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Biology

Isolamento e caratterizzazione delle vescicole extracellulari cianobatteriche

Published: February 3, 2022 doi: 10.3791/63481
Automatic Translation
*1, *2, 3,4,5, 3,4, 3,4,6, 3,4,6
1Department of Biological Sciences, Wellesley College, 2Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Campus de Excelencia Internacional, Agroalimentario, Universidad de Córdoba, 3i3S - Instituto de Investigação e Inovação em Saúde, Universidade do Porto, 4IBMC - Instituto de Biologia Molecular e Celular, Universidade do Porto, 5MCbiology Doctoral Program, ICBAS - Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar, Universidade do Porto, 6Departamento de Biologia, Faculdade de Ciências, Universidade do Porto
* These authors contributed equally

Summary

Il presente protocollo fornisce descrizioni dettagliate per l'isolamento, la concentrazione e la caratterizzazione di vescicole extracellulari da colture cianobatteriche. Vengono inoltre discussi gli approcci per purificare le vescicole da colture a diverse scale, i compromessi tra le metodologie e le considerazioni per lavorare con i campioni sul campo.

Abstract

I cianobatteri sono un gruppo eterogeneo di batteri fotosintetici e Gram-negativi che svolgono ruoli critici negli ecosistemi globali e fungono da modelli biotecnologici essenziali. Lavori recenti hanno dimostrato che sia i cianobatteri marini che quelli d'acqua dolce producono vescicole extracellulari - piccole strutture legate alla membrana rilasciate dalla superficie esterna dei microbi. Mentre le vescicole probabilmente contribuiscono a diversi processi biologici, i loro ruoli funzionali specifici nella biologia cianobatterica rimangono in gran parte sconosciuti. Per incoraggiare e far progredire la ricerca in questo settore, viene presentato un protocollo dettagliato per isolare, concentrare e purificare le vescicole extracellulari cianobatteriche. Il lavoro attuale discute le metodologie che hanno isolato con successo le vescicole da grandi colture di Prochlorococcus, Synechococcus e Synechocystis. Vengono presentati i metodi per quantificare e caratterizzare i campioni di vescicole di questi ceppi. Vengono inoltre descritti approcci per isolare le vescicole dai campioni di campo acquatico. Infine, vengono discusse anche le sfide tipiche incontrate con la purificazione delle vescicole cianobatteriche, le considerazioni metodologiche per le diverse applicazioni a valle e i compromessi tra gli approcci.

Introduction

Le vescicole extracellulari (EV) sono strutture sferiche, che variano tra ~ 20-400 nm di diametro, rilasciate praticamente da tutti gli organismi nel loro ambiente circostante 1,2,3. Le vescicole sono delimitate da un doppio strato lipidico e non possono replicarsi. Nei batteri Gram-negativi, si pensa che queste strutture sorgano principalmente per "blebbing" di piccole porzioni dalla membrana esterna. Tuttavia, altri processi, tra cui il movimento flagellare, la lisi cellulare e la secrezione di materiale di membrana sia interno che esterno, possono produrre vescicole anche 4,5. Gli EV possono contenere varie biomolecole, tra cui lipidi, proteine solubili e di membrana, acidi nucleici e metaboliti, e possono trasportare questo materiale tra le cellule 4,5,6. Date queste caratteristiche, i veicoli elettrici sono in fase di studio per comprendere i loro possibili ruoli in una vasta gamma di processi biologici, tra cui la comunicazione cellulare, la formazione di biofilm, il trasferimento genico orizzontale, la dinamica ospite-fago e lo scambio di nutrienti 4,6.

I cianobatteri sono un gruppo ampio e diversificato di batteri Gram-negativi, compresi organismi unicellulari e filamentosi. Sono di interesse da molte prospettive, tra cui la comprensione della loro fisiologia e diversità 7,8, le funzioni critiche dell'ecosistema che servono 9,10 e la loro utilità per la biotecnologia11,12. I cianobatteri si trovano in un'ampia varietà di habitat, sia come organismi viventi liberi in ambienti marini, d'acqua dolce e terrestri, sia in associazioni simbiotiche con muschi, felci, piante o in licheni e spugne13. Servono come produttori primari cruciali negli ecosistemi acquatici, producendo ossigeno e carbonio organico attraverso la fotosintesi ossigenata 9,10, e alcuni sono in grado di fissare anche l'azoto atmosferico7. I cianobatteri marini e d'acqua dolce, tra cui Prochlorococcus, Synechococcus e Synechocystis, producono veicoli elettrici in condizioni di laboratorio 14,15,16 e le vescicole cianobatteriche si possono trovare anche in ambienti naturali14,17. Le funzioni biologiche ed ecologiche delle vescicole cianobatteriche sono sconosciute, ma è probabile che ulteriori ricerche in questo settore forniscano nuove intuizioni su questioni relative alla fisiologia cianobatterica, alla differenziazione, alle strategie di comunicazione, all'evoluzione e alle interazioni trofiche. Inoltre, la capacità dei veicoli elettrici cianobatterici di trasportare diverse categorie di biomolecole può avere applicazioni commerciali18,19.

Il presente protocollo descrive i metodi per isolare e caratterizzare le vescicole da colture cianobatteriche e campioni di campo per consentire e incoraggiare un esame più ampio della biologia delle vescicole extracellulari cianobatteriche. Mentre il flusso di lavoro qui descritto è analogo ai protocolli per isolare e caratterizzare i veicoli elettrici da altri batteri, le colture cianobatteriche e i campioni di campo contengono in genere concentrazioni di cellule e vescicole inferiori a quelle comunemente osservate con i sistemi modello associati all'ospite o patogeni 20,21,22. Pertanto, gli studi sui veicoli elettrici cianobatterici richiedono considerazioni e ottimizzazioni speciali per la coltivazione e l'isolamento delle vescicole, che variano ulteriormente tra ceppi e background dei mezzi. Poiché nessun singolo protocollo funzionerà ugualmente bene per tutti i ceppi, le condizioni di crescita e le applicazioni a valle, forniamo più opzioni e discutiamo i compromessi coinvolti in modo che i ricercatori possano determinare gli approcci più appropriati per affrontare le loro domande sperimentali.

Protocol

I ceppi cianobatterici sono ottenuti da diverse collezioni di colture (vedi Discussione per i dettagli).

1. Coltivazione cianobatterica

  1. Coltivare cianobatteri marini Prochlorococcus e Synechococcus seguendo i passaggi seguenti.
    1. Coltivare ceppi di Prochlorococcus e Synechococcus in palloni di policarbonato utilizzando un mezzo appropriato come Pro99 o SN (vedi Tabella dei materiali). Per i dettagli, si vedano i riferimenti23,24 pubblicati in precedenza.
    2. Acclimatare le colture coltivandole attraverso due o tre trasferimenti (1:20 diluizioni di coltura in mezzi freschi per ogni passaggio) nelle condizioni di temperatura e irradianza desiderate richieste per l'esperimento.
      NOTA: Le condizioni di crescita tipiche23,25 includono temperature comprese tra 15-30 °C all'irradianza tra 8-150 μmol fotoni m-2 s-1, ma le tolleranze di deformazione individuali e l'optima variano ampiamente26 e devono essere impostate in base alle indicazioni fornite dalle istruzioni o dalla letteratura per la raccolta delle colture pertinenti. Monitorare il tasso di crescita utilizzando la fluorescenza di coltura o la citometria a flusso conta23 e assicurarsi che le colture crescano a un tasso esponenziale costante di stato stazionario prima di iniziare l'esperimento.
    3. Effettuare una serie di trasferimenti graduali successivi da volumi più piccoli a volumi più grandi una volta che le cellule raggiungono la fase esponenziale tardiva (ad esempio, 20 ml < 250 ml < 2 L < 10 L < 20 L).
      NOTA: le colture di grandi volumi non possono essere inoculate direttamente da piccole quantità di coltura iniziale. Si noti che colture più grandi possono richiedere l'aggiunta di tamponi (come 1 mM HEPES, pH 7,5 o 3,75 mM TAPS, pH 8), insieme a bicarbonato di sodio supplementare o gorgogliamento con aria sterile24.
  2. Coltivare cianobatterio d'acqua dolce Synechocystis sp. PCC 6803.
    1. Preparare una coltura di Synechocystis sp. PCC 6803 da utilizzare come inoculo coltivandolo con aerazione (aria gorgogliante a 1 L/min), a 30 °C, sotto una luce di 16 h (conta fotoni di 50 μmol m-2 s-1) / 8 h regime scuro, fino ad una densità ottica a 730 nm (OD730) di 1.0 (fase esponenziale) in BG11 medio27.
    2. Inoculare 30 mL di questa coltura Synechocystis sp. PCC 6803 in 570 mL di BG11 medio ad un OD730 di 0,05 in 1 L di bottiglie di lavaggio del gas di vetro.
    3. Consentire alle cellule di crescere con aerazione, a 30 °C, sotto un regime di luce di 16 ore (conta fotoni di 50 μmol m-2 s-1) / 8 ore di buio, fino a un OD730 finale di 1,0-1,5.

