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Biology

सायनोबैक्टीरिया एक्स्ट्रासेल्युलर वेसिकल्स का अलगाव और लक्षण वर्णन

Published: February 3, 2022 doi: 10.3791/63481
Automatic Translation
*1, *2, 3,4,5, 3,4, 3,4,6, 3,4,6
1Department of Biological Sciences, Wellesley College, 2Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Campus de Excelencia Internacional, Agroalimentario, Universidad de Córdoba, 3i3S - Instituto de Investigação e Inovação em Saúde, Universidade do Porto, 4IBMC - Instituto de Biologia Molecular e Celular, Universidade do Porto, 5MCbiology Doctoral Program, ICBAS - Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar, Universidade do Porto, 6Departamento de Biologia, Faculdade de Ciências, Universidade do Porto
* These authors contributed equally

Summary

वर्तमान प्रोटोकॉल सायनोबैक्टीरिया संस्कृतियों से बाह्य कोशिकीय पुटिकाओं के अलगाव, एकाग्रता और लक्षण वर्णन के लिए विस्तृत विवरण प्रदान करता है। विभिन्न पैमानों पर संस्कृतियों से पुटिकाओं को शुद्ध करने के लिए दृष्टिकोण, तरीकों के बीच व्यापार-बंद, और क्षेत्र के नमूनों के साथ काम करने के लिए विचारों पर भी चर्चा की जाती है।

Abstract

साइनोबैक्टीरिया प्रकाश संश्लेषक, ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया का एक विविध समूह है जो वैश्विक पारिस्थितिक तंत्र में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है और आवश्यक जैव प्रौद्योगिकी मॉडल के रूप में कार्य करता है। हाल के काम से पता चला है कि समुद्री और मीठे पानी के सायनोबैक्टीरिया दोनों बाहरी पुटिकाओं का उत्पादन करते हैं - रोगाणुओं की बाहरी सतह से जारी छोटी झिल्ली-बाध्य संरचनाएं। जबकि पुटिकाएं संभवतः विविध जैविक प्रक्रियाओं में योगदान करती हैं, साइनोबैक्टीरिया जीव विज्ञान में उनकी विशिष्ट कार्यात्मक भूमिकाएं काफी हद तक अज्ञात हैं। इस क्षेत्र में अनुसंधान को प्रोत्साहित करने और आगे बढ़ाने के लिए, साइनोबैक्टीरिया एक्स्ट्रासेल्युलर पुटिकाओं को अलग करने, ध्यान केंद्रित करने और शुद्ध करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है। वर्तमान कार्य उन तरीकों पर चर्चा करता है जिन्होंने प्रोक्लोरोकोकस, सिनेकोकोकस और सिनेकोसिस्टिस की बड़ी संस्कृतियों से पुटिकाओं को सफलतापूर्वक अलग कर दिया है। इन उपभेदों से पुटिका के नमूनों को परिमाणित करने और विशेषता देने के लिए विधियां प्रस्तुत की गई हैं। जलीय क्षेत्र के नमूनों से पुटिकाओं को अलग करने के लिए दृष्टिकोण का भी वर्णन किया गया है। अंत में, साइनोबैक्टीरियल पुटिका शुद्धिकरण के साथ सामना की जाने वाली विशिष्ट चुनौतियों, विभिन्न डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए पद्धतिगत विचार, और दृष्टिकोणों के बीच व्यापार-बंद पर भी चर्चा की जाती है।

Introduction

बाह्य कोशिकीय पुटिकाएं (ईवी) गोलाकार संरचनाएं हैं, जो व्यास में ~ 20-400 एनएम के बीच होती हैं, जो लगभग सभी जीवों द्वारा अपने आसपास के वातावरण 1,2,3 में जारी की जाती हैं। पुटिकाओं को लिपिड बाईलेयर द्वारा सीमांकित किया जाता है और वे खुद को दोहरा नहीं सकते हैं। ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया में, इन संरचनाओं को मुख्य रूप से बाहरी झिल्ली से छोटे भागों के 'ब्लेबिंग' द्वारा उत्पन्न माना जाता है। फिर भी, फ्लैगेलर गति, सेल लाइसिस, और आंतरिक और बाहरी झिल्ली सामग्री दोनों के स्राव सहित अन्य प्रक्रियाएं, पुटिकाओं के साथ-साथ 4,5 का उत्पादन कर सकती हैं। ईवी में लिपिड, घुलनशील और झिल्ली प्रोटीन, न्यूक्लिक एसिड और मेटाबोलाइट्स सहित विभिन्न बायोमोलेक्यूल्स हो सकते हैं, और इस सामग्री को कोशिकाओं 4,5,6 के बीच परिवहन कर सकते हैं। इन विशेषताओं को देखते हुए, ईवी का अध्ययन जैविक प्रक्रियाओं की एक विस्तृत श्रृंखला में उनकी संभावित भूमिकाओं को समझने के लिए किया जा रहा है, जिसमें सेलुलर संचार, बायोफिल्म गठन, क्षैतिज जीन स्थानांतरण, मेजबान-फेज गतिशीलता और पोषक तत्व विनिमय 4,6 शामिल हैं।

साइनोबैक्टीरिया ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया का एक बड़ा और विविध समूह है, जिसमें एककोशिकीय और फिलामेंटस जीव शामिल हैं। वे कई दृष्टिकोणों से रुचि रखते हैं, जिसमें उनके शरीर विज्ञान और विविधताको समझना शामिल है 7,8, महत्वपूर्ण पारिस्थितिकी तंत्र कार्य जो वे 9,10 की सेवा करते हैं, और जैव प्रौद्योगिकी के लिए उनकी उपयोगिता11,12। साइनोबैक्टीरिया विभिन्न प्रकार के आवासों में पाए जाते हैं, या तो समुद्री, मीठे पानी और स्थलीय वातावरण में मुक्त रहने वाले जीवों के रूप में, या काई, फर्न, पौधों के साथ सहजीवी संघों में, या लाइकेन और स्पंजमें 13। वे जलीय पारिस्थितिक तंत्र में महत्वपूर्ण प्राथमिक उत्पादकों के रूप में कार्य करते हैं, ऑक्सीजनिक प्रकाश संश्लेषण 9,10 के माध्यम से ऑक्सीजन और कार्बनिक कार्बन का उत्पादन करते हैं, और कुछ वायुमंडलीय नाइट्रोजनको ठीक करने में सक्षम हैं। समुद्री और मीठे पानी के साइनोबैक्टीरिया, जिसमें प्रोक्लोरोकोकस, सिनेकोकोकस और सिनेकोसिस्टिस शामिल हैं, प्रयोगशाला की स्थिति में ईवी का उत्पादन करते हैं 14,15,16, और साइनोबैक्टीरियल पुटिकाएं प्राकृतिक वातावरण में भी पाई जा सकती हैं 14,17। साइनोबैक्टीरिया पुटिकाओं के जैविक और पारिस्थितिक कार्य अज्ञात हैं, लेकिन इस क्षेत्र में आगे के शोध से साइनोबैक्टीरियल फिजियोलॉजी, भेदभाव, संचार रणनीतियों, विकास और ट्रॉफिक इंटरैक्शन पर सवालों में नई अंतर्दृष्टि प्रदान करने की संभावना है। इसके अलावा, बायोमोलेक्यूल्स की विविध श्रेणियों को ले जाने के लिए साइनोबैक्टीरिया ईवी की क्षमता में वाणिज्यिक अनुप्रयोग18,19 हो सकते हैं।

वर्तमान प्रोटोकॉल साइनोबैक्टीरिया संस्कृतियों और क्षेत्र के नमूनों से पुटिकाओं को अलग करने और विशेषता देने के तरीकों का वर्णन करता है ताकि साइनोबैक्टीरियल एक्स्ट्रासेल्युलर पुटिका जीव विज्ञान की व्यापक परीक्षा को सक्षम और प्रोत्साहित किया जा सके। जबकि यहां वर्णित वर्कफ़्लो अन्य बैक्टीरिया से ईवी को अलग करने और विशेषता देने के लिए प्रोटोकॉल के अनुरूप है, साइनोबैक्टीरिया संस्कृतियों और क्षेत्र के नमूनों में आमतौर पर कम सेल और पुटिका सांद्रता होती है जो आमतौर पर मेजबान से जुड़े या रोगजनक मॉडल सिस्टम 20,21,22 के साथ देखी जाती है। इस प्रकार, साइनोबैक्टीरिया ईवी के अध्ययन के लिए खेती और पुटिका अलगाव के लिए विशेष विचारों और अनुकूलन की आवश्यकता होती है, जो उपभेदों और मीडिया पृष्ठभूमि के बीच आगे भिन्न होते हैं। चूंकि कोई भी एकल प्रोटोकॉल सभी उपभेदों, विकास की स्थिति और डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए समान रूप से अच्छी तरह से काम नहीं करेगा, इसलिए हम कई विकल्प प्रदान करते हैं और इसमें शामिल ट्रेड-ऑफ पर चर्चा करते हैं ताकि शोधकर्ता अपने प्रयोगात्मक प्रश्नों को संबोधित करने के लिए सबसे उपयुक्त दृष्टिकोण निर्धारित कर सकें।

Protocol

साइनोबैक्टीरिया उपभेदों को कई संस्कृति संग्रहों से प्राप्त किया जाता है (विवरण के लिए चर्चा देखें)।

1. सायनोबैक्टीरिया खेती

  1. नीचे दिए गए चरणों के बाद समुद्री साइनोबैक्टीरिया प्रोक्लोरोकोकस और सिनेकोकोकस की खेती करें।
    1. इस तरह के Pro99 या SN के रूप में एक उपयुक्त माध्यम का उपयोग कर polycarbonate फ्लास्क में Prochlorococcus और Synechococcus उपभेदों की खेती (सामग्री की तालिका देखें). विवरण के लिए, कृपया पहले प्रकाशित संदर्भ 23,24 देखें.
    2. प्रयोग के लिए आवश्यक वांछित तापमान और विकिरण स्थितियों के तहत उन्हें दो से तीन स्थानान्तरण (प्रत्येक मार्ग के लिए ताजा मीडिया में संस्कृति के 1: 20 dilutions) में विकसित करके संस्कृतियों को acclimate करें।
      नोट: विशिष्ट विकासकी स्थिति 23,25 में 8-150 μmol फोटॉन m-2 s-1 के बीच विकिरण पर 15-30 °C के बीच का तापमान शामिल है, लेकिन व्यक्तिगत तनाव सहिष्णुता और ऑप्टिमा व्यापक रूप से26 भिन्न होते हैं और प्रासंगिक संस्कृति संग्रह निर्देशों या साहित्य से मार्गदर्शन के आधार पर सेट करने की आवश्यकता होती है। संस्कृति प्रतिदीप्ति या प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करके विकास दर की निगरानीकरें 23 की गिनती करता है, और यह सुनिश्चित करता है कि प्रयोग शुरू करने से पहले संस्कृतियां एक सुसंगत स्थिर-राज्य घातीय दर पर बढ़ती हैं।
    3. कोशिकाओं के देर से घातीय चरण तक पहुंचने के बाद छोटे से बड़े वॉल्यूम तक क्रमिक स्थानांतरण का एक सेट करें (उदाहरण के लिए, 20 मिलीलीटर < 250 एमएल < 2 एल < 10 एल < 20 एल)।
      नोट: बड़ी मात्रा में संस्कृतियों को सीधे शुरुआती संस्कृति की छोटी मात्रा से संक्रमित नहीं किया जा सकता है। ध्यान दें कि बड़ी संस्कृतियों को बफर (जैसे कि 1 mM HEPES, pH 7.5 या 3.75 mM TAPS, pH 8) के अलावा की आवश्यकता हो सकती है, साथ ही पूरक सोडियम बाइकार्बोनेट या बाँझ हवा24 के साथ बुदबुदाते हुए।
  2. मीठे पानी के सायनोबैक्टीरियम Synechocystis एसपी पीसीसी 6803 की खेती करें।
    1. Synechocystis sp. PCC 6803 की एक संस्कृति तैयार करने के लिए वातन (1 एल / मिनट पर बुदबुदाती हवा) के साथ खेती करके इनोकुलम के रूप में उपयोग किया जा सकता है, 30 डिग्री सेल्सियस पर, 16 घंटे के प्रकाश के तहत (50 μmol m-2 s-1 की फोटॉन गिनती) / 8 घंटे अंधेरे शासन, BG11 मध्यम27 में 1.0 (घातीय चरण) के 730 एनएम (OD730) पर ऑप्टिकल घनत्व तक।
    2. इस संस्कृति के 30 मिलीलीटर Synechocystis एसपी पीसीसी 6803 BG11 के 570 mL में 1 एल ग्लास गैस धोने की बोतलों में 0.05 के एक OD730 के लिए मध्यम में टीका।
    3. कोशिकाओं को वातन के साथ बढ़ने की अनुमति दें, 30 डिग्री सेल्सियस पर, 16 घंटे के प्रकाश (50 μmol m-2 s-1 की फोटॉन गिनती) / 8 एच अंधेरे शासन के तहत, 1.0-1.5 के अंतिम OD730 तक।

