या ओवरएक्सप्रेशन के आधार पर आगे के आणविक अध्ययन के लिए आवश्यक है। यद्यपि जीनोम अनुक्रमों को छोटी अवधि के भीतर अगली पीढ़ी की अनुक्रमण मशीनों के साथ प्राप्त किया जा सकता है, डीएनए का निष्कर्षण मुश्किल हो सकता है और प्रजातियों पर निर्भर करता है। पी. कमी के साथ, कई प्रोटोकॉल का परीक्षण किया गया था। एक संशोधित cetyl trimethyl अमोनियम ब्रोमाइड (CTAB) आधारित विधि तब स्थापित की गई थी, जिसके परिणामस्वरूप प्रयोगशाला में निरंतर काम के लिए प्रत्येक शुद्धिकरण चक्र के डीएनए और डीएनए पैदावार की स्वीकार्य शुद्धता होती है। पांच उपभेदों के जीनोम को इस प्रोटोकॉल के साथ अनुक्रमित किया जा सकता है। अगला तार्किक परिवर्तन चरण पी. लैकुना में प्रोटीन अभिव्यक्ति स्थापित करना था।

इस प्रोटोकॉल में एक मार्कर प्रोटीन के रूप में उपयोग किए जाने वाले sfGFP को किसी भी प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के साथ पता लगाया जा सकता है। परीक्षण किए गए सभी प्रमोटरों का उपयोग P. lacuna sfGFP अभिव्यक्ति के लिए किया जा सकता है। परिवर्तन से उत्पन्न होने वाले उपभेदों की बढ़ती संख्या के परिणामस्वरूप संस्कृतियों को संग्रहीत करने के लिए एक विधि की आवश्यकता हुई है। इस तरह के तरीके Escherichia कोलाई और कई अन्य बैक्टीरिया18 के लिए स्थापित कर रहे हैं। मानक प्रोटोकॉल में, ग्लिसरॉल संस्कृतियों को तैयार किया जाता है, तरल नाइट्रोजन में स्थानांतरित किया जाता है, और -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाता है। इस विधि के लिए केवल कुछ चरणों की आवश्यकता होती है और उन प्रजातियों के लिए अत्यधिक विश्वसनीय है जिनके लिए यह स्थापित किया गया है। मानक प्रोटोकॉल पी. कमी के लिए व्यवहार्य नहीं था क्योंकि जीवित कोशिकाओं को सभी मामलों में पुनर्प्राप्त नहीं किया जा सकता था। हालांकि, जब ग्लिसरॉल को पिघलने के बाद हटा दिया गया था, तो सभी परीक्षणों की कोशिकाएं बच गईं। पी. लाकुना की गतिशीलता के विश्लेषण के लिए सरल विधियों को प्रस्तुत किया जाता है, जिसे टाइप IV पिली या फोटोरिसेप्टर की भूमिका की जांच करने के लिए नॉकआउट म्यूटाजेनेसिस के साथ जोड़ा जा सकता है। ये assays एकल-कोशिकीय साइनोबैक्टीरिया19,20,21 के उन लोगों से अलग हैं और अन्य Oscillatoria के लिए भी उपयोगी हो सकते हैं।

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Protocol

1. प्राकृतिक वातावरण से अलगाव

नोट: हरे शैवाल, Diatoms, फिलामेंटस साइनोबैक्टीरिया, और अन्य सूक्ष्म शैवाल अलग किया जा सकता है। प्रोटोकॉल का उपयोग प्रयोगशाला की स्थितियों के तहत बढ़ने वाले रॉकपूल से किसी भी माइक्रोएल्गा प्रजातियों के लिए किया जा सकता है। फिलामेंटस साइनोबैक्टीरिया जो ऑसिलेटरियल्स से संबंधित हैं, उन्हें आसानी से उनके आंदोलन और फिलामेंटस आकार से पहचाना जा सकता है। प्रजातियों को जीनोम अनुक्रमण या 16 एस आरआरएनए अनुक्रमण द्वारा अर्धप्योर अवस्था में पहचाना जा सकता है।

  1. समुद्री रॉकपूल (यानी, चट्टानी तट में गुहाओं) से तरल समुद्री जल के नमूनों को 50 एमएल फ्लास्क में स्थानांतरित करें। प्रत्येक फ्लास्क के लिए, प्राकृतिक स्रोत के सटीक स्थान या निर्देशांक पर ध्यान दें। यदि संभव हो, तो ज़ोप्लांकटन की मात्रा को कम करने के लिए 50 μm जाल के माध्यम से सामग्री को फ़िल्टर करें। नमूनों को 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत करें जब तक कि उन्हें उपसंस्कृत नहीं किया जा सकता है।
  2. एफ / 2 मध्यम22,23 में 3% बैक्टो-आगर युक्त 10 सेमी पेट्री व्यंजनों में 1 एमएल संस्कृतियों को स्थानांतरित करें (सामग्री की तालिका देखें)। 20 प्लेट तक तैयार करें। 50 μmol m-2 s-1 के सफेद प्रकाश के तहत खेती करें।
    नोट: उच्च प्रकाश तीव्रता खेती के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। 400 μmol m-2 s-1 तक की तीव्रता का उपयोग P. lacuna के लिए किया जा सकता है, हालांकि अन्य प्रजातियां अधिक प्रकाश-संवेदनशील हो सकती हैं।
  3. एक सप्ताह के बाद, बाँझ संदंश का उपयोग करके ताजा आगर प्लेटों में वांछित कोशिकाओं को स्थानांतरित करें। बाँझ परिस्थितियों में दूरबीन माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं को अलग करें। पुरानी आगर प्लेट को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें जब तक कि कोशिकाएं दिखाई न दें और नई आगर प्लेट पर विकसित न हों।
  4. संदूषण को खत्म करने के लिए हर हफ्ते इस स्थानांतरण चरण को दोहराएं। भारी संदूषण का पता लगाने के लिए नग्न आंखों का उपयोग करें और संदूषण के लिए अतिरिक्त जांच के लिए 400x आवर्धन के साथ एक माइक्रोस्कोप।
  5. यदि कोई नमूना संदूषण से मुक्त लगता है, तो आगर प्लेटों पर बैक्टीरिया या कवक संदूषण के लिए परीक्षण करें। एक एलबी24 अगर प्लेट (10 सेमी व्यास) में एक इनोक्यूलेशन लूप के साथ संस्कृति का एक अंश स्थानांतरित करें, प्लेट को कमरे के तापमान पर रखें, और 1-3 दिनों में दूषित पदार्थों के विकास की जांच करें।
  6. यदि एक बाँझ फिलामेंटस साइनोबैक्टीरिया प्रजाति प्राप्त की जाती है, तो इसे आगे की संस्कृति के काम के लिए उपयोग करें। तरल में या bacto-agar प्लेटों पर पी lacuna खेती. तरल संस्कृति के लिए 50 मिलीलीटर एफ /2 माध्यम या एफ / 2 + माध्यम के साथ 250 एमएल फ्लास्क का उपयोग करें।

2. डीएनए निष्कर्षण

नोट: इस विधि को 25 26 से अपनाया जाता है 

  1. f/2 माध्यम के 50 mL के साथ दो फ्लास्क तैयार करें। अन्य बढ़ती संस्कृतियों से पी लैकुना फिलामेंट्स के ~ 1 एमएल के साथ प्रत्येक को टीका लगाएं। 25 डिग्री सेल्सियस पर सफेद प्रकाश (50 μmol m-2 s-1) के तहत 50 rpm पर आंदोलन (क्षैतिज रोटेशन) के तहत 7 दिनों या उससे अधिक समय तक संस्कृतियों को रखें।
  2. अल्ट्रासाउंड के साथ संस्कृति का इलाज करें ( सामग्री की तालिका देखें) पूर्ण ऊर्जा के साथ 2 मिनट के लिए। 750 एनएम पर ओडी को मापें; यह सुनिश्चित करने के लिए जाँच करें कि यह ~ 0.5 है। संस्कृतियों को विकसित करना जारी रखें यदि ओडी बहुत कम है।
  3. 5,000 × जी, 20 मिनट centrifugation द्वारा फिलामेंट्स ले लीजिए। supernatant निकालें. अवशिष्ट तरल के साथ फिलामेंट्स को एक फ्रेंच प्रेस27 के कक्ष में स्थानांतरित करें। फ्रेंच प्रेस के दबाव को 20,000 साई पर सेट करें और कोशिकाओं को निकालें।
    नोट: फ्रेंच प्रेस सभी कोशिकाओं को लाइस करेगा और डीएनए जारी करेगा; मजबूत कतरनी बल1,500 बीपी डीएनए टुकड़े का उत्पादन करेंगे।
  4. 10,000 × जी पर 10 मिनट के लिए नमूने को सेंट्रीफ्यूज करें और supernatant को हटा दें।
  5. 400 μL लाइसिस बफर (4 M यूरिया, 0.1 M Tris / Cl, pH 7.4) और 50 μL proteinase K (10 mg / mL) के छर्रे में जोड़ें। 550 आरपीएम पर मिलाते हुए 60 मिनट के लिए नमूना 55 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करें।
  6. डीएनए निष्कर्षण बफर (3% CTAB, 1.4 M NaCl, 10 mM EDTA, 0.1 M Tris / Cl, 1% Sarkosyl, 0.1 M DTT, pH 8) के 1 mL जोड़ें और 55 °C और 550 rpm पर 60 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। सेंट्रीफ्यूजेशन ट्यूबों में समाधानों को स्थानांतरित करें, और क्लोरोफॉर्म / आइसोएमीलालकोहोल (24/1) के दो संस्करणों को जोड़ें।
  7. हिलाने के बाद, 9,000 × जी पर 5 मिनट के लिए नमूने को सेंट्रीफ्यूज करें। प्रतिक्रिया शीशियों में ऊपरी, जलीय चरण को स्थानांतरित करें और 1 मिलीलीटर बर्फ-ठंडे इथेनॉल और 3 एम सोडियम एसीटेट के 50 μL जोड़ें।
  8. नमूना भंवर और यह 1 ज या उससे अधिक समय के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर जगह है.
  9. 10,000 × जी (4 डिग्री सेल्सियस) पर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज और supernatant त्याग. गोली को 70% इथेनॉल से धोएं।
  10. नमूने को फिर से सेंट्रीफ्यूज करें। supernatant निकालें और गोली रात भर सूखी. न्यूक्लिएज मुक्त पानी में डीएनए को भंग करें। यह जांचने के लिए डीएनए स्पेक्ट्रम को मापें कि OD 260 nm/OD 280 nm 1.6 और 1.9 के बीच है या नहीं।
  11. एक agarose वैद्युतकणसंचलन जेल28 पर डीएनए के आकार का विश्लेषण करें।
  12. 300 चक्रों के लिए अगली पीढ़ी के अनुक्रमण द्वारा जीनोमिक डीएनए को अनुक्रमित करें, एक युग्मित-अंत सेटिंग के साथ और 150 ठिकानों की लंबाई पढ़ें ( सामग्री की तालिकाएं देखें)।
  13. उचित कंप्यूटर प्रोग्राम के साथ असेंबली निष्पादित करें; सामग्री की तालिका में दिए गए उदाहरण को देखें।
  14. एनोटेशन के लिए RAST सर्वर के लिए प्रारूप जीनोम सबमिट करें।
    नोट:: कुछ ही मिनटों के भीतर पूर्ण एनोटेशन प्राप्त करने के लिए डीएनए अनुक्रम अपलोड करें।