2. Separazione della biomassa cianobatterica dalla frazione di piccole particelle (vescicole)

NOTA: In primo luogo, si raccomanda di separare le cellule dal surnatante attraverso la pellettizzazione centrifuga delle cellule. Tuttavia, quando i volumi di coltura sono troppo grandi perché ciò sia fattibile, è possibile saltare la centrifugazione e procedere direttamente al filtraggio di intere colture utilizzando la filtrazione in capsule (fase 2.4).

  1. Eseguire la centrifugazione su celle separate (ideale per volumi fino a ~ 4 L, a seconda della capacità di centrifuga disponibile).
    1. Autoclave o lavare e pulire accuratamente le bottiglie della centrifuga utilizzando acqua di grado ultrapuro di tipo I (vedi Tabella dei materiali), assicurando che non rimangano residui di sapone o altro materiale.
    2. Caricare i campioni di coltura in un numero appropriato di flaconi di centrifuga e bilanciarli.
    3. Centrifuga colture per >10.000 x g a 4 °C per 10 min. Se il surnatante rimane visibilmente torbido, aumentare le condizioni di centrifugazione a 20 minuti alla massima velocità e riprovare.
    4. Decantare con cura o surnatante pipettato in un recipiente pulito e procedere a una delle seguenti opzioni di filtrazione menzionate nei passaggi 2.2-2.4.
  2. Opzione 1: eseguire la filtrazione delle siringhe utilizzando filtri da 0,2 μm (per volumi di campione fino a ~50 ml).
    1. Riempire una siringa sterile da 50 mL con un terreno di coltura in gran parte privo di cellule e filtrarla attraverso un filtro da 0,2 (o 0,45) μm di polietersolfone (PES) (vedere Tabella dei materiali). Raccogliere il filtrato in un recipiente pulito e sterilizzato.
    2. Ripetere questo passaggio fino a quando il filtro non è intasato (ad esempio, diventa difficile spingere con la siringa). Sostituire con un nuovo filtro e procedere fino a quando il campione non viene accuratamente filtrato.
  3. Opzione 2: eseguire una filtrazione sotto vuoto da 0,2 μm (fino a ~ 4 L).
    1. Lavare e pulire accuratamente l'apparecchio per vuoto utilizzando acqua di tipo I - ultrapura, collegandolo a una trappola per vuoto e a una pompa (vedere Tabella dei materiali).
    2. Inserire un filtro da 0,2 μm di diametro appropriato e bloccare l'apparecchio per vuoto.
    3. Aggiungere una piccola quantità di campione di coltura, assicurandosi che la pressione del vuoto rimanga <10 psi.
    4. Continuare a filtrare la lingua con piccoli incrementi fino al completamento. Se la velocità di filtrazione rallenta in modo significativo, arrestare il vuoto e sostituire il filtro.
    5. Raccogliere la frazione <0,2 μm contenente vescicole in un contenitore pulito.
  4. Opzione 3: eseguire la filtrazione della capsula da 0,2 μm (per volumi di campioni > ~ 4 L)
    1. Pulire tubi flessibili di dimensioni adeguate e recipiente di raccolta lavando con acqua e detergente delicato. Risciacquare il materiale con acqua distillata e deionizzata.
      NOTA: Prima dell'utilizzo, il materiale deve essere risciacquato con acqua di tipo I - ultrapura.
    2. Posizionare la coltura da filtrare in un luogo sicuro ed elevato con il vaso di raccolta finale sottostante. Collegare una porta di deflusso a capsula da 0,2 μm (vedere Tabella dei materiali) a un pezzo di tubo e posizionarlo in un recipiente di raccolta.
    3. Posizionare un altro tubo nel campione, iniziare un sifone a gravità tirando un campione nel tubo con una siringa e collegare il tubo al filtro della capsula. Utilizzare lo sfiato per rilasciare l'aria in eccesso e riempire la camera con surnatante.
    4. Lasciare che il materiale si muova attraverso la capsula fino a quando il campione non viene accuratamente filtrato. Se la portata diventa troppo lenta (< ~ 1/10 della portata iniziale, o che esce a goccia rispetto a un flusso che scorre continuamente), attendere o applicare una forza delicata con una pompa peristaltica fino all'aumento della contropressione. In alternativa, ripristinare parzialmente le portate scollegando temporaneamente il filtro, risciacquando la biomassa accumulata dal lato di afflusso con acqua ultrapulenta fino a quando il materiale non è più visibilmente torbido, quindi riavviare il processo di filtrazione.

3. Concentrazione del campione di vescicole

  1. Opzione 1: eseguire l'ultrafiltrazione centrifuga per concentrare piccoli volumi (<500 ml) di campioni.
    1. Risciacquare i concentratori centrifughi di ultrafiltrazione da 15-20 ml di scelta con acqua di tipo I - ultrapura.
    2. Caricare i concentratori nella centrifuga e ruotare a 4.400 x g a 4 °C. Scartare la corsa e ripetere questo passaggio almeno altre due volte.
    3. Caricare il campione surnatante in concentratori risciacquati con acqua e ruotare nelle stesse condizioni. A seconda degli obiettivi sperimentali, il filtrato campione può essere scartato o raccolto per un'ulteriore concentrazione (con concentratori con un limite di peso molecolare nominale di 3 kDa) e analisi.
    4. Ripetere questo passaggio fino a quando il campione non è concentrato su un volume finale di ~ 15-30 ml.
  2. Opzione 2: eseguire la filtrazione a flusso tangenziale (TFF) per concentrare un grande volume di campione (>500 ml).
    1. Impostare l'apparecchio TFF secondo le linee guida del produttore (vedere Tabella dei materiali). Collegare una pompa peristaltica alla linea di aspirazione e posizionare morsetti regolabili sulla linea di retentato. Disinfettare il TFF come raccomandato dal produttore, quindi lavare il dispositivo con 1 L di tipo I - acqua di grado ultrapuro.
      NOTA: le linee di aspirazione e di ritenzione devono essere collocate in un serbatoio di campioni pulito (flacone di vetro). Le linee filtrate devono essere convogliate in un recipiente o in un lavandino per rifiuti.
    2. Aggiungere <0,2 μm di filtrato nel serbatoio del campione. Aumentare lentamente la velocità della pompa e i livelli di contropressione sulla linea di retentato per aumentare l'uscita dalle linee di filtrato.
    3. Continuare a far funzionare il TFF, riempiendo il serbatoio con il surnatante di coltura man mano che il materiale viene rimosso. Evitare che la linea di aspirazione esca dal campione durante la lavorazione per evitare l'introduzione di bolle d'aria. Assicurarsi che la pressione di alimentazione non superi ~ 10 psi e che il nuovo contenuto fuoriesca dal TFF a un ritmo costante nel serbatoio.
    4. Interrompere la concentrazione del campione una volta che il volume nel serbatoio raggiunge la quantità più bassa possibile necessaria per mantenere il flusso nella linea di aspirazione senza introdurre bolle d'aria.
    5. Chiudere la linea di deflusso con un morsetto. Rimuovere la contropressione sulla linea di retentato e ricircolare il surnatante concentrato attraverso il filtro per ~ 10 minuti, riducendo la velocità di ricircolo a 20-40 ml / min per massimizzare il recupero.
    6. Spostare la linea di retentato in un recipiente pulito, rimuovere la linea di aspirazione dal campione e raccogliere il materiale concentrato. Recuperare il materiale rimanente nel serbatoio del campione utilizzando una pipetta.
    7. Filtrare il surnatante concentrato attraverso un filtro a siringa da 0,2 μm (fase 2.2) per garantire che non rimangano cellule.
      NOTA: il passaggio 3.2.7 è facoltativo.
    8. Se necessario, conservare il concentrato finale a 4 °C per ~3 settimane prima di passare alla purificazione delle vescicole (fase 4).

