Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Isolering og karakterisering af cyanobakterielle ekstracellulære vesikler

Published: February 3, 2022 doi: 10.3791/63481
Automatic Translation
*1, *2, 3,4,5, 3,4, 3,4,6, 3,4,6
1Department of Biological Sciences, Wellesley College, 2Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Campus de Excelencia Internacional, Agroalimentario, Universidad de Córdoba, 3i3S - Instituto de Investigação e Inovação em Saúde, Universidade do Porto, 4IBMC - Instituto de Biologia Molecular e Celular, Universidade do Porto, 5MCbiology Doctoral Program, ICBAS - Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar, Universidade do Porto, 6Departamento de Biologia, Faculdade de Ciências, Universidade do Porto
* These authors contributed equally

Summary

Den nuværende protokol indeholder detaljerede beskrivelser af isolering, koncentration og karakterisering af ekstracellulære vesikler fra cyanobakterielle kulturer. Tilgange til rensning af vesikler fra kulturer i forskellige skalaer, afvejninger mellem metoder og overvejelser om at arbejde med feltprøver diskuteres også.

Abstract

Cyanobakterier er en forskelligartet gruppe af fotosyntetiske, gramnegative bakterier, der spiller kritiske roller i globale økosystemer og tjener som væsentlige bioteknologiske modeller. Nyligt arbejde har vist, at både marine og ferskvandscyanobakterier producerer ekstracellulære vesikler - små membranbundne strukturer frigivet fra mikrobernes ydre overflade. Mens vesikler sandsynligvis bidrager til forskellige biologiske processer, forbliver deres specifikke funktionelle roller i cyanobakteriel biologi stort set ukendte. For at tilskynde til og fremme forskning på dette område præsenteres en detaljeret protokol til isolering, koncentration og rensning af cyanobakterielle ekstracellulære vesikler. Det nuværende arbejde diskuterer metoder, der med succes har isoleret vesikler fra store kulturer af Prochlorococcus, Synechococcus og Synechocystis. Metoder til kvantificering og karakterisering af vesikelprøver fra disse stammer præsenteres. Tilgange til isolering af vesikler fra akvatiske feltprøver er også beskrevet. Endelig diskuteres også typiske udfordringer med cyanobakterie vesikelrensning, metodologiske overvejelser for forskellige downstream-applikationer og afvejningerne mellem tilgange.

Introduction

Ekstracellulære vesikler (IV'er) er sfæriske strukturer, der spænder mellem ~ 20-400 nm i diameter, frigivet af stort set alle organismer i deres omgivende miljø 1,2,3. Vesikler er afgrænset af et lipid dobbeltlag og kan ikke replikere sig selv. I gramnegative bakterier menes disse strukturer primært at opstå ved at 'bløde' små portioner fra den ydre membran. Alligevel kan andre processer, herunder flagellar bevægelse, cellelyse og sekretion af både indre og ydre membranmateriale, producere vesikler samt 4,5. ELBILER kan indeholde forskellige biomolekyler, herunder lipider, opløselige proteiner og membranproteiner, nukleinsyrer og metabolitter, og kan transportere dette materiale mellem celler 4,5,6. I betragtning af disse funktioner undersøges elbiler for at forstå deres mulige roller i en bred vifte af biologiske processer, herunder cellulær kommunikation, biofilmdannelse, vandret genoverførsel, værtsfagdynamik og næringsstofudveksling 4,6.

Cyanobakterier er en stor og forskelligartet gruppe af gramnegative bakterier, herunder encellede og trådformede organismer. De er af interesse fra mange perspektiver, herunder forståelse af deres fysiologi og mangfoldighed 7,8, de kritiske økosystemfunktioner, de tjener 9,10, og deres anvendelighed til bioteknologi11,12. Cyanobakterier findes i en lang række levesteder, enten som fritlevende organismer i marine, ferskvands- og terrestriske miljøer eller i symbiotiske foreninger med moser, bregner, planter eller i lav og svampe13. De tjener som afgørende primærproducenter i akvatiske økosystemer, der producerer ilt og organisk kulstof gennem oxygenisk fotosyntese 9,10, og nogle er også i stand til at fiksere atmosfærisk nitrogen7. Marine og ferskvandscyanobakterier, herunder Prochlorococcus, Synechococcus og Synechocystis, producerer elbiler under laboratoriebetingelser 14,15,16, og cyanobakterielle vesikler kan også findes i naturlige miljøer 14,17. De biologiske og økologiske funktioner af cyanobakterielle vesikel er ukendte, men yderligere forskning på dette område vil sandsynligvis give ny indsigt i spørgsmål om cyanobakteriel fysiologi, differentiering, kommunikationsstrategier, evolution og trofiske interaktioner. Desuden kan cyanobakterielle elbilers evne til at transportere forskellige kategorier af biomolekyler have kommercielle anvendelser18,19.

Den foreliggende protokol beskriver metoder til isolering og karakterisering af vesikler fra cyanobakterielle kulturer og feltprøver for at muliggøre og tilskynde til en bredere undersøgelse af cyanobakteriel ekstracellulær vesikelbiologi. Mens arbejdsgangen beskrevet her er analog med protokoller til isolering og karakterisering af elbiler fra andre bakterier, indeholder cyanobakterielle kulturer og feltprøver typisk lavere celle- og vesikelkoncentrationer, end der almindeligvis observeres med værtssammenhæng eller patogene modelsystemer 20,21,22. Undersøgelser af cyanobakterielle elbiler kræver således særlige overvejelser og optimeringer til dyrkning og vesikkelisolering, som varierer yderligere mellem stammer og mediebaggrunde. Da ingen enkelt protokol vil fungere lige så godt for alle stammer, vækstbetingelser og downstream-applikationer, giver vi flere muligheder og diskuterer de involverede kompromiser, så forskere kan bestemme de tilgange, der er mest hensigtsmæssige til at løse deres eksperimentelle spørgsmål.

Protocol

De cyanobakterielle stammer er hentet fra flere kultursamlinger (se Diskussion for detaljer).

1. Cyanobakterial dyrkning

  1. Dyrk marine cyanobakterier Prochlorococcus og Synechococcus ved at følge nedenstående trin.
    1. Prochlorococcus- og Synechococcus-stammer dyrkes i polycarbonatkolber ved hjælp af et passende medium såsom Pro99 eller SN (se materialetabellen). For detaljer, se tidligere offentliggjorte referencer23,24.
    2. Akklimatisere kulturerne ved at dyrke dem på tværs af to til tre overførsler (1:20 fortyndinger af kultur til friske medier for hver passage) under de ønskede temperatur- og bestrålingsbetingelser, der kræves til eksperimentet.
      BEMÆRK: Typiske vækstbetingelser23,25 omfatter temperaturer mellem 15-30 °C ved bestråling mellem 8-150 pmolfotoner m-2 s-1, men individuelle stammetolerancer og optima varierer meget26 og skal indstilles på baggrund af vejledning fra de relevante kultursamlingsinstruktioner eller litteratur. Overvåg vækstraten ved hjælp af kulturfluorescens eller flowcytometri tæller23, og sørg for, at kulturer vokser med en konsekvent steady-state eksponentiel hastighed, inden eksperimentet påbegyndes.
    3. Udfør et sæt successive gradvise overførsler fra mindre til større volumener, når cellerne når sen eksponentiel fase (f.eks. 20 ml < 250 ml < 2 l < 10 l < 20 l).
      BEMÆRK: Kulturer med store mængder kan ikke direkte podes fra små mængder startkultur. Bemærk, at større kulturer kan kræve tilsætning af buffere (såsom 1 mM HEPES, pH 7,5 eller 3,75 mM TAPS, pH 8) sammen med supplerende natriumbicarbonat eller boblende med steril luft24.
  2. Dyrk ferskvandscyanobakterie Synechocystis sp. PCC 6803.
    1. Forbered en kultur af Synechocystis sp. PCC 6803, der skal anvendes som inokulum ved at dyrke den med beluftning (boblende luft ved 1 l / min), ved 30 ° C, under et 16 timers lys (fotonantal på 50 μmol m-2 s-1) / 8 timers mørkt regime, op til en optisk densitet ved 730 nm (OD730) på 1,0 (eksponentiel fase) i BG11 medium27.
    2. Inokuler 30 ml af denne kultur Synechocystis sp. PCC 6803 i 570 ml BG11-medium til en OD730 på 0,05 i 1 L glasgasvaskeflasker.
    3. Lad cellerne vokse med beluftning ved 30 °C under et 16 timers lys (fotontal på 50 μmol m-2 s-1) / 8 timer mørkt regime, op til en endelig OD730 på 1,0-1,5.

2. Adskillelse af cyanobakterial biomasse fra den lille partikelfraktion (vesikkel)

BEMÆRK: For det første anbefales det at adskille celler fra supernatanten gennem centrifugalpelletering af celler. Men når dyrkningsvolumener er for store til, at dette kan lade sig gøre, er det muligt at springe centrifugering over og gå direkte til filtrering af hele kulturer ved hjælp af kapselfiltrering (trin 2.4).