3. प्राकृतिक परिवर्तन और GFP अभिव्यक्ति

नोट: परिवर्तन ई कोलाई में प्रचारित एक प्लास्मिड वेक्टर पर आधारित है; pGEM-T या pUC19 का उपयोग बैकबोन वैक्टर के रूप में किया जा सकता है। क्लोनिंग तकनीकों को कई प्रयोगशालाओं में स्थापित किया जाता है; यह भी मानक प्रोटोकॉल28 और पी lacuna15,29 के लिए परिवर्तन वैक्टर पर लेख देखें. sfGFP अभिव्यक्ति के लिए वैक्टर के लिए उदाहरण प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग में वर्णित हैं। चार अभी तक अप्रकाशित वैक्टर का विवरण पूरक फ़ाइल 1 में प्रदान किया गया है।

  1. बाँझ प्रयोगशाला स्थितियों (स्वच्छ बेंच, बाँझ कांच के बर्तन) के तहत बाँझ सामग्री का उपयोग करके सभी चरणों का प्रदर्शन करें।
  2. एक चल रही संस्कृति से 2 x 1 मिलीलीटर पी लैकुना फिलामेंट्स के 2 x 1 मिलीलीटर के साथ दो 250 एमएल फ्लास्क में एफ / 2 तरल माध्यम के 2 x 50 मिलीलीटर को संक्रमित करें। सफेद प्रकाश (50 μmol m-2 s-1) आंदोलन के तहत खेती (क्षैतिज रोटेशन, 50 rpm) 25 °C पर ~ 5 दिनों के लिए।
  3. निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक मिडी प्रेप किट ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके परिवर्तन वेक्टर डीएनए के ~ 200 μg तैयार करें।
  4. 3 मिनट के लिए 10,000 आरपीएम पर पी लैकुना सेल निलंबन (सामग्री की तालिका देखें) के 100 मिलीलीटर Homogenize। 750 nm पर OD को मापें (वांछित मान = 0.35)।
  5. 6,000 × जी पर 15 मिनट के लिए सेल निलंबन सेंट्रीफ्यूज करें। supernatant निकालें, और शेष तरल और अतिरिक्त f/ 2 + माध्यम के 800 μL (अवशिष्ट तरल और फिलामेंट्स सहित कुल मात्रा) में गोली को निलंबित करें।
  6. आठ f/2+ bacto-agar प्लेटें (10 सेमी व्यास) लें जिसमें 120 μg / mL kanamycin होता है। पिपेट प्रत्येक आगर प्लेट के बीच में डीएनए के 10 μg. तुरंत प्रत्येक आगर प्लेट (डीएनए के शीर्ष पर) के बीच में सेल निलंबन के 100 μL पिपेट।
  7. अतिरिक्त तरल को वाष्पित करने की अनुमति देने के लिए साफ बेंच पर ढक्कन के बिना आगर प्लेट रखें। प्लेट को बंद करें और इसे 2 दिनों के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर सफेद प्रकाश में खेती करें।
  8. प्रत्येक आगर प्लेट के तंतुओं को एक इनोक्यूलेशन लूप के साथ कई ताजा एफ / 2 + बैक्टो-आगर प्लेटों पर वितरित करें जिसमें 120 μg / mL kanamycin होता है। 25 डिग्री सेल्सियस पर सफेद प्रकाश में प्लेटों की खेती करें और एक माइक्रोस्कोप के तहत नियमित रूप से संस्कृतियों की जांच करें।
  9. माइक्रोस्कोप के तहत 7-28 दिनों के बाद जीवित, परिवर्तित फिलामेंट्स की पहचान करें। स्वस्थ, हरे रंग के फिलामेंट्स (चित्रा 2) की तलाश करें जो अन्य फिलामेंट्स से अलग हैं। यदि इन हरे फिलामेंट्स की पहचान की जा सकती है, तो अगले चरण के साथ जारी रखें; अन्यथा, प्लेट को एक और 7 दिनों के लिए रखें।
  10. इन पहचाने गए जीवित फिलामेंट्स को 250 μg / mL kanamycin के साथ तरल f / 2 + माध्यम के 50 मिलीलीटर में स्थानांतरित करने के लिए संदंश का उपयोग करें। एक शेकर (क्षैतिज रोटेशन, 50 आरपीएम) पर 25 डिग्री सेल्सियस पर सफेद प्रकाश में खेती करें। चार सप्ताह तक विकास का निरीक्षण करें।
  11. फिलामेंट्स को 250 μg / mL kanamycin युक्त आगर माध्यम में वापस स्थानांतरित करें और फिलामेंट्स के बढ़ने की प्रतीक्षा करें। कई दिनों के बाद, एकल फिलामेंट्स को कनामाइसिन की उच्च सांद्रता के साथ एक ताजा आगर प्लेट में स्थानांतरित करें, उदाहरण के लिए, 500 μg / mL। मूल प्लेट रखें।
  12. सुनिश्चित करें कि फिलामेंट्स तरल संस्कृति में या अगर पर kanamycin की एक उच्च एकाग्रता में प्रचारित कर रहे हैं। अलगाव को गति देने के लिए कानामायसिन एकाग्रता को फिर से बढ़ाएं।
    नोट: रूपांतरित पी. लैकुना 10,000 μg / mL kanamycin तक बढ़ता है। अन्य प्रजातियां इस तरह की उच्च सांद्रता को सहन नहीं कर सकती हैं।
  13. यदि प्रतिरोधी कोशिकाओं को एक प्लेट पर व्यापक रूप से उगाया और वितरित किया जाता है, तो बाहरी और आंतरिक प्राइमरों के साथ पीसीआर करके पी. लैकुना के जीनोम में डालने के एकीकरण का परीक्षण करें।
    1. प्राइमरों का उपयोग करें जो आंतरिक प्राइमरों के रूप में सम्मिलन की क्लोनिंग के लिए डिज़ाइन किए गए थे।
    2. बाहरी प्राइमरों के डिजाइन के लिए, उन अनुक्रमों का चयन करें जो पी. लैकुना के जीनोम पर प्रस्तावित सम्मिलन साइट के 5 'और 3' हैं, लेकिन सम्मिलन के बाहर हैं।
    3. पीसीआर प्रतिक्रियाओं के लिए, आंतरिक प्राइमरों और बाहरी प्राइमरों का उपयोग करें। प्रतिरोधी तनाव (ओं) और जंगली प्रकार का उपयोग करें।
      नोट:: इनर प्राइमर इंगित करते हैं कि सम्मिलित करें मौजूद है; बाहरी प्राइमर दिखाते हैं कि सम्मिलित सही लोकस पर डाला जाता है।
  14. प्रत्येक पीसीआर प्रतिक्रिया के लिए, सीधे पीसीआर ट्यूबों में 10 मिलीग्राम फिलामेंट्स रखें और मानक प्रोटोकॉल24 के अनुसार पीसीआर करें। यदि कोई उत्पाद प्राप्त नहीं किया जाता है, तो एनीलिंग तापमान को अलग-अलग करें और फिलामेंट्स को पानी से धोएं।
    नोट: पीसीआर में कई अलग-अलग पोलीमरेज़ का उपयोग किया जा सकता है। मानक पोलीमरेज़, जैसे कि ताक पोलीमरेज़, में त्रुटि-जांच पोलीमरेज़ की तुलना में उच्च त्रुटि दर होती है, जो अधिक महंगी होती है। इस विश्लेषणात्मक पीसीआर को किसी भी त्रुटि-जांच पोलीमरेज़ की आवश्यकता नहीं है। हालांकि, त्रुटि-जांच पोलीमरेज़ का परीक्षण किया जाना चाहिए यदि कोई पीसीआर उत्पाद मानक पोलीमरेज़ के साथ प्राप्त नहीं किया जाता है।
  15. Agarose वैद्युतकणसंचलन24 पर प्रतिरोधी लाइन के पीसीआर उत्पादों का विश्लेषण करें।
    1. मार्कर के साथ बैंड पदों की तुलना करें और जंगली प्रकार और transformant की तुलना करें। आंतरिक और बाहरी प्राइमरों के साथ, जंगली प्रकार (प्रतिरोध कैसेट के सम्मिलन के कारण) या ट्रांसफॉर्मेंट के लिए दो बैंड की तुलना में ट्रांसफॉर्मेंट के लिए एक बड़े बैंड की तलाश करें: एक जंगली-प्रकार के बैंड के आकार के साथ और एक बड़ा। जैसा कि बाद का मामला अपूर्ण अलगाव को इंगित करता है, उच्च कानामाइसिन सांद्रता के साथ खेती जारी रखें।
      नोट: PCR और वैद्युतकणसंचलन पर अधिक जानकारी के लिए,15,24 या अन्य मानक साहित्य देखें।
  16. जीएफपी अभिव्यक्ति के लिए: 40x या 63x पर निर्धारित उद्देश्य के आवर्धन पर एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप ( सामग्री की तालिका देखें) के साथ एकल फिलामेंट्स का निरीक्षण करें। एक ब्राइटफील्ड ट्रांसमिशन छवि और एक प्रतिदीप्ति छवि पर कब्जा। GFP के लिए निम्नलिखित सेटिंग्स का उपयोग करें: उत्तेजना के लिए 470 एनएम बैंडपास, उत्सर्जन के लिए 525 एनएम बैंडपास, और एक 495 एनएम बीम विभाजक, 500 एमएस का प्रारंभिक एक्सपोजर समय।
  17. स्पष्ट प्रतिदीप्ति संकेतों के लिए एक्सपोज़र समय को समायोजित करें, संतृप्त तीव्रता से बचें। सभी नमूनों के लिए एक ही सेटिंग का उपयोग करने का प्रयास करें।
  18. जैसा कि जंगली-प्रकार के फिलामेंट्स भी प्रतिदीप्ति प्रदर्शित करेंगे, इस पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति के लिए ऊपर के समान सेटिंग्स के साथ छवियों को कैप्चर करेंगे।
    नोट: जीएफपी को व्यक्त करने वाले तनाव में एक उच्च संकेत होना चाहिए; अन्यथा, यह जीएफपी व्यक्त नहीं कर रहा है।
  19. एक्सपोज़र समय और प्रतिदीप्ति छवियों की पिक्सेल तीव्रता के आधार पर, विभिन्न फिलामेंट्स की GFP सामग्री की गणना और तुलना करें।