4. Isolamento e purificazione delle vescicole

  1. Pellet direttamente mediante ultracentrifugazione seguendo i passaggi seguenti.
    1. Posizionare il campione di coltura concentrato <0,2 μm in un tubo ultracentrifuga pulito. Aggiungere un supporto pulito o un buffer secondo necessità per garantire che il tubo sia completamente riempito.
      NOTA: se il campione di coltura finale è troppo grande per essere inserito in un tubo, pellettare il materiale in più tubi da combinare prima delle fasi di lavaggio o pelletre serialmente nello stesso tubo.
    2. Se necessario, creare un equilibrio e ruotare a ~ 100.000 x g per 3 ore a 4 °C.
    3. Rimuovere con attenzione il surnatante con una pipetta. Mentre i pellet di vescicole cianobatteriche possono mostrare una certa colorazione, sono spesso invisibili.
    4. Lavare il materiale pellettato aggiungendo al tubo ultracentrifuga un terreno di coltura fresco o un tampone di lavaggio come 1x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) (vedere Discussione), mescolare delicatamente pipettando e girare di nuovo come al punto 4.1.2. Ripetere il processo di lavaggio una seconda volta.
    5. Risospesciare il pellet finale in coltura fresca pipettando ripetutamente ma delicatamente su e giù intorno al fondo del tubo con una pipetta da 1 mL. Trasferimento su una nave pulita.
  2. Eseguire l'ultracentrifugazione del gradiente di densità.
    1. Preparare le scorte di iodixanolo (vedere Tabella dei materiali) creando una versione concentrata 4x dello sfondo tampone desiderato per il campione (vedere Discussione).
    2. Mescolare una parte del tampone 4x con tre parti di brodo di iodixanolo al 60% per ottenere una soluzione di iodixanolo al 45%.
    3. Diluire il 45% di iodixanolo con volumi di 1x tampone per creare scorte di fluidi gradienti al 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15% e 10% di concentrazioni finali di iodixanolo.
      NOTA: la quantità totale necessaria varia in base alla capacità del rotore/dei tubi ultracentrifuga.
    4. Impostare un gradiente di densità ultracentrifuga sovrapponendo con cura quantità uguali di 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10% e 0% di iossindinolo in un tubo ultracentrifuga in modo tale da utilizzare l'intero volume del tubo.
      NOTA: Il campione di vescicola extracellulare da purificare deve essere posizionato nella parte superiore del gradiente come parte dello strato di iodixanolo allo 0%. Se il volume finale del campione di vescicole supera la dimensione dello strato dello 0%, mescolare qualsiasi campione di vescicola in eccesso con un numero sufficiente di iodixanolo al 45% e/o tampone per generare il volume richiesto delle scorte di optiprep a concentrazione pari o superiore al 10% e utilizzarle nella posizione corrispondente nel gradiente.
    5. Ruotare il gradiente a ~ 100.000 x g a 4 °C per 6 ore.
    6. Raccogliere le frazioni (in genere 0,5 mL ciascuna per un gradiente di ~ 4,5 mL) mediante un'attenta pipettizzazione o utilizzando un collettore di frazioni (vedere Tabella dei materiali).
    7. Determinare la densità di ciascuna frazione (in g/mL) utilizzando una bilancia analitica e una pipetta calibrata per misurare il peso di un volume noto di campione. Rimuovere il campione dalla provetta, determinare il peso e restituire direttamente il campione.
    8. Diluire le singole frazioni in un nuovo tubo ultracentrifuga con tampone pulito e lavare il materiale come indicato nei passaggi 4.1.2-4.1.4. In alternativa, utilizzare colonne di dialisi o ultrafiltrazione per recuperare le particelle.
      NOTA: le vescicole extracellulari cianobatteriche in genere migrano a densità galleggianti di ~ 1,14-1,19 g / mL in iodixanolo.
  3. Conservare le vescicole a 4 °C se devono essere utilizzate entro 1-3 settimane. Congelare le vescicole a -20 °C o -80 °C se non vengono utilizzate per un periodo superiore a tale periodo.