2. छोटे कण (पुटिका) अंश से साइनोबैक्टीरिया बायोमास का पृथक्करण

नोट: सबसे पहले, कोशिकाओं के केन्द्रापसारक छर्रों के माध्यम से supernatant से कोशिकाओं को अलग करने की सिफारिश की है। हालांकि, जब संस्कृति की मात्रा इसके लिए संभव होने के लिए बहुत बड़ी होती है, तो सेंट्रीफ्यूजेशन को छोड़ना और कैप्सूल निस्पंदन (चरण 2.4) का उपयोग करके पूरी संस्कृतियों को फ़िल्टर करने के लिए सीधे आगे बढ़ना संभव है।

  1. कोशिकाओं को अलग करने के लिए सेंट्रीफ्यूजेशन करें (उपलब्ध सेंट्रीफ्यूज क्षमता के आधार पर ~ 4 एल तक की मात्रा के लिए सबसे अच्छा)।
    1. आटोक्लेव या अच्छी तरह से धोएं और प्रकार I अल्ट्राप्योर ग्रेड पानी का उपयोग करके सेंट्रीफ्यूज की बोतलों को साफ करें ( सामग्री की तालिका देखें), यह सुनिश्चित करते हुए कि कोई अवशिष्ट साबुन या अन्य सामग्री नहीं रहती है।
    2. सेंट्रीफ्यूज बोतलों की एक उचित संख्या में संस्कृति के नमूनों को लोड करें और उन्हें संतुलित करें।
    3. 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर >10,000 x g के लिए स्पिन संस्कृतियों। यदि supernatant स्पष्ट रूप से turbid रहता है, तो अधिकतम गति पर 20 मिनट तक सेंट्रीफ्यूजेशन की स्थिति बढ़ाएं और पुन: प्रयास करें।
    4. सावधानी से decant या pipet supernatant एक साफ पोत में और चरण 2.2-2.4 में उल्लिखित निम्नलिखित निस्पंदन विकल्पों में से एक के लिए आगे बढ़ें।
  2. विकल्प 1: 0.2 μm फिल्टर का उपयोग करके सिरिंज निस्पंदन प्रदर्शन (~ 50 mL तक नमूना वॉल्यूम के लिए)।
    1. एक बाँझ 50 मिलीलीटर सिरिंज को बड़े पैमाने पर सेल-मुक्त संस्कृति माध्यम से भरें, और इसे 0.2 (या 0.45) μm polyethersulfone (PES) फ़िल्टर के माध्यम से फ़िल्टर करें ( सामग्री की तालिका देखें)। एक साफ, निष्फल रिसेप्टैकल में फिल्टर ले लीजिए।
    2. इस चरण को तब तक दोहराएं जब तक कि फ़िल्टर भरा न हो जाए (उदाहरण के लिए, सिरिंज के साथ धक्का देना मुश्किल हो जाता है)। एक नए फ़िल्टर के साथ बदलें, और तब तक आगे बढ़ें जब तक कि नमूना पूरी तरह से फ़िल्टर न हो जाए।
  3. विकल्प 2: 0.2 μm वैक्यूम निस्पंदन (~ 4 एल तक) प्रदर्शन करें।
    1. टाइप I - अल्ट्राप्योर ग्रेड पानी का उपयोग करके वैक्यूम उपकरण को अच्छी तरह से धोएं और साफ करें, इसे वैक्यूम ट्रैप और पंप से जोड़ते हुए ( सामग्री की तालिका देखें)।
    2. एक उपयुक्त व्यास का एक 0.2 μm फ़िल्टर डालें और वैक्यूम उपकरण क्लैंप करें।
    3. संस्कृति नमूने की एक छोटी राशि जोड़ें, यह सुनिश्चित करते हुए कि वैक्यूम दबाव <10 साई रहता है।
    4. पूरा होने तक छोटे वेतन वृद्धि में संस्कृति को फ़िल्टर करना जारी रखें। यदि निस्पंदन दर काफी धीमी हो जाती है, तो वैक्यूम को रोकें और फ़िल्टर को बदलें।
    5. एक साफ कंटेनर में पुटिकाओं युक्त <0.2 μm अंश ले लीजिए।
  4. विकल्प 3: 0.2 μm कैप्सूल निस्पंदन प्रदर्शन (नमूना मात्रा के लिए > ~ 4 एल)
    1. पानी और हल्के डिटर्जेंट के साथ धोकर उचित आकार के लचीले टयूबिंग और संग्रह पोत को साफ करें। आसुत और विआयनीकृत पानी के साथ सामग्री कुल्ला।
      नोट: उपयोग से पहले, सामग्री को प्रकार I - अल्ट्राप्योर ग्रेड पानी के साथ कुल्ला किया जाना चाहिए।
    2. नीचे दिए गए अंतिम संग्रह पोत के साथ एक सुरक्षित, ऊंचा स्थान पर फ़िल्टर करने के लिए संस्कृति को रखें। एक 0.2 μm कैप्सूल फ़िल्टर कनेक्ट ( सामग्री की तालिका देखें) टयूबिंग के एक टुकड़े के लिए बहिर्वाह बंदरगाह और यह एक संग्रह पोत में जगह है.
    3. नमूने में एक और टयूबिंग रखें, एक सिरिंज के साथ टयूबिंग में कुछ नमूने खींचकर एक गुरुत्वाकर्षण साइफन शुरू करें, और ट्यूबिंग को कैप्सूल फ़िल्टर से कनेक्ट करें। अतिरिक्त हवा जारी करने के लिए वेंट का उपयोग करें और supernatant के साथ कक्ष को भरने के लिए।
    4. सामग्री को कैप्सूल के माध्यम से स्थानांतरित करने की अनुमति दें जब तक कि नमूना पूरी तरह से फ़िल्टर न हो जाए। यदि प्रवाह दर बहुत धीमी हो जाती है (< ~ 1/10 शुरुआती प्रवाह दर, या लगातार बहने वाली धारा के विपरीत ड्रॉपवाइज बाहर आ रही है), तो प्रतीक्षा करें या एक पेरिस्टाल्टिक पंप के साथ कोमल बल लागू करें जब तक कि बैकप्रेशर न बढ़ जाए। वैकल्पिक रूप से, आंशिक रूप से फ़िल्टर को अस्थायी रूप से डिस्कनेक्ट करके प्रवाह दरों को पुनर्स्थापित करें, अल्ट्राक्लीन पानी के साथ प्रवाह पक्ष से संचित बायोमास को बैकफ्लश करना जब तक कि सामग्री अब स्पष्ट रूप से टर्बिड न हो, और फिर निस्पंदन प्रक्रिया को पुनरारंभ करें।

3. पुटिका नमूना ध्यान केंद्रित

  1. विकल्प 1: नमूनों की छोटी (<500 मिलीलीटर) मात्रा पर ध्यान केंद्रित करने के लिए केन्द्रापसारक अल्ट्राफिल्ट्रेशन करें।
    1. प्रकार मैं के साथ पसंद के 15-20 mL ultrafiltration केन्द्रापसारक सांद्रक कुल्ला - ultrapure ग्रेड पानी.
    2. सेंट्रीफ्यूज में सांद्रकों को लोड करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 4,400 x g पर स्पिन करें। रन थ्रू को छोड़ दें और इस चरण को कम से कम दो बार और दोहराएं।
    3. पानी-कुल्ला सांद्रकों में supernatant नमूना लोड और एक ही शर्तों के तहत स्पिन. प्रयोगात्मक लक्ष्यों के आधार पर, नमूना फिल्टर को आगे की एकाग्रता के लिए त्याग या एकत्र किया जा सकता है (3 केडीए की नाममात्र आणविक वजन सीमा के साथ कंसंट्रेटर के साथ) और विश्लेषण।
    4. इस चरण को तब तक दोहराएं जब तक कि नमूना ~ 15-30 मिलीलीटर की अंतिम मात्रा पर केंद्रित न हो जाए।
  2. विकल्प 2: नमूने की एक बड़ी (>500 मिलीलीटर) मात्रा पर ध्यान केंद्रित करने के लिए स्पर्शरेखा प्रवाह निस्पंदन (टीएफएफ) करें।
    1. निर्माता के दिशानिर्देशों के अनुसार टीएफएफ उपकरण सेट करें ( सामग्री की तालिका देखें)। सेवन लाइन के लिए एक peristaltic पंप संलग्न करें और retentate लाइन पर समायोज्य clamps जगह. निर्माता द्वारा अनुशंसित के रूप में TFF को सैनिटाइज करें, और फिर डिवाइस को टाइप I के 1 L के साथ फ्लश करें - ultrapure ग्रेड पानी।
      नोट: सेवन और retentate लाइनों को एक साफ नमूना जलाशय (कांच की बोतल) में रखा जाना चाहिए। फिल्टर लाइन (ओं) को एक अपशिष्ट पोत या सिंक में निर्देशित किया जाना चाहिए।
    2. नमूना जलाशय में <0.2 μm छानना जोड़ें। धीरे-धीरे फिल्टर लाइनों से आउटपुट बढ़ाने के लिए retentate लाइन पर पंप की गति और बैकप्रेशर के स्तर में वृद्धि।
    3. टीएफएफ चलाने के लिए जारी रखें, संस्कृति supernatant के साथ जलाशय को फिर से भरना के रूप में सामग्री को हटा दिया जाता है। हवा के बुलबुले पेश करने से बचने के लिए प्रसंस्करण के दौरान नमूने से बाहर आने के लिए सेवन लाइन की अनुमति देने से बचें। सुनिश्चित करें कि फ़ीड दबाव ~ 10 साई से अधिक नहीं है और यह कि retentate TFF से बाहर एक सुसंगत गति से जलाशय में वापस बहता है।
    4. एक बार जलाशय में मात्रा हवा के बुलबुले शुरू किए बिना सेवन लाइन में प्रवाह को बनाए रखने के लिए आवश्यक सबसे कम संभव राशि तक पहुंचने के बाद नमूने को ध्यान केंद्रित करना बंद कर दें।
    5. एक क्लैंप के साथ बहिर्वाह रेखा को बंद करें। retentate लाइन पर backpressure निकालें और ~ 10 मिनट के लिए फिल्टर के माध्यम से केंद्रित supernatant recirculate, वसूली को अधिकतम करने के लिए 20-40 mL / मिनट के लिए recirculation दर को कम करने।
    6. एक साफ पोत में retentate लाइन ले जाएँ, नमूने से सेवन लाइन को हटा दें, और केंद्रित सामग्री एकत्र करें। एक पिपेट का उपयोग करके नमूना जलाशय में किसी भी शेष सामग्री को पुनर्प्राप्त करें।
    7. एक 0.2 μm सिरिंज फ़िल्टर (चरण 2.2) के माध्यम से केंद्रित supernatant फ़िल्टर यह सुनिश्चित करने के लिए कि कोई कोशिकाएं नहीं रहती हैं।
      नोट:: चरण 3.2.7 वैकल्पिक है।
    8. यदि आवश्यक हो, तो पुटिका शुद्धिकरण (चरण 4) पर जाने से पहले ~ 3 सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर अंतिम ध्यान केंद्रित करें।