4. क्रायोकन्जर्वेक्षण

नोट: पी lacuna और एकल कोशिकीय साइनोबैक्टीरियम Synechocystis एसपी. पीसीसी 6803 का उपयोग किया जाता है। वर्तमान विधि पी. कमी के लिए बेहतर काम करती है।

  1. P. lacuna या Synechocystissp PCC 6803 को कम से कम 10 दिनों के लिए f/2+ या BG-11 माध्यम के 10 mL में क्रमशः, सफेद प्रकाश (50 μmol m-2 s-1) के तहत आंदोलन के तहत 25 °C (क्षैतिज रोटेशन, 50 rpm) पर खेती करें।
  2. 3 मिनट के लिए 10,000 आरपीएम पर या एक अल्ट्रासाउंड डिवाइस (सामग्री की तालिका देखें) के साथ पूर्ण ऊर्जा पर 2 मिनट के लिए पी लैकुना संस्कृति (सामग्री की तालिका देखें) को homogenize करें। या तो संस्कृति के OD 750 nm निर्धारित करें कि क्या मान 1 और 7 के बीच है।
  3. 15 मिनट के लिए 6,000 × जी पर centrifugation द्वारा कोशिकाओं को इकट्ठा करें। supernatant निकालें.
  4. f/2+ या BG-11 माध्यम (अंतिम मात्रा) के 800 μL में सेल गोली को निलंबित करें और 2 mL क्रायोवियल में स्थानांतरित करें। सेल निलंबन के लिए एक 50% ग्लिसरॉल समाधान के 800 μL जोड़ें। शीशी को बंद करें और बार-बार उलटा करके मिलाएं।
  5. क्रायोवियल को तरल नाइट्रोजन में स्थानांतरित करें और इसे -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में क्रायोबॉक्स में स्टोर करें। फ्रीजर के भीतर बॉक्स की स्थिति और बॉक्स के भीतर नमूने के निर्देशांक पर ध्यान दें।
  6. कोशिकाओं की वसूली के लिए, क्रायोवियल को बाहर निकालें और कमरे के तापमान पर सामग्री को पिघलाएं। सामग्री को 2 एमएल प्रतिक्रिया ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  7. नमूने को दो बार धोएं। 1st धोने के लिए, 5 मिनट के लिए 6,000 × g पर सेंट्रीफ्यूज। supernatant निकालें, और f/2+ या BG-11 माध्यम के 2 mL में गोली resuspend. 2nd धोने के लिए, 5 मिनट के लिए 6,000 × g पर recentrifuge, supernatant को हटा दें, और f / 2 + या BG-11 माध्यम के 2 मिलीलीटर में गोली को निलंबित करें।
  8. खेती के लिए तैयार इन कोशिकाओं की अखंडता की जांच करने के लिए, छर्रे को 9 मिलीलीटर माध्यम में स्थानांतरित करें और उन्हें आंदोलन (55 आरपीएम) के तहत सफेद प्रकाश (50 μmol m-2 s-1) में खेती करें। पहले दिन और 1 सप्ताह के बाद संस्कृति के ओडी 750 एनएम की तुलना करें।

5. Phormidium lacuna की गतिशीलता

नोट: तीन अलग अलग assays का वर्णन किया जाएगा. एक ही संस्कृति का उपयोग सभी मामलों में किया जाता है।