  1. Udfør centrifugering for at adskille celler (bedst for volumener op til ~ 4 L, afhængigt af den tilgængelige centrifugekapacitet).
    1. Autoklave eller grundigt vaske og rengøre centrifugeflaskerne med type I ultrarent vand (se materialetabel), hvilket sikrer, at der ikke er nogen resterende sæbe eller andet materiale tilbage.
    2. Læg kulturprøver i et passende antal centrifugeflasker og balancer dem.
    3. Spinkulturer til > 10.000 x g ved 4 °C i 10 min. Hvis supernatanten forbliver synligt uklar, skal du øge centrifugeringsforholdene til 20 minutter ved maksimal hastighed og prøve igen.
    4. Dekanter forsigtigt eller pipet supernatant i en ren beholder, og fortsæt til en af følgende filtreringsmuligheder, der er nævnt i trin 2.2-2.4.
  2. Mulighed 1: Udfør sprøjtefiltrering ved hjælp af 0,2 μm filtre (for prøvevolumener op til ~ 50 ml).
    1. Fyld en steril 50 ml sprøjte med et stort set cellefrit dyrkningsmedium, og filtrer det gennem et 0,2 (eller 0,45) μm polyethersulfon (PES) filter (se materialetabel). Saml filtratet i en ren, steriliseret beholder.
    2. Gentag dette trin, indtil filteret er tilstoppet (f.eks. bliver det svært at skubbe med sprøjten). Udskift med et nyt filter, og fortsæt, indtil prøven er grundigt filtreret.
  3. Mulighed 2: Udfør 0,2 μm vakuumfiltrering (op til ~ 4 L).
    1. Vask og rengør vakuumapparatet grundigt med type I - ultrarent vandkvalitet, og tilslut det til en vakuumfælde og pumpe (se Materialetabel).
    2. Indsæt et 0,2 μm filter med en passende diameter, og fastspænd vakuumapparatet.
    3. Tilsæt en lille mængde kulturprøve, og det sikres, at vakuumtrykket forbliver <10 psi.
    4. Fortsæt med at filtrere kulturen i små trin, indtil den er færdig. Hvis filtreringshastigheden sænkes betydeligt, skal du stoppe vakuumet og udskifte filteret.
    5. Opsaml <0,2 μm fraktionen indeholdende vesikler i en ren beholder.
  4. Mulighed 3: Udfør 0,2 μm kapselfiltrering (for prøvevolumener > ~ 4 L)
    1. Rengør fleksibel slange- og opsamlingsbeholder i passende størrelse ved vask med vand og mildt rengøringsmiddel. Skyl materialet med destilleret og deioniseret vand.
      BEMÆRK: Før brug skal materialet skylles med type I - ultrarent vand.
    2. Placer den kultur, der skal filtreres, på et sikkert, forhøjet sted med den endelige opsamlingsbeholder nedenfor. Tilslut en 0,2 μm kapselfilter (se tabel over materialer) udstrømningsport til et stykke slange og anbring den i en opsamlingsbeholder.
    3. Anbring en anden slange i prøven, start en tyngdekraftssifon ved at trække en prøve ind i slangen med en sprøjte, og tilslut slangen til kapselfilteret. Brug udluftningen til at frigive overskydende luft og fylde kammeret med supernatant.
    4. Lad materiale bevæge sig gennem kapslen, indtil prøven er grundigt filtreret. Hvis strømningshastigheden bliver for langsom (< ~ 1/10th startstrømningshastigheden eller kommer dråbevis ud i modsætning til en kontinuerligt strømmende strøm), skal du vente eller anvende blid kraft med en peristaltisk pumpe, indtil modtrykket stiger. Alternativt kan du delvist genoprette strømningshastighederne ved midlertidigt at frakoble filteret, tilbageflushe akkumuleret biomasse fra tilstrømningssiden med ultrarent vand, indtil materialet ikke længere er synligt uklart, og derefter genstarte filtreringsprocessen.

3. Koncentrering af vesikkelprøven

  1. Mulighed 1: Udfør centrifugal ultrafiltrering til koncentrering af små (<500 ml) volumen af prøver.
    1. Skyl de 15-20 ml ultrafiltreringscentrifugalkoncentratorer efter eget valg med type I - ultrarent vand.
    2. Koncentratorerne lægges i centrifugen og centrifugeres ved 4.400 x g ved 4 °C. Kassér gennemgangen, og gentag dette trin mindst to gange mere.
    3. Læg supernatantprøven i vandskyllede koncentratorer og centrifuger under de samme betingelser. Afhængigt af eksperimentelle mål kan prøvefiltrat kasseres eller indsamles til yderligere koncentration (med koncentratorer med en nominel molekylvægtsgrænse på 3 kDa) og analyse.
    4. Gentag dette trin, indtil prøven er koncentreret til et endeligt volumen på ~ 15-30 ml.
  2. Mulighed 2: Udfør tangentiel strømningsfiltrering (TFF) til koncentrering af et stort (>500 ml) volumen prøve.
    1. Opsæt TFF-apparatet i overensstemmelse med producentens retningslinjer (se Materialetabel). Fastgør en peristaltisk pumpe til indsugningsledningen, og anbring justerbare klemmer på retentatledningen. Rens TFF som anbefalet af producenten, og skyl derefter enheden med 1 liter type I - ultrarent vand.
      BEMÆRK: Indsugnings- og retentatledningerne skal placeres i et rent prøvebeholder (glasflaske). Filtratledning(er) skal ledes ind i en affaldsbeholder eller -vask.
    2. Der tilsættes <0,2 μm filtrat i prøvebeholderen. Øg langsomt pumpehastigheden og modtryksniveauerne på retentate-linjen for at øge output fra filtratlinjerne.
    3. Fortsæt med at køre TFF, genopfyld reservoiret med kultursupernatant, når materialet fjernes. Undgå at lade indsugningsledningen komme ud af prøven under behandlingen for at undgå at indføre luftbobler. Sørg for, at fremføringstrykket ikke overstiger ~10 psi, og at retentatet strømmer ud af TFF i et ensartet tempo tilbage i reservoiret.
    4. Stop med at koncentrere prøven, når volumenet i reservoiret når den lavest mulige mængde, der er nødvendig for at opretholde strømmen ind i indsugningsledningen uden at indføre luftbobler.
    5. Luk udstrømningsledningen med en klemme. Fjern modtrykket på retentatelinjen, og recikuler den koncentrerede supernatant gennem filteret i ~ 10 minutter, hvilket reducerer recirkulationshastigheden til 20-40 ml / min for at maksimere genvindingen.
    6. Flyt retentatelinjen ind i en ren beholder, fjern indsugningslinjen fra prøven, og saml det koncentrerede materiale. Det resterende materiale i prøvebeholderen genvindes ved hjælp af en pipette.
    7. Filtrer det koncentrerede supernatant gennem et 0,2 μm sprøjtefilter (trin 2.2) for at sikre, at der ikke er nogen celler tilbage.
      BEMÆRK: Trin 3.2.7 er valgfrit.
    8. Opbevar om nødvendigt det endelige koncentrat ved 4 °C i ~3 uger, før det flyttes til vesikelrensning (trin 4).