4. पुटिका अलगाव और शुद्धिकरण

  1. नीचे दिए गए चरणों के बाद अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा सीधे गोली।
    1. एक साफ ultracentrifuge ट्यूब में केंद्रित <0.2 μm संस्कृति नमूना जगह. यह सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक के रूप में स्वच्छ मीडिया या बफर जोड़ें कि ट्यूब पूरी तरह से भर गई है।
      नोट: यदि अंतिम संस्कृति नमूना एक ट्यूब में फिट होने के लिए बहुत बड़ा है, तो या तो एक ही ट्यूब में धोने के चरणों या गोली क्रमिक रूप से संयुक्त होने के लिए कई ट्यूबों में सामग्री को गोली मार दें।
    2. यदि आवश्यक हो, तो एक संतुलन बनाएं और 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 घंटे के लिए ~ 100,000 एक्स जी पर स्पिन करें।
    3. ध्यान से एक पिपेट के साथ supernatant निकालें. जबकि साइनोबैक्टीरिया पुटिका छर्रों कुछ रंग दिखा सकते हैं, वे अक्सर अदृश्य होते हैं।
    4. ताजा संस्कृति मीडिया को जोड़कर या 1x फॉस्फेट-बफ़र्ड खारा (PBS) जैसे बफर को धोकर छर्रेदार सामग्री को धोएं ( चर्चा देखें) अल्ट्रासेंट्रिफ्यूज ट्यूब में, कोमल पिपेटिंग द्वारा मिश्रण करें, और चरण 4.1.2 के रूप में फिर से स्पिन करें। धोने की प्रक्रिया को दूसरी बार दोहराएं।
    5. बार-बार लेकिन धीरे-धीरे एक एमएल पिपेट के साथ ट्यूब के नीचे के चारों ओर ऊपर और नीचे pipetting द्वारा ताजा संस्कृति में अंतिम गोली resuspend. एक साफ बर्तन में स्थानांतरित करें।
  2. घनत्व प्रवणता ultracentrifugation निष्पादित करें।
    1. नमूने के लिए वांछित बफर पृष्ठभूमि का 4x केंद्रित संस्करण बनाकर आयोडिक्सनॉल स्टॉक तैयार करें ( सामग्री की तालिका देखें) ( चर्चा देखें)।
    2. 45% आयोडिक्सनॉल समाधान बनाने के लिए 60% आयोडिक्सनॉल स्टॉक के तीन भागों के साथ 4x बफर के एक हिस्से को मिलाएं।
    3. 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, और 10% अंतिम iodixanol सांद्रता पर ग्रेडिएंट मीडिया के स्टॉक बनाने के लिए 1x बफर की मात्रा के साथ 45% iodixanol पतला करें।
      नोट: कुल आवश्यक राशि ultracentrifuge रोटर / ट्यूबों की क्षमता के साथ भिन्न होगी।
    4. 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, और 0% ioxidinol की समान मात्रा को ध्यान से एक अल्ट्रासेंट्रिफ्यूज ट्यूब में ओवरलेकर एक अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज घनत्व ढाल स्थापित करें ताकि ट्यूब की पूरी मात्रा का उपयोग किया जा सके।
      नोट: शुद्ध किए जाने वाले बाह्य कोशिकीय पुटिका नमूने को 0% आयोडिक्सनॉल परत के हिस्से के रूप में ढाल के शीर्ष पर रखा जाना चाहिए। यदि पुटिका के नमूने की अंतिम मात्रा 0% परत के आकार से अधिक है, तो 10% या उच्च सांद्रता ऑप्टिप्रैप स्टॉक की आवश्यक मात्रा उत्पन्न करने के लिए पर्याप्त 45% आयोडिक्सनॉल और / या बफर के साथ किसी भी अतिरिक्त पुटिका नमूने को मिलाएं, और ग्रेडिएंट में संबंधित स्थान पर इनका उपयोग करें।
    5. 6 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ~ 100,000 x g पर ग्रेडिएंट स्पिन करें।
    6. भिन्नों को इकट्ठा करें (आमतौर पर 0.5 mL प्रत्येक के लिए ~ 4.5 mL ग्रेडिएंट के लिए) सावधानीपूर्वक pipetting या एक अंश कलेक्टर का उपयोग करके ( सामग्री की तालिका देखें)।
    7. नमूने की ज्ञात मात्रा के वजन को मापने के लिए एक विश्लेषणात्मक संतुलन और कैलिब्रेटेड पिपेट का उपयोग करके प्रत्येक अंश (जी / एमएल में) का घनत्व निर्धारित करें। ट्यूब से नमूना निकालें, वजन निर्धारित करें, और सीधे नमूना वापस करें।
    8. स्वच्छ बफर के साथ एक नई ultracentrifuge ट्यूब में अलग-अलग अंशों को पतला करें और 4.1.2-4.1.4 चरणों में उल्लिखित सामग्री को धोएं। वैकल्पिक रूप से, कणों को पुनर्प्राप्त करने के लिए डायलिसिस या अल्ट्राफिल्ट्रेशन कॉलम का उपयोग करें।
      नोट: साइनोबैक्टीरिया एक्स्ट्रासेल्युलर पुटिकाएं आमतौर पर आयोडिक्सनॉल में ~ 1.14-1.19 ग्राम / एमएल के उत्साही घनत्व के लिए माइग्रेट करती हैं।
  3. पुटिकाओं को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें यदि उनका उपयोग 1-3 सप्ताह के भीतर किया जाना है। पुटिकाओं को -20 डिग्री सेल्सियस या -80 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज करें यदि वे उस अवधि से अधिक समय तक उपयोग नहीं किए जाते हैं।