5. Caratterizzazione delle vescicole isolate

  1. Eseguire la microscopia elettronica a trasmissione di macchie negative (vedi Tabella dei materiali) (TEM; dimensione delle particelle, struttura, purezza).
    1. Per migliorare la qualità dell'immagine, scaricare il bagliore sulla superficie di una griglia TEM precedentemente rivestita utilizzando un sistema di scarica a bagliore secondo le linee guida del produttore (vedere Tabella dei materiali).
    2. Applicare con attenzione ~ 5 μL del campione di vescicole e lasciare riposare per 5 minuti.
      NOTA: i campioni con concentrazioni di vescicole >109 mL-1 in genere danno i migliori risultati; più campioni diluiti avranno poche vescicole per immagine.
    3. Rimuovere il campione toccando il bordo di una griglia su un pezzo di carta da filtro pulita.
    4. Pipettare una goccia di 20-50 μL di acetato di uranile al 2% (vedi Tabella dei materiali) su una superficie piana coperta da film plastico e posizionare la griglia che galleggia sopra di essa per 2 minuti.
    5. Rimuovere l'acetato di uranile usando carta da filtro e galleggiare brevemente su una goccia di acqua ultrapura per lavare. Ripeti il lavaggio dell'acqua una seconda volta.
      NOTA: la griglia asciutta finale è pronta per la visualizzazione dopo il passaggio 5.1.5.
  2. Eseguire la colorazione a sezione ultrasottile per TEM (dimensione delle particelle, struttura interna).
    1. Risospendare il pellet dal punto 4.1.5 con 1 mL di glutaraldeide al 2,5% in tampone cacodilato di sodio da 0,1 M (pH 7) (vedere Tabella dei materiali) e fissare il campione per 2 ore a 4 °C.
    2. Ruotare a ~100.000 x g per 1 ora a 4 °C.
    3. Lavare accuratamente il pellet con tampone di cacodilato di sodio 0,1 M (pH 7), quindi girare a ~100.000 x g per 1 ora a 4 °C.
    4. Fissare il pellet con 1 mL di tetrossido di osmio all'1% (vedere Tabella dei materiali) (preparato in tampone cacodilato di sodio da 0,1 M) per 1 ora, quindi lavare come al punto 5.2.3.
    5. Disidratare il campione con 1 mL di una serie ascendente di etanolo (50%, 70%, 90% e due volte in etanolo assoluto) in fasi di 10 minuti ciascuna a 4 °C.
    6. Aggiungere 250 μL di resina epossidica (vedi Tabella dei materiali) miscelata con etanolo assoluto (1:1) al pellet e incubare durante la notte a 4 °C.
    7. Trasferire il pellet a 500 μL di resina pura per 24 ore. Quindi, incubare la resina a 65 °C per 48 ore.
      NOTA: La resina è ora pronta per il sezionamento mediante ultramicrotomo, seguendo le istruzioni del produttore (vedere Tabella dei materiali).
    8. Macchiare le griglie contenenti sezioni con il 2% di acetato di uranile (in etanolo al 50%) per 5 min. Lavare delicatamente gli scivoli sotto l'acqua deionizzata corrente per 10-15 s ciascuno. Posizionare una goccia di citrato di piombo (vedi Tabella dei materiali) e macchiare per altri 5 minuti.
    9. Lavare come prima, rimuovere l'acqua tamponando la griglia su una carta da filtro e asciugare all'aria le griglie. Visualizza per TEM secondo le linee guida del produttore (vedi Tabella dei materiali).
  3. Eseguire analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA) (dimensione delle particelle, concentrazione).
    1. Utilizzando la carta per lenti, pulire accuratamente qualsiasi polvere o materiale visibile dal piatto ottico. Verificare che tutti gli O-ring e le altre guarnizioni siano puliti e intatti. Accendere lo strumento e avviare il software.
    2. Utilizzando una siringa pulita, riempire la camera con acqua ultrapura. Assicurarsi che non siano presenti bolle d'aria.
    3. Fare clic su Avvia fotocamera e visualizzare la regione ottimale della camera sulla "identificazione personale". Regolare lo stadio del microscopio orizzontalmente o verticalmente secondo necessità in modo che l'intensità del segnale sia uniforme in tutta la regione ripresa. Spostare l'area di imaging orizzontalmente rispetto all'impronta digitale (a destra, verso la linea verticale), trovando una regione vicina con un segnale di sfondo basso.
    4. Far scorrere i cursori Screen Gain e Camera Level al massimo, quindi diminuire al livello più basso per vedere le particelle più deboli.
      NOTA: le impostazioni tipiche per le vescicole cianobatteriche utilizzano un guadagno dello schermo di 7 e un livello della fotocamera compreso tra 10 e 12.
    5. Regolate la messa a fuoco secondo necessità per assicurarvi che le particelle siano approssimativamente ugualmente visibili in tutto il campo visivo. Continuare a spingere l'acqua ultra-pulita attraverso la camera fino a quando non si è confermato visivamente che la camera è pulita.
    6. Rimuovere l'acqua residua dalla camera usando una siringa diversa.
    7. Esaminare un campione del supporto/tampone in cui si trova il campione per determinare la concentrazione di particelle di fondo riempiendo la camera con un supporto/tampone utilizzando una siringa pulita da 1 mL.
    8. Selezionare Misurazione standard dalla casella a discesa SOP . Modifica le impostazioni per raccogliere almeno tre repliche tecniche di video di 60 s ciascuna. Premere Crea ed esegui script e seguire le istruzioni. Spingere ~ 100 μL di campione nella camera tra le repliche.
    9. Al termine dell'acquisizione, rimuovere il tampone residuo con una siringa, lavare 3-5 ml di acqua ultrapura attraverso la camera e rimuovere l'acqua rimanente.
    10. Aggiungere il campione di vescicola alla camera utilizzando una siringa da 1 mL e confermare le impostazioni di acquisizione. Se il conteggio delle particelle non rientra nell'intervallo lineare dello strumento (in genere tra 20-80 particelle / fotogramma), il campione dovrà essere diluito o concentrato. Spingere almeno 500 μL di campione nella camera prima di raccogliere i dati.
    11. Raccogli i dati video come nel passaggio 5.3.8, assicurandoti di pulire la camera con acqua ultrapura tra campioni diversi.
    12. Raccogliere tutti i campioni successivi dallo stesso organismo/esperimento utilizzando impostazioni identiche della telecamera per garantire la comparabilità dei dati; le modifiche nell'impostazione Livello fotocamera possono avere un effetto notevole sui valori finali ottenuti.
    13. Determinare i parametri delle particelle utilizzando la sezione di analisi del software. Selezionare Analisi > Apri esperimento e caricare il file di esempio. Selezionate Elabora file selezionati (Process Selected Files ) e attendete il completamento dell'analisi. Assicurarsi di utilizzare la stessa soglia di rilevamento per tutti i campioni successivi dello stesso esperimento.
      NOTA: poiché le vescicole cianobatteriche sono spesso deboli, la soglia di rilevamento dovrà in genere essere regolata al valore più sensibile (più basso).
  4. Eseguire la diffusione dinamica della luce (DLS) (dimensione delle particelle, potenziale zeta).
    1. Filtrare attraverso un filtro di dimensioni dei pori di 0,2 μm per qualsiasi campione che entra nel DLS per escludere particelle di grandi dimensioni che interferiscono con le misurazioni.
    2. Aggiungere 1 mL del supporto/tampone in una cuvetta pulita per esaminare possibili aggregazioni o altre nanoparticelle provenienti dal mezzo. Mettere la cuvetta con il lato smerigliato a sinistra nel micro campionatore e chiudere il coperchio. Lasciare equilibrare il campione per almeno 5 minuti.
    3. Inserire l'indice di rifrazione del materiale e l'assorbimento del materiale se differiscono in modo significativo dai valori predefiniti per l'acqua.
      NOTA: le proprietà del materiale avrebbero pochissima influenza se le vescicole fossero più piccole di 100 nm. Quando si misura il potenziale superficiale (potenziale zeta) dei veicoli elettrici, le vescicole devono essere risospese nel mezzo di crescita originale.
    4. Fare clic su Pannello di controllo strumenti per controllare le letture e avviare l'acquisizione dei dati facendo clic sull'icona verde. Se i valori hanno un bell'aspetto e il supporto/buffer non contiene aggregazioni o altre particelle, ora si è pronti per misurare il campione.
    5. Aggiungere 1 mL di campione di vescicola in una cuvetta pulita e raccogliere i dati come indicato al punto 5.4.4. Raccogli almeno tre repliche tecniche per 10 minuti ciascuna.
  5. Eseguire l'analisi del lipopolisaccaride (LPS) per confermare che i veicoli elettrici Gram-negativi sono presenti nel campione.
    1. Denaturare il campione di vescicole a 95 °C per 10 minuti in 1x tampone campione Laemmli standard (vedere Tabella dei materiali).
    2. Incubare con 0,2 U di proteasi di tipo XIV da Streptomyces griseus (vedi Tabella dei materiali) a 37 °C per 30 minuti per rimuovere le glicoproteine contaminanti.
    3. Separare i campioni trattati mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide SDS al 16% (p/v) secondo il protocollo16 precedentemente pubblicato.
    4. Per rilevare LPS, colorare il gel con kit di colorazione disponibili in commercio o con una tecnica di colorazione dell'argento modificata28. Quantificare l'abbondanza relativa di LPS mediante analisi densitometrica di gel colorati come da riferimenti29,30 precedentemente pubblicati.

6. Misurazioni del tasso di produzione delle vescicole

  1. Utilizzando l'analisi di tracciamento delle nanoparticelle come nel passaggio 5.3, o tecnologia equivalente, misurare la concentrazione di particelle nel mezzo di crescita per l'esperimento. Se viene rilevato un elevato numero di particelle, filtrare attraverso un filtro dei pori da 0,1 μm e ricontrollare.
    NOTA: per ridurre al minimo l'errore, la concentrazione di particelle di fondo del fluido deve essere inferiore al 10% della concentrazione di particelle riscontrata nelle colture alla densità più bassa.
  2. Acclimatare la coltura facendo crescere le cellule per almeno due successivi trasferimenti seriali nelle condizioni medie e ambientali desiderate per gli esperimenti come al punto 1.1.2. Le culture devono essere trasferite mentre sono ancora nella fase di crescita esponenziale. Garantire che i tassi di crescita della cultura misurati siano coerenti tra i trasferimenti; in caso contrario, continuare a trasferire colture fino a quando i tassi di crescita non saranno riproducibili.
  3. Raccogliere campioni di time-course al momento dell'inoculazione e intervalli regolarmente cronometrati attraverso la curva di crescita nella fase stazionaria iniziale. Scaglionare i punti temporali per avere un minimo di 3-4 campioni raccolti attraverso l'intera gamma di crescita esponenziale. Per eseguire il campionamento in ogni punto temporale, eseguire la procedura seguente.
    1. Filtrare 1 mL o più di coltura direttamente attraverso un filtro a siringa pulito e sterile da 0,2 μm e salvare il filtrato per misurare la concentrazione di vescicole come al punto 5.3. Congelare i campioni del corso temporale, se lo si desidera. Utilizzare la fluorescenza relativa per seguire le dinamiche di crescita della cultura.
    2. Salvare un campione dell'intera coltura per determinare le dimensioni della popolazione utilizzando un metodo appropriato per l'organismo (citometria a flusso; placcatura delle colonie; o altro).
  4. Ottenere misurazioni di cellule e particelle vescicolari (per mL) in ogni punto temporale.
  5. Identificare i timepoint che si sono verificati durante la fase di crescita esponenziale. Per calcolare r, il numero di vescicole prodotte per cellula per generazione, tra due punti durante la crescita esponenziale (tipicamente l'inizio e la fine del corso temporale), utilizzare l'equazione fornita nel File supplementare 1.
    NOTA: questo metodo è valido solo in condizioni di crescita in stato stazionario; le ipotesi sottostanti e la derivazione del calcolo sono dettagliate nel riferimento14.