4. Vesicle isolering og rensning

  1. Pellet direkte ved ultracentrifugation ved at følge nedenstående trin.
    1. Den koncentrerede < 0,2 μm dyrkningsprøve anbrings i et rent ultracentrifugerør. Tilføj rene medier eller buffer efter behov for at sikre, at røret er helt fyldt.
      BEMÆRK: Hvis den endelige dyrkningsprøve er for stor til at passe i et rør, skal du enten pelletere materialet i flere rør, der skal kombineres før vasketrinnene eller pellet serielt i det samme rør.
    2. Hvis det er nødvendigt, skal du oprette en balance og dreje ved ~ 100.000 x g i 3 timer ved 4 ° C.
    3. Fjern forsigtigt supernatanten med en pipette. Mens cyanobakterielle vesiklepiller kan vise en vis farve, er de ofte usynlige.
    4. Det pelleterede materiale vaskes ved at tilsætte friskkulturmedier eller vaskebuffer, f.eks. 1x fosfatbufret saltvand (PBS) (se diskussion) til ultracentrifugerøret, blandes ved skånsom pipettering og drejes igen som i trin 4.1.2. Gentag vaskeprocessen en gang til.
    5. Resuspend den endelige pellet i frisk kultur ved gentagne gange, men forsigtigt at pipettere op og ned omkring bunden af røret med en 1 ml pipette. Overfør til et rent fartøj.
  2. Udfør densitetsgradient ultracentrifugation.
    1. Forbered iodixanolbestande (se materialetabel) ved at lave en 4x koncentreret version af den bufferbaggrund, der ønskes for prøven (se Diskussion).
    2. Bland en del af 4x bufferen med tre dele af 60% iodixanol lager for at gøre en 45% iodixanol opløsning.
    3. Fortynd 45% iodixanol med volumener på 1x buffer for at skabe lagre af gradientmedier ved 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15% og 10% endelige iodixanolkoncentrationer.
      BEMÆRK: Den samlede mængde, der er behov for, vil variere med ultracentrifugerotorens/-rørenes kapacitet.
    4. Opret en ultracentrifugedensitetsgradient ved omhyggeligt at overlejre lige store mængder på 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10% og 0% ioxidinol i et ultracentrifugerør, således at hele rørets volumen udnyttes.
      BEMÆRK: Den ekstracellulære vesikelprøve, der skal renses, skal placeres øverst på gradienten som en del af 0% iodixanollaget. Hvis vesikleprøvens endelige volumen overstiger størrelsen af 0 %-laget, blandes en eventuel overskydende vesikelprøve med tilstrækkelig 45 % iodixanol og/eller buffer til at generere det krævede volumen af optiprep-lagrene på 10 % eller højere koncentration og anvende disse på det tilsvarende sted i gradienten.
    5. Drej gradienten ved ~ 100.000 x g ved 4 ° C i 6 timer.
    6. Saml fraktioner (typisk 0,5 ml hver for en ~ 4,5 ml gradient) ved omhyggelig pipettering eller ved hjælp af en fraktionsopsamler (se Materialetabel).
    7. Densiteten af hver fraktion (i g/ml) bestemmes ved hjælp af en analytisk vægt og kalibreret pipette til måling af vægten af et kendt prøvevolumen. Fjern prøven fra røret, bestem vægten, og returner prøven direkte.
    8. Fortynd de enkelte fraktioner i et nyt ultracentrifugerør med ren buffer, og vask materialet som nævnt i trin 4.1.2-4.1.4. Alternativt kan du bruge dialyse- eller ultrafiltreringskolonner til at genvinde partikler.
      BEMÆRK: Cyanobakterielle ekstracellulære vesikler migrerer typisk til opdriftstætheder på ~ 1,14-1,19 g / ml i iodixanol.
  3. Vesiklerne opbevares ved 4 °C, hvis de skal anvendes inden for 1-3 uger. Vesiklerne fryses ved -20 °C eller -80 °C, hvis de ikke anvendes i længere tid end denne periode.

5. Karakterisering af de isolerede vesikler

  1. Udfør elektronmikroskopi af negativ plettransmission (se tabel over materialer) (TEM; partikelstørrelse, struktur, renhed).
    1. For at forbedre billedkvaliteten skal gløden aflade overfladen på et tidligere belagt TEM-gitter ved hjælp af et glødudladningssystem i henhold til producentens retningslinjer (se Materialetabel).
    2. Påfør forsigtigt ~5 μL af vesikelprøven og lad den sidde i 5 minutter.
      BEMÆRK: Prøver med vesikelkoncentrationer >109 ml-1 vil typisk give de bedste resultater; mere fortyndede prøver vil have få vesikler pr. Billede.
    3. Fjern prøven ved at berøre kanten af et gitter til et stykke rent filterpapir.
    4. Pipet en 20-50 μL dråbe 2% uranylacetat (se tabel over materialer) på en plan overflade dækket af plastfilm, og læg gitteret flydende oven på det i 2 minutter.
    5. Fjern uranylacetat ved hjælp af filterpapir og flyd kort på en dråbe ultrarent vand for at vaske. Gentag vandvasken en gang til.
      BEMÆRK: Det endelige tørgitter er klar til visualisering efter trin 5.1.5.
  2. Udfør ultratynd sektionsfarvning til TEM (partikelstørrelse, intern struktur).
    1. Pelleten suspenderes fra trin 4.1.5 med 1 ml 2,5 % glutaraldehyd i 0,1 M natriumkacodylatbuffer (pH 7) (se materialetabellen), og prøven fastgøres til 2 timer ved 4 °C.
    2. Spin ved ~ 100.000 x g i 1 time ved 4 ° C.
    3. Pillen vaskes forsigtigt med 0,1 M natriumkacodylatbuffer (pH 7), og centrifugeres derefter ved ~100.000 x g i 1 time ved 4 °C.
    4. Pillen fastgøres med 1 ml 1 % osmiumtetroxid (se materialetabellen) (fremstillet i 0,1 M natriumkacodylatbuffer) i 1 time, og vaskes derefter som i trin 5.2.3.
    5. Dehydrere prøven med 1 ml af en ascendant serie ethanol (50%, 70%, 90% og to gange i absolut ethanol) i trin på 10 min hver ved 4 °C.
    6. Der tilsættes 250 μL epoxyharpiks (se materialetabellen) blandet med absolut ethanol (1:1) til pillen og inkuberes natten over ved 4 °C.
    7. Overfør pelleten til 500 μL ren harpiks i 24 timer. Derefter inkuberes harpiksen ved 65 °C i 48 timer.
      BEMÆRK: Harpiksen er nu klar til sektionering med ultramikrotom efter producentens anvisninger (se Materialetabel).
    8. Pletter gitterene indeholdende sektioner med 2% uranylacetat (i 50% ethanol) i 5 minutter. Vask diasene forsigtigt under rindende deioniseret vand i 10-15 s hver. Anbring en dråbe blycitrat (se Materialetabel) og plet i yderligere 5 minutter.
    9. Vask som før, fjern vandet ved at blotte gitteret på et filterpapir, og lufttør gitterene. Visualiser med TEM i henhold til producentens retningslinjer (se Tabel over materialer).
  3. Udfør nanopartikelsporingsanalyse (NTA) (partikelstørrelse, koncentration).
    1. Brug objektivpapir til forsigtigt at tørre støv eller synligt materiale af den optiske flade. Kontroller, om alle O-ringe og andre tætninger er rene og intakte. Tænd for instrumentet, og start softwaren.
    2. Brug en ren sprøjte til at fylde kammeret med ultrarent vand. Sørg for, at der ikke er luftbobler til stede.
    3. Klik på Start kamera og visualiser det optimale område af kammeret om 'tommelfingeraftrykket'. Juster mikroskoptrinnet vandret eller lodret efter behov, så signalintensiteten er jævn på tværs af det afbildede område. Flyt billedområdet vandret i forhold til aftrykket (til højre mod den lodrette linje), og find et område i nærheden med lavt baggrundssignal.
    4. Skub skyderne Screen Gain og Camera Level til maksimum, og sænk derefter til det laveste niveau for at se de svageste partikler.
      BEMÆRK: Typiske indstillinger for cyanobakterielle vesikler bruger en skærmforstærkning på 7 og kameraniveau mellem 10-12.
    5. Juster fokus efter behov for at sikre, at partikler er nogenlunde lige synlige på tværs af synsfeltet. Fortsæt med at skubbe ultrarent vand gennem kammeret, indtil du visuelt har bekræftet, at kammeret er rent.
    6. Fjern resterende vand fra kammeret ved hjælp af en anden sprøjte.
    7. Undersøg en prøve af mediet / bufferen, som din prøve er i, for at bestemme baggrundspartikelkoncentrationen ved at fylde kammeret med medier / buffer ved hjælp af en ren 1 ml sprøjte.
    8. Vælg Standardmåling i rullemenuen SOP . Skift indstillinger for at indsamle mindst tre tekniske replikater af 60 s videoer hver. Tryk på Opret og kør script, og følg vejledningen. Skub ~ 100 μL prøve ind i kammeret mellem replikater.
    9. Når erhvervelsen er afsluttet, skal du fjerne den resterende buffer med en sprøjte, skylle 3-5 ml ultrarent vand gennem kammeret og fjerne det resterende vand.
    10. Tilsæt vesikelprøven til kammeret ved hjælp af en 1 ml sprøjte, og bekræft anskaffelsesindstillingerne. Hvis partikeltallet ikke ligger inden for instrumentets lineære område (typisk mellem 20-80 partikler/ramme), skal prøven fortyndes eller koncentreres. Skub mindst 500 μL prøve ind i kammeret, før du indsamler data.
    11. Indsaml videodata som i trin 5.3.8, og sørg for at rengøre kammeret med ultrarent vand mellem forskellige prøver.
    12. Indsamle alle efterfølgende prøver fra den samme organisme/eksperiment ved hjælp af identiske kameraindstillinger for at sikre sammenlignelighed af data; Ændringer i indstillingen Kameraniveau kan have en bemærkelsesværdig effekt på de endelige værdier, der opnås.
    13. Bestem partikelparametre ved hjælp af analyseafsnittet i softwaren. Vælg Analyse > Åbn eksperiment, og indlæs eksempelfilen. Vælg Behandl valgte filer, og vent på, at analysen er afsluttet. Sørg for at bruge den samme registreringstærskel for alle efterfølgende prøver fra det samme eksperiment.
      BEMÆRK: Da cyanobakterielle vesikler ofte er svage, skal detektionstærsklen typisk justeres til den mest følsomme (laveste) værdi.
  4. Udfør dynamisk lysspredning (DLS) (partikelstørrelse, zetapotentiale).
    1. Filtrer gennem et 0,2 μm porestørrelsesfilter for enhver prøve, der går ind i DLS for at screene store partikler, der forstyrrer målingerne.
    2. Der tilsættes 1 ml af mediet/bufferen i en ren kuvette for at undersøge mulige aggregeringer eller andre nanopartikler, der kommer fra mediet. Sæt kuvetten med den frostede side til venstre i mikroprøveudtageren, og luk låget. Lad prøven ligestille i mindst 5 minutter.
    3. Indtast materialets brydningsindeks og materialeabsorptionen, hvis de adskiller sig væsentligt fra standardindstillingerne for vand.
      BEMÆRK: Materialeegenskaberne ville have meget lidt indflydelse, hvis vesiklerne er mindre end 100 nm. Ved måling af elbilers overfladepotentiale (zetapotentiale) bør vesiklerne resuspenderet i de oprindelige vækstmedier.
    4. Klik på Instrumentkontrolpanel for at kontrollere aflæsningerne og starte dataindsamling ved at klikke på det grønne ikon. Hvis værdierne ser gode ud, og dit medie/buffer ikke indeholder aggregeringer eller andre partikler, er du nu klar til at måle din prøve.
    5. Der tilsættes 1 ml vesikelprøve i en ren kuvette, og der indsamles data som nævnt i trin 5.4.4. Saml mindst tre tekniske replikater i 10 minutter hver.
  5. Udfør lipopolysaccharid (LPS) analyse for at bekræfte, at de gram-negative elbiler er til stede i prøven.
    1. Varmedenatureringsvesicleprøve ved 95 °C i 10 minutter i standard 1x Laemmli-prøvebuffer (se materialetabel).
    2. Inkuber med 0,2 U af type XIV-protease fra Streptomyces griseus (se materialetabel) ved 37 °C i 30 minutter for at fjerne forurenende glycoproteiner.
    3. Separate behandlede prøver ved elektroforese ved denaturering af 16% (w/v) SDS-polyacrylamidgeler efter den tidligere offentliggjorte protokol16.
    4. For at detektere LPS skal du plette gelen enten med kommercielt tilgængelige farvningssæt eller med en modificeret sølvfarvningsteknik28. Kvantificering af den relative LPS-overflod ved densitometrianalyse af farvede geler i henhold til tidligere offentliggjorte referencer29,30.