5. अलग पुटिकाओं के लक्षण वर्णन

  1. नकारात्मक दाग संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी प्रदर्शन ( सामग्री की तालिका देखें) (TEM; कण आकार, संरचना, शुद्धता).
    1. छवि की गुणवत्ता में सुधार करने के लिए, निर्माता के दिशानिर्देशों के अनुसार एक चमक निर्वहन प्रणाली का उपयोग करके एक पूर्व-लेपित टीईएम ग्रिड की सतह को चमक डिस्चार्ज करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    2. ध्यान से पुटिका के नमूने के ~ 5 μL लागू होते हैं और 5 मिनट के लिए बैठने देते हैं।
      नोट: पुटिका सांद्रता >109 एमएल -1 के साथ नमूने आमतौर पर सबसे अच्छा परिणाम देंगे; अधिक पतला नमूनों में प्रति छवि कुछ पुटिकाएं होंगी।
    3. साफ फिल्टर कागज के एक टुकड़े के लिए एक ग्रिड के किनारे को छूकर नमूना निकालें।
    4. प्लास्टिक फिल्म द्वारा कवर की गई एक सपाट सतह पर 2% यूरेनिल एसीटेट ( सामग्री की तालिका देखें) की एक 20-50 μL बूंद को पिपेट करें, और ग्रिड को 2 मिनट के लिए इसके शीर्ष पर तैरते हुए रखें।
    5. फिल्टर पेपर का उपयोग करके यूरेनिल एसीटेट को हटा दें और धोने के लिए अल्ट्राप्योर पानी की एक बूंद पर संक्षेप में फ्लोट करें। दूसरी बार पानी धोने को दोहराएं।
      नोट:: अंतिम सूखी ग्रिड चरण 5.1.5 के बाद विज़ुअलाइज़ेशन के लिए तैयार है।
  2. TEM (कण आकार, आंतरिक संरचना) के लिए अल्ट्रा-पतली अनुभाग धुंधला प्रदर्शन करें।
    1. चरण 4.1.5 से छर्रे को 0.1 एम सोडियम कैकोडिलेट बफर (पीएच 7) में 2.5% ग्लूटाराल्डिहाइड के 1 मिलीलीटर के साथ फिर से निलंबित करें ( सामग्री की तालिका देखें) और 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए नमूने को ठीक करें।
    2. 4 °C पर 1 h के लिए ~ 100,000 x g पर स्पिन करें।
    3. 0.1 एम सोडियम cacodylate बफर (पीएच 7) के साथ गोली को ध्यान से धोएं, और फिर 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए ~ 100,000 x g पर स्पिन करें।
    4. 1% ऑस्मियम टेट्रोक्साइड के 1 मिलीलीटर के साथ गोली को ठीक करें ( सामग्री की तालिका देखें) (0.1 एम सोडियम कैशोडिलेट बफर में तैयार) 1 घंटे के लिए, और फिर चरण 5.2.3 के रूप में धोएं।
    5. इथेनॉल की एक आरोही श्रृंखला के 1 मिलीलीटर (50%, 70%, 90%, और पूर्ण इथेनॉल में दो बार) के साथ नमूने को 4 डिग्री सेल्सियस पर प्रत्येक 10 मिनट के चरणों में निर्जलित करें।
    6. Epoxy राल के 250 μL जोड़ें ( सामग्री की तालिका देखें) गोली के लिए निरपेक्ष इथेनॉल (1: 1) के साथ मिश्रित और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट।
    7. 24 ज के लिए शुद्ध राल के 500 μL करने के लिए गोली हस्तांतरण. फिर, राल को 48 घंटे के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
      नोट: राल अब अल्ट्रामाइक्रोटोम द्वारा अनुभाग के लिए तैयार है, निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए ( सामग्री की तालिका देखें)।
    8. 5 मिनट के लिए 2% यूरेनिल एसीटेट (50% इथेनॉल में) के साथ वर्गों वाले ग्रिड को दाग दें। स्लाइड को धीरे से 10-15 सेकंड के लिए चल रहे विआयनीकृत पानी के नीचे धोएं। सीसा साइट्रेट की एक बूंद रखें ( सामग्री की तालिका देखें) और एक और 5 मिनट के लिए दाग।
    9. पहले की तरह धोएं, एक फिल्टर पेपर पर ग्रिड को ब्लोटिंग करके पानी को हटा दें, और ग्रिड को एयर-ड्राई करें। निर्माता के दिशानिर्देशों के अनुसार TEM द्वारा विज़ुअलाइज़ करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
  3. नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण (एनटीए) (कण आकार, एकाग्रता) करें।
    1. लेंस पेपर का उपयोग करके, ऑप्टिकल फ्लैट से किसी भी धूल या दृश्यमान सामग्री को सावधानीपूर्वक पोंछें। जांचें कि क्या सभी ओ-रिंग्स और अन्य सील साफ और बरकरार हैं। उपकरण को चालू करें और सॉफ़्टवेयर शुरू करें।
    2. एक साफ सिरिंज का उपयोग करके, कक्ष को अल्ट्रा-शुद्ध पानी से भरें। सुनिश्चित करें कि कोई हवा के बुलबुले मौजूद नहीं हैं।
    3. स्टार्ट कैमरा पर क्लिक करें और 'थंबप्रिंट' के बारे में कक्ष के इष्टतम क्षेत्र की कल्पना करें। माइक्रोस्कोप चरण को क्षैतिज या लंबवत रूप से समायोजित करें जैसा कि आवश्यक है ताकि संकेत तीव्रता छवि वाले क्षेत्र में भी हो। इमेजिंग क्षेत्र को थंबप्रिंट के सापेक्ष क्षैतिज रूप से ले जाएँ (दाईं ओर, ऊर्ध्वाधर रेखा की ओर), कम पृष्ठभूमि संकेत के साथ पास का क्षेत्र ढूंढें।
    4. स्क्रीन लाभ और कैमरा स्तर स्लाइडर्स को अधिकतम करने के लिए स्लाइड करें, और उसके बाद dimmest कणों को देखने के लिए निम्नतम स्तर तक कम करें।
      नोट: साइनोबैक्टीरिया पुटिकाओं के लिए विशिष्ट सेटिंग्स 7 की एक स्क्रीन लाभ और 10-12 के बीच कैमरा स्तर का उपयोग करें।
    5. यह सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक के रूप में फोकस को समायोजित करें कि कण दृश्य के क्षेत्र में लगभग समान रूप से समान रूप से दिखाई दे रहे हैं। कक्ष के माध्यम से अल्ट्रा-साफ पानी को धक्का देना जारी रखें जब तक कि आप नेत्रहीन रूप से पुष्टि नहीं कर लेते कि कक्ष साफ है।
    6. एक अलग सिरिंज का उपयोग करके कक्ष से अवशिष्ट पानी निकालें।
    7. मीडिया / बफर के एक नमूने की जांच करें जो आपके नमूने में एक साफ 1 एमएल सिरिंज का उपयोग करके मीडिया / बफर के साथ कक्ष को भरकर पृष्ठभूमि कण एकाग्रता को निर्धारित करने के लिए है।
    8. SOP ड्रॉपडाउन बॉक्स से मानक माप का चयन करें। प्रत्येक 60 s वीडियो के कम से कम तीन तकनीकी प्रतिकृतियों को इकट्ठा करने के लिए सेटिंग्स बदलें। स्क्रिप्ट बनाएँ और चलाएँ दबाएँ और संकेतों का पालन करें. पुश ~ प्रतिकृति के बीच कक्ष में नमूना के 100 μL.
    9. जब अधिग्रहण पूरा हो जाता है, तो एक सिरिंज के साथ अवशिष्ट बफर को हटा दें, कक्ष के माध्यम से अल्ट्रा-शुद्ध पानी के 3-5 मिलीलीटर फ्लश करें, और शेष पानी को हटा दें।
    10. एक 1 एमएल सिरिंज का उपयोग कर कक्ष के लिए पुटिका नमूना जोड़ें और अधिग्रहण सेटिंग्स की पुष्टि करें। यदि कण गणना उपकरण की रैखिक सीमा (आमतौर पर 20-80 कणों / फ्रेम के बीच) के भीतर नहीं है, तो नमूने को पतला या केंद्रित करने की आवश्यकता होगी। डेटा एकत्र करने से पहले कक्ष में कम से कम 500 μL नमूने को पुश करें।
    11. चरण 5.3.8 के रूप में वीडियो डेटा एकत्र करें, विभिन्न नमूनों के बीच अल्ट्रा-शुद्ध पानी के साथ कक्ष को साफ करना सुनिश्चित करें।
    12. डेटा की तुलनात्मकता सुनिश्चित करने के लिए समान कैमरा सेटिंग्स का उपयोग करके एक ही जीव / प्रयोग से बाद के सभी नमूनों को एकत्र करें; कैमरा स्तर सेटिंग में परिवर्तन प्राप्त अंतिम मानों पर एक उल्लेखनीय प्रभाव पड़ सकता है।
    13. सॉफ़्टवेयर के विश्लेषण अनुभाग का उपयोग करके कण पैरामीटर निर्धारित करें. विश्लेषण > खोलें प्रयोग का चयन करें, और नमूना फ़ाइल लोड करें। चयनित फ़ाइलों को संसाधित करें का चयन करें और विश्लेषण के पूर्ण होने की प्रतीक्षा करें. एक ही प्रयोग से सभी बाद के नमूनों के लिए एक ही डिटेक्शन थ्रेशोल्ड का उपयोग करना सुनिश्चित करें।
      नोट: के रूप में साइनोबैक्टीरिया vesicles अक्सर मंद कर रहे हैं, डिटेक्शन थ्रेशोल्ड आमतौर पर सबसे संवेदनशील (सबसे कम) मान के लिए समायोजित करने की आवश्यकता होगी।
  4. गतिशील प्रकाश प्रकीर्णन (डीएलएस) (कण आकार, जीटा क्षमता) प्रदर्शन करें।
    1. किसी भी नमूने के लिए 0.2 μm ताकना आकार फ़िल्टर के माध्यम से फ़िल्टर करें जो माप के साथ हस्तक्षेप करने वाले बड़े कणों को स्क्रीन करने के लिए डीएलएस में जाता है।
    2. मीडिया से आने वाले संभावित एकत्रीकरण या अन्य नैनोकणों की जांच करने के लिए एक साफ क्यूवेट में मीडिया / बफर के 1 एमएल जोड़ें। माइक्रो सैंपलर में बाईं ओर ठंढ वाली तरफ के साथ क्यूवेट रखो, और ढक्कन को बंद करें। नमूने को कम से कम 5 मिनट के लिए संतुलित होने दें।
    3. सामग्री और सामग्री अवशोषण के अपवर्तक सूचकांक दर्ज करें यदि वे पानी के लिए डिफ़ॉल्ट से काफी भिन्न हैं।
      नोट: भौतिक गुणों का बहुत कम प्रभाव होगा यदि पुटिकाएं 100 एनएम से छोटी हैं। ईवी की सतह क्षमता (जीटा क्षमता) को मापते समय, पुटिकाओं को मूल विकास मीडिया में फिर से निलंबित किया जाना चाहिए।
    4. रीडिंग की जांच करने के लिए इंस्ट्रूमेंट कंट्रोल पैनल पर क्लिक करें और हरे रंग के आइकन पर क्लिक करके डेटा अधिग्रहण शुरू करें। यदि मान अच्छे दिखते हैं और आपके मीडिया /बफ़र में एकत्रीकरण या अन्य कण नहीं हैं, तो अब आप अपने नमूने को मापने के लिए तैयार हैं।
    5. एक साफ cuvette में पुटिका के नमूने के 1 mL जोड़ें और चरण 5.4.4 में उल्लिखित के रूप में डेटा एकत्र करें। प्रत्येक 10 मिनट के लिए कम से कम तीन तकनीकी प्रतिकृतियों को इकट्ठा करें।
  5. यह पुष्टि करने के लिए लिपोपॉलीसेकेराइड (एलपीएस) विश्लेषण करें कि ग्राम-नकारात्मक ईवी नमूने में मौजूद हैं।
    1. मानक 1x Laemmli नमूना बफर में 10 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर गर्मी denature पुटिका नमूना ( सामग्री की तालिका देखें).
    2. स्ट्रेप्टोमाइसेस ग्रिज़ियस से प्रकार XIV प्रोटीज के 0.2 यू के साथ इनक्यूबेट करें (सामग्री की तालिका देखें) दूषित ग्लाइकोप्रोटीन को हटाने के लिए 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर।
    3. पहले सेप्रकाशित प्रोटोकॉल 16% (डब्ल्यू / वी) एसडीएस-पॉलीएक्रिलामाइड जैल के बाद विकृतीकरण पर वैद्युतकणसंचलन द्वारा अलग-अलग उपचारित नमूने।
    4. एलपीएस का पता लगाने के लिए, जेल को या तो व्यावसायिक रूप से उपलब्ध धुंधला किट के साथ या एक संशोधित चांदी धुंधला तकनीकके साथ दाग दें 28। पहले से प्रकाशित संदर्भ29,30 के अनुसार दाग जैल के घनत्वमिति विश्लेषण द्वारा सापेक्ष एलपीएस बहुतायत को मापें।

6. पुटिका उत्पादन दर माप

  1. चरण 5.3, या समकक्ष तकनीक के रूप में nanoparticle ट्रैकिंग विश्लेषण का उपयोग करते हुए, प्रयोग के लिए विकास मीडिया में कण एकाग्रता को मापें। यदि एक उच्च कण गिनती पाई जाती है, तो 0.1 μm रंध्र फ़िल्टर के माध्यम से फ़िल्टर करें और पुन: जाँच करें।
    नोट: त्रुटि को कम करने के लिए, मीडिया पृष्ठभूमि कण एकाग्रता सबसे कम घनत्व पर संस्कृतियों में पाए जाने वाले कण एकाग्रता के 10% से कम होनी चाहिए।
  2. चरण 1.1.2 के रूप में प्रयोगों के लिए वांछित मीडिया और पर्यावरणीय परिस्थितियों के तहत कम से कम दो क्रमिक सीरियल स्थानांतरण के लिए कोशिकाओं को बढ़ाकर संस्कृति को अनुकूलित करें। संस्कृतियों को स्थानांतरित करने की आवश्यकता है, जबकि अभी भी घातीय विकास चरण में है। सुनिश्चित करें कि मापा संस्कृति विकास दर हस्तांतरण भर में सुसंगत हैं; यदि नहीं, तो संस्कृतियों को तब तक स्थानांतरित करना जारी रखें जब तक कि विकास दर पुन: प्रस्तुत करने योग्य न हो।
  3. टीकाकरण पर समय-पाठ्यक्रम के नमूने एकत्र करें और प्रारंभिक स्थिर चरण में विकास वक्र में नियमित रूप से समयबद्ध अंतराल। स्टैगर समय के लिए घातीय विकास की पूरी श्रृंखला में एकत्र किए गए न्यूनतम 3-4 नमूनों को इंगित करता है। प्रत्येक समय बिंदु पर नमूना करने के लिए, निम्न चरणों का पालन करें।
    1. एक साफ, बाँझ 0.2 μm सिरिंज फिल्टर के माध्यम से सीधे 1 एमएल या अधिक संस्कृति फ़िल्टर करें और चरण 5.3 के रूप में पुटिकाओं की एकाग्रता को मापने के लिए फिल्टर को बचाने के लिए। यदि वांछित हो तो समय-पाठ्यक्रम के नमूनों को फ्रीज करें। संस्कृति विकास गतिशीलता का पालन करने के लिए सापेक्ष प्रतिदीप्ति का उपयोग करें।
    2. जीव के लिए उपयुक्त विधि (फ्लो साइटोमेट्री; कॉलोनी चढ़ाना; या अन्यथा) का उपयोग करके जनसंख्या के आकार को निर्धारित करने के लिए पूरी संस्कृति का एक नमूना सहेजें।
  4. प्रत्येक टाइमपॉइंट पर कोशिकाओं और पुटिका जैसे कणों (प्रति एमएल) के माप प्राप्त करें।
  5. घातीय विकास चरण के दौरान होने वाले टाइमपॉइंट्स की पहचान करें। आर की गणना करने के लिए, प्रति पीढ़ी प्रति सेल उत्पादित पुटिकाओं की संख्या, घातीय विकास के दौरान दो बिंदुओं (आमतौर पर समय-पाठ्यक्रम की शुरुआत और अंत) के बीच, पूरक फ़ाइल 1 में प्रदान किए गए समीकरण का उपयोग करें।
    नोट:: यह विधि केवल स्थिर-स्थिति वृद्धि स्थितियों के दौरान मान्य है; अंतर्निहित मान्यताओं और गणना की व्युत्पत्ति संदर्भ14 में विस्तृत हैं।