  1. सफेद प्रकाश (50 μmol m-2 s-1) में क्षैतिज आंदोलन (50 rpm) के तहत f/2 माध्यम में P. lacuna की खेती ~ 5 दिनों के लिए जब तक अनुमानित OD 750 nm 0.35 नहीं है। उपयोग करने तक नमूने को 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत करें।
  2. फिलामेंट्स ( सामग्री की तालिका देखें) को 3 मिनट के लिए 10,000 आरपीएम पर या अल्ट्रासाउंड के साथ ( सामग्री की तालिका देखें) को अधिकतम शक्ति और 1 के चक्र पर 1 मिनट के लिए homogenize करें। मापें OD 750 nm. यदि 0.35 से ऊपर है, तो f/2 माध्यम के साथ भिन्न को पतला करें। 5.3, 5.4, और 5.5 चरणों में गतिशीलता assays में इस समाधान का उपयोग करें।
  3. तरल माध्यम में आंदोलन के लिए परख
    1. गतिशीलता के प्रत्यक्ष अवलोकन के लिए, पी. लैकुना (चरण 5.2 से) युक्त माध्यम के 8 मिलीलीटर को 6 सेमी पेट्री डिश में स्थानांतरित करें। नमूना कमरे के तापमान तक पहुंचने तक कुछ मिनट प्रतीक्षा करें। सेलोफेन पन्नी के साथ पेट्री डिश को कवर करें।
    2. एक कैमरे के साथ एक मानक माइक्रोस्कोप की एक्स-वाई टेबल पर एक माइक्रोस्कोप स्लाइड रखें। माइक्रोस्कोप प्रकाश पर स्विच करें। आदर्श रूप से, हमेशा प्रकाश व्यवस्था के लिए एक ही विद्युत और ऑप्टिकल सेटिंग्स का उपयोग करें। प्रकाश के पथ में एक 4x या 10x उद्देश्य ले जाएँ।
    3. स्लाइड के शीर्ष पर पेट्री डिश रखें। तालिका के x, y, और z आंदोलनों द्वारा एकल फिलामेंट्स या फिलामेंट बंडलों को समायोजित करें।
      नोट: त्रि-आयामी व्यवस्था के कारण, प्रासंगिक अनुभाग का केवल एक हिस्सा फोकस में हो सकता है। सेलोफेन पन्नी प्रतिबंध के बिना फोकस को समायोजित करने की अनुमति देता है।
    4. एकल फिलामेंट्स या बंडलों के आंदोलनों का निरीक्षण करें। सुनिश्चित करें कि उद्देश्य लेंस तरल को नहीं छूता है। एक मानक माइक्रोस्कोप कैमरे के साथ फिलामेंट्स के आंदोलनों को रिकॉर्ड करें ( पूरक वीडियो S1 देखें)।
  4. सतह पर आंदोलन के लिए परख
    1. आगर सतहों पर फिलामेंट गतिशीलता के अवलोकन के लिए, एफ / 2 बैक्टो-अगर के साथ 6 सेमी पेट्री व्यंजन तैयार करें। सुनिश्चित करें कि आगर उद्देश्य लेंस के लिए आगर सतह के करीब जाने के लिए पर्याप्त उच्च है। वैकल्पिक रूप से, एक ~ 3 मिमी मोटी अगर परत तैयार करें और आगर के माध्यम से फिलामेंट्स को रिकॉर्ड करें (प्लेट को उल्टा रखें या उल्टे माइक्रोस्कोप का उपयोग करें)।
    2. पिपेट 0.5 मिलीलीटर एक 6 सेमी पेट्री डिश के बैक्टो-अगर सतह पर पी. लैकुना (चरण 5.2 से) युक्त एक समाधान का। तरल को सतह में प्रवेश करने की अनुमति दें। पेट्री डिश को बंद करें और 4x या 10x उद्देश्य का उपयोग करके सतह पर फिलामेंट्स के आंदोलन का निरीक्षण करें।
    3. सुनिश्चित करें कि माइक्रोस्कोप की एक ही विद्युत और ऑप्टिकल सेटिंग्स का उपयोग रिकॉर्डिंग के दौरान और बाद की रिकॉर्डिंग में किया जाता है।
    4. एक ओकुलर कैमरा और मिनीकंप्यूटर सिस्टम का उपयोग करके समय-चूक रिकॉर्डिंग कैप्चर करें। सुनिश्चित करें कि बाद की छवियों के बीच का समय अंतराल 5 s-1 मिनट है। प्रोग्राम समय अंतराल रिकॉर्डिंग को नियंत्रित करने के लिए minicomputer की Linux स्क्रिप्ट. एक उदाहरण स्क्रिप्ट के लिए पूरक फ़ाइल 2 और एक उदाहरण के रूप में पूरक वीडियो S2 देखें।
  5. फोटोटैक्सिस के लिए परख
    1. फोटोटैक्सिस प्रयोगों के लिए, प्रकाश उत्सर्जक डायोड (एलईडी) धारकों (यहां, एक 3 डी प्रिंटर के साथ) तैयार करें, जिसमें चयनित 5 मिमी एल ई डी को नीचे से ऊपर तक 20 मिमी2 के क्षेत्र को विकिरणित करने के लिए माउंट किया जाता है (चित्रा 3)। यदि आवश्यक हो, तो समानांतर में कई एलईडी धारकों का उपयोग करें, प्रत्येक एलईडी को एक प्रतिरोधक और पोटेंशियोमीटर के माध्यम से विद्युत रूप से एक समायोज्य बिजली की आपूर्ति से जोड़ते हैं। मापने और प्रयोग के आधार पर एलईडी तीव्रता को समायोजित करें। सुनिश्चित करें कि पूरी सेटिंग एक अंधेरे कमरे या एक बंद अंधेरे कंटेनर में है।
    2. पी लैकुना युक्त माध्यम के 8 मिलीलीटर (चरण 5.2 से) को 6 सेमी पेट्री डिश में रखें। एलईडी की प्रकाश तीव्रता समायोजित करें। ढक्कन के साथ पेट्री डिश को बंद करें और इसे एलईडी धारक पर रखें ताकि एलईडी पेट्री डिश के केंद्र में हो।
    3. वांछित अवधि (आमतौर पर 2 दिन) के बाद, सीधे प्रकाश उपचार की स्थिति के उद्देश्य से स्मार्टफोन कैमरे के साथ पेट्री डिश की एक छवि पर कब्जा करें। नमूने के विकिरण के लिए एक सफेद एलईडी पैनल का उपयोग करें। कैमरे की मैन्युअल सेटिंग्स का उपयोग करें; प्रकाश के प्रतिबिंब से बचें; हमेशा कैमरा लेंस और नमूने के बीच एक ही दूरी प्राप्त करने के लिए समायोजित करें। सुनिश्चित करें कि एक्सपोज़र सेटिंग्स ImageJ का उपयोग करके बाद के विश्लेषण के लिए उपयुक्त छवि देती हैं।
    4. ImageJ सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके फिलामेंट्स के केंद्रीय सर्कल के व्यास को मापें।
      1. ImageJ खोलें, फ़ाइल | पर क्लिक करें खोलें, इच्छित फ़ाइल का चयन करें, और Enter क्लिक करें.
      2. सीधे बटन का चयन करें (एक सीधी रेखा के साथ)। पेट्री डिश के एक छोर से विपरीत छोर तक एक रेखा खींचने के लिए बाएं माउस बटन दबाएं। सुनिश्चित करें कि रेखा फिलामेंट्स के सर्कल के केंद्र से गुजरती है।
      3. कुंजीपटल पर Ctrl-K दबाएँ या विश्लेषण करें क्लिक करें | ImageJ मेनू में प्लॉट प्रोफ़ाइल. पिक्सेल तीव्रता बनाम दूरी के साथ एक x-y विंडो के लिए देखो-पेट्री डिश के एक 1 डी प्रोफ़ाइल बनाम प्लॉट किया. सुनिश्चित करें कि सबसे कम पिक्सेल तीव्रता 0 से थोड़ा ऊपर है और उच्चतम मान 255 से नीचे है।
      4. वृत्त के बाहर पिक्सेल तीव्रता के लिए एक औसत मान और वृत्त में पिक्सेल तीव्रता के लिए किसी अन्य औसत मान का अनुमान लगाएँ. इन मानों के बीच y-स्थिति पर, इन स्थितियों पर माउस के साथ इंगित करके वृत्त के दोनों किनारों के x-मानों का अनुमान लगाएं। दोनों मानों को नोट करें और अंतर की गणना करें।
      5. दाईं ओर y-अक्ष पर माउस को इंगित करके उच्चतम x-मान प्राप्त करें. ध्यान दें कि यह मान e पेट्री डिश के व्यास का प्रतिनिधित्व करता है। यदि यह व्यास 5 सेमी है, तो केंद्रीय फिलामेंट सर्कल के व्यास की गणना 5 सेमी के रूप में d/e × करें।

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Representative Results

उपर्युक्त विधियों का पालन करते हुए, पी. लैकुना के 5 अलग-अलग उपभेदों को रॉकपूल से अलग किया गया था और अनुक्रमित किया गया था (चित्र1 और तालिका 1)। सभी संस्कृतियों को ~ 1 वर्ष के उप-संस्कृति के बाद बाँझ किया गया था , सिवाय पी. लैकुना HE10JO को छोड़कर। यह तनाव अभी भी Marivirga atlantica, एक समुद्री जीवाणु के साथ दूषित है। बाद के हेलगोलैंड भ्रमण के दौरान, अन्य फिलामेंटस साइनोबैक्टीरिया को रॉक पूल से अलग किया गया था, जो पी. लैकुना से अलग हैं और उन्हें विशेषता की आवश्यकता है।

कई डीएनए निष्कर्षण और शुद्धिकरण विधियों का परीक्षण पी. कमी के लिए किया गया था। सबसे अच्छा परिणाम ऊपर वर्णित के रूप में एक अनुकूलित CTAB विधि के साथ प्राप्त किए गए थे। डीएनए की पैदावार 310 ± 50 μg / mL थी, OD 260 nm / OD 280 nm 1.7 ± 0.03 था, और OD 260 nm / OD 230 nm 0.78 ± 0.04 (n = 17) था। जीनोम अनुक्रमण से पता चला है कि सभी उपभेदों का डीएनए थोड़ा अलग था, जैसा कि अपेक्षित था (तालिका 1)। कोर प्रोटीन अनुक्रमों ने 0.04% का अधिकतम अंतर दिखाया (तालिका 2)। हालांकि सभी मसौदा जीनोम अधूरे थे, कोई भी मान सकता है कि HE10JO30 के जीनोम का >98% अनुक्रमित किया गया था। यह अनुमान अपूर्ण खुले पठन फ़्रेम की संख्या पर आधारित है. आंशिक प्रोटीन अनुक्रमों को HE10DO और HE10JO के RAST एनोटेशन के बाद आसानी से पहचाना जा सकता है। HE10JO में, ~ 4,500 में से 60 प्रोटीन में एक लापता एन- या सी-टर्मिनल अनुक्रम था। जीनोम अनुक्रमों को पूरक (पूरक फ़ाइल 3, पूरक फ़ाइल 4, पूरक फ़ाइल 5, पूरक फ़ाइल 6, और पूरक फ़ाइल 7) में पाया जा सकता है।

दिलचस्प बात यह है कि एक ही प्रजाति के उपभेदों को दो द्वीपों, हेलगोलैंड और गिग्लियो से अलग किया गया था। दोनों द्वीपों के बीच रैखिक दूरी 1,400 किमी है। दोनों स्थानों के बीच एक लिंक होना चाहिए, उदाहरण के लिए, समुद्र के माध्यम से जहाजों द्वारा या, अधिक संभावना है, प्रवासी पक्षियों द्वारा। दोनों द्वीपों पर कई पक्षी प्रजातियां पाई जा सकती हैं, और उनमें से कई प्रवासी पक्षी हैं। एक द्वीप के पी. लाकुना उपभेदों के भीतर विविधता निकटतम हेलगोलैंड और गिग्लियो उपभेदों (तालिका 2) के बीच की तुलना में अधिक थी। यह दोनों स्थानों के बीच एक गहन आदान-प्रदान को इंगित करता है।

प्राकृतिक परिवर्तन HE10DO के साथ प्रमुख तनाव के रूप में और HE10JO के साथ परीक्षण किया गया था। वर्तमान प्रोटोकॉल पहले12 वर्णित प्रोटोकॉल की तुलना में अधिक सीधा है क्योंकि वॉशिंग चरणों की कम संख्या और परिवर्तन के बाद कम स्थानांतरण चरण हैं। इस नई विधि का उपयोग प्रयोगशाला में लगातार किया जाता है; ~ 15 सफल परिवर्तन प्राप्त किए गए थे।