6. Målinger af vesikkelproduktionshastighed

  1. Ved hjælp af nanopartikelsporingsanalyse som i trin 5.3 eller tilsvarende teknologi måles partikelkoncentrationen i vækstmediet til eksperimentet. Hvis der findes et højt partikelantal, filtreres gennem et 0,1 μm porefilter og kontrolleres igen.
    BEMÆRK: For at minimere fejlen skal mediebaggrundspartikelkoncentrationen være mindre end 10% af partikelkoncentrationen, der findes i kulturer med den laveste densitet.
  2. Akklimatisere kulturen ved at dyrke celler i mindst to på hinanden følgende serielle overførsler under de medie- og miljøforhold, der ønskes for forsøgene som i trin 1.1.2. Kulturer skal overføres, mens de stadig er i den eksponentielle vækstfase. Sikre, at de målte kulturvækstrater er konsistente på tværs af overførsler; hvis ikke, fortsæt med at overføre kulturer, indtil vækstraterne er reproducerbare.
  3. Saml tidsforløbsprøver ved podning og regelmæssigt tidsindstillede intervaller på tværs af vækstkurven i den tidlige stationære fase. Stagger tidspunkter for at få mindst 3-4 prøver indsamlet på tværs af hele spektret af eksponentiel vækst. Udfør følgende trin for at prøve på hvert tidspunkt.
    1. 1 ml eller mere af dyrkningen filtreres direkte gennem et rent, sterilt sprøjtefilter på 0,2 μm, og filtratet gemmes for at måle vesiklernes koncentration som i trin 5.3. Frys tidsforløbsprøverne, hvis det ønskes. Brug relativ fluorescens til at følge kulturens vækstdynamik.
    2. Gem en prøve af hele kulturen for at bestemme populationsstørrelsen ved hjælp af en metode, der passer til organismen (flowcytometri, kolonibelægning eller på anden måde).
  4. Få målinger af celler og vesikellignende partikler (pr. ml) på hvert tidspunkt.
  5. Identificer de tidspunkter, der opstod i den eksponentielle vækstfase. For at beregne r skal antallet af vesikler, der produceres pr. Celle pr. Generation, mellem to punkter under eksponentiel vækst (typisk begyndelsen og slutningen af tidsforløbet), bruge ligningen i Supplerende fil 1.
    BEMÆRK: Denne metode er kun gyldig under steady-state vækstbetingelser; underliggende antagelser og afledning af beregningen er beskrevet i reference14.

Representative Results

Figur 1 viser en oversigt over den cyanobakterielle vesikkelisoleringsproces og fremhæver centrale aspekter af protokollen beskrevet her. Af særlig opmærksomhed er trinnene, der beskriver adskillelse af cyanobakteriømasse fra den lille partikelfraktion (vesikel), der koncentrerer vesikkelprøven og vesikelsisolering og -oprensning (figur 1, trin 2 til 4), som er afgørende for at opnå reproducerbare præparater af vesikler. Figur 2 viser repræsentative resultater fra isolering og karakterisering af ekstracellulære vesikler fra cyanobakterien Synechocystis sp. PCC 6803. Den ydre membran af denne cyanobakterie har vist sig at indeholde carotenoider31, som giver en karakteristisk orange farve til vesiklernes prøver indsamlet ved direkte pelletering gennem ultracentrifugering (figur 2A). Når vesiklepillen er resuspended, kan vesikler undersøges ved transmissionselektronmikroskopi (TEM), enten ved negativ farvning af prøver med uranylacetat (figur 2B) eller ved observation af ultratynde sektioner (figur 2C). Vesikelstørrelsesfordeling og -koncentration kan vurderes ved hjælp af dynamisk lysspredning (DLS) (figur 2D) og nanopartikelsporingsanalyser (NTA) (figur 2E). Med den beskrevne protokol blev der typisk opnået ~3,5 ± 1,0 x 108 nanopartikler pr. ml i en eksponentielt voksende kultur af Synechocystis sp. PCC 6803 ved en OD730 på 1,0. Biokemiske analyser af isolerede elbiler kan udføres som supplement til den fysiske karakterisering af de isolerede vesikler. Som et eksempel blev rensede Synechocystis sp. PCC 6803 vesikel adskilt på en SDS-polyacrylamidgel og farvet til lipopolysaccharider (LPS; Figur 2F). Da LPS er specifik for den ydre membran32, kan LPS-detektion validere tilstedeværelsen af membranbundne vesikler og tjene som markør til analyse af relativt vesikleindhold mellem præparater fra samme stamme33. Inspektion af den relative overflod af LPS med lav vs. høj molekylvægt kan indikere ændringer i vesiklesammensætningen mellem prøver34,35.

Figure 1
Figur 1: Eksperimentelle procedurer anvendt til cyanobakterielle EV-isolering og karakterisering. Skematiske gengivelser af dyrkningskulturer (1) og adskillelse af cyanobakteriel biomasse fra vækstmediet (2). Cellefrie prøver, der indeholder vesikler, koncentreres (3), og derefter isoleres og renses elbilerne (4). Afhængigt af applikationen kan vesikelpræparater karakteriseres ved hjælp af en eller en kombination af transmissionselektronmikroskopi (TEM), nanopartikelsporingsanalyse (NTA), dynamisk lysspredning (DLS) og lipopolysaccharid (LPS) profilering (5). RT, stuetemperatur. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Repræsentative resultater af den ekstracellulære vesikelisolering og karakterisering for cyanobakterien Synechocystis sp. PCC 6803. (A) Fotografi af den ekstracellulære vesikelpille (EVs pellet) opnået efter ultracentrifugation af det koncentrerede cellefrie ekstracellulære medium fra en 600 ml Synechocystis sp. PCC 6803-kultur dyrket til en OD730 på 1,0-1,5. Bemærk den typiske orange farve af vesicle pellet afledt af carotenoiderne, der findes i den ydre membran. (B,C) Transmissionselektronmikroskopi (TEM) fotografier af negativt farvede (B) og ultratynde sektioner (C) af Synechocystis sp. PCC 6803 vesikelprøver. Skalastænger: henholdsvis 200 nm og 50 nm. Prøver blev visualiseret på et transmissionselektronmikroskop, der blev betjent ved 80 kV. D) Typisk DLS-afbildning (Dynamic Light Scattering), der viser fordelingen af vesikelvolumen som funktion af vesikeldiameter (i nm). Farvede linjer angiver data fra tre tekniske replikatmålinger af den samme prøve. (E) Repræsentative nanopartikelsporingsanalysedata (NTA) for Synechocystis ekstracellulær vesikelstørrelsesfordeling (i nm). Den sorte linje angiver gennemsnittet af tre tekniske replikater, og de røde linjer repræsenterer standardfejlen i middelværdien. (F) Lipopolysaccharider (LPS) profil blev påvist efter adskillelse af vesikelpræparatet ved elektroforese på en 16% (w/v) SDS-polyacrylamidgel og farvning med et kommercielt LPS-farvningssæt. LPS med lav og høj molekylvægt, svarende til henholdsvis grove og glatte LPS-former, kan påvises. Klik her for at se en større version af denne figur.