Representative Results

La Figura 1 presenta una panoramica del processo di isolamento delle vescicole cianobatteriche, evidenziando gli aspetti chiave del protocollo qui descritto. Di particolare rilievo sono le fasi che dettagliano la separazione della biomassa cianobatterica dalla frazione di piccole particelle (vescicole), concentrando il campione di vescicole e l'isolamento e la purificazione delle vescicole (Figura 1, fasi da 2 a 4), che sono fondamentali per ottenere preparazioni riproducibili di vescicole. La Figura 2 presenta risultati rappresentativi dell'isolamento e della caratterizzazione delle vescicole extracellulari dal cianobatterio Synechocystis sp. PCC 6803. La membrana esterna di questo cianobatterio ha dimostrato di contenere carotenoidi31, che conferiscono una caratteristica colorazione arancione ai campioni di vescicole raccolti mediante pellettizzazione diretta attraverso ultracentrifugazione (Figura 2A). Una volta che il pellet di vescicole è stato risospeso, le vescicole possono essere esaminate mediante microscopia elettronica a trasmissione (TEM), sia colorando negativamente campioni con acetato di uranile (Figura 2B) o osservando sezioni ultrasottili (Figura 2C). La distribuzione e la concentrazione delle dimensioni delle vescicole possono essere valutate utilizzando la diffusione dinamica della luce (DLS) (Figura 2D) e le analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA) (Figura 2E). Con il protocollo descritto, in genere ~ 3,5 ± 1,0 x 108 nanoparticelle per mL sono state ottenute in una coltura in crescita esponenziale di Synechocystis sp. PCC 6803 ad un OD730 di 1,0. Le analisi biochimiche dei veicoli elettrici isolati possono essere eseguite per integrare la caratterizzazione fisica delle vescicole isolate. Ad esempio, le vescicole purificate di Synechocystis sp. PCC 6803 sono state separate su un gel di poliacrilammide SDS e colorate per lipopolisaccaridi (LPS; Figura 2F). Poiché gli LPS sono specifici per la membrana esterna32, il rilevamento LPS può convalidare la presenza di vescicole legate alla membrana e fungere da marcatore per l'analisi del contenuto relativo delle vescicole tra i preparati dello stesso ceppo33. L'ispezione dell'abbondanza relativa di LPS a basso e alto peso molecolare può indicare cambiamenti nella composizione delle vescicole tra i campioni34,35.

Figure 1
Figura 1: Procedure sperimentali utilizzate per l'isolamento e la caratterizzazione cianobatterica dei veicoli elettrici. Rappresentazioni schematiche di colture in crescita (1) e separazione della biomassa cianobatterica dal mezzo di crescita (2). I campioni privi di cellule contenenti vescicole sono concentrati (3), quindi i veicoli elettrici vengono isolati e purificati (4). A seconda dell'applicazione, i preparati di vescicole possono essere caratterizzati utilizzando una o una combinazione di microscopia elettronica a trasmissione (TEM), analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA), diffusione dinamica della luce (DLS) e profilazione del lipopolisaccaride (LPS) (5). RT, temperatura ambiente. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Risultati rappresentativi dell'isolamento delle vescicole extracellulari e della caratterizzazione per il cianobatterio Synechocystis sp. PCC 6803. (A) Fotografia del pellet di vescicole extracellulari (EVs pellet) ottenuto dopo ultracentrifugazione del mezzo extracellulare concentrato privo di cellule da una coltura di Synechocystis sp. PCC 6803 da 600 mL coltivata a un OD730 di 1,0-1,5. Si noti la tipica colorazione arancione del pellet di vescicole derivato dai carotenoidi presenti nella membrana esterna. (B,C) Fotografie al microscopio elettronico a trasmissione (TEM) di sezioni macchiate negativamente (B) e ultrasottili (C) di campioni di vescicole PCC 6803. Barre di scala: 200 nm e 50 nm, rispettivamente. I campioni sono stati visualizzati su un microscopio elettronico a trasmissione azionato a 80 kV. (D) Tipico diagramma a diffusione dinamica della luce (DLS) raffigurante la distribuzione del volume delle vescicole in funzione del diametro delle vescicole (in nm). Le linee colorate indicano i dati di tre misurazioni tecniche di replica dello stesso campione. (E) Dati rappresentativi di analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA) della distribuzione extracellulare delle dimensioni delle vescicole di Synechocystis (in nm). La linea nera indica la media di tre repliche tecniche e le linee rosse rappresentano l'errore standard della media. (F) Il profilo dei lipopolisaccaridi (LPS) è stato rilevato dopo aver separato la preparazione della vescicola mediante elettroforesi su un gel SDS-poliacrilammide al 16% (p/v) e la colorazione con un kit di colorazione LPS commerciale. Sono rilevabili LPS a basso e alto peso molecolare, corrispondenti rispettivamente a forme LPS ruvide e lisce. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

File supplementare 1: Equazione per calcolare r. Il numero di vescicole prodotte per cellula per generazione tra due punti durante la crescita esponenziale (tipicamente l'inizio e la fine del corso del tempo) è determinato usando questa equazione. Fare clic qui per scaricare questo file.

Discussion

Considerazioni generali
Il protocollo (Figura 1) è presentato come un insieme di opzioni per evidenziare che non esiste un metodo "taglia unica" per lavorare con vescicole extracellulari cianobatteriche. I ricercatori interessati possono utilizzare le sezioni di questo protocollo che sono compatibili e appropriate per il loro particolare organismo modello, domande / obiettivi sperimentali e disponibilità di attrezzature. Tutti gli approcci di isolamento delle vescicole comportano compromessi e si tradurranno inevitabilmente in un certo grado di pregiudizio. Mentre si dovrebbe cercare di minimizzare questo quando possibile, la considerazione più cruciale è quella di garantire che la metodologia dettagliata utilizzata sia riportata secondo le linee guida MISEV (Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles)36.

Crescita della cultura
Le colture cianobatteriche possono essere facilmente ottenute da una delle tante collezioni di colture disponibili in tutto il mondo. Alcuni esempi sono la Roscoff Culture Collection (Station Biologique de Roscoff, Francia), la Pasteur Culture Collection (Institute Pasteur, Parigi, Francia) e il Provasoli-Guillard National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA, Maine, USA). Il ceppo cianobatterico scelto deve essere coltivato nelle condizioni medie e ambientali appropriate, variando in modo significativo tra i diversi ceppi. Un elenco di mezzi comunemente usati per la coltivazione cianobatterica può essere trovato su siti web di raccolta di colture o altre pubblicazioni 37,38,39.