केएनआर प्रतिरोध कैसेट को आमतौर पर आसन्न क्षेत्रों द्वारा परिभाषित होमोलोगस साइट में एकीकृत किया गया था, जैसा कि आंतरिक और बाहरी प्राइमरों का उपयोग करके पीसीआर द्वारा दिखाया गया है। अधिकांश साइनोबैक्टीरिया की तरह, पी. लैकुना पॉलीप्लॉइड है। इसमें प्रति सेल12 में 100 से अधिक गुणसूत्र हो सकते हैं। परिवर्तन के 1 सप्ताह बाद बाहरी प्राइमरों के साथ एक पीसीआर परीक्षण में आमतौर पर वैद्युतकणसंचलन जेल पर 2 बैंड होते हैं, जंगली-प्रकार के बैंड के आकार के साथ एक और एक धीमा माइग्रेटिंग बैंड जो प्रतिरोध कैसेट (चित्रा 4) के सम्मिलन को इंगित करता है। डबल बैंड इंगित करता है कि गुणसूत्रों के केवल एक उप-खंड में सम्मिलन होता है। कानामायसिन पर चयन के 4 सप्ताह के बाद, अलगाव आमतौर पर पूरा हो जाता है, और जैल पर केवल एक बड़ा पीसीआर बैंड दिखाई देता है। हालांकि, pMH1 के साथ परिवर्तन के मामले में (नीचे देखें), अलगाव 3 महीने से अधिक समय के बाद पूरा हो गया था।

वैक्टर pAK1, pAK2, pAK3, और pMH1 sfGFP अभिव्यक्ति पर परीक्षण के लिए बनाए गए थे। PAK1, pAK2, और pAK3 में, sfGFP जीन क्रमशः cpc560, A2813, और psbA2 प्रमोटरों के नियंत्रण में है। ये प्रमोटर Synechocystis sp. PCC 6803 या Synechococcus sp. PCC 700231 से हैं। इन वैक्टरों के निर्माण के लिए, sfGFP प्रमोटर और टर्मिनेटर अनुक्रमों को Synechococcus sp. PCC 700231 के परिवर्तन के लिए उपयोग किए जाने वाले वैक्टर से लिया गया था। प्रासंगिक अनुक्रमों को pFN1 (या pFN_7_37_KanR15) की होमोलोगस chwA (sc_7_37) साइट में एकीकृत किया गया था। pMH1 अभिव्यक्ति वेक्टर का निर्माण डीएनए संश्लेषण द्वारा टेम्पलेट के रूप में पी. लैकुना अनुक्रमों का उपयोग करके किया गया था (पूरक फ़ाइल 6)। CpcB-cpcA (phycocyanin और phycocyanin α) P. lacuna के अनुक्रमों को क्रमिक रूप से व्यवस्थित किया जाता है। एक 100 बीपी इंटरजेनिक क्षेत्र दोनों कोडिंग क्षेत्रों को अलग करता है। सिंथेटिक अनुक्रम में यह अंतर्जात cpcB-cpcA अनुक्रम और cpcB प्रमोटर शामिल थे। sfGFP और KanR कैसेट cpcB स्टॉप कोडोन (cpcA के 5' के सिर्फ 3 'रखा गया है)। CPCB प्रमोटर, cpcB, sfGFP, KanR, cpcA (5'to 3') के साथ पूरे सिंथेटिक अनुक्रम को pUC19 में क्लोन किया गया है। एक मानचित्र चित्र 5 में दिखाया गया है। PAK1, pAK2, और pAK3 की क्लोनिंग और pMH1 का पूरा अनुक्रम पूरक फ़ाइल 1 में दिए गए हैं।

सभी 4 ट्रांसफॉर्मेंट (pAK1, pAK2, pAK3, और pMH1 के साथ) GFP व्यक्त किया; सभी प्रतिदीप्ति स्तर जंगली प्रकार के फिलामेंट्स की पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति से ऊपर थे (चित्रा 6)। अपूर्ण अलगाव के साथ pMH1 transformants एक GFP संकेत है कि फिलामेंट्स के बीच बहुत परिवर्तनशील था पता चला. प्रतिदीप्ति संकेत समान रूप से वितरित किया गया था जब अलगाव पूरा हो गया था (चित्रा 6 ई)। PAK1, pAK2, और pAK3 transformants के माइक्रोस्कोप सिग्नल समान थे लेकिन pMH1 (चित्रा 6E) की तुलना में ~ 5x कमजोर थे।

स्थापित क्रायोकंजर्वेशन विधि एक ऐसी विधि पर आधारित है जिसे ई कोलाई के लिए स्थापित किया गया था। जब पिघलने के बाद ग्लिसरॉल हटाने के लिए 2 धोने के चरण किए गए थे, तो 15 पी में से 15 पी लैकुना नमूने बच गए (तालिका 3)। इस प्रोटोकॉल का उपयोग Synechocystis PCC 6803 के लिए भी किया जा सकता है, लेकिन केवल 2 धोने के चरणों के साथ और 1 (तालिका 3) के साथ नहीं।

Oscillatoriales फिलामेंट्स की एक और विशेषता उनकी गतिशीलता है: P. lacuna फिलामेंट्स सतहों पर लगातार चलते हैं (चित्रा 7) और एक तरल माध्यम (चित्रा 8) में। दोनों प्रकार की गति का अध्ययन पेट्री व्यंजनों में बिना या आगर माध्यम के साथ आसानी से किया जा सकता है। टाइम-लैप्स रिकॉर्डिंग की आवश्यकता होती है क्योंकि आगर पर आंदोलन धीमा होता है। फिलामेंट्स प्रकाश शंकु की ओर बढ़ते हैं यदि एक प्रकाश बीम नीचे से आता है (चित्र 3)। प्रकाश तीव्रता, तरंग दैर्ध्य और समय के प्रभावों का आसानी से एक सरल सेटअप के साथ अध्ययन किया जा सकता है। इस प्रभाव के फोटोरिसेप्टर अभी तक स्पष्ट नहीं हैं। संभावित उम्मीदवारों को नॉकआउट म्यूटेंट के साथ संबोधित किया जा सकता है। फिलामेंट्स प्रकाश को कैसे पाते हैं, इसके अंतर्निहित तंत्र भी स्पष्ट नहीं है। इस प्रश्न के लिए, अंधेरे से प्रकाश तक उनके आंदोलन के दौरान फिलामेंट्स को रिकॉर्ड करने के लिए एक अवरक्त प्रणाली की आवश्यकता होती है।

Figure 1
चित्रा 1: हेलगोलैंड और गिग्लियो से एकत्र किए गए फोरमिडियम लैकुना के उपभेद। फिलामेंट्स को 6 सेमी पेट्री व्यंजनों में एफ / 2 अगर पर 11 दिनों के लिए प्रचारित किया जाता है। (ए) तनाव GI08AO; (बी) तनाव GI08IO; (c) तनाव GI09CO; (घ) तनाव HE10DO; (ई) तनाव HE10JO; (च) तनाव HE15M2G1. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: परिवर्तन के 5 सप्ताह बाद Phormidium lacuna फिलामेंट्स। sfGFP अभिव्यक्ति वेक्टर pMH1 का उपयोग किया गया था; चयन 120 μg / mL kanamycin के साथ f / 2 + माध्यम पर हुआ। हरे रंग के फिलामेंट्स प्रतिरोधी और जीवित हैं; अन्य फिलामेंट्स मर चुके हैं। स्केल बार = 100 μm. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: Phototaxis प्रयोग. बाएं: 4 लाल एलईडी के साथ एलईडी धारक, एक समायोज्य बिजली की आपूर्ति से जुड़ा हुआ है। प्रत्येक एलईडी के शीर्ष पर, एक Phormidium lacuna संस्कृति के 8 mL के साथ एक 6 सेमी पेट्री पकवान है। दाएँ: लाल एलईडी (15 μmol m-2 s-1) पर 2 दिनों के बाद पी. lacuna के साथ पेट्री पकवान. संक्षिप्त नाम: एलईडी = प्रकाश उत्सर्जक डायोड। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: एकीकरण और pAK1 के साथ Phormidium lacuna के परिवर्तन के बाद सम्मिलित करने का अलगाव. बाहरी प्राइमरों के साथ पीसीआर। सम्मिलित किए बिना और उसके साथ उत्पाद के अपेक्षित आकार क्रमशः 2371 और 5016 बीपी हैं। बाईं लेन: मार्कर, लेन 1, 2, 3, 4: फिलामेंट्स के पीसीआर उत्पाद क्रमशः एक प्रतिरोधी फिलामेंट (परिवर्तन के बाद 4 सप्ताह) के अलगाव के बाद 7 दिन, 11 दिन, 14 दिन और 17 दिन। लेन 5: जंगली प्रकार का पीसीआर उत्पाद (एक अलग जेल से)। 7 दिन के नमूने में, सम्मिलित गुणसूत्रों के एक छोटे से अंश में मौजूद है। यह अंश 17 दिनों तक बढ़ता है, जहां कोई जंगली-प्रकार का बैंड दिखाई नहीं देता है, यानी, अलगाव पूरा हो जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: अंतर्जात cpcB प्रमोटर के नियंत्रण के तहत sfGFP अभिव्यक्ति के लिए वेक्टर. नारंगी: Phormidium lacuna होमोलॉगस अनुक्रम, बैंगनी / नीला: pUC-19 वेक्टर बैकबोन, हरा: sfGFP और KanR के साथ सम्मिलित करें। संक्षेप: sfGFP = सुपरफ़ोल्डर ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन; KanR = kanamycin प्रतिरोध। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: Phormidum lacuna में sfGFP की अभिव्यक्ति. P. lacuna जंगली प्रकार के फिलामेंट्स (ए) की प्रतिदीप्ति छवियां और pAK1 (B), pAK2 (C), pAK3 (D), और pMH1 (E) के साथ परिवर्तन के बाद। pMH1 में, sfGFP जीन को phycocyanin जीन के 3 'रखा जाता है और इसलिए अंतर्जात cpcó प्रमोटर द्वारा संचालित होता है; अन्य मामलों में, sfGFP cpc560, A2813, या psbA2s प्रमोटरों Synechocystis PCC 6803 से क्रमशः द्वारा संचालित है। प्रतिदीप्ति सेटिंग्स GFP के लिए विशिष्ट हैं; सभी छवियों को एक ही एकीकरण समय और ऑप्टिकल सेटिंग्स के साथ रिकॉर्ड किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्रा 7: 4x आवर्धन पर आगर की सतह पर Phormidium lacuna के विलय छवि. पहली छवि को लाल रंग में प्रस्तुत किया गया है, दूसरा (1 मिनट बाद लिया गया) हरे रंग में। अगर पर निशान भी नोट करें। स्केल बार = 100 μm. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें।