Supplerende fil 1: Ligning til beregning af r. Antallet af vesikler produceret pr. celle pr. generation mellem to punkter under eksponentiel vækst (typisk begyndelsen og slutningen af tidsforløbet) bestemmes ved hjælp af denne ligning. Klik her for at downloade denne fil.

Discussion

Generelle betragtninger
Protokollen (figur 1) præsenteres som et sæt muligheder for at fremhæve, at der ikke findes nogen "one-size-fits-all"-metode til at arbejde med cyanobakterielle ekstracellulære vesikler. Interesserede forskere kan udnytte de dele af denne protokol, der er kompatible og passende for deres særlige modelorganisme, eksperimentelle spørgsmål / mål og udstyrstilgængelighed. Alle vesikkelisoleringsmetoder involverer afvejninger og vil uundgåeligt resultere i en vis grad af bias. Mens man bør søge at minimere dette, når det er muligt, er den mest afgørende overvejelse at sikre, at den anvendte detaljerede metode rapporteres i henhold til relevante MISEV-retningslinjer (Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles)36.

Kultur vækst
Cyanobakterielle kulturer kan let fås fra en af de mange kultursamlinger, der er tilgængelige over hele verden. Et par eksempler er Roscoff Culture Collection (Station Biologique de Roscoff, Frankrig), Pasteur Culture Collection (Institute Pasteur, Paris, Frankrig) og Provasoli-Guillard National Center for Marine Alger and Microbiota (NCMA, Maine, USA). Den valgte cyanobakterielle stamme skal dyrkes under de relevante medium- og miljøforhold, der varierer betydeligt mellem forskellige stammer. En liste over almindeligt anvendte medier til cyanobakteriel dyrkning kan findes på kulturindsamlingswebsteder eller andre publikationer 37,38,39.

Arbejde med cyanobakterielle ekstracellulære vesikler giver nogle unikke udfordringer sammenlignet med de metoder, der er rapporteret for mange typiske modellaboratorieheteretertotrofer. Cyanobakterielle kulturer har vesikelkoncentrationer af størrelsesordener lavere end dem, der findes i andre mikrober, såsom Escherichia coli 14,16,40. Disse forskelle, der formodentlig skyldes lavere celletætheder og/eller vesikelproduktionshastigheder, betyder, at relativt store kulturer (~ 1-20 l eller mere) kan være nødvendige for at give tilstrækkeligt materiale til bulkanalyser. Således opfordres forskere til at teste vesikkeludbytter fra mindre kulturer for at bestemme, hvor meget materiale der vil være nødvendigt for at nå deres ønskede slutmål. Betydningen af at fastslå, om det medie, der anvendes til forsøget, har en påviselig partikelbaggrund, skal også understreges, inden et forsøg påbegyndes, da dette materiale potentielt kan forvirre vesiklepopulationskvantificeringen, reducere følsomheden af vesiklatkoncentrations-/størrelsesmålinger eller forurene de endelige vesiklpræparater.

En anden udfordring for feltet er, at ikke alle cyanobakterier vokser godt, eller overhovedet, i ren kultur. Indtil de er gjort axeniske, kan fortolkninger af fysiske vesikleegenskaber, produktionshastigheder eller indhold ikke nødvendigvis føre til klare konklusioner om vesikler produceret af en enkelt stamme i samfundet. Forskere rådes også til at overveje, hvilke andre typer partikler der kan være til stede og potentielt forveksles med vesikler ved hjælp af specifikke nanopartikelanalyseværktøjer, som ikke nødvendigvis kan diskriminere mellem forskellige partikeltyper. Det kan f.eks. være vigtigt at kontrollere, at den stamme, der anvendes, mangler en profag, enten via genomsekventering, induktionsassays eller andre midler eller ikke frigiver andre typer partikler. Efter vores erfaring er de fleste cyanobakterielle vesikler <0,2 μm i diameter, men når man ser på en ny stamme eller væksttilstand, skal man bekræfte, om brug af et 0,45 μm porestørrelsesfilter ændrer størrelsesfordelingen af rensede partikler.

Mange aspekter af kulturforholdene kan påvirke vesikelproduktionen og dens indhold41,42. De fysiske og kemiske forhold, der anvendes til dyrkningsvækst (herunder lysindstråling, temperatur og mediesammensætning), skal således dokumenteres og kontrolleres i det omfang, det er muligt for at sikre resultaternes reproducerbarhed. Enhver kemisk analyse af vesiklenindholdet skal tage højde for baggrundssammensætningen, navnlig når der udføres analyser i »-omics«-stil med høj kapacitet. Dette kan være særligt kritisk, når du bruger udefinerede medier, såsom dem, der er baseret på en naturlig havvandsbaggrund eller suppleret med gærekstrakt eller tryptone. Brug af et defineret vækstmedium kan være at foretrække afhængigt af de eksperimentelle mål.

Forskere skal nøje overvåge kulturvækstdynamikken med jævne mellemrum for at sikre, at de ved, hvor i vækstfasen en given batchkultur er, og ikke kun indsamle prøver efter en vilkårlig tid. Vesikkelsammensætningen kan variere på tværs af vækstfaser, især mellem eksponentielle og stationære faser41,42. For eksempel kan i det mindste en brøkdel af vesiklerne, der udtages i den stationære fase, opstå fra en anden cellulær mekanisme, såsom cellelyse, der ikke vil forekomme under eksponentiel vækst. Selvom dette stadig kan være af stor biologisk interesse, er det vigtigt at kende prøven. Hvis en cyanobakteriel kultur når den ønskede vækstfase på et tidspunkt, hvor det ikke er muligt at gå direkte til prøvekoncentrationen, anbefales det straks at adskille cellerne fra fraktionen <0,2 μm (med centrifugering og/eller direkte 0,2 μm filtrering) og derefter opbevare det cellefrie filtrat ved 4 °C. Materialet kan opbevares på denne måde i dagevis med ringe eller ingen mærkbar indvirkning på koncentrationen eller størrelsesfordelingen af vesikler.

Vesikkelrensninger
Det hyppige behov for at isolere vesikler fra signifikante volumenkulturer er afgørende i den cyanobakterielle vesikelisoleringsarbejdsgang. Når du arbejder med større mængder materiale, skal vesiklerne koncentreres før downstream-separationsarbejdsgange. Koncentratorer (tangentielle flowfiltermembraner eller centrifugalkolonner) med en nominel molekylvægtsgrænse på 100 kDa anbefales generelt, da de tillader adskillelse fra opløseligt materiale med lav molekylvægt, samtidig med at koncentrationstiderne holdes rimelige, men 30 kDa-filtre anvendes også ofte med succes. Mens flere ikke-ultracentrifugationsbaserede metoder til rensning af vesikler (f.eks. Størrelsesudelukkelseskromatografi, mikrofluidiske baserede systemer, affinitetsfangstteknikker og nedbørsbaserede tilgange) bliver populære inden for det ekstracellulære vesikelfelt, er det vores erfaring, at disse tilgange kan resultere i reducerede udbytter og typisk er uforenelige med de nødvendige kulturmængder.

Forskere skal overveje sammensætningen af iodixanolbaggrunden og de vaske-/resuspensionbuffere, der anvendes under vesikkelrensning for at sikre, at de er kompatible med de ønskede downstream-applikationer. I mange tilfælde kan den endelige vesikelprøve resuspenderet i vækstmedier eller en defineret buffer, der i sammensætning kan sammenlignes med vækstmediet (f.eks. naturligt vs. kunstigt havvand). Dette er dog muligvis ikke muligt med marine cyanobakterielle vesiler, hvilket vil kræve yderligere eksperimentel manipulation til analyse, da høje saltkoncentrationer svarende til havvandsniveauer kan hæmme mange enzymatiske reaktioner. I sådanne tilfælde fungerer standardlaboratoriebuffere såsom 0,2 μm filtreret, 1x PBS typisk godt til opretholdelse af stabiliteten af marine cyanobakterielle vesikel og kan være mere kompatible med nedstrøms eksperimentelle processer.