Representative Results

चित्रा 1 साइनोबैक्टीरिया पुटिका अलगाव प्रक्रिया का एक सिंहावलोकन प्रस्तुत करता है, जो यहां वर्णित प्रोटोकॉल के प्रमुख पहलुओं को उजागर करता है। विशेष रूप से ध्यान दें कि छोटे कण (पुटिका) अंश से साइनोबैक्टीरिया बायोमास के अलगाव का विवरण देने वाले चरण हैं, पुटिका नमूने और पुटिका अलगाव और शुद्धिकरण (चित्रा 1, चरण 2 से 4) को केंद्रित करते हैं, जो पुटिकाओं की पुन: प्रस्तुत करने योग्य तैयारी प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण हैं। चित्रा 2 सायनोबैक्टीरियम Synechocystis sp. PCC 6803 से बाह्य कोशिकीय पुटिकाओं के अलगाव और लक्षण वर्णन से प्रतिनिधि परिणाम प्रस्तुत करता है। इस सायनोबैक्टीरियम की बाहरी झिल्ली को कैरोटीनॉयड31 को शामिल करने के लिए दिखाया गया है, जो अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन (चित्रा 2 ए) के माध्यम से सीधे पैलेटिंग द्वारा एकत्र किए गए पुटिकाओं के नमूनों के लिए एक विशिष्ट नारंगी रंग प्रदान करता है। एक बार पुटिका गोली resuspended है, पुटिकाओं संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (TEM) द्वारा जांच की जा सकती है, या तो uranyl एसीटेट (चित्रा 2B) के साथ नकारात्मक धुंधला नमूनों द्वारा या अल्ट्राथिन वर्गों (चित्रा 2C) के अवलोकन द्वारा। पुटिका आकार वितरण और एकाग्रता का मूल्यांकन गतिशील प्रकाश प्रकीर्णन (डीएलएस) (चित्रा 2 डी) और नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण (एनटीए) (चित्रा 2 ई) का उपयोग करके किया जा सकता है। वर्णित प्रोटोकॉल के साथ, आमतौर पर ~ 3.5 ± 1.0 x 10प्रति एमएल 8 नैनोकणों को Synechocystis sp. PCC 6803 की तेजी से बढ़ती संस्कृति में 1.0 के OD730 पर प्राप्त किया गया था। पृथक ईवी के जैव रासायनिक विश्लेषण को पृथक पुटिकाओं के भौतिक लक्षण वर्णन के पूरक के लिए किया जा सकता है। एक उदाहरण के रूप में, शुद्ध Synechocystis एसपी पीसीसी 6803 पुटिकाओं को एक एसडीएस-पॉलीएक्रिलामाइड जेल पर अलग किया गया था और लिपोपॉलीसेकेराइड (एलपीएस) के लिए दाग दिया गया था; चित्रा 2F)। चूंकि एलपीएस बाहरी झिल्ली32 के लिए विशिष्ट हैं, इसलिए एलपीएस का पता लगाने से झिल्ली-बाध्य पुटिकाओं की उपस्थिति को मान्य किया जा सकता है और एक ही तनाव33 से तैयारियों के बीच सापेक्ष पुटिका सामग्री का विश्लेषण करने के लिए एक मार्कर के रूप में काम किया जा सकता है। कम बनाम उच्च आणविक भार एलपीएस की सापेक्ष बहुतायत का निरीक्षण34,35 नमूनों के बीच पुटिका संरचना में परिवर्तन का संकेत दे सकता है।

Figure 1
चित्रा 1: साइनोबैक्टीरिया ईवी अलगाव और लक्षण वर्णन के लिए उपयोग की जाने वाली प्रयोगात्मक प्रक्रियाएं। बढ़ती संस्कृतियों (1) के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व और विकास माध्यम (2) से साइनोबैक्टीरिया बायोमास का अलगाव। पुटिकाओं वाले सेल-मुक्त नमूने केंद्रित होते हैं (3), और फिर ईवी को अलग और शुद्ध किया जाता है (4). आवेदन के आधार पर, पुटिका की तैयारी को संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (टीईएम), नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण (एनटीए), गतिशील प्रकाश प्रकीर्णन (डीएलएस), और लिपोपॉलीसेकेराइड (एलपीएस) प्रोफाइलिंग (5) के एक या संयोजन का उपयोग करके विशेषता दी जा सकती है। आरटी, कमरे का तापमान। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: साइनोबैक्टीरियम Synechocystis sp. PCC 6803 के लिए बाह्य कोशिकीय पुटिका अलगाव और लक्षण वर्णन के प्रतिनिधि परिणाम। (ए) 600 एमएल Synechocystis sp. PCC 6803 संस्कृति से केंद्रित सेल-मुक्त बाह्य कोशिकीय माध्यम के ultracentrifugation के बाद प्राप्त extracellular पुटिका गोली (EVs गोली) की तस्वीर 1.0-1.5 के एक OD730 के लिए उगाया. बाहरी झिल्ली में पाए जाने वाले कैरोटीनॉयड से व्युत्पन्न पुटिका गोली के विशिष्ट नारंगी रंग पर ध्यान दें। (B, C) संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (TEM) नकारात्मक रूप से दाग (बी) और Ultrathin वर्गों (सी) Synechocystis एसपी पीसीसी 6803 पुटिका नमूनों की तस्वीरें. स्केल बार: क्रमशः 200 एनएम और 50 एनएम। नमूनों को 80 केवी पर संचालित एक संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप पर कल्पना की गई थी। (डी) विशिष्ट गतिशील प्रकाश प्रकीर्णन (डीएलएस) प्लॉट पुटिका व्यास (एनएम में) के एक समारोह के रूप में पुटिका आयतन के वितरण को दर्शाता है। रंगीन रेखाएं एक ही नमूने के तीन तकनीकी प्रतिकृति मापों से डेटा इंगित करती हैं। (ई) प्रतिनिधि nanoparticle ट्रैकिंग विश्लेषण (NTA) Synechocystis extracellular पुटिका आकार वितरण (एनएम में) के डेटा। काली रेखा तीन तकनीकी प्रतिकृतियों के माध्य को इंगित करती है, और लाल रेखाएं माध्य की मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करती हैं। (एफ) लिपोपॉलीसेकेराइड्स (एलपीएस) प्रोफ़ाइल को 16% (डब्ल्यू / वी) एसडीएस-पॉलीएक्रिलामाइड जेल पर वैद्युतकणसंचलन द्वारा पुटिका की तैयारी को अलग करने और वाणिज्यिक एलपीएस स्टेनिंग किट के साथ धुंधला करने के बाद पता लगाया गया था। कम और उच्च आणविक-वजन वाले एलपीएस, क्रमशः किसी न किसी और चिकनी-एलपीएस रूपों के अनुरूप, पता लगाने योग्य हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक फ़ाइल 1: r की गणना करने के लिए समीकरण। घातीय विकास के दौरान दो बिंदुओं (आमतौर पर समय पाठ्यक्रम की शुरुआत और अंत) के बीच प्रति पीढ़ी प्रति कोशिका उत्पादित पुटिकाओं की संख्या इस समीकरण का उपयोग करके निर्धारित की जाती है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

Discussion

सामान्य विचार
प्रोटोकॉल (चित्रा 1) को इस बात पर प्रकाश डालने के लिए विकल्पों के एक सेट के रूप में प्रस्तुत किया गया है कि साइनोबैक्टीरियल एक्स्ट्रासेल्युलर पुटिकाओं के साथ काम करने के लिए कोई 'एक आकार-फिट-सभी' विधि नहीं है। इच्छुक शोधकर्ता इस प्रोटोकॉल के वर्गों का उपयोग कर सकते हैं जो उनके विशेष मॉडल जीव, प्रयोगात्मक प्रश्नों / लक्ष्यों और उपकरण उपलब्धता के लिए संगत और उपयुक्त हैं। सभी पुटिका अलगाव दृष्टिकोण में ट्रेड-ऑफ शामिल हैं और अपरिहार्य रूप से पूर्वाग्रह की कुछ डिग्री में परिणाम होगा। जबकि किसी को जब भी संभव हो इसे कम करने की कोशिश करनी चाहिए, सबसे महत्वपूर्ण विचार यह सुनिश्चित करना है कि उपयोग की जाने वाली विस्तृत पद्धति उचित MISEV (एक्स्ट्रासेल्युलर पुटिकाओं के अध्ययन के लिए न्यूनतम जानकारी) दिशानिर्देशों36 के अनुसार रिपोर्ट की गई है।

संस्कृति विकास
साइनोबैक्टीरिया संस्कृतियों को दुनिया भर में उपलब्ध कई संस्कृति संग्रहों में से एक से आसानी से प्राप्त किया जा सकता है। कुछ उदाहरण Roscoff संस्कृति संग्रह (स्टेशन Biologique de Roscoff, फ्रांस), पाश्चर संस्कृति संग्रह (संस्थान पाश्चर, पेरिस, फ्रांस), और समुद्री शैवाल और माइक्रोबायोटा के लिए Provasoli-Guillard राष्ट्रीय केंद्र (NCMA, मेन, संयुक्त राज्य अमेरिका) हैं। पसंद के साइनोबैक्टीरिया तनाव को उचित माध्यम और पर्यावरणीय स्थितियों में खेती की जानी चाहिए, जो विभिन्न उपभेदों के बीच काफी भिन्न होती है। साइनोबैक्टीरिया की खेती के लिए आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले मीडिया की एक सूची संस्कृति संग्रह वेबसाइटों या अन्य प्रकाशनों 37,38,39 पर पाई जा सकती है।