Figure 8
चित्रा 8: तरल माध्यम में Phormidium lacuna की विलय छवि. दोनों छवियों के बीच का समय अंतराल 10 सेकंड था। पहली छवि लाल रंग में मुद्रित की जाती है; दूसरा हरे रंग में मुद्रित किया जाता है। दोनों रंगों की तुलना करने से 10 सेकंड के भीतर आंदोलन को दिखाया गया है। स्केल बार = 100 μm. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें।

मोच HE10JO HE10DO GI08AO GI09CO HE15M2G1
Contigs 104 174 218 102 154
कुल bp 48,19,017 47,88,491 47,78,775 36,69,922 45,98,395

तालिका 1: Phormidium lacuna उपभेदों.

Gi09CO HE10DO HE10JO HE15M2G1
Gi08AO 42 40 0 42
Gi09CO 2 42 0
HE10DO 40 2
HE10JO 42

तालिका 2. 10,876 अमीनो एसिड के साथ 20 कोर प्रोटीन के अनुक्रमों में उपभेदों के बीच अमीनो एसिड अंतर।

सेल घनत्व OD 750 nm 1 1 3 3 5 5 7 7
धोता है 1 2 1 2 1 2 1 2
Synechocystis पीसीसी 6803 2/5 5/5 1/4 4/4 0/4 4/4 0/4 3/4
Phormidium lacuna HE10DO 4/4 4/4 4/4 4/4 3/ 4 4/4 3/3 3/3

तालिका 3: Synechocystis पीसीसी 6803 और Phormidium lacuna HE10DO साइनोबैक्टीरिया के साथ क्रायोकन्जर्वेरेशन परीक्षण। पहली संख्या उन संस्कृतियों की संख्या को दर्शाती है जो ठंड / पिघलने के बाद बच गए; दूसरी संख्या कुल परीक्षणों को दर्शाती है।

पूरक वीडियो S1: समय-अंतराल के बिना तरल समाधान में Phormidium lacuna फिलामेंट्स का आंदोलन। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक वीडियो S2: समय-अंतराल के साथ आगर की सतह पर Phormidium lacuna फिलामेंट्स का आंदोलन। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक फ़ाइल 1: Phormidium lacuna के परिवर्तन के लिए वैक्टर की क्लोनिंग. परिवर्तन वैक्टर की सूची; क्लोनिंग के लिए प्राइमरों की सूची; जीबी प्रारूप में pMH1 का अनुक्रम. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

पूरक फ़ाइल 2: शेल स्क्रिप्ट (sh) रास्पबेरी पाई minicomputer के लिए. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

पूरक फ़ाइल 3: HE152G1 के डीएनए अनुक्रम. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

पूरक फ़ाइल 4: GI08AO के डीएनए अनुक्रम. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

पूरक फ़ाइल 5: GI09CO के डीएनए अनुक्रम। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

पूरक फ़ाइल 6: HE10DO के डीएनए अनुक्रम. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

पूरक फ़ाइल 7: HE10JO के डीएनए अनुक्रम. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

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Discussion

यद्यपि साइनोबैक्टीरिया के कई उपभेद संस्कृति संग्रह 32,33,34,35,36 से उपलब्ध हैं, फिर भी जंगली से नए साइनोबैक्टीरिया की मांग है क्योंकि ये प्रजातियां विशिष्ट गुणों के अनुकूल हैं। पी. लैकुना को रॉकपूल से एकत्र किया गया था और नमक सांद्रता और तापमान30 की विविधताओं के लिए अनुकूलित किया गया है। इस प्रजाति के उपभेद 2008, 2009 और 2010 में भ्रमण के दौरान पाए गए थे। यहां वर्णित प्रक्रिया के साथ, पी. लाकुना के 5 उपभेदों को अलग किया गया था, और इनमें से 4 उपभेद बाँझ थे। तनाव P. lacuna HE10JO स्थायी रूप से जीवाणु Marivirga atlantica, एक समुद्री जीवाणु rRNA और जीनोम अनुक्रमण द्वारा पहचाना के साथ दूषित है। इस जीवाणु को यांत्रिक पृथक्करण, विभिन्न तापमानों पर विकास, एंटीबायोटिक दवाओं के साथ उपचार, या रासायनिक उपचार के आवेदन के बावजूद साइनोबैक्टीरियम से अलग नहीं किया जा सकता था। संदूषण के बावजूद, P. lacuna HE10JO को अन्य उपभेदों के समान खेती की जा सकती है। बाद के भ्रमण में, Oscillatoriales के अन्य सदस्य पाए गए, जिनका अभी तक विस्तार से विश्लेषण नहीं किया गया है। P. lacuna फिर से नहीं मिला था। यह स्पष्ट नहीं है कि पी. कमी को बाद के वर्षों और दो अलग-अलग स्थानों में अलग-थलग क्यों किया गया था, लेकिन बाद में नहीं मिला। इसकी बहुतायत निश्चित रूप से गैर-अनुमानित स्थितियों पर निर्भर करती है। तापमान, नमक सांद्रता, और अकार्बनिक या कार्बनिक पोषक तत्व रॉकपूल में अत्यधिक परिवर्तनशील हैं। इसलिए, प्रजातियों की संरचना एक अप्रत्याशित तरीके से समय के साथ उतार-चढ़ाव कर सकती है।

प्राकृतिक परिवर्तन विभिन्न साइनोबैक्टीरिया के लिए स्थापित किया गया है, ज्यादातर एकल-कोशिका वाली प्रजातियां। फिलामेंटस पी. लाकुना आदेश Oscillatoriales की एकमात्र प्रजाति है जिसके लिए प्राकृतिक परिवर्तन स्थापित किया गया है। परिवर्तन वर्तमान प्रोटोकॉल के साथ लगभग हमेशा सफल रहा। सामान्य तौर पर, एक परिवर्तन परीक्षण के बाद प्रतिरोधी फिलामेंट्स की संख्या काफी भिन्न होती है, और कभी-कभी परिवर्तन विफल हो जाता है, जिसके परिणामस्वरूप मूल्यवान समय का नुकसान होता है। इसलिए समानांतर में कई परिवर्तन परियोजनाओं को करने की सलाह दी जाती है। पूर्ण अलगाव के लिए समय, आमतौर पर प्रतिरोधी तनाव के अलगाव के 4 सप्ताह बाद, भी भिन्न हो सकता है। क्योंकि कानामायसिन पर विकास के बाद पूर्ण अलगाव की कोई गारंटी नहीं है, बाहरी और आंतरिक प्राइमरों का उपयोग करके पीसीआर परीक्षण करना महत्वपूर्ण है।

प्रत्येक वेक्टर में 2 x 500-1,000 बीपी होमोलोगस अनुक्रम होने चाहिए, उदाहरण के लिए, पीसीआर द्वारा मेजबान से प्रवर्धित और एक प्रतिरोध कैसेट द्वारा बाधित (उदाहरण के लिए, यहां उपयोग किए जाने वाले कानामायसिन कैसेट कानआर) 37,38। अभिव्यक्ति के लिए, एक प्रमोटर, कोडिंग अनुक्रम (उदाहरण के लिए,sfGFP 39 के लिए), टर्मिनेटर, और प्रतिरोध कैसेट को सजातीय अनुक्रमों के बीच क्लोन किया जाना चाहिए। क्लोनिंग रणनीतियाँ प्रजातियों-विशिष्ट हैं और प्रयोग के उद्देश्य पर निर्भर करती हैं।

यह परिवर्तन विधि अन्य Oscillatoriales उपभेदों या अन्य साइनोबैक्टीरिया के साथ भी संभव हो सकती है: प्राकृतिक परिवर्तन प्रकार IV पिली पर आधारित है, जो लगभग हर दूसरे साइनोबैक्टीरिया जीनोम 3,15,40 में मौजूद हैं। इसलिए, वर्तमान विधि अन्य प्रजातियों के साथ नए परीक्षणों को उत्तेजित कर सकती है। क्योंकि टाइप IV पिली भी गतिशीलता के लिए प्रासंगिक हैं, इसलिए उन स्थितियों की जांच करना महत्वपूर्ण है जिनके तहत साइनोबैक्टीरिया गतिशील हैं।