Lavorare con vescicole extracellulari cianobatteriche presenta alcune sfide uniche rispetto alle metodologie riportate per molti tipici modelli di eterotrofi di laboratorio. Le colture cianobatteriche hanno concentrazioni di vescicole di ordini di grandezza inferiori a quelle che si trovano in altri microbi come Escherichia coli 14,16,40. Queste differenze, presumibilmente derivanti da densità cellulari più basse e/o tassi di produzione di vescicole, significano che possono essere necessarie colture relativamente grandi (~ 1-20 L o più) per produrre materiale sufficiente per analisi di massa. Pertanto, i ricercatori sono incoraggiati a testare le rese di vescicole da colture su scala più piccola per determinare quanto materiale sarà necessario per raggiungere gli obiettivi finali desiderati. Anche l'importanza di stabilire se il mezzo utilizzato per l'esperimento ha un fondo di particolato rilevabile deve essere sottolineata prima di iniziare qualsiasi esperimento, poiché tale materiale può potenzialmente confondere la quantificazione della popolazione delle vescicole, ridurre la sensibilità delle misurazioni della concentrazione / dimensione delle vescicole o contaminare i preparati finali delle vescicole.

Un'altra sfida per il campo è che non tutti i cianobatteri crescono bene, o affatto, in pura cultura. Fino a quando non saranno rese aspre, le interpretazioni delle caratteristiche fisiche delle vescicole, dei tassi di produzione o del contenuto non possono necessariamente portare a conclusioni chiare sulle vescicole prodotte da qualsiasi ceppo nella comunità. Si consiglia inoltre ai ricercatori di considerare quali altri tipi di particelle potrebbero essere presenti e potenzialmente confusi con le vescicole da specifici strumenti di analisi delle nanoparticelle, che non possono necessariamente discriminare tra diversi tipi di particelle. Ad esempio, può essere essenziale verificare che il ceppo utilizzato manchi di un profago, tramite sequenziamento del genoma, saggi di induzione o altri mezzi o non rilasci altri tipi di particolato. Nella nostra esperienza, la maggior parte delle vescicole cianobatteriche hanno un diametro di < 0,2 μm, ma quando si osserva un nuovo ceppo o condizione di crescita, si dovrebbe confermare se l'uso di un filtro di dimensioni dei pori di 0,45 μm altera la distribuzione dimensionale delle particelle purificate.

Molti aspetti delle condizioni di coltura possono influenzare la produzione di vescicole e il suo contenuto41,42. Pertanto, le condizioni fisiche e chimiche utilizzate per la crescita della coltura (compresa l'irradianza luminosa, la temperatura e la composizione dei mezzi) devono essere documentate e controllate nella misura possibile per garantire la riproducibilità dei risultati. Qualsiasi analisi chimica del contenuto delle vescicole deve tenere conto della composizione di fondo, in particolare quando si eseguono analisi ad alta produttività in stile "omico". Questo può essere particolarmente critico quando si utilizzano mezzi indefiniti, come quelli basati su uno sfondo naturale di acqua di mare o integrati con estratto di lievito o triptone. L'uso di un mezzo di crescita definito può essere preferibile a seconda degli obiettivi sperimentali.

I ricercatori devono monitorare attentamente le dinamiche di crescita della coltura a intervalli regolari per assicurarsi di sapere dove si trova una determinata coltura batch e non solo raccogliere campioni dopo un periodo di tempo arbitrario. La composizione delle vescicole può variare tra le fasi di crescita, in particolare tra le fasi esponenziali e stazionarie41,42. Ad esempio, almeno una frazione di vescicole campionate nella fase stazionaria può derivare da un diverso meccanismo cellulare, come la lisi cellulare, che non si verificherà durante la crescita esponenziale. Anche se questo può ancora essere di grande interesse biologico, è essenziale conoscere il campione. Se una coltura cianobatterica raggiunge la fase di crescita desiderata in un momento in cui non è possibile procedere direttamente alla concentrazione del campione, si consiglia di separare immediatamente le cellule dalla frazione < 0,2 μm (con centrifugazione e/o filtrazione diretta da 0,2 μm) e quindi conservare il filtrato cell-free a 4 °C. Il materiale può essere conservato in questo modo per giorni con un impatto minimo o nullo sulla concentrazione o sulla distribuzione dimensionale delle vescicole.

Purificazioni di vescicole
La frequente necessità di isolare le vescicole da colture di volume significativo è vitale nel flusso di lavoro di isolamento delle vescicole cianobatteriche. Quando si lavora con volumi maggiori di materiale, le vescicole dovranno essere concentrate prima dei flussi di lavoro di separazione a valle. I concentratori (membrane filtranti a flusso tangenziale o colonne centrifughe) con un limite di peso molecolare nominale di 100 kDa sono generalmente consigliati, in quanto consentono la separazione da materiale solubile a basso peso molecolare mantenendo ragionevoli i tempi di concentrazione, ma anche i filtri da 30 kDa sono spesso utilizzati con successo. Mentre diversi metodi non ultracentrifugati per purificare le vescicole (ad esempio, cromatografia di esclusione dimensionale, sistemi basati su microfluidica, tecniche di cattura dell'affinità e approcci basati sulla precipitazione) stanno diventando popolari nel campo delle vescicole extracellulari, nella nostra esperienza, questi approcci possono comportare una diminuzione delle rese e sono in genere incompatibili con i volumi di coltura necessari.

I ricercatori devono considerare la composizione dello sfondo di iodixanolo e i tamponi di lavaggio / risospensione utilizzati durante la purificazione delle vescicole per garantire che siano compatibili con le applicazioni a valle desiderate. In molti casi, il campione finale di vescicola può essere risospeso in mezzi di crescita o in un tampone definito paragonabile per composizione al mezzo di crescita (ad esempio, acqua di mare naturale o artificiale). Tuttavia, questo potrebbe non essere possibile con le vescicole cianobatteriche marine, che richiederanno ulteriori manipolazioni sperimentali per l'analisi, poiché alte concentrazioni di sale simili ai livelli di acqua di mare possono inibire molte reazioni enzimatiche. In questi casi, i tamponi di laboratorio standard come 0,2 μm filtrati, 1x PBS in genere funzionano bene per mantenere la stabilità delle vescicole cianobatteriche marine e possono essere più compatibili con i processi sperimentali a valle.

La purificazione del gradiente di densità può essere considerata facoltativa a seconda degli obiettivi sperimentali e della composizione della coltura, ma è fortemente raccomandata per produrre un campione più rigorosamente puro e riproducibile. Le popolazioni ev sono eterogenee e possono essere trovate in una gamma di densità galleggianti, che variano ulteriormente in base alla deformazione, alle condizioni di crescita e ad altri fattori 4,5,6. Le densità sopra elencate rappresentano quelle tipicamente trovate per le vescicole provenienti da colture cianobatteriche e campioni di campo in iodixanolo, ma i risultati in altri ceppi possono variare. Altri materiali con gradiente di densità come il saccarosio e il CsCl possono essere utilizzati per le vescicole, ma migreranno a diverse densità di galleggiamento in questi sfondi. Diversi background di gradienti possono influenzare il recupero dei virus lipidici43 e potrebbero potenzialmente influenzare il recupero delle vescicole da diversi ceppi.

Le vescicole possono essere perse in più punti attraverso l'isolamento delle vescicole e il processo di purificazione del gradiente qui descritto, riducendo le rese e aumentando la quantità di materiale di partenza necessaria per ottenere una determinata resa finale delle vescicole per le applicazioni a valle. Particolare attenzione deve essere prestata quando si lavora con pellet di vescicole dopo l'ultracentrifugazione. Mentre alcune vescicole cianobatteriche possono avere carotenoidi o altri composti che possono prestare a campioni di vescicole una certa quantità di pigmentazione (Figura 2), a seconda della deformazione o della quantità di materiale, non ci si aspetta necessariamente che sia in grado di visualizzare direttamente il pellet di vescicole. Essere consapevoli di dove ci si aspetta che il pellet venga dato il tipo di rotore della centrifuga utilizzato. Quando possibile, si suggerisce di esaminare al microscopio elettronico campioni di vescicole purificate per verificare la composizione del materiale finale recuperato.

