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Biology

Aislamiento y caracterización de vesículas extracelulares cianobacterianas

Published: February 3, 2022 doi: 10.3791/63481
Automatic Translation
*1, *2, 3,4,5, 3,4, 3,4,6, 3,4,6
1Department of Biological Sciences, Wellesley College, 2Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Campus de Excelencia Internacional, Agroalimentario, Universidad de Córdoba, 3i3S - Instituto de Investigação e Inovação em Saúde, Universidade do Porto, 4IBMC - Instituto de Biologia Molecular e Celular, Universidade do Porto, 5MCbiology Doctoral Program, ICBAS - Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar, Universidade do Porto, 6Departamento de Biologia, Faculdade de Ciências, Universidade do Porto
* These authors contributed equally

Summary

El presente protocolo proporciona descripciones detalladas para el aislamiento, la concentración y la caracterización de vesículas extracelulares de cultivos de cianobacterias. También se discuten los enfoques para purificar vesículas de cultivos a diferentes escalas, las compensaciones entre metodologías y las consideraciones para trabajar con muestras de campo.

Abstract

Las cianobacterias son un grupo diverso de bacterias fotosintéticas y gramnegativas que desempeñan un papel crítico en los ecosistemas globales y sirven como modelos biotecnológicos esenciales. Trabajos recientes han demostrado que tanto las cianobacterias marinas como las de agua dulce producen vesículas extracelulares, pequeñas estructuras unidas a la membrana liberadas de la superficie externa de los microbios. Si bien las vesículas probablemente contribuyen a diversos procesos biológicos, sus funciones funcionales específicas en la biología de las cianobacterias siguen siendo en gran parte desconocidas. Para fomentar y avanzar en la investigación en esta área, se presenta un protocolo detallado para aislar, concentrar y purificar las vesículas extracelulares de cianobacterias. El trabajo actual discute metodologías que han aislado con éxito vesículas de grandes cultivos de Prochlorococcus, Synechococcus y Synechocystis. Se presentan métodos para cuantificar y caracterizar muestras de vesículas de estas cepas. También se describen enfoques para aislar vesículas de muestras de campo acuático. Finalmente, también se discuten los desafíos típicos encontrados con la purificación de vesículas de cianobacterias, las consideraciones metodológicas para diferentes aplicaciones posteriores y las compensaciones entre los enfoques.

Introduction

Las vesículas extracelulares (EV) son estructuras esféricas, que oscilan entre ~ 20-400 nm de diámetro, liberadas por prácticamente todos los organismos en su entorno circundante 1,2,3. Las vesículas están delimitadas por una bicapa lipídica y no pueden replicarse a sí mismas. En las bacterias Gram-negativas, se cree que estas estructuras surgen principalmente por "sangrado" de pequeñas porciones de la membrana externa. Aún así, otros procesos, incluido el movimiento flagelar, la lisis celular y la secreción de material de membrana interna y externa, también pueden producir vesículas 4,5. Los EV pueden contener varias biomoléculas, incluyendo lípidos, proteínas solubles y de membrana, ácidos nucleicos y metabolitos, y pueden transportar este material entre las células 4,5,6. Dadas estas características, los EV se están estudiando para comprender sus posibles funciones en una amplia gama de procesos biológicos, incluida la comunicación celular, la formación de biopelículas, la transferencia horizontal de genes, la dinámica huésped-fago y el intercambio de nutrientes 4,6.

Las cianobacterias son un grupo grande y diverso de bacterias Gram-negativas, incluyendo organismos unicelulares y filamentosos. Son de interés desde muchas perspectivas, incluida la comprensión de su fisiología y diversidad 7,8, las funciones críticas de los ecosistemas a las que sirven 9,10 y su utilidad para la biotecnología11,12. Las cianobacterias se encuentran en una amplia variedad de hábitats, ya sea como organismos de vida libre en ambientes marinos, de agua dulce y terrestres, o en asociaciones simbióticas con musgos, helechos, plantas o en líquenes y esponjas13. Sirven como productores primarios cruciales en los ecosistemas acuáticos, produciendo oxígeno y carbono orgánico a través de la fotosíntesisoxigénica 9,10, y algunos son capaces de fijar nitrógeno atmosférico también7. Las cianobacterias marinas y de agua dulce, incluyendo Prochlorococcus, Synechococcus y Synechocystis, producen EV en condiciones de laboratorio 14,15,16, y las vesículas de cianobacterias también se pueden encontrar en ambientes naturales14,17. Las funciones biológicas y ecológicas de las vesículas de cianobacterias son desconocidas, pero es probable que la investigación adicional en esta área proporcione nuevos conocimientos sobre la fisiología de las cianobacterias, la diferenciación, las estrategias de comunicación, la evolución y las interacciones tróficas. Además, la capacidad de los vehículos eléctricos cianobacterianos para transportar diversas categorías de biomoléculas puede tener aplicaciones comerciales18,19.

El presente protocolo describe métodos para aislar y caracterizar vesículas de cultivos de cianobacterias y muestras de campo para permitir y fomentar un examen más amplio de la biología de las vesículas extracelulares de cianobacterias. Si bien el flujo de trabajo descrito aquí es análogo a los protocolos para aislar y caracterizar los EV de otras bacterias, los cultivos de cianobacterias y las muestras de campo generalmente contienen concentraciones de células y vesículas más bajas que las que se observan comúnmente con los sistemas modelos patógenos o asociados al huésped 20,21,22. Por lo tanto, los estudios de EV cianobacterianos requieren consideraciones y optimizaciones especiales para el cultivo y el aislamiento de vesículas, que varían aún más entre cepas y fondos de medios. Como ningún protocolo funcionará igual de bien para todas las cepas, condiciones de crecimiento y aplicaciones posteriores, proporcionamos múltiples opciones y discutimos las compensaciones involucradas para que los investigadores puedan determinar los enfoques más apropiados para abordar sus preguntas experimentales.

Protocol

Las cepas de cianobacterias se obtienen de varias colecciones de cultivos (ver Discusión para más detalles).

1. Cultivo de cianobacterias

  1. Cultive cianobacterias marinas Prochlorococcus y Synechococcus siguiendo los pasos a continuación.
    1. Cultivar cepas de Prochlorococcus y Synechococcus en matraces de policarbonato utilizando un medio apropiado como Pro99 o SN (ver Tabla de Materiales). Para obtener más información, consulte las referencias 23,24 publicadas anteriormente.
    2. Aclimatar los cultivos cultivándolos a través de dos o tres transferencias (diluciones 1:20 de cultivo en medios frescos para cada pasaje) bajo las condiciones de temperatura e irradiancia deseadas requeridas para el experimento.
      NOTA: Las condiciones típicas de crecimiento23,25 incluyen temperaturas entre 15-30 °C a irradiancia entre 8-150 fotones μmol m-2 s-1, pero las tolerancias de las cepas individuales y el óptimo varían ampliamente26 y deben establecerse en función de la orientación de las instrucciones o literatura de recolección de cultivos relevantes. Monitoree la tasa de crecimiento utilizando fluorescencia de cultivo o citometría de flujo cuenta23, y asegúrese de que los cultivos crezcan a una tasa exponencial de estado estacionario constante antes de comenzar el experimento.
    3. Llevar a cabo un conjunto de transferencias graduales sucesivas de volúmenes más pequeños a mayores una vez que las células alcanzan la fase exponencial tardía (por ejemplo, 20 ml < 250 ml < 2 L < 10 L < 20 L).
      NOTA: Los cultivos de gran volumen no se pueden inocular directamente a partir de pequeñas cantidades de cultivo inicial. Tenga en cuenta que los cultivos más grandes pueden requerir la adición de tampones (como 1 mM HEPES, pH 7.5 o 3.75 mM TAPS, pH 8), junto con bicarbonato de sodio suplementario o burbujeo con aire estéril24.
  2. Cultivar cianobacterias de agua dulce Synechocystis sp. PCC 6803.
    1. Preparar un cultivo de Synechocystis sp. PCC 6803 para ser utilizado como inóculo cultivándolo con aireación (aire burbujeante a 1 L/min), a 30 °C, bajo una luz de 16 h (recuento de fotones de 50 μmol m-2 s-1) / régimen oscuro de 8 h, hasta una densidad óptica a 730 nm (OD730) de 1,0 (fase exponencial) en medio BG1127.
    2. Inocular 30 mL de este cultivo Synechocystis sp. PCC 6803 en 570 mL de medio BG11 a un OD730 de 0,05 en botellas de lavado de gas de vidrio de 1 L.
    3. Permita que las células crezcan con aireación, a 30 °C, bajo una luz de 16 h (recuento de fotones de 50 μmol m-2 s-1) / régimen oscuro de 8 h, hasta un OD730 final de 1.0-1.5.