साइनोबैक्टीरिया एक्स्ट्रासेल्युलर पुटिकाओं के साथ काम करना कई विशिष्ट मॉडल प्रयोगशाला हेटरोट्रॉफ़्स के लिए रिपोर्ट किए गए तरीकों की तुलना में कुछ अद्वितीय चुनौतियां प्रस्तुत करता है। साइनोबैक्टीरिया संस्कृतियों में अन्य रोगाणुओं जैसे एस्चेरिचिया कोलाई14,16,40 में पाए जाने वाले लोगों की तुलना में कम परिमाण के आदेशों की पुटिका सांद्रता होती है। ये अंतर, संभवतः कम सेल घनत्व और / या पुटिका उत्पादन दरों से उत्पन्न होते हैं, इसका मतलब है कि अपेक्षाकृत बड़ी संस्कृतियों (~ 1-20 एल या अधिक) को थोक विश्लेषण के लिए पर्याप्त सामग्री उत्पन्न करने की आवश्यकता हो सकती है। इस प्रकार, शोधकर्ताओं को यह निर्धारित करने के लिए छोटे पैमाने पर संस्कृतियों से पुटिका की पैदावार का परीक्षण करने के लिए प्रोत्साहित किया जाता है कि उनके वांछित अंतिम लक्ष्यों को प्राप्त करने के लिए कितनी सामग्री आवश्यक होगी। यह स्थापित करने के महत्व को स्थापित करने के लिए कि क्या प्रयोग के लिए उपयोग किए जाने वाले मीडिया में एक पता लगाने योग्य कण पृष्ठभूमि है, किसी भी प्रयोग को शुरू करने से पहले भी जोर देने की आवश्यकता है, क्योंकि वह सामग्री संभावित रूप से पुटिका जनसंख्या परिमाणीकरण को भ्रमित कर सकती है, पुटिका एकाग्रता / आकार माप की संवेदनशीलता को कम कर सकती है, या अंतिम पुटिका तैयारी को दूषित कर सकती है।

क्षेत्र के लिए एक और चुनौती यह है कि सभी साइनोबैक्टीरिया शुद्ध संस्कृति में अच्छी तरह से, या बिल्कुल भी विकसित नहीं होते हैं। जब तक कि एक्सेनिक प्रदान नहीं किया जाता है, भौतिक पुटिका विशेषताओं, उत्पादन दरों, या सामग्री की व्याख्याएं आवश्यक रूप से समुदाय में किसी भी एक तनाव द्वारा उत्पादित पुटिकाओं के बारे में स्पष्ट निष्कर्ष नहीं निकाल सकती हैं। शोधकर्ताओं को यह भी सलाह दी जाती है कि अन्य प्रकार के कण क्या मौजूद हो सकते हैं और विशिष्ट नैनोपार्टिकल विश्लेषण उपकरणों द्वारा पुटिकाओं के साथ संभावित रूप से भ्रमित हो सकते हैं, जो आवश्यक रूप से विभिन्न कण प्रकारों के बीच भेदभाव नहीं कर सकते हैं। उदाहरण के लिए, यह सत्यापित करना आवश्यक हो सकता है कि उपयोग किए जा रहे तनाव में एक प्रोफेज का अभाव है, या तो जीनोम अनुक्रमण, प्रेरण assays, या अन्य साधनों के माध्यम से या अन्य प्रकार के कण पदार्थ जारी नहीं करता है। हमारे अनुभव में, अधिकांश साइनोबैक्टीरिया पुटिकाएं व्यास में <0.2 μm हैं, लेकिन जब एक नए तनाव या विकास की स्थिति को देखते हैं, तो किसी को यह पुष्टि करनी चाहिए कि क्या 0.45 μm रंध्र-आकार फिल्टर का उपयोग करने से शुद्ध कणों के आकार वितरण में बदलाव होता है।

संस्कृति की स्थिति के कई पहलू पुटिका उत्पादन और इसकी सामग्री41,42 को प्रभावित कर सकते हैं। इस प्रकार, संस्कृति विकास के लिए उपयोग की जाने वाली भौतिक और रासायनिक स्थितियों (प्रकाश विकिरण, तापमान और मीडिया संरचना सहित) को परिणामों की पुनरुत्पादकता सुनिश्चित करने के लिए संभव डिग्री तक प्रलेखित और नियंत्रित करने की आवश्यकता है। पुटिका सामग्री के किसी भी रासायनिक विश्लेषण को पृष्ठभूमि संरचना के लिए जिम्मेदार होना चाहिए, खासकर जब '-ओमिक्स' शैली उच्च-थ्रूपुट विश्लेषण किया जाता है। अपरिभाषित मीडिया का उपयोग करते समय यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण हो सकता है, जैसे कि प्राकृतिक समुद्री जल पृष्ठभूमि पर आधारित या खमीर निकालने या ट्रिपटोन के साथ पूरक। एक परिभाषित विकास माध्यम का उपयोग करना प्रयोगात्मक लक्ष्यों के आधार पर बेहतर हो सकता है।

शोधकर्ताओं को यह सुनिश्चित करने के लिए नियमित अंतराल पर संस्कृति विकास गतिशीलता की सावधानीपूर्वक निगरानी करने की आवश्यकता है कि वे जानते हैं कि विकास के चरण में एक दिए गए बैच संस्कृति कहां है और न केवल समय की एक मनमाने ढंग से राशि के बाद नमूने एकत्र करते हैं। पुटिका संरचना विकास चरणों में भिन्न हो सकती है, विशेष रूप से घातीय और स्थिर चरणों41,42 के बीच। उदाहरण के लिए, स्थिर चरण में नमूना पुटिकाओं का कम से कम कुछ अंश एक अलग सेलुलर तंत्र से उत्पन्न हो सकता है, जैसे कि सेल लाइसिस, जो घातीय विकास के दौरान नहीं होगा। हालांकि यह अभी भी महान जैविक रुचि का हो सकता है, नमूना जानना आवश्यक है। यदि एक साइनोबैक्टीरिया संस्कृति एक ऐसे समय में वांछित विकास चरण तक पहुंचती है जब नमूना एकाग्रता के लिए सीधे आगे बढ़ना संभव नहीं होता है, तो कोशिकाओं को <0.2 μm अंश से तुरंत अलग करना (सेंट्रीफ्यूजेशन और / या प्रत्यक्ष 0.2 μm निस्पंदन के साथ), और फिर सेल-मुक्त निस्पंदन को 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत करने की सिफारिश की जाती है। सामग्री को पुटिकाओं की एकाग्रता या आकार वितरण पर कोई ध्यान देने योग्य प्रभाव नहीं होने के साथ दिनों के लिए इस तरह से संग्रहीत किया जा सकता है।

पुटिका शोधन
महत्वपूर्ण मात्रा संस्कृतियों से पुटिकाओं को अलग करने की लगातार आवश्यकता साइनोबैक्टीरिया पुटिका अलगाव वर्कफ़्लो में महत्वपूर्ण है। सामग्री की बड़ी मात्रा के साथ काम करते समय, पुटिकाओं को डाउनस्ट्रीम पृथक्करण वर्कफ़्लो से पहले केंद्रित करने की आवश्यकता होगी। 100 केडीए की नाममात्र आणविक वजन सीमा के साथ कंसंट्रेटर (स्पर्शरेखा प्रवाह फिल्टर झिल्ली या केन्द्रापसारक कॉलम) को आम तौर पर सलाह दी जाती है, क्योंकि वे एकाग्रता समय को उचित रखते हुए कम आणविक वजन के साथ घुलनशील सामग्री से अलग होने की अनुमति देते हैं, लेकिन 30 केडीए फिल्टर भी अक्सर सफलता के साथ उपयोग किए जाते हैं। जबकि पुटिकाओं को शुद्ध करने के कई गैर-अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन-आधारित तरीके (उदाहरण के लिए, आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी, माइक्रोफ्लुइडिक-आधारित सिस्टम, आत्मीयता-कैप्चर तकनीक, और वर्षा-आधारित दृष्टिकोण) बाह्य कोशिकीय पुटिका क्षेत्र में लोकप्रिय हो रहे हैं, हमारे अनुभव में, इन दृष्टिकोणों के परिणामस्वरूप पैदावार में कमी आ सकती है और आमतौर पर आवश्यक संस्कृति वॉल्यूम के साथ असंगत होते हैं।

शोधकर्ताओं को आयोडिक्सनॉल पृष्ठभूमि की संरचना और पुटिका शुद्धिकरण के दौरान उपयोग किए जाने वाले धोने / पुनर्सस्पेंशन बफर की संरचना पर विचार करने की आवश्यकता है ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि वे वांछित डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के साथ संगत हैं। कई मामलों में, अंतिम पुटिका नमूने को विकास मीडिया या विकास माध्यम (जैसे, प्राकृतिक बनाम कृत्रिम समुद्री जल) के लिए संरचना में तुलनीय एक परिभाषित बफर में फिर से निलंबित किया जा सकता है। हालांकि, यह समुद्री साइनोबैक्टीरिया पुटिकाओं के साथ संभव नहीं हो सकता है, जिसके लिए विश्लेषण के लिए आगे प्रयोगात्मक हेरफेर की आवश्यकता होगी, क्योंकि समुद्री जल के स्तर के समान उच्च नमक सांद्रता कई एंजाइमेटिक प्रतिक्रियाओं को रोक सकती है। ऐसे मामलों में, मानक प्रयोगशाला बफर जैसे कि 0.2 μm फ़िल्टर किया गया, 1x PBS आमतौर पर समुद्री साइनोबैक्टीरिया पुटिकाओं की स्थिरता को बनाए रखने के लिए अच्छी तरह से काम करते हैं और डाउनस्ट्रीम प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं के साथ अधिक संगत हो सकते हैं।

घनत्व ढाल शुद्धिकरण को प्रयोगात्मक लक्ष्यों और संस्कृति संरचना के आधार पर वैकल्पिक माना जा सकता है, लेकिन अधिक सख्ती से शुद्ध और पुन: प्रस्तुत करने योग्य नमूना बनाने के लिए दृढ़ता से अनुशंसित है। ईवी आबादी विषम हैं और उत्साही घनत्व की एक श्रृंखला में पाई जा सकती हैं, जो आगे तनाव, विकास की स्थिति और अन्यकारकों 4,5,6 से भिन्न होती हैं। ऊपर सूचीबद्ध घनत्व आमतौर पर साइनोबैक्टीरियल संस्कृतियों और आयोडिक्सानोल में क्षेत्र के नमूनों से पुटिकाओं के लिए पाए जाने वाले लोगों का प्रतिनिधित्व करते हैं, लेकिन अन्य उपभेदों में परिणाम भिन्न हो सकते हैं। अन्य घनत्व ढाल सामग्री जैसे सुक्रोज और सीएससीएल का उपयोग पुटिकाओं के लिए किया जा सकता है, लेकिन वे इन पृष्ठभूमि में विभिन्न उत्साही घनत्वों में स्थानांतरित हो जाएंगे। विभिन्न ग्रेडिएंट मीडिया पृष्ठभूमि लिपिड-संलग्न वायरस43 की वसूली को पूर्वाग्रहित कर सकती है और संभावित रूप से विभिन्न उपभेदों से पुटिकाओं की वसूली को प्रभावित कर सकती है।

पुटिकाओं को पुटिका अलगाव के माध्यम से कई बिंदुओं पर खो दिया जा सकता है, और यहां वर्णित ढाल शुद्धिकरण प्रक्रिया, पैदावार को कम करने और डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए दिए गए अंतिम पुटिका उपज को प्राप्त करने के लिए आवश्यक प्रारंभिक सामग्री की मात्रा में वृद्धि। अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन के बाद पुटिका छर्रों के साथ काम करते समय विशेष देखभाल की जानी चाहिए। जबकि कुछ साइनोबैक्टीरिया पुटिकाओं में कैरोटीनॉयड या अन्य यौगिक हो सकते हैं जो पुटिका के नमूनों को रंजकता की कुछ मात्रा में उधार दे सकते हैं (चित्रा 2), तनाव या सामग्री की मात्रा के आधार पर, यह जरूरी नहीं है कि पुटिकाओं को सीधे पैलेट की कल्पना करने में सक्षम होने की उम्मीद हो। इस बात से अवगत रहें कि गोली को उपयोग किए जाने वाले सेंट्रीफ्यूज रोटर के प्रकार को कहां दिए जाने की उम्मीद है। जब संभव हो, शुद्ध पुटिका के नमूनों को इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा जांच करने का सुझाव दिया जाता है ताकि बरामद अंतिम सामग्री की संरचना को सत्यापित किया जा सके।

पुटिकाओं और उनकी सामग्री पर भंडारण की स्थिति का प्रभाव एक खुला सवाल बना हुआ है। हालांकि यह पाया गया है कि भंडारण साइनोबैक्टीरिया पुटिका आकार या एकाग्रता14 पर एक उल्लेखनीय प्रभाव नहीं पड़ता है, अलग-थलग पुटिका तैयारी की कार्यक्षमता समय44 के साथ बदल सकती है। जबकि फ्रीज / पिघलने वाले चक्रों से बचा जाना चाहिए जब भी संभव हो, समग्र पुटिका संख्याओं और आकारों पर ठंड के नमूनों का प्रभाव कम से कम प्रतीत होता है। किसी को पुटिका सामग्री की संरचना को प्रभावित करने के लिए फ्रीज-पिघलने वाले चक्रों की क्षमता के बारे में पता होना चाहिए, जैसे कि पुटिका से जुड़े न्यूक्लिक एसिड की लंबाई या प्रोटीन की स्थिरता।

पुटिकाओं से field samples
प्राकृतिक जलीय वातावरण से बाह्य कोशिकीय पुटिकाओं को अलग करने के लिए वर्तमान तरीके वैचारिक रूप से और परिचालन रूप से बड़ी मात्रा वाली संस्कृतियों के लिए यहां वर्णित लोगों के समान हैं। फिर भी, उन्हें सामग्री की अधिक मात्रा की आवश्यकता हो सकती है। इस तरह के क्षेत्र के नमूनों में विश्लेषण के लिए पर्याप्त सामग्री प्राप्त करने के लिए सैकड़ों से हजारों लीटर पानी एकत्र करना, निस्पंदन और एकाग्रता शामिल हो सकती है। उपयोग किए जा रहे नमूने की टर्बिडिटी के आधार पर, 0.2 μm फ़िल्टर से पहले एक या अधिक पूर्व-निस्पंदन चरणों को शामिल करने की आवश्यकता हो सकती है। उपयोग किए जाने वाले विशिष्ट टीएफएफ डिवाइस को उचित मात्रा में इस तरह की बड़ी मात्रा में काम करने के लिए उपयुक्त होना चाहिए (आदर्श रूप से घंटों के क्रम में) और नमूने पर अत्यधिक दबाव डाले बिना। व्यवहार में, इसमें अक्सर संस्कृति-आधारित नमूनों पर लागू होने की तुलना में बहुत अधिक कुल सतह क्षेत्र का उपयोग करना शामिल होता है, साथ ही साथ बढ़े हुए प्रवाह दरों को सुविधाजनक बनाने के लिए बड़े व्यास की टयूबिंग भी शामिल होती है। इस बढ़े हुए फ़िल्टर सतह क्षेत्र की संभावना छोटे टीएफएफ व्यवस्था और ध्यान की एक बड़ी अंतिम मात्रा की तुलना में कण हानि में मामूली वृद्धि होगी; हालांकि, इन चिंताओं को कुल प्रसंस्करण समय के विचारों के साथ संतुलित किया जाना चाहिए। एक विस्तारित महासागरीय क्रूज जैसी स्थितियों के लिए जहां नमूने कई दिनों के लिए एक प्रयोगशाला में वापस नहीं आएंगे, नमूनाकरण के बाद, हम क्षेत्र में प्रारंभिक 0.2 μm निस्पंदन और TFF चरणों को पूरा करने की सलाह देते हैं। केंद्रित सामग्री की इस छोटी मात्रा को तब बोर्ड पर 4 डिग्री सेल्सियस या -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है (उपलब्धता और डाउनस्ट्रीम विश्लेषणात्मक विचारों के आधार पर) जब तक कि इसे अंतिम प्रसंस्करण के लिए प्रयोगशाला में वापस नहीं किया जाता है।

अन्य छोटे कणों, दोनों कार्बनिक और अकार्बनिक से बाह्य कोशिकीय पुटिकाओं का अलगाव और अलगाव चुनौतीपूर्ण हो सकता है, और विभिन्न कणों को अलग करने के तरीके अभी तक सही नहीं हैं। उदाहरण के लिए, आयोडिक्सेनॉल घनत्व ग्रेडिएंट किसी दिए गए नमूने में मौजूद पुटिकाओं और वायरस के सभी वर्गों को आसानी से अलग नहीं कर सकते हैं। जैसा कि भ्रमित कणों के प्रकार, और उनके भौतिक गुण, नमूना साइटों के बीच भिन्न होंगे, वर्तमान में एक प्रोटोकॉल प्रदान करना असंभव है जो छोटे जलीय कणों के सभी वर्गों को मजबूत रूप से विभाजित करेगा। परीक्षण और त्रुटि आवश्यक हैं, और ग्रेडिएंट और अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन स्थितियों में उपयोग की जाने वाली आयोडिक्सानोल रेंज के साथ प्रयोग को अलगाव को अधिकतम करने के लिए आवश्यक होगा; छोटी मात्रा का एक संग्रह, अधिक बारीक रूप से हल घनत्व अंशों की भी आवश्यकता हो सकती है। संदर्भ के आधार पर, आयोडिक्सेनॉल के बजाय सीएससीएल ग्रेडिएंट का उपयोग करने से पर्यावरणीय कणोंको अलग करने में मदद मिल सकती है। फिर भी, आसमाटिक स्थितियों में परिवर्तन अंतिम बरामद उत्पादों में पूर्वाग्रहों को जन्म दे सकता है, जैसा कि ऊपर चर्चा की गई है।

पुटिका लक्षण वर्णन
नैनोपार्टिकल विश्लेषण उपकरण अभी तक माइक्रोबायोलॉजी प्रयोगशाला सेटिंग्स में नियमित रूप से उपलब्ध नहीं हैं, लेकिन तेजी से उपलब्ध हो रहे हैं। सभी तरीकों में पेशेवरों और विपक्ष हैं, और हम साइनोबैक्टीरिया पुटिका के काम के लिए अन्य सभी की तुलना में बेहतर होने के रूप में एक मंच का कोई विशिष्ट समर्थन नहीं करते हैं; वास्तव में, सभी के पास लागत, संकल्प, उपयोग में आसानी, पता लगाने की सीमा, विभिन्न विकास मीडिया / बफर पृष्ठभूमि के साथ संगतता, और डेटा पुनरुत्पादन से संबंधित विशेष व्यापार-बंद हैं। ऊपर वर्णित नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण पर आधारित उपकरणों के अलावा, नैनोफ्लो साइटोमेट्री, माइक्रोफ्लुइडिक प्रतिरोधक पल्स सेंसिंग, और ट्यूनेबल प्रतिरोधी पल्स सेंसिंग सहित अन्य दृष्टिकोणों को46,47 लागू किया जा सकता है। उपयोगकर्ताओं को अपने उपलब्ध इंस्ट्रूमेंटेशन के विवरण को जानने और यह सत्यापित करने के लिए सावधान रहना चाहिए कि यह उनके सिस्टम के साथ अच्छी तरह से काम करता है, क्योंकि समुद्री जल-आधारित मीडिया के साथ कुछ प्लेटफार्मों का उपयोग करते समय हमें कठिनाइयों का सामना करना पड़ा है। हम क्षेत्र को पुटिका आकार, सांद्रता और उत्पादन दरों के मात्रात्मक लक्षण वर्णन की ओर बढ़ने के लिए प्रोत्साहित करते हैं। प्रति एमएल आधार पर एक मौलिक कण पर पुटिका सांद्रता को मापने, और प्रोटीन सामग्री या अन्य मीट्रिक के संदर्भ में नहीं, अधिक मात्रात्मक ढांचे में पुटिकाओं के एकीकरण के लिए अनुमति देगा और उपभेदों और स्थितियों के बीच अंतर-तुलना को सक्षम करेगा। <100nm कणों के लिए एकाग्रता माप को कैलिब्रेट करने की क्षमता में सुधार करने के लिए आगे के प्रयासों की आवश्यकता है।

तथ्य यह है कि पुटिका उत्पादन दर माप सीधे 0.2 μm फ़िल्टर्ड संस्कृति supernatant से कण नुकसान को कम करने के लिए किया जाता है ऊपर वर्णित अन्य शुद्धिकरण चरणों के साथ जुड़ा होगा। हालांकि, इसका मतलब यह है कि दृष्टिकोण आवश्यक रूप से वास्तविक बाह्य कोशिकीय पुटिकाओं और संस्कृतियों में पाए जाने वाले अन्य छोटे कणों के बीच भेदभाव नहीं करता है। केवल विशिष्ट आकार सीमाओं (जैसे, 50-250 एनएम व्यास) के भीतर कणों की गिनती कुछ बाहरी लोगों को बाहर करने में मदद कर सकती है, लेकिन दृश्य पुष्टि है कि पैलेट <0.2 μm संस्कृति सामग्री झिल्ली-बाध्य पुटिकाओं (टीईएम या अन्य दृष्टिकोणों द्वारा) प्रतीत होती है, विशेष रूप से यह दावा करने में सक्षम होने के लिए आवश्यक है कि कोई पुटिका जैसे कणों के उत्पादन के विपरीत पुटिकाओं के उत्पादन को माप रहा है।