Tæthedsgradientrensning kan betragtes som valgfri afhængigt af forsøgsmålene og kultursammensætningen, men anbefales kraftigt til fremstilling af en strengere ren og reproducerbar prøve. EV-populationer er heterogene og kan findes på tværs af en række opdriftstætheder, som yderligere varierer efter stamme, vækstbetingelser og andre faktorer 4,5,6. De ovennævnte tætheder repræsenterer dem, der typisk findes for vesikler fra cyanobakterielle kulturer og feltprøver i iodixanol, men resultaterne i andre stammer kan variere. Andre densitetsgradientmaterialer som saccharose og CsCl kan anvendes til vesikler, men de vil migrere til forskellige opdriftstætheder i disse baggrunde. Forskellige gradientmediebaggrunde kan skævvride genopretningen af lipidlukkede vira43 og kan potentielt påvirke genopretningen af vesikler fra forskellige stammer.

Vesikler kan gå tabt på flere punkter gennem vesikkelisoleringen og gradientrensningsprocessen, der er beskrevet her, hvilket reducerer udbyttet og øger mængden af udgangsmateriale, der er nødvendigt for at opnå et givet endeligt vesikleudbytte til downstream-applikationer. Der skal udvises særlig forsigtighed, når man arbejder med vesikpellets efter ultracentrifugation. Mens nogle cyanobakterielle vesikler kan have carotenoider eller andre forbindelser, som kan give vesikkelprøver en vis mængde pigmentering (figur 2), afhængigt af stammen eller mængden af materiale, forventes det ikke nødvendigvis at være i stand til at visualisere vesiklerne pellet direkte. Vær opmærksom på, hvor pillen forventes at få den anvendte type centrifugerotor. Når det er muligt, foreslås det, at rensede vesikelprøver undersøges ved elektronmikroskopi for at verificere sammensætningen af det genvundne endelige materiale.

Opbevaringsbetingelsernes indvirkning på vesikler og deres indhold er fortsat et åbent spørgsmål. Selv om det konstateres, at opbevaringen ikke har en bemærkelsesværdig effekt på cyanobakterielle vesiklerstørrelse eller koncentration14, kan funktionaliteten af isolerede vesikelpræparater ændre sig over tid44. Selv om fryse-/optøningscyklusser bør undgås, når det er muligt, synes virkningen af frysning af prøver på det samlede vesikantal og -størrelser at være minimal. Man bør være opmærksom på potentialet for fryse-optøningscyklusser for at påvirke sammensætningen af vesikelindholdet, såsom længden af vesikle-associerede nukleinsyrer eller stabiliteten af proteiner.

Vesikler fra field srigelige
Nuværende metoder til isolering af ekstracellulære vesikler fra naturlige vandmiljøer svarer konceptuelt og operationelt til dem, der er beskrevet her for store volumenkulturer. Alligevel kan de kræve endnu større mængder materiale. Sådanne feltprøver kan involvere indsamling, filtrering og koncentration af hundreder til tusinder af liter vand for at opnå tilstrækkeligt materiale til analyse. Afhængigt af turbiditeten af den prøve, der anvendes, kan det være nødvendigt at indarbejde et eller flere forfiltreringstrin før filteret på 0,2 μm. Den specifikke TFF-anordning, der anvendes, bør være egnet til at arbejde med så store mængder inden for en rimelig tid (ideelt set i timerækkefølgen) og uden at lægge for stort pres på prøven. I praksis indebærer dette ofte at bruge et meget større samlet overfladeareal, end der kan anvendes på kulturbaserede prøver, samt slanger med større diameter for at lette øgede strømningshastigheder. Dette øgede filteroverfladeareal vil sandsynligvis føre til en marginal stigning i partikeltab sammenlignet med mindre TFF-ordninger og et større endeligt koncentratvolumen; Disse betænkeligheder skal dog afvejes med hensynet til den samlede sagsbehandlingstid. I situationer som f.eks. et udvidet oceanografisk krydstogt, hvor prøverne ikke vender tilbage til et laboratorium i mange dage efter prøveudtagningen, anbefaler vi, at der udføres indledende 0,2 μm filtrerings- og TFF-trin i marken. Dette mindre volumen koncentreret materiale kan derefter opbevares ved 4 °C eller -80 °C om bord (afhængigt af tilgængeligheden og nedstrøms analytiske overvejelser), indtil det returneres til laboratoriet med henblik på endelig behandling.

Isolering og adskillelse af ekstracellulære vesikler fra andre små partikler, både organiske og uorganiske, kan være udfordrende, og metoder til adskillelse af forskellige partikler er endnu ikke perfekte. For eksempel kan iodixanoldensitetsgradienter ikke let adskille alle klasser af vesikler og vira, der er til stede i en given prøve. Da typerne af forvirrende partikler og deres fysiske egenskaber vil variere mellem prøveudtagningssteder, er det i øjeblikket umuligt at tilvejebringe en protokol, der robust opdeler alle klasser af små akvatiske partikler. Forsøg og fejl er afgørende, og eksperimentering med iodixanolområdet, der anvendes i gradient- og ultracentrifugationsbetingelserne, vil være påkrævet for at maksimere adskillelsen; en samling af mindre volumen, mere fint opløste densitetsfraktioner kan også være påkrævet. Afhængigt af konteksten kan brug af CsCl-gradienter i stedet for iodixanol hjælpe med at adskille miljøpartikler45. Alligevel kan ændringen i osmotiske forhold føre til forstyrrelser i de endelige genvundne produkter, som diskuteret ovenfor.

Vesikel karakterisering
Nanopartikelanalyseinstrumenter er endnu ikke rutinemæssigt tilgængelige i mikrobiologiske laboratorieindstillinger, men bliver stadig mere tilgængelige. Alle metoder har fordele og ulemper, og vi giver ingen specifik godkendelse af en platform som værende bedre end alle andre til cyanobakterielle vesiklerarbejde; faktisk har alle særlige afvejninger med hensyn til omkostninger, opløsning, brugervenlighed, detektionsgrænser, kompatibilitet med forskellige vækstmedier / bufferbaggrunde og datareproducerbarhed. Ud over instrumenter baseret på nanopartikelsporingsanalyse beskrevet ovenfor kan andre tilgange, herunder nanoflowcytometri, mikrofluidisk resistiv pulsføling og justerbar resistiv pulsføling, anvendes46,47. Brugere bør være forsigtige med at lære detaljerne i deres tilgængelige instrumentering og kontrollere, at det fungerer godt med deres system, da vi har stødt på vanskeligheder, når vi bruger nogle platforme med havvandsbaserede medier. Vi opfordrer feltet til at bevæge sig mod kvantitativ karakterisering af vesikelstørrelse, koncentrationer og produktionshastigheder. Måling af vesikelkoncentrationer på basis af en grundlæggende partikel pr. ml og ikke med hensyn til proteinindhold eller andre målinger vil gøre det muligt at integrere vesikler i mere kvantitative rammer og muliggøre sammenligninger mellem stammer og tilstande. Der er behov for en yderligere indsats for at forbedre evnen til at kalibrere koncentrationsmålinger for <100nm partikler.

Det faktum, at målinger af vesikelproduktionshastighed udføres direkte fra 0,2 μm filtreret kultursupernatant for at minimere partikeltab, ville være forbundet med andre rensningstrin beskrevet ovenfor. Dette betyder dog, at tilgangen ikke nødvendigvis diskriminerer mellem faktiske ekstracellulære vesikler og andre små partikler, der findes i kulturerne. Kun optælling af partikler inden for bestemte størrelsesintervaller (f.eks. 50-250 nm diameter) kan bidrage til at udelukke nogle outliers, men visuel bekræftelse af, at pelleteret <0,2 μm kulturindhold synes at være membranbundne vesikler (ved TEM eller andre tilgange) er nødvendig for specifikt at kunne hævde, at man måler produktionen af vesikler i modsætning til produktionen af vesiklelignende partikler.

En væsentlig faktor i vesikelkarakterisering er at sikre, at vesikelprøven analyseres i det passende lineære følsomhedsområde for nanopartikelanalyseanordningen. Når en prøve er for koncentreret, er det ligetil at fortynde materialet med en ren buffer og analysere det igen. På den anden side kan den relativt lave celle- og/eller vesicletæthed i nogle cyanobakterielle kulturer undertiden give vesikelpræparater, der ligger under nogle instrumenters detektionsgrænser. I tilfælde, hvor dette sker med bulk vesikelrensninger, kan man overveje at dyrke større volumenkulturer, genpelletering og genbrug af det endelige materiale i et mindre volumen eller vurdere, om der er et trin i isolationsprocessen, hvor der forekommer for store tab og kan afbødes. Ved måling af vesikleproduktionshastigheder er rettelserne ikke nødvendigvis så ligetil. Prøver kan koncentreres, hvis det er nødvendigt, men den første skal se, om justeringer af mediet kan resultere i højere celletætheder, eller om der kan opnås tilstrækkeligt koncentrerede prøver fra senere tidspunkter i den eksponentielle fase, hvor koncentrationerne vil være højere.