2. Separación de la biomasa cianobacteriana de la fracción de partícula pequeña (vesícula)

NOTA: En primer lugar, se recomienda separar las células del sobrenadante mediante la peletización centrífuga de las células. Sin embargo, cuando los volúmenes de cultivo son demasiado grandes para que esto sea factible, es posible omitir la centrifugación y proceder directamente a filtrar cultivos enteros utilizando la filtración de cápsulas (paso 2.4).

  1. Realice la centrifugación para separar las celdas (mejor para volúmenes de hasta ~ 4 L, dependiendo de la capacidad de la centrífuga disponible).
    1. Lave y limpie a fondo las botellas de la centrífuga con agua de grado ultrapuro Tipo I (consulte la Tabla de materiales), asegurándose de que no quede jabón residual u otro material.
    2. Cargue muestras de cultivo en un número adecuado de botellas de centrífuga y equilibre.
    3. Cultivos de centrifugado para >10.000 x g a 4 °C durante 10 min. Si el sobrenadante permanece visiblemente turbio, aumente las condiciones de centrifugación a 20 min a la velocidad máxima y vuelva a intentarlo.
    4. Decantar cuidadosamente o sobrenadante de pipeta en un recipiente limpio y proceder a una de las siguientes opciones de filtración mencionadas en los pasos 2.2-2.4.
  2. Opción 1: realizar la filtración de jeringas utilizando filtros de 0,2 μm (para volúmenes de muestra de hasta ~50 ml).
    1. Llene una jeringa estéril de 50 ml con un medio de cultivo en gran parte libre de células y filtre a través de un filtro de polietersulfona (PES) de 0,2 (o 0,45) μm (consulte la Tabla de materiales). Recoja el filtrado en un recipiente limpio y esterilizado.
    2. Repita este paso hasta que el filtro esté obstruido (por ejemplo, se vuelve difícil empujar con la jeringa). Reemplace con un filtro nuevo y continúe hasta que la muestra se filtre a fondo.
  3. Opción 2: realizar una filtración al vacío de 0,2 μm (hasta ~4 L).
    1. Lave y limpie a fondo el aparato de vacío con agua de grado ultrapuro Tipo I, conectándolo a una trampa y bomba de vacío (consulte la Tabla de materiales).
    2. Inserte un filtro de 0,2 μm de un diámetro apropiado y sujete el aparato de vacío.
    3. Agregue una pequeña cantidad de muestra de cultivo, asegurando que la presión de vacío permanezca <10 psi.
    4. Continúe filtrando la referencia cultural en pequeños incrementos hasta que se complete. Si la velocidad de filtración disminuye significativamente, detenga el vacío y reemplace el filtro.
    5. Recoger la fracción de <0,2 μm que contiene vesículas en un recipiente limpio.
  4. Opción 3: realizar una filtración de cápsula de 0,2 μm (para volúmenes de muestra > ~ 4 L)
    1. Limpie los tubos flexibles de tamaño adecuado y el recipiente de recolección lavando con agua y detergente suave. Enjuague el material con agua destilada y desionizada.
      NOTA: Antes de la utilización, el material debe enjuagarse con agua de grado ultrapuro Tipo I.
    2. Coloque el cultivo a filtrar en un lugar seguro y elevado con el recipiente de recolección final debajo. Conecte un puerto de salida de filtro de cápsula de 0,2 μm (consulte la Tabla de materiales) a una pieza de tubo y colóquelo en un recipiente de recolección.
    3. Coloque otro tubo en la muestra, comience un sifón de gravedad tirando de un poco de muestra en el tubo con una jeringa y conecte el tubo al filtro de la cápsula. Use la ventilación para liberar el exceso de aire y llene la cámara con sobrenadante.
    4. Deje que el material se mueva a través de la cápsula hasta que la muestra se filtre a fondo. Si el caudal se vuelve demasiado lento (< ~ 1/10 del caudal inicial, o saliendo hacia abajo en lugar de una corriente que fluye continuamente), espere o aplique una fuerza suave con una bomba peristáltica hasta que aumente la contrapresión. Alternativamente, restaure parcialmente los caudales desconectando temporalmente el filtro, retrolavando la biomasa acumulada del lado de entrada con agua ultralimpia hasta que el material ya no esté visiblemente turbio, y luego reinicie el proceso de filtración.

3. Concentración de la muestra de vesícula

  1. Opción 1: realizar ultrafiltración centrífuga para concentrar un volumen pequeño (<500 ml) de muestras.
    1. Enjuague los concentradores centrífugos de ultrafiltración de 15-20 ml de su elección con agua de grado ultrapuro Tipo I.
    2. Cargue los concentradores en la centrífuga y gire a 4.400 x g a 4 °C. Descarta la ejecución y repite este paso al menos dos veces más.
    3. Cargue la muestra de sobrenadante en concentradores enjuagados con agua y gire en las mismas condiciones. Dependiendo de los objetivos experimentales, el filtrado de la muestra se puede desechar o recolectar para una mayor concentración (con concentradores con un límite de peso molecular nominal de 3 kDa) y análisis.
    4. Repita este paso hasta que la muestra se concentre en un volumen final de ~15-30 ml.
  2. Opción 2: realizar filtración de flujo tangencial (TFF) para concentrar un gran volumen de muestra (>500 ml).
    1. Configure el aparato TFF de acuerdo con las directrices del fabricante (consulte la Tabla de materiales). Conecte una bomba peristáltica a la línea de admisión y coloque abrazaderas ajustables en la línea de retención. Desinfecte el TFF según lo recomendado por el fabricante y luego enjuague el dispositivo con 1 L de tipo I: agua de grado ultrapuro.
      NOTA: Las líneas de admisión y retención deben colocarse en un depósito de muestra limpio (botella de vidrio). Las líneas de filtrado deben dirigirse a un recipiente o sumidero de desechos.
    2. Añadir < filtrado de 0,2 μm en el depósito de muestras. Aumente lentamente la velocidad de la bomba y los niveles de contrapresión en la línea de retención para aumentar la salida de las líneas de filtrado.
    3. Continúe ejecutando el TFF, rellenando el reservorio con sobrenadante de cultivo a medida que se retira el material. Evite permitir que la línea de admisión salga de la muestra durante el procesamiento para evitar la introducción de burbujas de aire. Asegúrese de que la presión de alimentación no exceda ~ 10 psi y que el retentato fluya fuera del TFF a un ritmo constante de regreso al depósito.
    4. Deje de concentrar la muestra una vez que el volumen en el depósito alcance la cantidad más baja posible necesaria para mantener el flujo en la línea de admisión sin introducir burbujas de aire.
    5. Cierre la línea de salida con una abrazadera. Retire la contrapresión en la línea de retención y recircule el sobrenadante concentrado a través del filtro durante ~ 10 minutos, reduciendo la tasa de recirculación a 20-40 ml / min para maximizar la recuperación.
    6. Mueva la línea de retención a un recipiente limpio, retire la línea de admisión de la muestra y recoja el material concentrado. Recupere cualquier material restante en el depósito de muestras utilizando una pipeta.
    7. Filtre el sobrenadante concentrado a través de un filtro de jeringa de 0,2 μm (paso 2.2) para asegurarse de que no queden células.
      NOTA: El paso 3.2.7 es opcional.
    8. Si es necesario, guarde el concentrado final a 4 °C durante ~ 3 semanas antes de pasar a la purificación de vesículas (paso 4).