L'impatto delle condizioni di conservazione sulle vescicole e sul loro contenuto rimane una questione aperta. Sebbene si sia riscontrato che la conservazione non ha un effetto notevole sulla dimensione delle vescicole cianobatteriche o sulla concentrazione14, la funzionalità dei preparati di vescicole isolate può cambiare nel tempo44. Mentre i cicli di congelamento/ disgelo dovrebbero essere evitati quando possibile, l'impatto del congelamento dei campioni sul numero e sulle dimensioni complessive delle vescicole sembra essere minimo. Si dovrebbe essere consapevoli del potenziale dei cicli di congelamento-disgelo per influenzare la composizione del contenuto di vescicole, come la lunghezza degli acidi nucleici associati alle vescicole o la stabilità delle proteine.

Vescicole da field samples
Gli attuali metodi per isolare le vescicole extracellulari dagli ambienti acquatici naturali sono concettualmente e operativamente simili a quelli descritti qui per le colture di grandi volumi. Tuttavia, possono richiedere volumi di materiale ancora maggiori. Tali campioni sul campo possono comportare la raccolta, la filtrazione e la concentrazione di centinaia o migliaia di litri di acqua per ottenere materiale sufficiente per l'analisi. A seconda della torbidità del campione utilizzato, potrebbe essere necessaria l'incorporazione di una o più fasi di prefiltrazione prima del filtro da 0,2 μm. Il dispositivo TFF specifico utilizzato dovrebbe essere appropriato per lavorare con volumi così grandi in un ragionevole lasso di tempo (idealmente nell'ordine delle ore) e senza esercitare una pressione eccessiva sul campione. In pratica, ciò comporta spesso l'utilizzo di una superficie totale molto maggiore di quella che potrebbe essere applicata ai campioni basati sulla coltura, nonché tubi di diametro maggiore per facilitare l'aumento delle portate. Questa maggiore superficie del filtro porterà probabilmente ad un aumento marginale delle perdite di particelle rispetto alle disposizioni TFF più piccole e a un volume finale maggiore di concentrato; tuttavia, queste preoccupazioni devono essere bilanciate con considerazioni sul tempo totale di elaborazione. Per situazioni come una crociera oceanografica prolungata in cui i campioni non torneranno in laboratorio per molti giorni dopo il campionamento, si consiglia di eseguire la filtrazione iniziale di 0,2 μm e le fasi TFF sul campo. Questo volume minore di materiale concentrato può quindi essere immagazzinato a 4 °C o -80 °C a bordo (a seconda della disponibilità e delle considerazioni analitiche a valle) fino a quando non viene restituito al laboratorio per la lavorazione finale.

L'isolamento e la separazione delle vescicole extracellulari da altre piccole particelle, sia organiche che inorganiche, possono essere impegnative e i metodi per separare le diverse particelle non sono ancora perfetti. Ad esempio, i gradienti di densità dello iodixanolo potrebbero non separare facilmente tutte le classi di vescicole e virus presenti in un dato campione. Poiché i tipi di particelle confondenti e le loro proprietà fisiche variano tra i siti di campionamento, è attualmente impossibile fornire un protocollo che partiziona in modo robusto tutte le classi di piccole particelle acquatiche. Tentativi ed errori sono essenziali e sarà necessaria la sperimentazione con la gamma di iodixanolo utilizzata nelle condizioni di gradiente e ultracentrifugazione per massimizzare la separazione; può anche essere necessaria una raccolta di frazioni di densità più piccole e più finemente risolte. A seconda del contesto, l'uso di gradienti CsCl invece di iodixanolo può aiutare a separare le particelle ambientali45. Tuttavia, il cambiamento delle condizioni osmotiche potrebbe portare a distorsioni nei prodotti finali recuperati, come discusso sopra.

Caratterizzazione delle vescicole
Gli strumenti di analisi delle nanoparticelle non sono ancora regolarmente disponibili nei laboratori di microbiologia, ma stanno diventando sempre più disponibili. Tutte le metodologie hanno pro e contro, e non facciamo alcuna approvazione specifica di una piattaforma come migliore di tutte le altre per il lavoro delle vescicole cianobatteriche; in effetti, tutti hanno particolari compromessi riguardanti costi, risoluzione, facilità d'uso, limiti di rilevamento, compatibilità con diversi media di crescita / sfondi buffer e riproducibilità dei dati. Oltre agli strumenti basati sull'analisi di tracciamento delle nanoparticelle sopra descritta, altri approcci, tra cui la citometria a nanoflusso, il rilevamento di impulsi resistivi microfluidici e il rilevamento di impulsi resistivi sintonizzabili, possono essere applicati46,47. Gli utenti dovrebbero fare attenzione a conoscere i dettagli della loro strumentazione disponibile e verificare che funzioni bene con il loro sistema, poiché abbiamo riscontrato difficoltà quando si utilizzano alcune piattaforme con supporti a base di acqua di mare. Incoraggiamo il campo a muoversi verso la caratterizzazione quantitativa delle dimensioni delle vescicole, delle concentrazioni e dei tassi di produzione. Misurare le concentrazioni di vescicole su una particella fondamentale per mL, e non in termini di contenuto proteico o altre metriche, consentirà l'integrazione delle vescicole in quadri più quantitativi e consentirà l'intercomparazione tra ceppi e condizioni. Sono necessari ulteriori sforzi per migliorare la capacità di calibrare le misurazioni della concentrazione per particelle <100nm.

Il fatto che le misurazioni della velocità di produzione delle vescicole vengano eseguite direttamente dal surnatante di coltura filtrato da 0,2 μm per ridurre al minimo le perdite di particelle sarebbe associato ad altre fasi di purificazione sopra descritte. Tuttavia, ciò significa che l'approccio non discrimina necessariamente tra vescicole extracellulari reali e altre piccole particelle presenti nelle colture. Solo il conteggio delle particelle all'interno di intervalli di dimensioni specifici (ad esempio, diametro 50-250 nm) può aiutare a escludere alcuni valori anomali, ma la conferma visiva che i contenuti di coltura di < 0,2 μm pellettati sembrano essere vescicole legate alla membrana (tramite TEM o altri approcci) è necessaria per poter affermare specificamente che si sta misurando la produzione di vescicole rispetto alla produzione di particelle simili a vescicole.

Un fattore essenziale nella caratterizzazione delle vescicole è garantire che il campione di vescicole venga analizzato nell'intervallo di sensibilità lineare appropriato del dispositivo di analisi delle nanoparticelle. Quando un campione è troppo concentrato, è semplice diluire quel materiale con un buffer pulito e rianalizzarlo. D'altra parte, la densità relativamente bassa di cellule e / o vescicole di alcune colture cianobatteriche può talvolta produrre preparati di vescicole che sono al di sotto dei limiti di rilevamento di alcuni strumenti. Nei casi in cui ciò si verifica con la purificazione delle vescicole sfuse, si può prendere in considerazione la crescita di colture di volume maggiore, la ricombinatura e la risospendizione del materiale finale in un volume più piccolo, o la valutazione se esiste una fase del processo di isolamento in cui si verificano perdite eccessive e potrebbero essere mitigate. Quando si misurano i tassi di produzione di vescicole, le correzioni non sono necessariamente così semplici. I campioni possono essere concentrati se necessario, ma il primo dovrebbe vedere se gli aggiustamenti al mezzo potrebbero comportare densità cellulari più elevate o se campioni sufficientemente concentrati potrebbero essere ottenuti da punti temporali successivi durante la fase esponenziale in cui le concentrazioni saranno più elevate.

Limitazioni
Come con qualsiasi protocollo, l'isolamento delle vescicole utilizzando questi approcci ha chiari limiti. Questi approcci non si basano sulla loro garanzia che una preparazione completamente pura di vescicole sarà isolata. Sia le colture che i campioni di campo possono contenere altri materiali, che migrano in modo simile alle vescicole nei gradienti di densità. Tuttavia, come minimo, questi tipi di metodologie di purificazione aggiuntive sono essenziali per garantire rigore e riproducibilità dell'analisi delle vescicole. Mentre descriviamo gli approcci di isolamento delle vescicole nel contesto dei cianobatteri, le colture di molti altri microbi conterranno anche vescicole a concentrazioni relativamente basse e le procedure qui descritte dovrebbero essere generalmente applicabili. Si prevede che questi metodi serviranno non come protocollo permanente, ma piuttosto come punto di partenza per stimolare futuri progressi nel lavoro con vescicole extracellulari di diversi microbi. Sono necessari sforzi futuri per fondere questi metodi con altri approcci come le colonne di esclusione delle dimensioni o il frazionamento asimmetrico del flusso di campo per migliorare la discriminazione e la separazione di diverse categorie di piccole particelle da colture e campioni ambientali. Siamo anche fiduciosi che queste tecniche possano continuare ad evolversi insieme ai miglioramenti nelle tecnologie di caratterizzazione delle nanoparticelle per migliorare la capacità di esaminare l'eterogeneità all'interno delle popolazioni di vescicole, il loro contenuto e i loro esatti ruoli funzionali nell'ambiente.

Disclosures

Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.

Acknowledgments

Gli autori riconoscono il sostegno delle piattaforme scientifiche i3S "Biointerfacce e nanotecnologie" e "Istologia e microscopia elettronica", membro dell'infrastruttura nazionale Piattaforma portoghese di bioimaging (PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122). Ringraziamo anche il Prof. J. A. Gonzalez-Reyes (Università di Córdoba, Spagna) per aver contribuito a ottimizzare il protocollo di colorazione della sezione ultrasottile per TEM, e la Dott.ssa Cecília Durães e la Dott.ssa Ana Rita Pinto (Università di Porto, Portogallo) per l'analisi di tracciamento delle nanoparticelle.

Questo lavoro è stato finanziato dalla US National Science Foundation (OCE-2049004 to SJB), dal Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER) attraverso il COMPETE 2020 Operacional Programme for Competitiveness and Internationalisation (POCI), Portogallo, 2020, e da fondi portoghesi attraverso Fundação para a Ciência e a Tecnologia/Ministério da Ciência, Tecnologia e Ensino Superior nell'ambito del progetto POCI-01-0145-FEDER-029540 (PTDC/BIA-OUT/29540/2017 to PO). Fundação para a Ciência e a Tecnologia è anche fortemente riconosciuta per la borsa di dottorato SFRH / BD / 130478/2017 (SL) e la sovvenzione FCT Investigator IF / 00256 / 2015 (PO). M.C.M.-M. è stato sostenuto da una borsa di studio individuale Marie Skłodowska-Curie (gruppo di esperti sul reinserimento) nell'ambito del programma quadro Orizzonte 2020 (H2020-MSCA-IF-2018-RI-844891).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1x Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 Home-made buffer --- Standard wash/storage buffer which can be used with vesicles; can be made in lab or purchased commercially
2% Uranyl acetate solution Electron Microscopy Sciences 22400-2 Negative staining - TEM
4x Laemmli Sample Buffer Bio-Rad 161-0747 Denaturation of vesicle sample prior to proteolysis, required for lipopolysaccharides (LPS) staining
Amicon Ultra Centrifugal Filters (100 kDa) Merck UFC9100XX Alternative option for centrifugal ultrafiltration
BG11 medium Home-made medium --- Medium for cultivation of Synechocystis sp. PCC 6803
Carbon Support Film 200 Mesh, copper. CF200-Cu Electron Microscopy Sciences 71150 Transmission electron microscopy (TEM) grid
easiGlow Glow Discharge Cleaning System Ted Pella 91000 Commercial TEM grid glow discharger
EMbed 812 epoxy resin Electron Microscopy Sciences 14120 Ultra-thin sections - TEM
Filter holder for vacuum system Thermo Fisher Scientific 300-4000 Reusable units with filter membrane support plates
Glutaraldehyde  Grade I Sigma-Aldrich G5882-10X1ml Ultra-thin sections - TEM
HEPES [N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid) sodium salt] Sigma-Aldrich H7006 Buffering agent for cyanobacterial growth media
Lead Citrate, Trihydrate Electron Microscopy Sciences 17800 Stain for use in electron microscopy
Macrosep Advance Centrifugal Devices with Omega Membrane 100K Pall MAP100C36 For centrifugal ultrafiltration of small volume samples
Millipore Pellicon 3 TFF Module EMD Millipore XX42P0060 or XX42P0080 Alternative TFF option for concentrating large volume samples
Milli-Q Reference Water Purification System Merck Z00QSV0WW Water purification system for obtaining type I ultrapure grade water
NanoSight Malvern Panalytical LM14 or NS300 Nanoparticle tracking analysis
Optima L80 XP Ultracentrifuge Beckman Coulter L80 XP Ultracentrifuge (or similar model)
OptiPrep / Iodixanol Sigma-Aldrich D1556 Density gradient media
Osmium Tetroxide Reagent Plus Sigma-Aldrich 201030 Ultra-thin sections - TEM
Pall Centramate PE TFF holder Pall Corporation FS002K10 TFF module good for concentrating 10s-100s of L of sample; requires additional 30 or 100 kDa filter modules to scale with your estimated volumes
Peristaltic pump Masterflex L/S Cole-Parmer 07559-07 Pump for driving large-scale TFF modules
Piston Gradient Fractionator Biocomp Instruments 152-001 Automated density gradient fractionation
Polycarbonate tubes for the 70 Ti rotor Beckman Coulter 355618 Reusable ultracentrifuge polycarbonate aluminum tubes with cap assembly
Pro99 medium Home-made medium --- Medium for cultivation of Prochlorococcus
Pro-Q Emerald LPS Gel Stain Kit Thermo Fisher Scientific P20495 LPS staining
SN medium Home-made medium --- Medium for cultivation of cyanobacterial marine strains such as Synechococcus
Sodium cacodylate trihydrate Sigma-Aldrich C0250-100G Buffering agent in the preparation of vesicles samples for TEM
SW32Ti swinging bucket rotor Beckman Coulter 369650 Ultracentrifuge rotor, holds 6x ~40 mL tubes; good for pelleting of bulk material
SW60Ti swinging bucket rotor Beckman Coulter 335650 Ultracentrifuge rotor, holds 6x ~4.5 mL tubes; good for gradient purifications and final vesicle washes
Syringe 1mL Luer BD Plastipak 303172 For vesicle isolation and loading samples into nanparticle tracking analysis (NTA) equipment
Syringe filter 0.2 µm Pall Corporation 4602 For vesicle isolation from cultures
TAPS [N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]-3-aminopropanesulfonic acid] Sigma-Aldrich T5130 Buffering agent for cyanobacterial growth media
Transmission electron microscope JEOL JEM-1400 Or similar microscope
Type 70 Ti Fixed-Angle Titanium Rotor Beckman Coulter 337922 Ultracentrifuge rotor, holds 8x ~39 mL tubes; good for pelleting of bulk material
Type XIV protease from Streptomyces griseus Sigma-Aldrich P5147 Enzyme for proteolysis of EVs proteins, required for LPS staining
UltraClear tubes for the SW32Ti rotor Beckman Coulter 344058 Single use ultracentrifuge tubes
UltraClear tubes for the SW60Ti rotor Beckman Coulter 344062 Single use ultracentrifuge tubes
Ultramicrotome PowerTome XL, PT-PC RMC Products,  Boeckeler Instruments 75501 Microtome for ultra-thin sections - TEM
Universal 320 R centrifuge Hettich Z654736 This or any similar general-purpose benchtop/floor standing centrifuge can be used for pelleting cells
Vacuum apparatus KNF Neuberger N026.3 AT.18 Or any similar vacuum pump and trap
Vivaflow 200 100,000 MWCO PES Sartorius VF20P4 TFF module, good for 2-3L. You can connect different modules for higher volume (figure 1).
Whatman Polycap TC Capsule filter (0.2/0.2µm) Cytiva 6717-9502 Capsule filter for filtering large volumes of liquid
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Biologia Numero 180
Isolamento e caratterizzazione delle vescicole extracellulari cianobatteriche
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Biller, S. J., Muñoz-Marín, M. d. C., Lima, S., Matinha-Cardoso, J., Tamagnini, P., Oliveira, P. Isolation and Characterization of Cyanobacterial Extracellular Vesicles. J. Vis. Exp. (180), e63481, doi:10.3791/63481 (2022).

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