पुटिका लक्षण वर्णन में एक आवश्यक कारक यह सुनिश्चित करना है कि पुटिका के नमूने का विश्लेषण नैनोपार्टिकल विश्लेषण डिवाइस की उचित रैखिक संवेदनशीलता सीमा में किया जा रहा है। जब एक नमूना बहुत केंद्रित होता है, तो उस सामग्री को एक साफ बफर के साथ पतला करना और इसका फिर से विश्लेषण करना सीधा होता है। दूसरी ओर, कुछ साइनोबैक्टीरिया संस्कृतियों के अपेक्षाकृत कम सेल और / या पुटिका घनत्व कभी-कभी पुटिका तैयारी पैदा कर सकते हैं जो कुछ उपकरणों की पहचान सीमा से नीचे हैं। ऐसे मामलों में जहां यह थोक पुटिका शुद्धिकरण के साथ होता है, कोई भी बड़ी मात्रा वाली संस्कृतियों को बढ़ाने, एक छोटी मात्रा में अंतिम सामग्री को फिर से गोली मारने और फिर से निलंबित करने पर विचार कर सकता है, या मूल्यांकन कर सकता है कि क्या अलगाव प्रक्रिया में कोई कदम है जहां अत्यधिक नुकसान हो रहा है और इसे कम किया जा सकता है। पुटिका उत्पादन दरों को मापते समय, फिक्स जरूरी नहीं कि इतने सरल हों। यदि आवश्यक हो तो नमूनों को केंद्रित किया जा सकता है, लेकिन पहले व्यक्ति को यह देखना चाहिए कि क्या मीडिया में समायोजन के परिणामस्वरूप उच्च सेल घनत्व हो सकता है या क्या घातीय चरण के दौरान बाद के समय बिंदुओं से पर्याप्त रूप से केंद्रित नमूने प्राप्त किए जा सकते हैं जहां सांद्रता अधिक होगी।

सीमाओं
किसी भी प्रोटोकॉल के साथ, इन दृष्टिकोणों का उपयोग करके पुटिका अलगाव की स्पष्ट सीमाएं हैं। ये दृष्टिकोण उनकी गारंटी पर भरोसा नहीं करते हैं कि पुटिकाओं की पूरी तरह से शुद्ध तैयारी को अलग कर दिया जाएगा। दोनों संस्कृतियों और क्षेत्र के नमूनों में अन्य सामग्री हो सकती है, जो घनत्व ग्रेडिएंट में पुटिकाओं के समान प्रवास करती हैं। फिर भी, कम से कम, इन प्रकार के अतिरिक्त शुद्धिकरण के तरीके पुटिका विश्लेषण की कठोरता और पुनरुत्पादन सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक हैं। जबकि हम साइनोबैक्टीरिया के संदर्भ में पुटिका अलगाव दृष्टिकोण का वर्णन करते हैं, कई अन्य रोगाणुओं की संस्कृतियों में तुलनात्मक रूप से कम सांद्रता में पुटिकाएं भी होंगी, और यहां वर्णित प्रक्रियाएं आम तौर पर लागू होनी चाहिए। यह उम्मीद की जाती है कि ये तरीके एक स्थायी प्रोटोकॉल के रूप में नहीं बल्कि इसके बजाय विभिन्न रोगाणुओं से बाह्य कोशिकीय पुटिकाओं के साथ काम करने में भविष्य की प्रगति को बढ़ावा देने के लिए एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में काम करेंगे। संस्कृतियों और पर्यावरणीय नमूनों से छोटे कणों की विभिन्न श्रेणियों के भेदभाव और अलगाव में सुधार करने के लिए आकार बहिष्करण कॉलम या असममित क्षेत्र प्रवाह फ्रैक्शनेशन जैसे अन्य दृष्टिकोणों के साथ इन विधियों को विलय करने के लिए भविष्य के प्रयासों की आवश्यकता होती है। हमें यह भी उम्मीद है कि ये तकनीकें पुटिका आबादी, उनकी सामग्री और पर्यावरण में उनकी सटीक कार्यात्मक भूमिकाओं के भीतर विषमता की जांच करने की क्षमता में सुधार करने के लिए नैनोपार्टिकल लक्षण वर्णन प्रौद्योगिकियों में सुधार के साथ विकसित करना जारी रख सकती हैं।

Disclosures

लेखकों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

लेखकi3S वैज्ञानिक प्लेटफार्मों "Biointerfaces और नैनो टेक्नोलॉजी", और "Histology and Electron Microscopy", Bioimaging के राष्ट्रीय बुनियादी ढांचे पुर्तगाली प्लेटफ़ॉर्म (PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122) के एक सदस्य के समर्थन को स्वीकार करते हैं। हम टीईएम के लिए अल्ट्रा-थिन सेक्शन स्टेनिंग प्रोटोकॉल को अनुकूलित करने में मदद करने के लिए प्रोफेसर जे ए गोंजालेज-रेयेस (कॉर्डोबा विश्वविद्यालय, स्पेन) और डॉ सेसिलिया ड्यूरेस और डॉ एना रीटा पिंटो (पोर्टो विश्वविद्यालय, पुर्तगाल) को नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण के लिए धन्यवाद देते हैं।

इस काम को यूएस नेशनल साइंस फाउंडेशन (OCE-2049004 से SJB तक) द्वारा वित्त पोषित किया गया था, Fundo Europeu de De De Dessenvolvimento Regional (FEDER) द्वारा Compete 2020 Operacional Programme for Competitiveness and Internationalization (POCI), पुर्तगाल, 2020 के माध्यम से, और Fundação para a Ciência e a Tecnologia/Ministério da Ciéncia, Tecnologia e Ensino-05 के ढांचे में Tecnologia/Ministério da Ciéncia, Tecnologia e Ensino-01 के ढांचे में 01-05-010000 के ढांचे में। Fundação पैरा एक Ciência e एक Tecnologia भी पीएचडी फैलोशिप SFRH / BD / 130478 / 2017 (SL) के लिए बहुत स्वीकार किया जाता है, और FCT अन्वेषक अनुदान IF / 00256 / 2015 (पीओ)। M.C.M.-M. क्षितिज 2020 फ्रेमवर्क प्रोग्राम (H2020-MSCA-IF-2018-RI-844891) के भीतर एक मैरी Skloodowska-Curie व्यक्तिगत फैलोशिप (Reintegration पैनल) द्वारा समर्थित था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1x Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 Home-made buffer --- Standard wash/storage buffer which can be used with vesicles; can be made in lab or purchased commercially
2% Uranyl acetate solution Electron Microscopy Sciences 22400-2 Negative staining - TEM
4x Laemmli Sample Buffer Bio-Rad 161-0747 Denaturation of vesicle sample prior to proteolysis, required for lipopolysaccharides (LPS) staining
Amicon Ultra Centrifugal Filters (100 kDa) Merck UFC9100XX Alternative option for centrifugal ultrafiltration
BG11 medium Home-made medium --- Medium for cultivation of Synechocystis sp. PCC 6803
Carbon Support Film 200 Mesh, copper. CF200-Cu Electron Microscopy Sciences 71150 Transmission electron microscopy (TEM) grid
easiGlow Glow Discharge Cleaning System Ted Pella 91000 Commercial TEM grid glow discharger
EMbed 812 epoxy resin Electron Microscopy Sciences 14120 Ultra-thin sections - TEM
Filter holder for vacuum system Thermo Fisher Scientific 300-4000 Reusable units with filter membrane support plates
Glutaraldehyde  Grade I Sigma-Aldrich G5882-10X1ml Ultra-thin sections - TEM
HEPES [N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid) sodium salt] Sigma-Aldrich H7006 Buffering agent for cyanobacterial growth media
Lead Citrate, Trihydrate Electron Microscopy Sciences 17800 Stain for use in electron microscopy
Macrosep Advance Centrifugal Devices with Omega Membrane 100K Pall MAP100C36 For centrifugal ultrafiltration of small volume samples
Millipore Pellicon 3 TFF Module EMD Millipore XX42P0060 or XX42P0080 Alternative TFF option for concentrating large volume samples
Milli-Q Reference Water Purification System Merck Z00QSV0WW Water purification system for obtaining type I ultrapure grade water
NanoSight Malvern Panalytical LM14 or NS300 Nanoparticle tracking analysis
Optima L80 XP Ultracentrifuge Beckman Coulter L80 XP Ultracentrifuge (or similar model)
OptiPrep / Iodixanol Sigma-Aldrich D1556 Density gradient media
Osmium Tetroxide Reagent Plus Sigma-Aldrich 201030 Ultra-thin sections - TEM
Pall Centramate PE TFF holder Pall Corporation FS002K10 TFF module good for concentrating 10s-100s of L of sample; requires additional 30 or 100 kDa filter modules to scale with your estimated volumes
Peristaltic pump Masterflex L/S Cole-Parmer 07559-07 Pump for driving large-scale TFF modules
Piston Gradient Fractionator Biocomp Instruments 152-001 Automated density gradient fractionation
Polycarbonate tubes for the 70 Ti rotor Beckman Coulter 355618 Reusable ultracentrifuge polycarbonate aluminum tubes with cap assembly
Pro99 medium Home-made medium --- Medium for cultivation of Prochlorococcus
Pro-Q Emerald LPS Gel Stain Kit Thermo Fisher Scientific P20495 LPS staining
SN medium Home-made medium --- Medium for cultivation of cyanobacterial marine strains such as Synechococcus
Sodium cacodylate trihydrate Sigma-Aldrich C0250-100G Buffering agent in the preparation of vesicles samples for TEM
SW32Ti swinging bucket rotor Beckman Coulter 369650 Ultracentrifuge rotor, holds 6x ~40 mL tubes; good for pelleting of bulk material
SW60Ti swinging bucket rotor Beckman Coulter 335650 Ultracentrifuge rotor, holds 6x ~4.5 mL tubes; good for gradient purifications and final vesicle washes
Syringe 1mL Luer BD Plastipak 303172 For vesicle isolation and loading samples into nanparticle tracking analysis (NTA) equipment
Syringe filter 0.2 µm Pall Corporation 4602 For vesicle isolation from cultures
TAPS [N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]-3-aminopropanesulfonic acid] Sigma-Aldrich T5130 Buffering agent for cyanobacterial growth media
Transmission electron microscope JEOL JEM-1400 Or similar microscope
Type 70 Ti Fixed-Angle Titanium Rotor Beckman Coulter 337922 Ultracentrifuge rotor, holds 8x ~39 mL tubes; good for pelleting of bulk material
Type XIV protease from Streptomyces griseus Sigma-Aldrich P5147 Enzyme for proteolysis of EVs proteins, required for LPS staining
UltraClear tubes for the SW32Ti rotor Beckman Coulter 344058 Single use ultracentrifuge tubes
UltraClear tubes for the SW60Ti rotor Beckman Coulter 344062 Single use ultracentrifuge tubes
Ultramicrotome PowerTome XL, PT-PC RMC Products,  Boeckeler Instruments 75501 Microtome for ultra-thin sections - TEM
Universal 320 R centrifuge Hettich Z654736 This or any similar general-purpose benchtop/floor standing centrifuge can be used for pelleting cells
Vacuum apparatus KNF Neuberger N026.3 AT.18 Or any similar vacuum pump and trap
Vivaflow 200 100,000 MWCO PES Sartorius VF20P4 TFF module, good for 2-3L. You can connect different modules for higher volume (figure 1).
Whatman Polycap TC Capsule filter (0.2/0.2µm) Cytiva 6717-9502 Capsule filter for filtering large volumes of liquid
Zetasizer Malvern Panalytical Zetasizer Nano ZS Dynamic light scattering (DLS) instrument

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जीव विज्ञान अंक 180
सायनोबैक्टीरिया एक्स्ट्रासेल्युलर वेसिकल्स का अलगाव और लक्षण वर्णन
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Biller, S. J.,… More

Biller, S. J., Muñoz-Marín, M. d. C., Lima, S., Matinha-Cardoso, J., Tamagnini, P., Oliveira, P. Isolation and Characterization of Cyanobacterial Extracellular Vesicles. J. Vis. Exp. (180), e63481, doi:10.3791/63481 (2022).

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