4. Aislamiento y purificación de vesículas

  1. Pellet directamente por ultracentrifugación siguiendo los pasos a continuación.
    1. Coloque la muestra de cultivo concentrada de <0,2 μm en un tubo de ultracentrífuga limpio. Agregue medios limpios o tampón según sea necesario para asegurarse de que el tubo esté completamente lleno.
      NOTA: Si la muestra de cultivo final es demasiado grande para caber en un tubo, peletee el material en varios tubos para combinarlo antes de los pasos de lavado o pellet en serie en el mismo tubo.
    2. Si es necesario, cree un equilibrio y gire a ~ 100,000 x g durante 3 h a 4 ° C.
    3. Retire con cuidado el sobrenadante con una pipeta. Si bien los gránulos de vesículas cianobacterianas pueden mostrar cierta coloración, con frecuencia son invisibles.
    4. Lave el material granulado agregando medios de cultivo frescos o tampón de lavado como 1 solución salina tamponada con fosfato (PBS) (consulte Discusión) al tubo de la ultracentrífuga, mezcle mediante pipeteo suave y vuelva a girar como en el paso 4.1.2. Repita el proceso de lavado por segunda vez.
    5. Resuspender el pellet final en cultivo fresco mediante el pipeteo repetido pero suave hacia arriba y hacia abajo alrededor de la parte inferior del tubo con una pipeta de 1 ml. Traslado a un recipiente limpio.
  2. Realizar ultracentrifugación de gradiente de densidad.
    1. Prepare las existencias de iodixanol (consulte la Tabla de materiales) haciendo una versión concentrada 4x del fondo tampón deseado para la muestra (consulte Discusión).
    2. Mezcle una parte del tampón 4x con tres partes de iodixanol al 60% para hacer una solución de iodixanol al 45%.
    3. Diluya 45% de iodixanol con volúmenes de 1x tampón para crear existencias de medios degradados al 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15% y 10% de concentraciones finales de iodixanol.
      NOTA: La cantidad total necesaria variará con la capacidad del rotor/tubos de la ultracentrífuga.
    4. Configure un gradiente de densidad de ultracentrífuga superponiendo cuidadosamente cantidades iguales de 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10% y 0% de ioxidinol en un tubo de ultracentrífuga de modo que se utilice todo el volumen del tubo.
      NOTA: La muestra de vesícula extracelular a purificar debe colocarse en la parte superior del gradiente como parte de la capa de iodixanol al 0%. Si el volumen final de la muestra de vesícula excede el tamaño de la capa del 0%, mezcle cualquier muestra de vesícula en exceso con suficiente iodixanol y / o tampón al 45% para generar el volumen requerido de las existencias de optiprep de concentración del 10% o más, y utilícelas en la ubicación correspondiente en el gradiente.
    5. Gire el gradiente a ~100.000 x g a 4 °C durante 6 h.
    6. Recolecte fracciones (típicamente 0.5 mL cada una para un gradiente de ~4.5 mL) mediante un pipeteo cuidadoso o usando un colector de fracciones (consulte la Tabla de Materiales).
    7. Determine la densidad de cada fracción (en g/mL) utilizando una balanza analítica y una pipeta calibrada para medir el peso de un volumen conocido de muestra. Retire la muestra del tubo, determine el peso y devuelva la muestra directamente.
    8. Diluya las fracciones individuales en un nuevo tubo de ultracentrífuga con tampón limpio y lave el material como se menciona en los pasos 4.1.2-4.1.4. Alternativamente, use columnas de diálisis o ultrafiltración para recuperar partículas.
      NOTA: Las vesículas extracelulares cianobacterianas generalmente migran a densidades flotantes de ~ 1.14-1.19 g / ml en iodixanol.
  3. Guarde las vesículas a 4 °C si se van a utilizar en un plazo de 1 a 3 semanas. Congelar las vesículas a -20 °C o -80 °C si no se utilizan durante más tiempo que ese período.

5. Caracterización de las vesículas aisladas

  1. Realizar microscopía electrónica de transmisión de tinción negativa (ver Tabla de Materiales) (TEM; tamaño de partícula, estructura, pureza).
    1. Para mejorar la calidad de la imagen, descargue con brillo la superficie de una rejilla TEM recubierta anteriormente utilizando un sistema de descarga de resplandor de acuerdo con las pautas del fabricante (consulte la Tabla de materiales).
    2. Aplique cuidadosamente ~ 5 μL de la muestra de vesícula y deje reposar durante 5 min.
      NOTA: Las muestras con concentraciones de vesículas >109 mL-1 generalmente darán los mejores resultados; más muestras diluidas tendrán pocas vesículas por imagen.
    3. Retire la muestra tocando el borde de una rejilla con un trozo de papel de filtro limpio.
    4. Pipetee una gota de 20-50 μL de acetato de uranilo al 2% (ver Tabla de materiales) sobre una superficie plana cubierta por una película de plástico, y coloque la rejilla flotando sobre ella durante 2 min.
    5. Retire el acetato de uranilo con papel de filtro y flote brevemente sobre una gota de agua ultrapura para lavar. Repita el lavado con agua por segunda vez.
      NOTA: La cuadrícula seca final está lista para su visualización después del paso 5.1.5.
  2. Realice tinción de sección ultrafina para TEM (tamaño de partícula, estructura interna).
    1. Resuspender el pellet del paso 4.1.5 con 1 ml de glutaraldehído al 2,5% en tampón de cacodilato de sodio 0,1 M (pH 7) (ver Tabla de materiales) y fijar la muestra durante 2 h a 4 °C.
    2. Girar a ~100.000 x g durante 1 h a 4 °C.
    3. Lave el pellet cuidadosamente con un tampón de cacodilato de sodio de 0,1 M (pH 7) y luego gire a ~ 100,000 x g durante 1 h a 4 ° C.
    4. Fije el pellet con 1 ml de tetróxido de osmio al 1% (consulte la Tabla de materiales) (preparado en tampón de cacodilato de sodio de 0,1 M) durante 1 h, y luego lave como en el paso 5.2.3.
    5. Deshidratar la muestra con 1 mL de una serie ascendente de etanol (50%, 70%, 90% y dos veces en etanol absoluto) en pasos de 10 min cada uno a 4 °C.
    6. Añadir 250 μL de resina epoxi (ver Tabla de Materiales) mezclada con etanol absoluto (1:1) al pellet e incubar durante la noche a 4 °C.
    7. Transfiera el pellet a 500 μL de resina pura durante 24 h. A continuación, incubar la resina a 65 °C durante 48 h.
      NOTA: La resina ya está lista para ser seccionada por ultramicrotomo, siguiendo las instrucciones del fabricante (ver Tabla de Materiales).
    8. Manche las rejillas que contienen secciones con acetato de uranilo al 2% (en etanol al 50%) durante 5 min. Lave los toboganes suavemente bajo agua desionizada durante 10-15 s cada uno. Coloque una gota de citrato de plomo (ver Tabla de materiales) y manche durante otros 5 minutos.
    9. Lavar como antes, quitar el agua secando la rejilla en un papel de filtro y secar al aire las rejillas. Visualización por TEM según las directrices del fabricante (ver Tabla de Materiales).
  3. Realizar análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA) (tamaño de partícula, concentración).
    1. Con papel de lente, limpie cuidadosamente cualquier polvo o material visible del plano óptico. Compruebe si todas las juntas tóricas y otros sellos están limpios e intactos. Encienda el instrumento y arranque el software.
    2. Con una jeringa limpia, llene la cámara con agua ultrapura. Asegúrese de que no haya burbujas de aire presentes.
    3. Haga clic en Iniciar cámara y visualice la región óptima de la cámara sobre la 'huella digital'. Ajuste la etapa del microscopio horizontal o verticalmente según sea necesario para que la intensidad de la señal sea uniforme en toda la región fotografiada. Mueva la región de imagen horizontalmente en relación con la huella digital (a la derecha, hacia la línea vertical), encontrando una región cercana con una señal de fondo baja.
    4. Deslice los controles deslizantes Ganancia de pantalla y Nivel de cámara al máximo y, a continuación, disminuya al nivel más bajo para ver las partículas más tenues.
      NOTA: La configuración típica para las vesículas de cianobacterias utiliza una ganancia de pantalla de 7 y un nivel de cámara entre 10-12.
    5. Ajuste el enfoque según sea necesario para garantizar que las partículas sean aproximadamente igualmente visibles en todo el campo de visión. Continúe empujando agua ultra limpia a través de la cámara hasta que haya confirmado visualmente que la cámara está limpia.
    6. Retire el agua residual de la cámara con una jeringa diferente.
    7. Examine una muestra del medio/tampón en el que se encuentra su muestra para determinar la concentración de partículas de fondo llenando la cámara con medio/tampón con una jeringa limpia de 1 ml.
    8. Seleccione Medición estándar en el cuadro desplegable SOP . Cambie la configuración para recopilar al menos tres réplicas técnicas de videos de 60 s cada una. Presione Crear y ejecutar script y siga las indicaciones. Empuje ~ 100 μL de muestra en la cámara entre réplicas.
    9. Cuando se complete la adquisición, retire el tampón residual con una jeringa, enjuague 3-5 ml de agua ultrapura a través de la cámara y retire el agua restante.
    10. Agregue la muestra de vesícula a la cámara con una jeringa de 1 ml y confirme la configuración de adquisición. Si el recuento de partículas no está dentro del rango lineal del instrumento (típicamente entre 20-80 partículas/ marco), la muestra deberá diluirse o concentrarse. Empuje al menos 500 μL de muestra en la cámara antes de recopilar datos.
    11. Recopile datos de video como en el paso 5.3.8, asegurándose de limpiar la cámara con agua ultrapura entre diferentes muestras.
    12. Recoger todas las muestras posteriores del mismo organismo/experimento utilizando configuraciones de cámara idénticas para garantizar la comparabilidad de los datos; los cambios en la configuración de Nivel de cámara pueden tener un efecto notable en los valores finales obtenidos.
    13. Determine los parámetros de partículas utilizando la sección de análisis del software. Seleccione Análisis > Abrir experimento y cargue el archivo de ejemplo. Seleccione Procesar archivos seleccionados y espere a que se complete el análisis. Asegúrese de utilizar el mismo umbral de detección para todas las muestras posteriores del mismo experimento.
      NOTA: Como las vesículas de cianobacterias son frecuentemente tenues, el umbral de detección generalmente deberá ajustarse al valor más sensible (más bajo).
  4. Realizar dispersión dinámica de la luz (DLS) (tamaño de partícula, potencial zeta).
    1. Filtre a través de un filtro de tamaño de poro de 0,2 μm para cualquier muestra que entre en el DLS para detectar partículas grandes que interfieren con las mediciones.
    2. Agregue 1 ml del medio / tampón en una cubeta limpia para examinar posibles agregaciones u otras nanopartículas provenientes del medio. Coloque la cubeta con el lado esmerilado a la izquierda en el micro muestreador y cierre la tapa. Deje que la muestra se equilibre durante al menos 5 min.
    3. Ingrese el índice de refracción del material y la absorción del material si difieren significativamente de los valores predeterminados para el agua.
      NOTA: Las propiedades del material tendrían muy poca influencia si las vesículas son menores de 100 nm. Al medir el potencial superficial (potencial zeta) de los evs, las vesículas deben resuspendirse en el medio de crecimiento original.
    4. Haga clic en panel de control de instrumentos para verificar las lecturas e iniciar la adquisición de datos haciendo clic en el icono verde. Si los valores se ven bien y su medio/búfer no contiene agregaciones u otras partículas, ahora está listo para medir su muestra.
    5. Agregue 1 ml de muestra de vesícula en una cubeta limpia y recopile datos como se menciona en el paso 5.4.4. Recopile al menos tres réplicas técnicas durante 10 minutos cada una.
  5. Realizar análisis de lipopolisacáridos (LPS) para confirmar que los EV Gram-negativos están presentes en la muestra.
    1. Muestra de vesícula de desnaturalización térmica a 95 °C durante 10 min en tampón de muestra laemmli estándar 1x (consulte la Tabla de materiales).
    2. Incubar con 0,2 U de proteasa tipo XIV de Streptomyces griseus (ver Tabla de Materiales) a 37 °C durante 30 min para eliminar glicoproteínas contaminantes.
    3. Muestras tratadas separadas por electroforesis en geles de desnaturalización al 16% (p/v) de SDS-poliacrilamida siguiendo el protocolo16 publicado anteriormente.
    4. Para detectar LPS, manche el gel con kits de tinción disponibles comercialmente o con una técnica de tinción de plata modificada28. Cuantificar la abundancia relativa de LPS mediante análisis de densitometría de geles teñidos según las referenciaspublicadas anteriormente 29,30.

6. Mediciones de la tasa de producción de vesículas

  1. Utilizando el análisis de seguimiento de nanopartículas como en el paso 5.3, o tecnología equivalente, mida la concentración de partículas en el medio de crecimiento para el experimento. Si se encuentra un recuento alto de partículas, filtre a través de un filtro de poro de 0,1 μm y vuelva a verificar.
    NOTA: Para minimizar el error, la concentración de partículas de fondo del medio debe ser inferior al 10% de la concentración de partículas encontrada en cultivos con la densidad más baja.
  2. Aclimatar el cultivo mediante células en crecimiento durante al menos dos transferencias seriadas sucesivas en los medios y condiciones ambientales deseados para los experimentos como en el paso 1.1.2. Las culturas deben transferirse mientras aún se encuentran en la fase de crecimiento exponencial. Asegurar que las tasas de crecimiento de la cultura medidas sean consistentes en todas las transferencias; de lo contrario, continúe transfiriendo cultivos hasta que las tasas de crecimiento sean reproducibles.
  3. Recolectar muestras de curso de tiempo tras la inoculación e intervalos programados regularmente a través de la curva de crecimiento en la fase estacionaria temprana. Escalonar los puntos de tiempo para tener un mínimo de 3-4 muestras recolectadas en todo el rango de crecimiento exponencial. Para muestrear en cada punto de tiempo, realice los pasos siguientes.
    1. Filtre 1 ml o más de cultivo directamente a través de un filtro de jeringa limpio y estéril de 0,2 μm y guarde el filtrado para medir la concentración de vesículas como en el paso 5.3. Congele las muestras de curso de tiempo si lo desea. Utilice la fluorescencia relativa para seguir la dinámica de crecimiento del cultivo.
    2. Guarde una muestra de todo el cultivo para determinar el tamaño de la población utilizando un método apropiado para el organismo (citometría de flujo; revestimiento de colonias; o de otra manera).
  4. Obtener mediciones de células y partículas similares a vesículas (por ml) en cada punto de tiempo.
  5. Identifique los puntos de tiempo que ocurrieron durante la fase de crecimiento exponencial. Para calcular r, el número de vesículas producidas por célula por generación, entre dos puntos durante el crecimiento exponencial (típicamente el comienzo y el final del curso del tiempo), use la ecuación proporcionada en el Archivo Suplementario 1.
    NOTA: Este método solo es válido durante condiciones de crecimiento en estado estacionario; los supuestos subyacentes y la derivación del cálculo se detallan en la referencia14.