Begrænsninger
Som med enhver protokol har vesikelisolering ved hjælp af disse tilgange klare begrænsninger. Disse tilgange er ikke afhængige af deres garanti for, at en fuldstændig ren fremstilling af vesikler vil blive isoleret. Både kulturer og feltprøver kan indeholde andre materialer, som migrerer på samme måde som vesikler i densitetsgradienter. Alligevel er disse typer af yderligere oprensningsmetoder i det mindste afgørende for at sikre strenghed og reproducerbarhed af vesikelanalyse. Mens vi beskriver vesikkelisoleringsmetoder i forbindelse med cyanobakterier, vil kulturer af mange andre mikrober også indeholde vesikler i forholdsvis lave koncentrationer, og de procedurer, der er beskrevet her, bør være generelt anvendelige. Det forventes, at disse metoder ikke vil tjene som en permanent protokol, men i stedet som udgangspunkt for at anspore fremtidige fremskridt i arbejdet med ekstracellulære vesikler fra forskellige mikrober. Der er behov for en fremtidig indsats for at fusionere disse metoder med andre tilgange såsom kolonner til udelukkelse af størrelse eller asymmetrisk feltstrømfraktionering for at forbedre forskelsbehandlingen og adskillelsen af forskellige kategorier af små partikler fra kulturer og miljøprøver. Vi håber også, at disse teknikker kan fortsætte med at udvikle sig sammen med forbedringer i nanopartikelkarakteriseringsteknologier for at forbedre evnen til at undersøge heterogenitet inden for vesikelpopulationer, deres indhold og deres nøjagtige funktionelle roller i miljøet.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Forfatterne anerkender støtten fra i3S Scientific Platforms "Biointerfaces and Nanotechnology" og "Histology and Electron Microscopy", et medlem af den nationale infrastruktur Portugisisk Platform of Bioimaging (PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122). Vi takker også professor J. A. Gonzalez-Reyes (University of Córdoba, Spanien) for at hjælpe med at optimere den ultratynde sektionsfarvningsprotokol for TEM og Dr. Cecília Durães og Dr. Ana Rita Pinto (University of Porto, Portugal) for nanopartikelsporingsanalysen.

Dette arbejde blev finansieret af US National Science Foundation (OCE-2049004 til SJB), af Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER) fonde gennem COMPETE 2020 Operacional Programme for Competitiveness and Internationalisation (POCI), Portugal, 2020, og af portugisiske midler gennem Fundação para a Ciência e a Tecnologia/Ministério da Ciência, Tecnologia e Ensino Superior inden for rammerne af projektet POCI-01-0145-FEDER-029540 (PTDC/BIA-OUT/29540/2017 til PO). Fundação para a Ciência e a Tecnologia er også stærkt anerkendt for ph.d.-stipendiet SFRH/BD/130478/2017 (SL) og FCT Investigator grant IF/00256/2015 (PO). M.C.M.-M. blev støttet af et individuelt Marie Skłodowska-Curie-stipendium (reintegrationspanel) inden for rammerne af Horisont 2020-rammeprogrammet (Horisont 2020-MSCA-IF-2018-RI-844891).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1x Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 Home-made buffer --- Standard wash/storage buffer which can be used with vesicles; can be made in lab or purchased commercially
2% Uranyl acetate solution Electron Microscopy Sciences 22400-2 Negative staining - TEM
4x Laemmli Sample Buffer Bio-Rad 161-0747 Denaturation of vesicle sample prior to proteolysis, required for lipopolysaccharides (LPS) staining
Amicon Ultra Centrifugal Filters (100 kDa) Merck UFC9100XX Alternative option for centrifugal ultrafiltration
BG11 medium Home-made medium --- Medium for cultivation of Synechocystis sp. PCC 6803
Carbon Support Film 200 Mesh, copper. CF200-Cu Electron Microscopy Sciences 71150 Transmission electron microscopy (TEM) grid
easiGlow Glow Discharge Cleaning System Ted Pella 91000 Commercial TEM grid glow discharger
EMbed 812 epoxy resin Electron Microscopy Sciences 14120 Ultra-thin sections - TEM
Filter holder for vacuum system Thermo Fisher Scientific 300-4000 Reusable units with filter membrane support plates
Glutaraldehyde  Grade I Sigma-Aldrich G5882-10X1ml Ultra-thin sections - TEM
HEPES [N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid) sodium salt] Sigma-Aldrich H7006 Buffering agent for cyanobacterial growth media
Lead Citrate, Trihydrate Electron Microscopy Sciences 17800 Stain for use in electron microscopy
Macrosep Advance Centrifugal Devices with Omega Membrane 100K Pall MAP100C36 For centrifugal ultrafiltration of small volume samples
Millipore Pellicon 3 TFF Module EMD Millipore XX42P0060 or XX42P0080 Alternative TFF option for concentrating large volume samples
Milli-Q Reference Water Purification System Merck Z00QSV0WW Water purification system for obtaining type I ultrapure grade water
NanoSight Malvern Panalytical LM14 or NS300 Nanoparticle tracking analysis
Optima L80 XP Ultracentrifuge Beckman Coulter L80 XP Ultracentrifuge (or similar model)
OptiPrep / Iodixanol Sigma-Aldrich D1556 Density gradient media
Osmium Tetroxide Reagent Plus Sigma-Aldrich 201030 Ultra-thin sections - TEM
Pall Centramate PE TFF holder Pall Corporation FS002K10 TFF module good for concentrating 10s-100s of L of sample; requires additional 30 or 100 kDa filter modules to scale with your estimated volumes
Peristaltic pump Masterflex L/S Cole-Parmer 07559-07 Pump for driving large-scale TFF modules
Piston Gradient Fractionator Biocomp Instruments 152-001 Automated density gradient fractionation
Polycarbonate tubes for the 70 Ti rotor Beckman Coulter 355618 Reusable ultracentrifuge polycarbonate aluminum tubes with cap assembly
Pro99 medium Home-made medium --- Medium for cultivation of Prochlorococcus
Pro-Q Emerald LPS Gel Stain Kit Thermo Fisher Scientific P20495 LPS staining
SN medium Home-made medium --- Medium for cultivation of cyanobacterial marine strains such as Synechococcus
Sodium cacodylate trihydrate Sigma-Aldrich C0250-100G Buffering agent in the preparation of vesicles samples for TEM
SW32Ti swinging bucket rotor Beckman Coulter 369650 Ultracentrifuge rotor, holds 6x ~40 mL tubes; good for pelleting of bulk material
SW60Ti swinging bucket rotor Beckman Coulter 335650 Ultracentrifuge rotor, holds 6x ~4.5 mL tubes; good for gradient purifications and final vesicle washes
Syringe 1mL Luer BD Plastipak 303172 For vesicle isolation and loading samples into nanparticle tracking analysis (NTA) equipment
Syringe filter 0.2 µm Pall Corporation 4602 For vesicle isolation from cultures
TAPS [N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]-3-aminopropanesulfonic acid] Sigma-Aldrich T5130 Buffering agent for cyanobacterial growth media
Transmission electron microscope JEOL JEM-1400 Or similar microscope
Type 70 Ti Fixed-Angle Titanium Rotor Beckman Coulter 337922 Ultracentrifuge rotor, holds 8x ~39 mL tubes; good for pelleting of bulk material
Type XIV protease from Streptomyces griseus Sigma-Aldrich P5147 Enzyme for proteolysis of EVs proteins, required for LPS staining
UltraClear tubes for the SW32Ti rotor Beckman Coulter 344058 Single use ultracentrifuge tubes
UltraClear tubes for the SW60Ti rotor Beckman Coulter 344062 Single use ultracentrifuge tubes
Ultramicrotome PowerTome XL, PT-PC RMC Products,  Boeckeler Instruments 75501 Microtome for ultra-thin sections - TEM
Universal 320 R centrifuge Hettich Z654736 This or any similar general-purpose benchtop/floor standing centrifuge can be used for pelleting cells
Vacuum apparatus KNF Neuberger N026.3 AT.18 Or any similar vacuum pump and trap
Vivaflow 200 100,000 MWCO PES Sartorius VF20P4 TFF module, good for 2-3L. You can connect different modules for higher volume (figure 1).
Whatman Polycap TC Capsule filter (0.2/0.2µm) Cytiva 6717-9502 Capsule filter for filtering large volumes of liquid
Zetasizer Malvern Panalytical Zetasizer Nano ZS Dynamic light scattering (DLS) instrument