जीन सम्मिलन सजातीय पुनर्संयोजन पर आधारित है और इसके परिणामस्वरूप होमोलोगस साइटों का विघटन होता है। इसलिए, परिवर्तन का उपयोग अक्सर जीन नॉकआउट के लिए किया जाता है। सम्मिलित जीन की अभिव्यक्ति को प्रेरित किया जाएगा यदि एक सक्रिय प्रमोटर और एक कोडिंग अनुक्रम को सजातीय साइट में एकीकृत किया जाता है। पी. लाकुना में, प्रमोटर गतिविधि प्रजातियों पर निर्भर थी। CPC560, A2813, और PsbA2 Synechocystis PCC SP 6803 या Synechococcus sp. PCC 7002 31 के प्रमोटर और P. lacuna के cpcB प्रमोटर sfGFP अभिव्यक्ति ड्राइव कर सकते हैं। इन निर्माणों में से, अंतर्जात cpcB प्रमोटर ने सबसे मजबूत अभिव्यक्ति को प्रेरित किया, हालांकि sfGFP जीन phycocyanin जीन के 3 'स्थित है। यह साइनोबैक्टीरिया अभिव्यक्ति में अंतर्जात प्रवर्तकों के अधिक सामान्य उपयोग को इंगित करता है।

जीन नॉकआउट और गति अध्ययन का संयोजन गतिशीलता और फोटोटैक्सिस के आणविक तंत्र पर प्रकाश डालेगा। एलईडी प्रकाश स्रोत फोटोटैक्सिस प्रयोगों के लिए प्रकाश प्रदान कर सकते हैं। लगभग कोई भी तरंग दैर्ध्य उपलब्ध है, और प्रकाश तीव्रता को एक समायोज्य बिजली की आपूर्ति और potentiometers द्वारा संशोधित किया जा सकता है। एलईडी धारकों को आसानी से विभिन्न एल ई डी के संयोजन का एहसास करने के लिए 3 डी प्रिंटर द्वारा बनाया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई संघर्ष नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को कार्ल्सरूहर इंस्टीट्यूट ऑफ टेक्नोलॉजी द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Autoclave 3870 ELV Tuttnauer 3870 ELV
Bacto Agar OttoNorwald 214010
BG-11 Freshwater Solution Sigma Aldrich C3061
BG-11 medium Merck 73816-250ML
Boric acid Merck 10043-35-3 H3BO3
Calcium chloride dihydrate Carl Roth 10035-04-8 CaCl2 · 2 H2O
Cell culture flasks Cellstar with filter screw cap, sterile, 250 mL Greiner 658190
Cell culture flasks Cellstar with filter screw cap, sterile, 50 mL Greiner 601975
Centrifuge LYNX 4000 Thermo Scientific 75006580 and rotor
Centrifuge microstar 17 VWR International N/A for up to 13,000 rpm
Cetyltrimethylammonium Bromide (CTAB) PanReac AppliChem 57-09-0 C19H42BrN
Chloroform : Isoamyl Alcohol 24 : 1 PanReac AppliChem
A1935
Cobalt(II) chloride hexahydrate Merck 7791-13-1 CoCl2 · 6 H2O
Copper(II) sulphate pentahydrate Merck 7758-99-8  CuSO4 · 5 H2O
D(+)-Biotin Carl Roth 58-85-5  C10H16N2O3S
DNA ladder 1 kb New England Biolabs N3232
DNA ladder 100 bp New England Biolabs N3231
Electrical pipetting help accujet-pro S Brand GmbH 26360 for pipetting 1-25 mL
Ethanol VWR 64-17-5 C2H6O
Ethylenediamine tetraacetic acid disodium salt dihydrate Carl Roth 6381-92-6 EDTA-Na2 · 2 H2O
Fluorescence microscope ApoTome Zeiss
Fluorescence microscope Axio Imager 2 Zeiss
French Pressure Cell Press American Instrument Company N/A
Gel documation System Saffe Image Invitrogen
Gelelctrophoresis system Mupid-One/-exu ADVANCED
Glassware, different
Glycerol Carl Roth 56-81-5 C3H8O3
Iron(III) chloride hexahydrate Merck 10025-77-1  FeCl3 · 6 H2O
Kanamycin Sigma-Aldrich 25389-94-0
Kanamycin sulphate Carl Roth 25389-94-0 C18H36N4O11 · H2SO4
Lauroylsarcosine, Sodium Salt (Sarcosyl) Sigma Aldrich 137-16-6 C15H28NO3 · Na
LB Broth (Lennox) Carl Roth X964.4
Light source, fluorescent tube L18W/954 daylight OSRAM cultivation of cyanobacteria
Light source, LED panel XL 6500K 140 W Bloom Star N/A cultivation of cyanobacteria, up to 1,000 µmol m-2 s-1
Magnesium chloride hexahydrate Carl Roth 7791-18-6 MgCl2 · 6 H2O
Manganese(II) chloride tetrahydrate Serva 13446-34-9 MnCl2 · 4 H2O
Microscope DM750 Zeiss
Midi prep plasmid extraction kit NucleoBond Xtra Midi kit Macherey-NAGEL GmbH & Co. KG REF740410.50
Minicomputer Raspberry Pi 4 + Conrad Electronics 2138863-YD for time-lapse recording
Ocular camera EC3 Leica for continuous recording up to 30 s
Ocular camera MikrOkular Full HD Bresser for time-lapse recordings, coupled to Raspberry Pi minicomputer
Petri dishes polystyrole, 100 mm x 20 mm Merck P5606-400EA
Petri dishes polystyrole, 60 mm x 15 mm Merck P5481-500EA
Photometer Nanodrop ND-1000 Peqlab Biotechnologie
Photometer Uvikon XS Goebel Instrumentelle Analytik GmbH
Pipetman 100-1,000 µL Gilson SKU: FA10006M
Pipetman 10-100 µL Gilson SKU: FA10004M
Plastic pipettes 10 mL, sterile Greiner 607107
Plastic tube, sterile, 15 mL Greiner 188271
Plastic tube, sterile, 50 mL Greiner 227261
Potassium bromide Carl Roth 7758-02-3 KBr
Potassium chloride Carl Roth 7447-40-7 KCl
Power supply Statron 3252-1 Statron Gerätetechnik GmbH
Power supply Voltcraft PPS 16005 Conrad Electronics for LED
Proteinase K Promega MC500C from Maxwell 16 miRNA Tissue Kit AS1470
Q5 polymerase New England Biolabs M0491S
Sequencing kit NextSeq 500/550 v2.5 Illumina
Sequencing system NextSeq 550 SY-415-1002 Illumina
Shaker Unimax 2010 Heidolph Instruments for cultivation
Sodium acetate Carl Roth 127-09-3 NaCH3COO
Sodium chloride Carl Roth 7647-14-5 NaCl
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate Carl Roth 10049-21-5 NaH2PO4 · H2O
Sodium fluoride Carl Roth 7681-49-4 NaF
Sodium hydrogen carbonate Carl Roth 144-55-8 NaHCO3
Sodium molybdate dihydrate Serva 10102-40-6 Na2MoO4 · 2 H2O
Sodium nitrate Merck 7631-99-4 NaNO3
Sodium sulphate Carl Roth 7757-82-6 Na2SO4
Strontium chloride hexahydrate Carl Roth 10025-70-4 SrCl2 · 6 H2O
Thiamine hydrochloride Merck 67-03-8 C12H17ClN4OS · HCl
TRIS Carl Roth 77-86-1 C4H11NO3
Ultrasonic device UP100H with sonotrode MS3 Hielscher Ultrasound Technology UP100H
Ultraturrax Silent Crusher M Heidolph Instruments homogenizer
Urea Carl Roth 57-13-6 CH4N2O
Vitamin B12 Sigma 68-19-9 C63H88CoN14O14P
Vitamin solution 0.3 µM thiamin-HCl, 2.1 nM biotin, 0.37 nM cyanocobalamin
Water Stills, Water treatment VEOLIA water technologies ELGA_21001
Zinc sulphate heptahydrate Sigma 7446-20-0 ZnSO4 · 7 H2O
software, URL
gatb-minia program for DNA assembly https://github.com/GATB/gatb-minia-pipeline makes large scaffolds from short DNA reads, Linux based
ImageJ software for immage processing (pixel intensities, circle diameter)
RAST annotation server https://rast.nmpdr.org input: genome DNA sequence, detects open reading frames, lists protein sequences and their functions
Culture media
Artificial seawater 0.41 M NaCl , 53 mM MgCl2,28 mM Na2SO4, 10 mM CaCl2 , 9 mM  KCl , 2.4 mM NaHCO3 ,0.84 mM KBr, 0.49 mM H3BO3, 90 µM SrCl2, 72 µM NaF
f/2 -liquid medium artificial seawater, 0.1 % (v/v) trace element solution, 0.05 % (v/v) vitamin solution, 0.88 mM NaNO3, 36 µM NaH2PO4 
f/2+ liquid medium f/2-medium, with 10 times increased NaNO3 and NaH2PO4 (0.88 mM NaNO3, 36 µM NaH2PO4
f/2+-agar 3 % (w/v) bacto agar, artificial seawater, 0.1 % (v/v) trace element solution, 0.05 % (v/v) vitamin solution ,8.8 mM NaNO3, 0.36 mM NaH2PO4
f/2-agar 3 % (w/v) bacto agar, artificial seawater, 0.1 % (v/v) trace element solution, 0.05 % (v/v) vitamin solution ,0.88 mM NaNO3, 36 µM NaH2PO4
Trace element solution 0.36 mM NaH2PO4, 12 µM Na2EDTA, 39 nM CuSO4, 26 nM Na2MoO4 , 77 nM ZnSO4, 42 nM CoCl2, 0.91 µM MnCl2
Vitamin solution 0.3 µM thiamin-HCl, 2.1 nM biotin, 0.37 nM cyanocobalamin

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References

  1. Brasil, B., de Siqueira, F. G., Salum, T. F. C., Zanette, C. M., Spier, M. R. Microalgae and cyanobacteria as enzyme biofactories. Algal Research-Biomass Biofuels and Bioproducts. 25, 76-89 (2017).
  2. Gundolf, R., Oberleitner, S., Richter, J. Evaluation of New Genetic Toolkits and Their Role for Ethanol Production in Cyanobacteria. Energies. 12 (18), 3515 (2019).
  3. Wendt, K. E., Pakrasi, H. B. Genomics approaches to deciphering natural transformation in cyanobacteria. Frontiers in Microbiology. 10, 1259 (2019).
  4. Tandeau de Marsac, N., et al. A new approach for molecular cloning in cyanobacteria: cloning of an Anacystis nidulans met gene using a Tn901-induced mutant. Gene. 20 (1), 111-119 (1982).
  5. Porter, R. D. Transformation in cyanobacteria. Critical Reviews in Microbiology. 13 (2), 111-132 (1986).
  6. Joset, F. Transformation in Synechocystis PCC 6714 and 6803: preparation of chromosomal DNA. Methods in Enzymology. 167, 712-714 (1988).
  7. Tsinoremas, N. F., Kutach, A. K., Strayer, C. A., Golden, S. S. Efficient gene transfer in Synechococcus sp strains PCC-7942 and PCC-6301 by interspecies conjugation and chromosomal recombination. Journal of Bacteriology. 176 (21), 6764-6768 (1994).
  8. Matsunaga, T., Takeyama, H. Genetic engineering in marine cyanobacteria. Journal of Applied Phycology. 7 (1), 77-84 (1995).
  9. Frigaard, N. U., Sakuragi, Y., Bryant, D. A. Gene inactivation in the cyanobacterium Synechococcus sp. PCC 7002 and the green sulfur bacterium Chlorobium tepidum using in vitro-made DNA constructs and natural transformation. Methods in Molecular Biology. 274, 325-340 (2004).
  10. Iwai, M., Katoh, H., Katayama, M., Ikeuchi, M. Improved genetic transformation of the thermophilic cyanobacterium, Thermosynechococcus elongatus BP-1. Plant and Cell Physiology. 45 (2), 171-175 (2004).
  11. Vioque, A. Transformation of cyanobacteria. Transgenic Microalgae as Green Cell. Leon, R., Galvan, A., Fernandez, E. , Springer. 12-22 (2007).
  12. Nies, F., Mielke, M., Pochert, J., Lamparter, T. Natural transformation of the filamentous cyanobacterium Phormidium lacuna. Plos One. 15 (6), 0234440 (2020).
  13. Ravindran, C. R. M., Suguna, S., Shanmugasundaram, S. Electroporation as a tool to transfer the plasmid pRL489 in Oscillatoria MKU 277. Journal of Microbiological Methods. 66 (1), 174-176 (2006).
  14. El Semary, N. A. Optimized electroporation-induced transformation in Microcystis aeruginosa PCC7806. Biotechnologie Agronomie Societe et Environnement. 14 (1), 149-152 (2010).
  15. Nies, F., Mielke, M., Pochert, J., Lamparter, T. Natural transformation of the filamentous cyanobacterium Phormidium lacuna. PLoS One. 15 (6), 0234440 (2020).
  16. Sode, K., Tatara, M., Takeyama, H., Burgess, J. G., Matsunaga, T. Conjugative gene-transfer in marine cyanobacteria - Synechococcus Sp, Synechocystis Sp and Pseudanabaena Sp. Applied Microbiology and Biotechnology. 37 (3), 369-373 (1992).
  17. Stucken, K., Ilhan, J., Roettger, M., Dagan, T., Martin, W. F. Transformation and conjugal transfer of foreign gGenes into the filamentous multicellular cyanobacteria (Subsection V) Fischerella and Chlorogloeopsis. Current Microbiology. 65 (5), 552-560 (2012).
  18. Bellali, S., Khalil, J. B., Fontanini, A., Raoult, D., Lagier, J. C. A new protectant medium preserving bacterial viability after freeze drying. Microbiological Research. 236, 126454 (2020).
  19. Wallner, T., Pedroza, L., Voigt, K., Kaever, V., Wilde, A. The cyanobacterial phytochrome 2 regulates the expression of motility-related genes through the second messenger cyclic di-GMP. Photochemical & Photobiological Sciences. 19 (5), 631-643 (2020).
  20. Wilde, A., Fiedler, B., Borner, T. The cyanobacterial phytochrome Cph2 inhibits phototaxis towards blue light. Molecular Microbiology. 44 (4), 981-988 (2002).
  21. Bhaya, D., Takahashi, A., Grossman, A. R. Light regulation of type IV pilus-dependent motility by chemosensor-like elements in Synechocystis PCC6803. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (13), 7540-7545 (2001).
  22. Guillard, R. R., Ryther, J. H. Studies of marine planktonic diatoms. I. Cyclotella nana Hustedt, and Detonula confervacea (cleve) Gran. Canadian Journal of Microbiology. 8, 229-239 (1962).
  23. Kester, D. R., Duedall, I. W., Connors, D. N., Pytkowicz, R. M. Preparation of artificial seawater. Limnology and Oceanography. 12 (1), 176-179 (1967).
  24. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning. A Laboratory Manual. 3rd edition. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).
  25. Cold Spring Harbor Protocols. CTAB DNA extraction buffer. Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (3), (2009).
  26. Singh, S. P., Rastogi, R. P., Häder, D. -P., Sinha, R. P. An improved method for genomic DNA extraction from cyanobacteria. World Journal of Microbiology & Biotechnology. 27, 1225-1230 (2011).
  27. French, C. S., Milner, H. W. Disintegration of bacteria and small particles by high-pressure extrusion. Methods in Enzymology. 1, 64-67 (1955).
  28. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning, a laboratory manual. 2nd ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).
  29. Lamparter, T., et al. The involvement of type IV pili and phytochrome in gliding motility, lateral motility and phototaxis of the cyanobacterium Phormidium lacuna. bioRxiv. , (2021).
  30. Nies, F., et al. Characterization of Phormidium lacuna strains from the North Sea and the Mediterranean Sea for biotechnological applications. Process Biochemistry. 59, 194-206 (2017).
  31. Kachel, B., Mack, M. Engineering of Synechococcus sp. strain PCC 7002 for the photoautotrophic production of light-sensitive riboflavin (vitamin B2). Metabolic Engineering. 62, 275-286 (2020).
  32. Lukavsky, J., Cepak, V., Komarek, J., Kasparkova, M., Takacova, M. Catalogue of algal and cyanobacterial strains of culture collection of autotrophic organisms at Trebon. Algological Studies. 63, 59-112 (1992).
  33. Philbrick, J. B., Diner, B. A., Zilinskas, B. A. Construction and characterization of cyanobacterial mutants lacking the manganese-stabilizing polypeptide of photosystem-ii. Journal of Biological Chemistry. 266 (20), 13370-13376 (1991).
  34. Pinevich, A. V., Veprritskii, A. A., Gromov, B. V., Krautvald, K., Titova, N. N. Cellular and cultural properties and characterization of the pigment in Nostoc sp, a cyanobacterium unusually rich in c-phycoerythrin. Microbiology. 63 (5), 481-485 (1994).
  35. Schlosser, U. G., Friedl, T. Additions to the culture collection of algae at Gottingen since 1997. Nova Hedwigia. 71 (1-2), 243-262 (2000).
  36. Takano, H., Arai, T., Hirano, M., Matsunaga, T. Effects of intensity and quality of light on phycocyanin production by a marine cyanobacterium Synechococcus sp. 042902. Applied Microbiology and Biotechnology. 43 (6), 1014-1018 (1995).
  37. Carrer, H., Hockenberry, T. N., Svab, Z., Maliga, P. Kanamycin resistance as a selectable marker for plastid transformation in tobacco. Molecular and General Genetics: MGG. 241 (1-2), 49-56 (1993).
  38. Kaulen, H., Schell, J., Kreuzaler, F. Light-induced expression of the chimeric chalcone synthase-NptII gene in tobacco cells. EMBO Journal. 5 (1), 1-8 (1986).
  39. Cotlet, M., Goodwin, P. M., Waldo, G. S., Werner, J. H. A comparison of the fluorescence dynamics of single molecules of a green fluorescent protein: One- versus two-photon excitation. Chemphyschem. 7 (1), 250-260 (2006).
  40. Taton, A., et al. The circadian clock and darkness control natural competence in cyanobacteria. Nature Communications. 11 (1), 1688 (2020).

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जीव विज्ञान अंक 180
प्राकृतिक परिवर्तन, प्रोटीन अभिव्यक्ति, और फिलामेंटस साइनोबैक्टीरियम <em>Phormidium lacuna</em> के क्रायोकन्जर्वेक्षण
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Weber, N., Hofmeister, M., Wunsch,… More

Weber, N., Hofmeister, M., Wunsch, N., Kohler, A., Kaster, A. K., Vollmers, J., Kachel, B., Mack, M., Lamparter, T. Natural Transformation, Protein Expression, and Cryoconservation of the Filamentous Cyanobacterium Phormidium lacuna. J. Vis. Exp. (180), e63470, doi:10.3791/63470 (2022).

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