Representative Results

La Figura 1 presenta una visión general del proceso de aislamiento de vesículas cianobacterianas, destacando aspectos clave del protocolo descrito aquí. De particular interés son los pasos que detallan la separación de la biomasa de cianobacterias de la fracción de partícula pequeña (vesícula), la concentración de la muestra de vesícula y el aislamiento y purificación de vesículas (Figura 1, pasos 2 a 4), que son críticos para obtener preparaciones reproducibles de vesículas. La Figura 2 presenta resultados representativos del aislamiento y caracterización de vesículas extracelulares de la cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. Se ha demostrado que la membrana externa de esta cianobacteria contiene carotenoides31, que confieren una coloración anaranjada característica a las muestras de vesículas recogidas por peletización directa mediante ultracentrifugación (Figura 2A). Una vez que se resuspende el pellet de vesícula, las vesículas se pueden examinar mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM), ya sea teñiendo negativamente las muestras con acetato de uranilo (Figura 2B) o mediante la observación de secciones ultrafinas (Figura 2C). La distribución y concentración del tamaño de las vesículas se puede evaluar mediante dispersión dinámica de luz (DLS) (Figura 2D) y análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA) (Figura 2E). Con el protocolo descrito, típicamente se obtuvieron ~3.5 ± 1.0 x 108 nanopartículas por ml en un cultivo de crecimiento exponencial de Synechocystis sp. PCC 6803 a un OD730 de 1.0. Se pueden realizar análisis bioquímicos de EV aislados para complementar la caracterización física de las vesículas aisladas. Como ejemplo, las vesículas purificadas de Synechocystis sp. PCC 6803 se separaron en un gel de poliacrilamida SDS y se tiñeron para lipopolisacáridos (LPS; Figura 2F). Como los LPS son específicos de la membrana externa32, la detección de LPS puede validar la presencia de vesículas unidas a la membrana y servir como marcador para analizar el contenido relativo de vesículas entre preparaciones de la misma cepa33. La inspección de la abundancia relativa de LPS de bajo vs. alto peso molecular puede indicar cambios en la composición de vesículas entre muestras34,35.

Figure 1
Figura 1: Procedimientos experimentales utilizados para el aislamiento y caracterización de EV cianobacterianos. Representaciones esquemáticas de cultivos en crecimiento (1) y separación de la biomasa cianobacteriana del medio de crecimiento (2). Las muestras libres de células que contienen vesículas se concentran (3), y luego los EV se aíslan y purifican (4). Dependiendo de la aplicación, las preparaciones de vesículas se pueden caracterizar utilizando una o una combinación de microscopía electrónica de transmisión (TEM), análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA), dispersión dinámica de luz (DLS) y perfil de lipopolisacáridos (LPS) (5). RT, temperatura ambiente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Resultados representativos del aislamiento y caracterización de vesículas extracelulares para la cianobacteria Synechocystis sp. PCC 6803. (A) Fotografía del pellet de vesícula extracelular (EVs pellet) obtenido después de la ultracentrifugación del medio extracelular concentrado libre de células de un cultivo de Synechocystis sp. PCC 6803 de 600 ml cultivado a un OD730 de 1.0-1.5. Tenga en cuenta la coloración naranja típica de la bolita de vesícula derivada de los carotenoides que se encuentran en la membrana externa. (B,C) Fotografías de microscopía electrónica de transmisión (TEM) de secciones teñidas negativamente (B) y ultrafinas (C) de muestras de vesículas de Synechocystis sp. PCC 6803. Barras de escala: 200 nm y 50 nm, respectivamente. Las muestras se visualizaron en un microscopio electrónico de transmisión operado a 80 kV. (D) Gráfico típico de dispersión dinámica de luz (DLS) que representa la distribución del volumen de la vesícula en función del diámetro de la vesícula (en nm). Las líneas de color indican datos de tres mediciones técnicas replicadas de la misma muestra. (E) Datos representativos de análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA) de la distribución del tamaño de la vesícula extracelular de Synechocystis (en nm). La línea negra indica la media de tres réplicas técnicas, y las líneas rojas representan el error estándar de la media. (F) El perfil de lipopolisacáridos (LPS) se detectó después de separar la preparación de vesículas por electroforesis en un gel de poliacrilamida SDS al 16% (p/v) y la tinción con un kit de tinción de LPS comercial. Los LPS de bajo y alto peso molecular, correspondientes a formas de LPS rugosas y lisas, respectivamente, son detectables. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Expediente complementario 1: Ecuación para calcular r. El número de vesículas producidas por célula por generación entre dos puntos durante el crecimiento exponencial (típicamente el comienzo y el final del curso del tiempo) se determina utilizando esta ecuación. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discussion

Consideraciones generales
El protocolo (Figura 1) se presenta como un conjunto de opciones para resaltar que no existe un método único para trabajar con vesículas extracelulares de cianobacterias. Los investigadores interesados pueden utilizar las secciones de este protocolo que son compatibles y apropiadas para su organismo modelo particular, preguntas / objetivos experimentales y disponibilidad de equipos. Todos los enfoques de aislamiento de vesículas implican compensaciones y inevitablemente resultarán en algún grado de sesgo. Si bien se debe tratar de minimizar esto siempre que sea posible, la consideración más crucial es asegurarse de que la metodología detallada utilizada se informe de acuerdo con las pautas apropiadas MISEV (Información mínima para estudios de vesículas extracelulares)36.

Crecimiento de la cultura
Los cultivos de cianobacterias se pueden obtener fácilmente de una de las muchas colecciones de cultivos disponibles en todo el mundo. Algunos ejemplos son la Colección de Cultura Roscoff (Station Biologique de Roscoff, Francia), la Colección de Cultura Pasteur (Instituto Pasteur, París, Francia) y el Centro Nacional Provasoli-Guillard de Algas Marinas y Microbiota (NCMA, Maine, EE. UU.). La cepa cianobacteriana de elección debe cultivarse en el medio y las condiciones ambientales apropiadas, variando significativamente entre las diferentes cepas. Se puede encontrar una lista de los medios de uso común para el cultivo de cianobacterias en los sitios web de recolección de cultivos u otras publicaciones 37,38,39.

Trabajar con vesículas extracelulares de cianobacterias presenta algunos desafíos únicos en comparación con las metodologías reportadas para muchos heterótrofos de laboratorio modelo típicos. Los cultivos de cianobacterias tienen concentraciones de vesículas de órdenes de magnitud inferiores a las encontradas en otros microbios como Escherichia coli 14,16,40. Estas diferencias, presumiblemente derivadas de densidades celulares más bajas y / o tasas de producción de vesículas, significan que se pueden requerir cultivos relativamente grandes (~ 1-20 L o más) para producir suficiente material para análisis a granel. Por lo tanto, se alienta a los investigadores a probar los rendimientos de vesículas de cultivos a menor escala para determinar cuánto material será necesario para lograr sus objetivos finales deseados. La importancia de establecer si el medio utilizado para el experimento tiene un fondo de partículas detectable también debe enfatizarse antes de comenzar cualquier experimento, ya que ese material puede confundir potencialmente la cuantificación de la población de vesículas, reducir la sensibilidad de las mediciones de concentración / tamaño de vesículas o contaminar las preparaciones finales de vesículas.

Otro desafío para el campo es que no todas las cianobacterias crecen bien, o en absoluto, en cultivo puro. Hasta que se vuelvan axénicas, las interpretaciones de las características físicas de las vesículas, las tasas de producción o el contenido no necesariamente pueden conducir a conclusiones claras sobre las vesículas producidas por cualquier cepa de la comunidad. También se aconseja a los investigadores que consideren qué otros tipos de partículas podrían estar presentes y potencialmente confundirse con las vesículas mediante herramientas específicas de análisis de nanopartículas, que no necesariamente pueden discriminar entre diferentes tipos de partículas. Por ejemplo, puede ser esencial verificar que la cepa que se está utilizando carece de un profago, ya sea a través de la secuenciación del genoma, ensayos de inducción u otros medios o no libera otros tipos de partículas. En nuestra experiencia, la mayoría de las vesículas de cianobacterias tienen <0,2 μm de diámetro, pero al observar una nueva cepa o condición de crecimiento, se debe confirmar si el uso de un filtro de tamaño de poro de 0,45 μm altera la distribución del tamaño de las partículas purificadas.

Muchos aspectos de las condiciones de cultivo pueden influir en la producción de vesículas y su contenido41,42. Por lo tanto, las condiciones físicas y químicas utilizadas para el crecimiento del cultivo (incluida la irradiancia de la luz, la temperatura y la composición de los medios) deben documentarse y controlarse en la medida de lo posible para garantizar la reproducibilidad de los resultados. Cualquier análisis químico del contenido de las vesículas debe tener en cuenta la composición de fondo, especialmente cuando se llevan a cabo análisis de alto rendimiento de estilo "ómico". Esto puede ser especialmente crítico cuando se usan medios indefinidos, como los basados en un fondo natural de agua de mar o complementados con extracto de levadura o triptona. El uso de un medio de crecimiento definido puede ser preferible dependiendo de los objetivos experimentales.

Los investigadores deben monitorear cuidadosamente la dinámica de crecimiento del cultivo a intervalos regulares para asegurarse de que saben en qué parte de la fase de crecimiento se encuentra un cultivo por lotes determinado y no solo recolectar muestras después de un período de tiempo arbitrario. La composición de las vesículas puede variar entre las fases de crecimiento, particularmente entre las fases exponencial y estacionaria41,42. Por ejemplo, al menos una fracción de las vesículas muestreadas en la fase estacionaria puede surgir de un mecanismo celular diferente, como la lisis celular, que no ocurrirá durante el crecimiento exponencial. Si bien esto aún puede ser de gran interés biológico, es esencial conocer la muestra. Si un cultivo de cianobacterias alcanza la fase de crecimiento deseada en un momento en que no es posible proceder directamente a la concentración de la muestra, se recomienda separar las células de la fracción de <0,2 μm inmediatamente (con centrifugación y/ o filtración directa de 0,2 μm), y luego almacenar el filtrado libre de células a 4 °C. El material se puede almacenar de esta manera durante días con poco o ningún impacto notable en la concentración o distribución del tamaño de las vesículas.

Purificaciones de vesículas
La necesidad frecuente de aislar vesículas de cultivos de volumen significativo es vital en el flujo de trabajo de aislamiento de vesículas cianobacterianas. Cuando se trabaja con grandes volúmenes de material, las vesículas deberán concentrarse antes de los flujos de trabajo de separación posteriores. En general, se recomiendan concentradores (membranas de filtro de flujo tangencial o columnas centrífugas) con un límite de peso molecular nominal de 100 kDa, ya que permiten la separación del material soluble con bajo peso molecular manteniendo tiempos de concentración razonables, pero los filtros de 30 kDa también se utilizan con frecuencia con éxito. Si bien varios métodos no basados en la ultracentrifugación para purificar vesículas (por ejemplo, cromatografía de exclusión de tamaño, sistemas basados en microfluídica, técnicas de captura de afinidad y enfoques basados en precipitaciones) se están volviendo populares en el campo de las vesículas extracelulares, en nuestra experiencia, estos enfoques pueden resultar en una disminución de los rendimientos y, por lo general, son incompatibles con los volúmenes de cultivo necesarios.

Los investigadores deben considerar la composición del fondo de iodixanol y los tampones de lavado / resuspensión utilizados durante la purificación de vesículas para garantizar que sean compatibles con las aplicaciones posteriores deseadas. En muchos casos, la muestra final de vesícula se puede resuspendir en medios de crecimiento o en un tampón definido comparable en composición al medio de crecimiento (por ejemplo, agua de mar natural vs. artificial). Sin embargo, esto puede no ser posible con las vesículas de cianobacterias marinas, que requerirán una manipulación experimental adicional para el análisis, ya que las altas concentraciones de sal similares a los niveles de agua de mar pueden inhibir muchas reacciones enzimáticas. En tales casos, los tampones de laboratorio estándar, como 0,2 μm filtrados, 1x PBS generalmente funcionan bien para mantener la estabilidad de las vesículas de cianobacterias marinas y pueden ser más compatibles con los procesos experimentales posteriores.

La purificación del gradiente de densidad puede considerarse opcional dependiendo de los objetivos experimentales y la composición del cultivo, pero se recomienda encarecidamente para producir una muestra más rigurosamente pura y reproducible. Las poblaciones de EV son heterogéneas y se pueden encontrar en un rango de densidades flotantes, que varían aún más según la tensión, las condiciones de crecimiento y otros factores 4,5,6. Las densidades enumeradas anteriormente representan las que se encuentran típicamente para las vesículas de cultivos de cianobacterias y muestras de campo en iodixanol, pero los resultados en otras cepas pueden variar. Otros materiales de gradiente de densidad como la sacarosa y CsCl se pueden utilizar para vesículas, pero migrarán a diferentes densidades flotantes en estos fondos. Diferentes fondos de medios degradados pueden sesgar la recuperación de virus encerrados en lípidos43 y podrían influir potencialmente en la recuperación de vesículas de diferentes cepas.

Las vesículas se pueden perder en múltiples puntos a través del aislamiento de vesículas y el proceso de purificación de gradiente descrito aquí, reduciendo los rendimientos y aumentando la cantidad de material de partida necesario para lograr un rendimiento final de vesículas dado para aplicaciones posteriores. Se debe tener especial cuidado al trabajar con gránulos de vesícula después de la ultracentrifugación. Si bien algunas vesículas de cianobacterias pueden tener carotenoides u otros compuestos que pueden dar a las muestras de vesículas cierta cantidad de pigmentación (Figura 2), dependiendo de la cepa o la cantidad de material, no se espera necesariamente poder visualizar el pellet de vesículas directamente. Tenga en cuenta dónde se espera que se administre el pellet, el tipo de rotor de centrífuga utilizado. Cuando sea posible, se sugiere que las muestras de vesículas purificadas se examinen mediante microscopía electrónica para verificar la composición del material final recuperado.

El impacto de las condiciones de almacenamiento en las vesículas y su contenido sigue siendo una pregunta abierta. Aunque se encuentra que el almacenamiento no tiene un efecto notable sobre el tamaño de la vesícula cianobacteriana o la concentración14, la funcionalidad de las preparaciones de vesículas aisladas puede cambiar con el tiempo44. Si bien los ciclos de congelación / descongelación deben evitarse siempre que sea posible, el impacto de la congelación de muestras en el número y tamaño general de vesículas parece ser mínimo. Uno debe ser consciente de la posibilidad de que los ciclos de congelación-descongelación influyan en la composición del contenido de las vesículas, como la longitud de los ácidos nucleicos asociados a las vesículas o la estabilidad de las proteínas.

Vesículas de field samples
Los métodos actuales para aislar vesículas extracelulares de ambientes acuáticos naturales son conceptual y operativamente similares a los descritos aquí para cultivos de gran volumen. Aún así, pueden requerir volúmenes aún mayores de material. Tales muestras de campo pueden implicar la recolección, filtración y concentración de cientos a miles de litros de agua para obtener suficiente material para el análisis. Dependiendo de la turbidez de la muestra que se esté utilizando, puede ser necesaria la incorporación de uno o más pasos de prefiltración antes del filtro de 0,2 μm. El dispositivo TFF específico utilizado debe ser apropiado para trabajar con volúmenes tan grandes en un período de tiempo razonable (idealmente en el orden de horas) y sin ejercer una presión excesiva sobre la muestra. En la práctica, esto a menudo implica el uso de un área de superficie total mucho mayor de la que podría aplicarse a las muestras basadas en cultivos, así como tubos de mayor diámetro para facilitar el aumento de los caudales. Este aumento de la superficie del filtro probablemente conducirá a un aumento marginal en las pérdidas de partículas en comparación con los arreglos TFF más pequeños y un mayor volumen final de concentrado; sin embargo, estas preocupaciones deben equilibrarse con consideraciones del tiempo total de procesamiento. Para situaciones como un crucero oceanográfico prolongado donde las muestras no volverán a un laboratorio durante muchos días después del muestreo, recomendamos llevar a cabo la filtración inicial de 0,2 μm y los pasos de TFF en el campo. Este volumen más pequeño de material concentrado se puede almacenar a 4 °C o -80 °C a bordo (dependiendo de la disponibilidad y las consideraciones analíticas posteriores) hasta que se devuelva al laboratorio para su procesamiento final.

El aislamiento y la separación de vesículas extracelulares de otras partículas pequeñas, tanto orgánicas como inorgánicas, pueden ser un desafío, y los métodos para separar diferentes partículas aún no son perfectos. Por ejemplo, los gradientes de densidad de iodixanol pueden no separar fácilmente todas las clases de vesículas y virus presentes en una muestra dada. Como los tipos de partículas de confusión, y sus propiedades físicas, variarán entre los sitios de muestreo, actualmente es imposible proporcionar un protocolo que divida de manera robusta todas las clases de partículas acuáticas pequeñas. El ensayo y error son esenciales, y se requerirá experimentación con el rango de iodixanol utilizado en las condiciones de gradiente y ultracentrifugación para maximizar la separación; también se puede requerir una colección de fracciones de densidad de menor volumen y más finamente resueltas. Dependiendo del contexto, el uso de gradientes CsCl en lugar de iodixanol puede ayudar a separar las partículas ambientales45. Aún así, el cambio en las condiciones osmóticas podría conducir a sesgos en los productos recuperados finales, como se discutió anteriormente.

Caracterización de vesículas
Los instrumentos de análisis de nanopartículas aún no están disponibles de forma rutinaria en entornos de laboratorio de microbiología, pero están cada vez más disponibles. Todas las metodologías tienen pros y contras, y no hacemos ningún respaldo específico de una plataforma como mejor que todas las demás para el trabajo de vesículas de cianobacterias; de hecho, todos tienen compensaciones particulares con respecto a los costos, la resolución, la facilidad de uso, los límites de detección, la compatibilidad con diferentes medios de crecimiento / fondos de búfer y la reproducibilidad de los datos. Además de los instrumentos basados en el análisis de seguimiento de nanopartículas descrito anteriormente, se pueden aplicar otros enfoques, incluida la citometría de nanoflujo, la detección de pulsos resistivos microfluídicos y la detección de pulsos resistivos sintonizables46,47. Los usuarios deben tener cuidado de conocer los detalles de su instrumentación disponible y verificar que funcione bien con su sistema, ya que hemos encontrado dificultades al usar algunas plataformas con medios basados en agua de mar. Alentamos al campo a avanzar hacia la caracterización cuantitativa del tamaño de las vesículas, las concentraciones y las tasas de producción. La medición de las concentraciones de vesículas sobre una base fundamental de partículas por ml, y no en términos de contenido de proteínas u otras métricas, permitirá la integración de vesículas en marcos más cuantitativos y permitirá la intercomparación entre cepas y condiciones. Se necesitan más esfuerzos para mejorar la capacidad de calibrar las mediciones de concentración para partículas de <100 nm.

El hecho de que las mediciones de la tasa de producción de vesículas se realicen directamente a partir de un sobrenadante de cultivo filtrado de 0,2 μm para minimizar las pérdidas de partículas se asociaría con otros pasos de purificación descritos anteriormente. Sin embargo, esto significa que el enfoque no necesariamente discrimina entre las vesículas extracelulares reales y otras partículas pequeñas que se encuentran en los cultivos. Solo contar partículas dentro de rangos de tamaño específicos (por ejemplo, 50-250 nm de diámetro) puede ayudar a excluir algunos valores atípicos, pero se necesita una confirmación visual de que los contenidos de cultivo de <0,2 μm granulados parecen ser vesículas unidas a la membrana (por TEM u otros enfoques) para poder afirmar específicamente que se está midiendo la producción de vesículas en lugar de la producción de partículas similares a vesículas.

Un factor esencial en la caracterización de vesículas es asegurarse de que la muestra de vesículas se está analizando en el rango de sensibilidad lineal apropiado del dispositivo de análisis de nanopartículas. Cuando una muestra está demasiado concentrada, es sencillo diluir ese material con un tampón limpio y volver a analizarlo. Por otro lado, la densidad celular y/o vesícula relativamente baja de algunos cultivos de cianobacterias a veces puede producir preparaciones de vesículas que están por debajo de los límites de detección de algunos instrumentos. En los casos en que esto ocurre con purificaciones de vesículas a granel, se puede considerar cultivar cultivos de mayor volumen, volver a peletizar y resuspender el material final en un volumen más pequeño, o evaluar si hay un paso en el proceso de aislamiento donde se están produciendo pérdidas excesivas y podrían mitigarse. Al medir las tasas de producción de vesículas, las correcciones no son necesariamente tan sencillas. Las muestras se pueden concentrar si es necesario, pero la primera debe ver si los ajustes en los medios podrían resultar en densidades celulares más altas o si se podrían obtener muestras suficientemente concentradas de puntos de tiempo posteriores durante la fase exponencial donde las concentraciones serán más altas.

Limitaciones
Al igual que con cualquier protocolo, el aislamiento de vesículas utilizando estos enfoques tiene claras limitaciones. Estos enfoques no se basan en su garantía de que se aislará una preparación completamente pura de vesículas. Tanto los cultivos como las muestras de campo pueden contener otros materiales, que migran de manera similar a las vesículas en gradientes de densidad. Aún así, como mínimo, este tipo de metodologías de purificación adicionales son esenciales para garantizar el rigor y la reproducibilidad del análisis de vesículas. Si bien describimos los enfoques de aislamiento de vesículas en el contexto de las cianobacterias, los cultivos de muchos otros microbios también contendrán vesículas a concentraciones comparativamente bajas, y los procedimientos descritos aquí deberían ser generalmente aplicables. Se espera que estos métodos no sirvan como un protocolo permanente, sino como un punto de partida para estimular futuros avances en el trabajo con vesículas extracelulares de diversos microbios. Se requieren esfuerzos futuros para fusionar estos métodos con otros enfoques, como las columnas de exclusión de tamaño o el fraccionamiento asimétrico del flujo de campo para mejorar la discriminación y la separación de diferentes categorías de partículas pequeñas de cultivos y muestras ambientales. También tenemos la esperanza de que estas técnicas puedan continuar evolucionando junto con las mejoras en las tecnologías de caracterización de nanopartículas para mejorar la capacidad de examinar la heterogeneidad dentro de las poblaciones de vesículas, su contenido y sus roles funcionales exactos en el medio ambiente.

Disclosures

Los autores declaran que no hay conflictos de intereses.

Acknowledgments

Los autores reconocen el apoyo de las Plataformas Científicas i3S "Biointerfaces y Nanotecnología", y "Histología y Microscopía Electrónica", miembro de la plataforma nacional de infraestructura portuguesa de bioimagen (PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122). También agradecemos al Prof. J. A. González-Reyes (Universidad de Córdoba, España) por ayudar a optimizar el protocolo de tinción de sección ultradelgada para TEM, y a la Dra. Cecília Durães y la Dra. Ana Rita Pinto (Universidad de Oporto, Portugal) por el análisis de seguimiento de nanopartículas.

Este trabajo fue financiado por la Fundación Nacional de Ciencias de los Estados Unidos (OCE-2049004 a SJB), por fondos del Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER) a través del Programa Operativo COMPETE 2020 para la Competitividad y la Internacionalización (POCI), Portugal, 2020, y por fondos portugueses a través de la Fundação para a Ciência e a Tecnologia/Ministério da Ciência, Tecnologia e Ensino Superior en el marco del proyecto POCI-01-0145-FEDER-029540 (PTDC/BIA-OUT/29540/2017 a PO). La Fundação para a Ciência e a Tecnologia también es muy reconocida por la beca de doctorado SFRH / BD / 130478 / 2017 (SL) y la beca DE INVESTIGADOR FCT IF / 00256 / 2015 (PO). M.C.M.-M. contó con el apoyo de una beca individual Marie Skłodowska-Curie (panel de reintegración) dentro del Programa Marco Horizonte 2020 (H2020-MSCA-IF-2018-RI-844891).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1x Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 Home-made buffer --- Standard wash/storage buffer which can be used with vesicles; can be made in lab or purchased commercially
2% Uranyl acetate solution Electron Microscopy Sciences 22400-2 Negative staining - TEM
4x Laemmli Sample Buffer Bio-Rad 161-0747 Denaturation of vesicle sample prior to proteolysis, required for lipopolysaccharides (LPS) staining
Amicon Ultra Centrifugal Filters (100 kDa) Merck UFC9100XX Alternative option for centrifugal ultrafiltration
BG11 medium Home-made medium --- Medium for cultivation of Synechocystis sp. PCC 6803
Carbon Support Film 200 Mesh, copper. CF200-Cu Electron Microscopy Sciences 71150 Transmission electron microscopy (TEM) grid
easiGlow Glow Discharge Cleaning System Ted Pella 91000 Commercial TEM grid glow discharger
EMbed 812 epoxy resin Electron Microscopy Sciences 14120 Ultra-thin sections - TEM
Filter holder for vacuum system Thermo Fisher Scientific 300-4000 Reusable units with filter membrane support plates
Glutaraldehyde  Grade I Sigma-Aldrich G5882-10X1ml Ultra-thin sections - TEM
HEPES [N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid) sodium salt] Sigma-Aldrich H7006 Buffering agent for cyanobacterial growth media
Lead Citrate, Trihydrate Electron Microscopy Sciences 17800 Stain for use in electron microscopy
Macrosep Advance Centrifugal Devices with Omega Membrane 100K Pall MAP100C36 For centrifugal ultrafiltration of small volume samples
Millipore Pellicon 3 TFF Module EMD Millipore XX42P0060 or XX42P0080 Alternative TFF option for concentrating large volume samples
Milli-Q Reference Water Purification System Merck Z00QSV0WW Water purification system for obtaining type I ultrapure grade water
NanoSight Malvern Panalytical LM14 or NS300 Nanoparticle tracking analysis
Optima L80 XP Ultracentrifuge Beckman Coulter L80 XP Ultracentrifuge (or similar model)
OptiPrep / Iodixanol Sigma-Aldrich D1556 Density gradient media
Osmium Tetroxide Reagent Plus Sigma-Aldrich 201030 Ultra-thin sections - TEM
Pall Centramate PE TFF holder Pall Corporation FS002K10 TFF module good for concentrating 10s-100s of L of sample; requires additional 30 or 100 kDa filter modules to scale with your estimated volumes
Peristaltic pump Masterflex L/S Cole-Parmer 07559-07 Pump for driving large-scale TFF modules
Piston Gradient Fractionator Biocomp Instruments 152-001 Automated density gradient fractionation
Polycarbonate tubes for the 70 Ti rotor Beckman Coulter 355618 Reusable ultracentrifuge polycarbonate aluminum tubes with cap assembly
Pro99 medium Home-made medium --- Medium for cultivation of Prochlorococcus
Pro-Q Emerald LPS Gel Stain Kit Thermo Fisher Scientific P20495 LPS staining
SN medium Home-made medium --- Medium for cultivation of cyanobacterial marine strains such as Synechococcus
Sodium cacodylate trihydrate Sigma-Aldrich C0250-100G Buffering agent in the preparation of vesicles samples for TEM
SW32Ti swinging bucket rotor Beckman Coulter 369650 Ultracentrifuge rotor, holds 6x ~40 mL tubes; good for pelleting of bulk material
SW60Ti swinging bucket rotor Beckman Coulter 335650 Ultracentrifuge rotor, holds 6x ~4.5 mL tubes; good for gradient purifications and final vesicle washes
Syringe 1mL Luer BD Plastipak 303172 For vesicle isolation and loading samples into nanparticle tracking analysis (NTA) equipment
Syringe filter 0.2 µm Pall Corporation 4602 For vesicle isolation from cultures
TAPS [N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]-3-aminopropanesulfonic acid] Sigma-Aldrich T5130 Buffering agent for cyanobacterial growth media
Transmission electron microscope JEOL JEM-1400 Or similar microscope
Type 70 Ti Fixed-Angle Titanium Rotor Beckman Coulter 337922 Ultracentrifuge rotor, holds 8x ~39 mL tubes; good for pelleting of bulk material
Type XIV protease from Streptomyces griseus Sigma-Aldrich P5147 Enzyme for proteolysis of EVs proteins, required for LPS staining
UltraClear tubes for the SW32Ti rotor Beckman Coulter 344058 Single use ultracentrifuge tubes
UltraClear tubes for the SW60Ti rotor Beckman Coulter 344062 Single use ultracentrifuge tubes
Ultramicrotome PowerTome XL, PT-PC RMC Products,  Boeckeler Instruments 75501 Microtome for ultra-thin sections - TEM
Universal 320 R centrifuge Hettich Z654736 This or any similar general-purpose benchtop/floor standing centrifuge can be used for pelleting cells
Vacuum apparatus KNF Neuberger N026.3 AT.18 Or any similar vacuum pump and trap
Vivaflow 200 100,000 MWCO PES Sartorius VF20P4 TFF module, good for 2-3L. You can connect different modules for higher volume (figure 1).
Whatman Polycap TC Capsule filter (0.2/0.2µm) Cytiva 6717-9502 Capsule filter for filtering large volumes of liquid
Zetasizer Malvern Panalytical Zetasizer Nano ZS Dynamic light scattering (DLS) instrument

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Biología Número 180
Aislamiento y caracterización de vesículas extracelulares cianobacterianas
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Biller, S. J., Muñoz-Marín, M. d. C., Lima, S., Matinha-Cardoso, J., Tamagnini, P., Oliveira, P. Isolation and Characterization of Cyanobacterial Extracellular Vesicles. J. Vis. Exp. (180), e63481, doi:10.3791/63481 (2022).

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