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends. Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
  2. van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (4), 213-228 (2018).
  3. Coelho, C., Casadevall, A. Answers to naysayers regarding microbial extracellular vesicles. Biochemical Society Transactions. 47 (4), 1005-1012 (2019).
  4. Schwechheimer, C., Kuehn, M. J. Outer-membrane vesicles from Gram-negative bacteria: biogenesis and functions. Nature Reviews Microbiology. 13 (10), 605-619 (2015).
  5. Toyofuku, M., Nomura, N., Eberl, L. Types and origins of bacterial membrane vesicles. Nature Reviews Microbiology. 17 (1), 13-24 (2019).
  6. Kulp, A., Kuehn, M. J. Biological Functions and Biogenesis of Secreted Bacterial Outer Membrane Vesicles. Annual Review of Microbiology. 64 (1), 163-184 (2010).
  7. Berman-Frank, I., Lundgren, P., Falkowski, P. Nitrogen fixation and photosynthetic oxygen evolution in cyanobacteria. Research in Microbiology. 154 (3), 157-164 (2003).
  8. Flores, E., Herrero, A. Compartmentalized function through cell differentiation in filamentous cyanobacteria. Nature Reviews Microbiology. 8 (1), 39-50 (2010).
  9. Flombaum, P., et al. Present and future global distributions of the marine cyanobacteria Prochlorococcus and Synechococcus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (24), 9824 (2013).
  10. Biller, S. J., Berube, P. M., Lindell, D., Chisholm, S. W. Prochlorococcus: the structure and function of collective diversity. Nature Reviews Microbiology. 13 (1), 13-27 (2015).
  11. Abed, R. M. M., Dobretsov, S., Sudesh, K. Applications of cyanobacteria in biotechnology. Journal of Applied Microbiology. 106 (1), 1-12 (2009).
  12. Lea-Smith, D. J., et al. Editorial: Exploring the growing role of cyanobacteria in industrial biotechnology and sustainability. Frontiers in Microbiology. 12, 1963 (2021).
  13. Garcia-Pichel, F., Zehr, J. P., Bhattacharya, D., Pakrasi, H. B. What's in a name? The case of cyanobacteria. Journal of Phycology. 56 (1), 1-5 (2020).
  14. Biller, S. J., et al. Bacterial vesicles in marine ecosystems. Science. 343 (6167), 183 (2014).
  15. Pardo, Y. A., Florez, C., Baker, K. M., Schertzer, J. W., Mahler, G. J. Detection of outer membrane vesicles in Synechocystis PCC 6803. FEMS Microbiology Letters. 362 (20), (2015).
  16. Oliveira, P., et al. The versatile TolC-like Slr1270 in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. Environmental Microbiology. 18 (2), 486-502 (2016).
  17. Biller, S. J., et al. Membrane vesicles in sea water: heterogeneous DNA content and implications for viral abundance estimates. The ISME Journal. 11 (2), 394-404 (2017).
  18. Yin, H., et al. Synechococcus elongatus PCC7942 secretes extracellular vesicles to accelerate cutaneous wound healing by promoting angiogenesis. Theranostics. 9 (9), 2678-2693 (2019).
  19. Lima, S., Matinha-Cardoso, J., Tamagnini, P., Oliveira, P. Extracellular vesicles: An overlooked secretion system in cyanobacteria. Life. 10 (8), 129 (2020).
  20. Gupta, S., Marcela Rodriguez, G. Isolation and characterization of extracellular vesicles produced by iron-limited mycobacteria. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (152), e60359 (2019).
  21. Jung, A. L., et al. Legionella pneumophila outer membrane vesicles: Isolation and analysis of their pro-inflammatory potential on macrophages. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (120), e55146 (2017).
  22. Fantappiè, L., et al. Antibody-mediated immunity induced by engineered Escherichia coli OMVs carrying heterologous antigens in their lumen. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), (2014).
  23. Moore, L. R., et al. Culturing the marine cyanobacterium Prochlorococcus. Limnology and Oceanography: Methods. 5 (10), 353-362 (2007).
  24. Rippka, R., et al. Prochlorococcus marinus Chisholm et al. 1992 subs. Pastoris subs. nov. Strain PCC 9511, the first axenic chlorophyll a2/b2-containing cyanobacterium (Oxyphotobacteria). International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 50 (5), 1833 (2000).
  25. Moore, L. R., Chisholm, S. W. Photophysiology of the marine cyanobacterium Prochlorococcus: Ecotypic differences among cultured isolates. Limnology and Oceanography. 44 (3), 628 (1999).
  26. Charpy, L., Larkum, A. W. D. Bulletin de l'Institut Océanographique de Monaco, (n spécial 19). , 457-475 (1999).
  27. Stanier, R. Y., Kunisawa, R., Mandel, M., Cohen-Bazire, G. Purification and properties of unicellular blue-green algae (order Chroococcales). Bacteriological Reviews. 35 (2), 171-205 (1971).
  28. Fomsgaard, A., Freudenberg, M. A., Galanos, C. Modification of the silver staining technique to detect lipopolysaccharide in polyacrylamide gels. Journal of Clinical Microbiology. 28 (12), 2627-2631 (1990).
  29. Abràmoff, M. D., Magalhães, P. J., Ram, S. J. Image processing with ImageJ. Biophotonics International. 11 (7), 36-42 (2004).
  30. Peterson, T. Densitometric analysis using NIH image. North American Vascular Biology Organization (NAVBO) eNewsletter. 16 (3), (2010).
  31. Jürgens, U. J., Weckesser, J. Carotenoid-containing outer membrane of Synechocystis sp. strain PCC6714. Journal of Bacteriology. 164 (1), 384-389 (1985).
  32. Whitfield, C., Trent, M. S. Biosynthesis and export of bacterial lipopolysaccharides. Annual Review of Biochemistry. 83 (1), 99-128 (2014).
  33. McBroom, A. J., Johnson, A. P., Vemulapalli, S., Kuehn, M. J. Outer membrane vesicle production by Escherichia coli is independent of membrane instability. Journal of Bacteriology. 188 (15), 5385-5392 (2006).
  34. Kadurugamuwa, J. L., Beveridge, T. J. Virulence factors are released from Pseudomonas aeruginosa in association with membrane vesicles during normal growth and exposure to gentamicin: a novel mechanism of enzyme secretion. Journal of Bacteriology. 177 (14), 3998-4008 (1995).
  35. Nguyen, T. T., Saxena, A., Beveridge, T. J. Effect of surface lipopolysaccharide on the nature of membrane vesicles liberated from the Gram-negative bacterium Pseudomonas aeruginosa. Journal of Electron Microscopy. 52 (5), 465-469 (2003).
  36. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
  37. Norena-Caro, D. A., Malone, T. M., Benton, M. G. Nitrogen sources and iron availability affect pigment biosynthesis and nutrient consumption in Anabaena sp. UTEX 2576. Microorganisms. 9 (2), 431 (2021).
  38. Rippka, R. Isolation and purification of cyanobacteria. Methods in Enzymology. , Academic Press. 3-27 (1988).
  39. Van Alphen, P., Abedini Najafabadi, H., Branco dos Santos, F., Hellingwerf, K. J. Increasing the photoautotrophic growth rate of Synechocystis sp. PCC 6803 by identifying the limitations of its cultivation. Biotechnology Journal. 13 (8), 1700764 (2018).
  40. Reimer, S. L., et al. Comparative analysis of outer membrane vesicle isolation methods with an Escherichia coli tolA. mutant reveals a hypervesiculating phenotype with outer-inner membrane vesicle content. Frontiers in Microbiology. 12 (383), (2021).
  41. Zavan, L., Bitto, N. J., Johnston, E. L., Greening, D. W., Kaparakis-Liaskos, M. Helicobacter pylori growth stage determines the size, protein composition, and preferential cargo packaging of outer membrane vesicles. Proteomics. 19 (1-2), 1800209 (2019).
  42. Soares, N. C., et al. Associating growth-phase-related changes in the proteome of Acinetobacter baumannii with increased resistance to oxidative stress. Journal of Proteome Research. 9 (4), 1951-1964 (2010).
  43. Thurber, R. V., Haynes, M., Breitbart, M., Wegley, L., Rohwer, F. Laboratory procedures to generate viral metagenomes. Nature Protocols. 4 (4), 470-483 (2009).
  44. Dell'Annunziata, F., et al. Outer membrane vesicles derived from Klebsiella pneumoniae are a driving force for horizontal gene transfer. International Journal of Molecular Sciences. 22 (16), 8732 (2021).
  45. Linney, M. D., Schvarcz, C. R., Steward, G. F., DeLong, E. F., Karl, D. M. A method for characterizing dissolved DNA and its application to the North Pacific Subtropical Gyre. Limnology and Oceanography: Methods. 19 (3), 210-221 (2021).
  46. Arab, T., et al. Characterization of extracellular vesicles and synthetic nanoparticles with four orthogonal single-particle analysis platforms. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (6), 12079 (2021).
  47. Cimorelli, M., Nieuwland, R., Varga, Z., vander Pol, E. Standardized procedure to measure the size distribution of extracellular vesicles together with other particles in biofluids with microfluidic resistive pulse sensing. PLoS ONE. 16 (4), 0249603 (2021).

Tags

Biologi udgave 180
Isolering og karakterisering af cyanobakterielle ekstracellulære vesikler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Biller, S. J.,… More

Biller, S. J., Muñoz-Marín, M. d. C., Lima, S., Matinha-Cardoso, J., Tamagnini, P., Oliveira, P. Isolation and Characterization of Cyanobacterial Extracellular Vesicles. J. Vis. Exp. (180), e63481, doi:10.3791/63481 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter